SK419491A3 - Thf preparations - Google Patents

Description

Vynález se týká pŕípravkú, které lze získat z brzlíku a jejich syntetických derivátú.

Posavadni stav techniky

V posledních letech byl patrný zvýôený zájem o extrakty získané ze zvíŕecích, zejména telecích brzlíkú a o jejich imunologické charakteristiky*

V práci autorú ÄLlana J.OoldsteiAa a Jeffŕye L* Hossia v Gomprehensive Therapy, 4, 49-57 /1978/ se uvádí, že kromS vlastní sledované látky /označené jako thymosin’’/ byly hodnoceny další tri brzlíková faktory. Jednalo se o thymopoietiny, sérový faktor thymu /STF/ a hunorálnl faktor thymu /THF/.

Thymopoietiny /dŕíve nazývané “thymin/, jejich príprava a použití byly již popsány napríklad v prúci Gideona Goldsteina, Náture 247, str. 11-14 /1974/ a US patentu δ. 4055633, 4077949, 4120951 a 4124700. Thymopoietiny se získávají z telecích brzlíkú sekvenční dialýzou, molekulárni vylučovací chromatografií a frakční chromatografií. 2iskají se dvé účinné látky, označované jako thymopoietin I a II.

Obé látkyjsou polypeptidy, mající 49 amínokyselinových zbytkú. Liší se však ve štruktúre zbytkú v poloze 1 a 43. US patent č. 4002740 uvádí syntézu tridekapeptidu, který má údajné mnoho podobných vlastností jako thymopoietin II. US patent č. 4369137 popisuje určité meziprodukty vhodné pro prípravu thymopoietinového pentapeptidu. US patenty č.

4190646» 4261886 a 4397842 popisují peptidy, mající aktivitu thymopoietinu.

Sérový faktor thymu, jaho príprava a vlastnosti byly popsány v práci J.P.Bacha á spol· v Náture 266, str· 55-57 /1977/ a US patentech č· 4098777» 4133804 a 4148886. Získó se s vepŕové krv® sekvenční defibrinací, dialýzou, zahugténím ve vhodné® filtru, frakcionaei na molekulárni©. situ, chromatografií na iontoméničových pryskyŕicích, další frakcionaei chromatografií na tenké vrstvé a elektroforézou. Produkt se jeví jako polypeptid, majíci 9 aminokyselinových zbytkô. Peptidy mají strukturu podobnou sérovému faktoru thymu, popsanému v US patentu C. 4301065·

Thymosiny, kromé údajň v práci Cooprehensive Therapy uvedené výše, byly popsány v US patentech č· 4010148, 4079127, 4082737, 4116951, 4128637 a 4148788, US patent č. 4010148, popisuje napríklad prípravu frákcí thymosinu ze zhomogenizovaného sovčího thymu. Tento postup zahrnuje vícestupnový čističi proces, kde produkt každého stupné je označováň jáko frakce’*. Produkt získaný jednoduchým odstredení© homogenizovaného thymu je tedy frakce l. Produkt získaný po homogenizeci a odstredení s následným zahrátí© a zpracováním s acetóne© a sírane® amonným a s konečným ultraodstŕedéním sraženiny získané se sírane® amonným pri 4 °C pri odsolení na koloné Sephadex 0-25 /jemné/ j© frakci 5”. Další zpracování končí elektroforézou, kde první pík proteínový poskytuje frakci 8. Prakce 8 j© polypeptid, obsahujicí 108 aminokyselinových zbytkň. US patent č.

4128637 vyjasňuje skutečnost, že témito postupy lze ziskat rňzné polypeptidy, aající molekulovou hmotnost od 1200 do 4000 a lze je definovať jako thymosiny. US patent č.

4082737 popisuje výrobu pevného, stabilního prípravku prostého endotoxinň, obsahujiciho smés polypeptidň, tvorících thymosinovou frakci 5.

Goldsteinové práci Comprehensive Therapy je produkt popsaoý výše popsón z hlediska vlastností jednoho polypeptidu označeného jako thymosin získaného z thymosinové frakce 5. Je uvedeno, že se jedná o polypeptid o 28 aminokyselinových zbytcích, majících molekulovou hmotnost 3108 a izoelektrický bod pri pH 4,2. To je také popsáno a nároková’ no v US patentu S. 4079127. Rádioimunológieké stanovení thymosinu $ ₁ je popsáno v US patentech fi· 4264571 s é.

tech ô. 4442031 « g. 4470926. Bis-thymosin ας je popsán v US patentu Č. 4396605. Z thymosln faktoru 5 byly získány

thymosln První látka má 50 aminokyselinových zbytkú, pŕičemž druhé látka má 43 aminokyselinových zbytkú. To je popsáno v US patentu č. 4297276« Fragmenty thymosinu a jsou popsány v US patentu fi. 4395404· Thymosiny ρ θ a jsou popsány v US patentech ô. 4388234 ad. 4389343·

Dalším produktom, který byl získén z brzlíku, je obecné se Vyskytujícf imunopoietický polypeptid /UB IP/ popsaný v US patentech fi. 4002602 a 4167557 a v Proceedings of the· National Academy of Sciences 72, str. 11-15 /1975/· Má molekulovou hmotnost asi 8500 a obsahuje 74 eminokyzelinových zbytkú. Podobná peptidová látka je uvedená v US patentech fi. 4215111 a 4190647.

Další extrakty byly popsány v US patentech fi. 34p859> 3466367, 3657417, 4239498, 4377511 a 4394374, které popisují výrobu extrektô, ale nepopisujú výrobu daného polypeptidu.

US patent fi. 4374828 popisuje extrakty thymu, mající špecifický obsah aminokyselín, ale neuvádí žádnou sekvenci aminokyselín. 7 US patentu fi. 4046877 je popsán lidský sérový prealbumin, mající vlastnosti podobné hormonúm thymu. Imunostiaulafiní prípravok bakteriálni RMA je popsán v US patentu fi. 4389396. Peptidy vhodné pro užití v oblasti funkce thymu jsou popsány v US patentech č. 4250086, 4320118, n4i*j-, .

4389342 a 4428938.

U véech týchto produktil byly uvádény určité účinky pri problémech imunodeficience. Jak vSák bylo uvedeno* v Proceedings of the Society f or Experimente! Biology and Medicín® 159, str. 195 ež 200 /1978/, thymopoietin, UB IP a sérový faktor thymu nejsou účinné pro vyvolání pro vyvolání thymus-závislé imunokompetence významné u intáktních zvíŕat.

V žádném z dosavadních údajú z oboru není uvedeno nebo nsvrženo špecifické peptidové složení podie vynálezu, mají c í humorální aktivitu thyiau.

Humorální faktor thymu /THF/ byl popsán napríklad v Journal od Experimental Medicíne, 132, str. 885-897 /1970/, Journal of Experimental Medicíne, 138, str. 1521-1532 /1972/, Gellular Lamunology 19,, str. 151-157 /1975/ a US patentu δ, 4250Θ84, kde jsou uvedený úspSäné klinické výsledky u lidí. Ualäí výsledky; klinických štúdií byly uvedený na setkání New York Aeademy of Sciences , 26.2.

1979. Tento humorální faktor thymu se podie dosavadních znalostí označuje jako THF I.

K dosažení klinicky vhodného THF I podie výfie uvedených postupú popsaných ve výäe uvedených publikecích a v US patentu č. 4250084, každá účinná frakce, obsahujicí THF I, pripravená purlfikačním zpiisobem byla zkoušena sedmi /7/ rúznými biologickými stanoveními a pouze frakce, které vykázaly] politivní výsledky byly podrobený dalšíau čiáténí a použití. Nyní se väak ukázalo, že k dosažení biologicky aktivních frakcí, které lze podávat klinicky, je nutné pouze stanovení účinnosti v biologických stanoveních v cMP, PHA, ConA a MLC.

J

f v í Λ	4				- í
	)	ho			í,
' o <		p		J O?	f rx r íí C
l/l g >'	XX ? > i σ J j	X	G*	; CH > ÍC
·< ΓΠ	ĹO		CC	ŕ
N		hO			ŕ $
				rc

Dosud se pŕedpokládalo, že pŕípravek· THFΊ,” výšepopsaný napríklad v US patentu č.4250084 je jednoduchý polypeptid, jelikož migruje ve tvaru jednoduché ninhydrin-pozitivní škvrny jak pri chromatografii elektroforéze pri pH 3,5. Dále Pri . izoelektrické íokusaci s isoelektrickým bodem 5,6 na tenké vrstve tak pri papírové migruje jako jednoduchý pruh na polyakrylamidových gelech až 5,9. Ačkoliv žádná ukázala jako frakce. Také se z aminokyselín není pri pŕípravé aromatická, bylo zjišténo, že THF I absorbuje ultrafialové záŕeni pri 280 nm, což je typické pro aromatické látky. Tato vlastnost se také užitečná pro izolaci požadované THF I pŕedpokládalo, že pŕípravek THF I, tak jak je popsán napríklad ve výše uvedeném US patentu, je v podstaté čistý polypeptid, mající molekulovou hmotnost asi 3200. Nepŕedpokládalo se, že tento již znám*? THF T by mchi být dále separováii do íf«koí, které by mohly mít molekulovou hmotnost menší než asi 3200 pomoci jednoduché gelové filtrace, nebo které by mohly mít néjaké frakce molekulové hmotnosti menší než asi 3200, které by mély zcela stejný profil biologických stanovení uvedených pro THF I.

Prekvapivé pak bylo zjišténo, že uvedený humorální faktor thyxu /THF I/' není ve skutečnosti jednou sloučeninou a že podrobí-li se gelové špecifické filtraci, dochází k separaci produktO a požadovaná biologická aktivita se jevi být omezena na určité frakce. Dále bylo zjišténo, že požadované biologicky aktivní frakce jsou ty, které nevykazuj í v podstaté žádnou absorpci ultrafialových paprskô pri 280 nm. Predpoklad pro obsah aktivních produktô ve frakcích z gelové filtrace je, aby tyto frakce nemély významnou absorpci v ultrafialovém záŕeni pri 280 nm.

Pŕedchozí prihláška č.Ser.153644,která byla nahrazena pokračovaci prihláškou č.Ser. 741753, na kterou byl udélen US patent č. 4621135,uvádí izolaci biolo. < · ... ' . .;'·- - y·-.''/-’· . ·,·-; ':-'y ·---6gicky aktivní látky typu humorálního thymu /označená jako THF II/, vyznačující se zjevnou molekulovou hmotností nižší než asi 1800, pŕičemž v podstatš u této látky neexistuje ultrafialová absorpce pri £80 nm a je prokázéna biologická účinnost z hlediska biologických stanovení cÄJP,

PH A, ConA a MLC. Tato pŕedchozí prihláška taká uvádí postup pro získání THF II, který zahrnuje zpracování THF I \ gelovou filtrací za použití média, majícího limit vyluČování asi 1800 Daltonú, shromáždšním frakci, které nevykážu jí v podstatš žádnou ebsorpci pri 280 nm a výkazují aktivitu pri biologických stanoveních cÄťíP, MLC, PHA a ConA. Jedna z konkrétnich látek pro gelovou filtraci, která se ukázala být aktivní pro požadovanou frakcionač i pro získání THF II j® pryskyrice Biogel P2, což je polyakrylamidový gel perličkového typu, mající vylučovací mez 1800 Daltonú. T_at₀ pryskyrice je dostupná od fy Bio-Rsd LaboratoZýes of Richmond, Calif. 94.804.

Biologické stanovení cMMP použité pri hodnocení frakci je popsáno napríklad v pracích Kocka a Trainina, J.Sxp.Med. 139, str. 193 /1974/, Kooka a Trainina, J.Exp. Meď. 139, str. 193 /1974/, Kooka a Trainina, J.Immunol.

114, str. 157 /1975/ a Kooka, Umiela a Albala, Ann.H.Y. Acad.Sci. 249, str. 349 /1975/.

Biologická stanovení PHA a ConA, použitá pri hodnocení frakci jsou popsána napríklad v práci Rottera a Trainina, Cell.Immunol.16, str. 413 /1975/.

Biologické stanovení MLC použité pri hodnocení frakci je popsáno napríklad v pracích Umiela a Trainina, Eur.J. Lamuno.5, str.85 /1975/ a Kooka, Umiela a Albala, Ann.N.Y.

% ad. Sci 249, str.349 /1975/.

Predchozí prihláška Ser. č. 227299, která byla nahrazena pokračovací prihláškou č.Ser. 741753, na kterou byl udélen US patent č. 4621135 uvádl izolaci biologicky účinné látky humorálního typu thymu / značená jako THF III/ vyznačujte! se zjevnou molekulovou hmotnosti menší než asi 1500 a mající biologickou účinnost v biologických stanoveních cAMP, PHA, ConA a MLC. Tato predchozí prihláška také uvádí postup pro získání THF III, který zahrnuje adaorpci THF II na reverzní fázi ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii, eluci téchto látek z kolony a shromášdéní írakcí, vykazujících aktivitu ve všech parametrech cAMP, PHA, ConA a MLC biologických stanoveních.

Predchozí prihlášky ser.č. 300330 a 394571, které byly fiťďirazeriy pokračovací prihláškou c. Ser. 741753, na kterou by i udélen US patent č. 4621135, uvádéjí izolaci biologicky aktivního materiálu humorálního typu thymu / označeného jako THF-7/, vyznačuj ícího se zjevnou molekulovou hmotností asi 1500 nebo menši a majícího biologickou účinnost ve všech biologických stanoveních účinnosti cAMP, PHA, ConA a MLC. Tyto predchozí prihlášky také uvádéjí zpúsob získání THF-7, který zahrnuje adsorpci na reverzní fázi pomoci vysokoúčinné kapalinové ehromatograíie sa uvedení do rovnováhy pomoci pyridinfomiátu, s následujíci eluci z kolony smési pyridinformiátu a n-propanolu a shromáždénim frakcí, vykazujicích účinnost ve všech biologických stanoveních cAMP, PHA, ConA a MLC.

Predchozí prihlášky č.ser.475175 a 535539, které byly nahrazeny pokračovací prihláškou č.Ser.741753, na kterou byl udélen US patent č. 4621135, uvádéjí další zpracování k prečišténí THF-7 pomoci vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi pro získání biologicky aktivní látky, označené jako gama írakce THF-8. Predchozí prihláška ser.Č. 559393, která byla nahrazena pokračovací prihláškou č. Ser. 741753, na kterou byl udélen US patent č. 4621135, uvádí další separaci THF-8 gama frakce do nékolika biologicky

-Ίάaktivních látek, označených jako gama 2, gama V téchto pi*ihláškách byly rovnéž uvedený pro gama 5 a THF gama 4 sekvence aminokyselín, práce naznačí i ly, že di*íve uvedené sekvence THF gama 2 a THF gama 4 byly chybné.

a gama 5.

THF gama 2, THF

Další analytické aminokyselín pro * ’- ·.,·.. ' '· ' ;z '·’

%-y.' /í,·'.

a:

—8—

Podstata vynálezu

Postupem podie vynálezu se získají látky, majťcí humorélní aktivitu thymu a vyberou se ze tŕídy peptídô, majícich následujíci sekvenee aminokyselíní

Leu-Olu- Αερ-Gly-Pro-Ly s-Phe-Leu,

His-Pro-Deu-Fro-Asp-Leu-Tyr a

Phe-Val-Leu.

lyto látky mohou být izolovány z pŕirozených thymd nebo mohou být synteti2ovány.

Výchozí TUF I materiál pro výrobu látek podie vynálezu se obecné pripraví postupem popsanýa v US patentu δ.

4250084 uvedeným výše, který je zde citován pro úplnost.

K pripravé THF I se zmrazený thymus, výhodné telecí thymus zhomogenizuje ve vhodném kapalném médiu jako je pufr nebo solný roztok, bunééné zlomky a daläí nežádoucí složky se odstráni ultracentrífugací /napríklad pri 90000 g až 150000g po dobu 2 až 5 hodin a filtrací pŕes vhodný membránový filtr, napríklad velikosti porú 0,8 až 2,0 ^um tak, aby se získala tekutina prostá mikroorganismú, produkujících endotoxíny. Takto získaná sterilní tekutina se pak podrobí exhaustní dialýze a získaný produkt se pak lyofilizuje a opét rozpouští ve vhodném kapalném médiu, dialýza se obvykle provádí vúCi vétšímu objemu vody, soľného roztoku nebo solného roztoku fosfátového pufru /PBS/ za studená po dobu 24 až 60 hodin. Každá vhodná dialýzační membrána, která umožňuje prúchod látek o molekulové hmotnosti menší než 10000 múže být použitá. Vhodné membrány zahrnují celofánové dialyzační vaky. lyofilizovaný dialyzét se pak rozpustí napríklad v destilované vodé, v hydrogenuhličitanu emonném, v PBS nebo tris-pufru a zŕedí se na vhodnou koncentrací polypeptidu 1 až 15 ag/al solventu.

Výsledný roztok se pak podrobí gelové filtraci.

Použitá média a počet stupnú potrebných pro gelovou filtraci pri pŕípravé výchozího THF I materiálu pro tento vynález závisí v určitéo rozsahu na zpúsobu pŕedcházejícího čiáténí a zvlášté n© podstaté média použitého pro dialyzačni stupeň. To múže umožnit prúchod pouze látek s relatívni nízkou molekulovou hmotností a lze tak docílit minimálni potrebu stupnú gelové filtrace. V každém pŕipadé však bude butbé odatranit látky s nízkou molekulovou hmotností. To lze provést elucí a zadržaním prázdného objemu na koloné, mající vylučovací mez nekolik set Daltonú, napríklad na Sephadexu G-10 /Pharmacia/, který má vylučovací mez 700 Daltonú.

Další frakcionace k výrobé výchozího materiálu THF I se provádí gelovou filtrací za použití sorbentú pro gelovou filtraci, aajících Vylučovací mez okolo 5000 Daltonú, jako je napríklad Sephsdex 0-25 /Pharmacia/. Kolona se obvykle eluuje roztokom uhličitanu amonného pri pH 8,0*

Aktívni frakce se hodnotí pomoci 4 biologických stanovení uvedených výše. <íe-li to žádoucí, provede se další frakcionace napríklad na DBAE-Sephedexu A-2 5 /Pharmacia/ za použití 0,1M tris-HCl nebo 0,11í NH₄HCO₃ pri pH 8 a vyvíjenía s lineárním koncentračním gradientem NaCl. Soli lze odstrániť filtrací sorbentem, majícím nízkou vylučovací mez z hlediska molekulové hmotnosti jako je Sephadex G-10 a získáním prázdného objemu.

Tento pripravený výehozí THF I se pak nechá projít pŕes gelový filtrační materiál, mající mez vylučování asi 1800 Daltonú podie popisu pŕedchózí prihlášky ser.č. 153644. 2adrŽený materiál se pak eluuje vodou a eluovaný materiál se shromažáuje ve frakcích. U každé frakce se sleduje ultrafialové absorpce pri 280 no a u každé frakce se provádí biologické stanovení e.ABäP, PHA, ConA a MLC. První frakce

-turnaji výraznou absorpci pri 280 nm, ale nemají biologickou účinnost ve vôech z výše uvedených biologických stanové* nich· Další skupina frakcí v podstáté nevykazuje absorpci v ultrafialovém záŕení pri 2Θ0 nm, ale má biologickou úäinnost ve všech z výše uvedených biologických stanoveních. Následující skupina frakcí mó výraznou absorpci v ultrafialovém záŕení pri 230 nm, ale nemá biologickou účinnost ve všech z výše uvedených biologických stanoveních. Požadovaný materiál THF II, mající biologickou aktivitu ve všech čtyŕech biologických stanoveních se nachézí ve frákeích, majících pomér eluôního objemu /Ve/ k prázdnému objemu /Vo/ filtračniho média gelové filtraee od asi 1,1 do asi 1,4. Prázdný objem média gelové filtraee se stanoví známýrni zpásoby. Jeden z postupú pro méŕení prázäného objemu používá Blue Dextran 2000. Je to vysokomolekulárni dextran, mající molekulovou hmotnost okolo 2000000, oosahující modré barvivo © je dostupné od PharmaciaFine Chemicals Inc. K médiu pro gélovou filtrací se pridá 0,1 procentní vodný roztok /hmotn./obj./ Blue Dextranu 2000 v množstvi, tvoŕícím 1 % obj.celkového objemu filtračniho média gelové filtraee. Na kolonu se pak vnese voda a provádí se eluce \ rýchlostí 0,95 ml/min. Shromažáují se eluované frakce obje» ’ mu 5,75 ml· J každé frakce se sleduje absorpce svätia pri ·;

600 nm. Celkový objem, zahrnující i frakci, mající maximum absorbance pri 600 nm, predstavuje prázdný objem média gelové filtraee.

Biologicky aktívni frakce THF II pripravené výše uvedeným zpúsobem se pak spojí a k dalšímu čiôténí se použije vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi. Absorbované látky se pak eluují vhodným rozpouätédlem a získají se frakce, mající biologickou účinnost ve všech čtyŕech výše uvedených biologických stanoveních. Takto získaný materiál se označuje jako THF III.

-11Vhodnými chromatografiekými medii použitelnými pro prípravu THF III jsou obchodné dostupné povrchové modifikované anorganické sorbenty, mající navázané oktyl/Cg/ nebo oktadecyl /C^g/féze. Dále lze použít další navázané fáze hydrofobnfho charakteru, používané pro kapalinovou chromatografii na reverzních fázich jako je bifenyl nebo hexyl /C^/ až oktadecyl /C^g/. Ihra vhodné materiály jsou obchodné dostupné pod chránénými známkami Lichrosorb SP-18 a Nucleosil C^g. Nucle03il je dostupný v rozaérech velikosti částic 5 β 10 mikrometrú od fý Macherey-^agel and Co., Duren, SPN. ^alším vhodným sorbentem je kolona pro HpJX od fy ÄLtex Scientific Inc., Berkeley, Calif.

Látku THF II lze aplikovat pri výše uvedené chromatografii v jakékoliv vhodné koncentraci, ale je výhodné použít roztoku, pripraveného lyofilizací roztoku THF II, který obsahuje asi 3 mg proteínu, kde lyofilizát se rozpustí v 1 ml destilované vody.'

Vodné roztoky, vhodné pro eluci absorbovaných látek THF III z výše uvedených chromatografiekých médií zahrnují soli, obsahující jako katión sodík, draslík nebo pyridinium a jako oniont acetát, fosfát nebo formiát, napfíklad v rozmezí hodnot pH 3,5 až 7,5. Koncentrace soli je asi 50 mM až 300 mM. Tyto vodné roztoky se pak misí se vhodnými organickými elučními Činidly jako je n-prbpanol, isopropanol, ethanol nebo acetonitril, s lineárním nebo nelineárním gradientem v rozmezí G až 20 % až 0 až 60 % organického rozpouštSdla. K získání THF III je výhodný gradientový systém 0 až 50 % n-propanolu v 50 mM roztoku octanu sodného nebo amonného pri pH 6,5.

Biologicky aktívni frakce THF III pripravené výše uvedeným zpúsobem se pak spojí a dále se čistí metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzních fázich.

-12<

Stejná chromatografieká média vhodná pro výrobu THP III jsou vhodná pro separaci i získání THF 7- Chromatografie· ké médium se výhodné pŕedem uvede do rovnováhy pyridinium formiétem pri koncentraci 0,3 mM e pri pH 4,0· Látky ad· sorbované na koloné se pak výhodné eluují smési pyridiniumformiátu a n-propanolu. Hejvýhodnéjäí je gradient 7,5 az 25 % objemových n-propanolu. Eluovaná látka, mající biologickou účinnost ve véecb čtyŕech výäe popsaných biologických stanoveních se označuje jako THF-7·

Biologicky aktivní frakce THF-7 pripravené výäe uvedeným zpúsobem se pak spojí a dále Čistí pomoci vysokokapalinové chromatografie na reverzníeh fázi c h·» Pro separaci a získání THF-8 jsou vhodné stejná chromatografická média jako pro prípravu THF-7. Výhodným sopbentem je Nucleosil Cjθ /8 mikrometri/. Médium se výhodné uvede pŕedem do rovnováhy 0,1% /obj.Z roztokem kyseliny trífluoroctové pri pH 2,0. Látky, absorbované na koloné se výhodné eluují smési kyseliny trífluoroctové a n-propanolu. HejvýhodnéjŠÍ je použití gradientu 8-35 % /obj./ n-propanolu. Eluovaný ma_ teriél, mající biologickou účinnost v biologických zkouškách PHA, ConA a MLC se označuje jako THF-8.

THF-8 je složen z nékolika peptidových látek. Tyto peptidy lze separovat na jednotlivé látky pomoci izokratické separace. To lze docílit separací výše uvedeného THF-8 pomoci vysokoúčinné kapalinové chromatografie na chromatografickém médiu stejného typu jaký byl užit pro získání THF-8. V tomto pŕípadé se uvedení do rovnovéžného stavu provede smési 0,1M roztoku chloristanu sodného, 0,1% kyseliny ortofosforečné a 22% acetonitrilu. Materiál adsorbovaný na koloné se výhodné eluuje rozpouštédlem stejného složení j aké má rovnovážná smés. Frakce se charakterizuji ab30rpcí UV záŕení pri 211 nm. Frakce u kterých je patrnó maximum absorbance

pri 210 nm se vyčlenují pro další hodnocení. Tyto frakce se také hodnotí na prítomnost peptidú a pouze frakce, obsahující peptidy se uchovávaj! pro další zpracováni. Každá z výše uvedených frakcí, obsahujících peptidy, se pak jednotlivé odsolí pomoci vysokoúčinnó kapalinové chromatografie na médiu stejného typu použitého výše za uvedení do rovnováhy vhodným tékevým pufrem. Výhodným tlumivým systémem je 2 mM formiát amonný pri pH 7,8 nebo 0,1% kyselina trifluoroctová v 5% acetonitrilu. Odsolený peptid se pak eluuje z kolony vhodným tékavým pufrem a rozpouátédlem. Výhodné je použití formiátu amonného nebo trifluoracetátu za použití lineárního gradientu 5 až 50 % acetonitrilu. Eluce se sleduje pomoci absorpce pri 210 nm. Silené frakce jsou ty, které mají maximum absorbance pri 210 nm. Výsledné odsolené peptidové frakce jsou testovány na biologickou aktivitu ve stanoveních PHA, ConA a AäLC.

^'rakce THF-8, mající účinnost ve všech trech výše uvedených biologických stanoveních se označuj! jako THF gama 2, THF gama 4 a THF gama 5.

Výroba nových peptidú podie vynálezu ze žlázy thymu je podrobnéji popsána v následujicích pŕíkladech.

Príklady provedení vynálezu

Príklad 1

Biologicky aktivní frakce THF I pripravené v souladu s príkladom US pat.č. 42500S4 s tím rozdílem, že výchozí žlázy thymu byly zmrazený pred po.čátkem produkce THF I, byly spojený a byla získána smés, obsahující 1 mg proteinú. Tato kapalná smés pak byla lyofilizována. Lyofilizovaný materiál byl pak rozpuštén v 5 ml destilované vody a aplikován ns kolonu fíio Gel P-2, získanou od 3io-Rad Laboratories of Richmond, Calif. Kolona méla 2,9 cm v prúméru a 130 cm výšky. Prázdný objem /V©/ kolony byl pŕedem stanoven použitím KLue Dextranu 200 jako 270 ml. Obsah kolony pak byl eluován dvakrát destilovanou, epyrogenní vodou pri

-14prútokové rýchlosti 0,95 ml/min a pri 4 °C se sbírají frakce 5,75 ml* Pro každou frakci se sleduje ultrafialové abšorpce pfi 230 a 280 nm. &aždá frakce se také testuje na biologickou aktivitu v cÄÄP, PHA, ConA a MLC buozkoušjjách. Byly pozorovény dva rozdílné a dobfe rozlíšené piky abšorpce. Prvni pík abšorpce byl získén pro frakce eluované elučními objemy /Ve/ v rozmezi od 250 ml do 330 ml. /Ve/Vo poméry od 0,93 do 1,22/. Druhý absorpčni pík byl získén pro frakce eluované v elučních objemech v rozmazí od 490 ml do 550 ml. /Ve/Vo poméry od 1,82 do 2,04/. Frakce,mající biologickou aktivitu ve väech čtyfech biozkouškéch byly získány zásadné pri elučních objemech 322 ml až 345 ml /Ve/Vo pcméry od 2,29 do 1,28/. V podstaté všchny z téchto frakci majících požadovanou biologickou aktivitu nemély absorpci pfi 180. nm· I když tento aktivní materiál byl napočátku zadržovén Bio Gelem P-2, majícím vylučovací mez asi 1800 Daltonú, mél ejevnou molekulovou hmotnost vétši než asi 1800. Aktivní materiál v téchto frákcích byl označen jako THF II.

Frakce THF II pripravené jak je popsáno výše byly spojený a poskytly kapalnou smés, obsahující 3 mg proteinu. Tato kapalné smés pák byla lyofilizována. Lyofilizovaný materiál byl pak rozpuštén v 1 ml destilované vody a aplikovén na kolonu s reverzní fázi pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii /HPLC/ /C^g/, získanou od ALtex Scientific Inc. of Berkeley, California. Kolena méla 4,6 mm v prúmôru a byla dlouhé 250 mm a byla pfedem uvedená do rovnovéžného stavu s 50 mM acetátu sodného pri pH 6,5.

Obsahy kolony byly eluovány prúchodem 50 mM octanu sodného pri pH 6,5 kolonou prútokovou rýchlostí 48 ml/h po 1 hodinu. Prútoková rychlost byle pak udržované stejné po 45 minút a byl pritom nahrazovén roztok octanu sodného n-propanolem s Iineárním gredientem od 0 do 50% objemových. Frakce po 2 ml byly odebírány pri teploté okolí /asi 22 °C/. Eluáty z kolony byly monitorovány ultrafialovou absorpci pfi 230 nm a fluorescenční detekci primárních aminoskupin

-15/reákce po príchodu kolonou u podílí provedená s fluoresc®ai» nem pri pH 9,5/. &aždá frakce také byle testována ne biologickou aktivitu v in vitro c AfóP, PHA, ConA a MUC biozkouškách.

Byly pozorovány dvé rozdílné a,dobre oddélenó plochy absorpce, které reagují, navíc, s fluorescaininea. První pík absorpce byl získán za použití jediného pufru a eluován elucí objemí 5-25 al· Fluorescamin-pozitivní materiál byl , eluovený ve stejné ploáe s elucí objemy v rozmezí 5 až 45 ml. Druhý pík ultrafialová absorpce, který byl také fluoreacamin pozitívni, byl eluován následující operací lineárního gradientu propanolu s elucí objemy v rozmezí 4—10 ml /0-9 % propanolu/. Frakce, mající biologickou aktivitu ve vSech výše uvedených biozkouškóch byly získány pouze pri elučních objemech 12 ml až 16 ml /10-16 % propanolu/. V podstaté vSéchhy tyto frakce, mající požadovanou biologickou aktivitu mély určité absorpce pri 230 nm, ale byly fluorescsminnegatívni. Aktivni materiál v téchto frakcích byl ozna6en jako THF III.

Frakce THF III pripravené jak je popsáno výše byly spojený a lyofilizovány. Lyofilizovený materiál byl pak rozpuätén v destilované vodé a aplikován na kolonu s reverzní fázi pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii popsanou výše, která byla pŕedem uvedená do rovnovážného stavu 0,3 ifi pyridinforaiátu pri pH 4,0. Obsahy kolony byly eluovány príchodem Q,3M pyrldínformiátu pri pH 4,0 kolonou pri prítokové rýchlostí 24 ml/h oo 12 min. Prítoková rychlost pak byla udržována na téže rýchlosti 12 min za nahrazování pyridiniumformiátu n-propanoleá) pri lineérním gradientu od 0 do 7,5 % obj. Prítoková rychlost pak byla udržována na stejné rýchlosti 54 min pri nahrazování určitého množství pyridinformiétuvého roztoku n-propanolem pri lineárním gradientu od 7,5 do 25 % obj. Frakce 1 ml každá byly odebírény pri teploté okolí /asi 22 °C/· L^ždé frakce eluovaná

-16?r-

a n-propanolem pak byla analyzována na celkový obsah aminokyselín po hydrolýze¹ a byla podrobená výSe uvedených čtyŕem biologickým zkouäkém. Frakce, obsehující materiál eluovaný z kolony aa použití 14-1Θ& obj. n-propanolu mély maximálni celkový obsah aminokyselín a také pozitívni výs-r ledky ve výSe uvedených čtsŕech biozkouškách. ^äctivní materiál v téchto frakcích byl označ en jako THF-7.

Vysokorychlostní gélová filtrace THF-7 na kolonš TSK-GEL SW 2Q00 /adsorbent od Toyo Sóda Mfg.Co., Japonsko/ potvrdila zjevnou molekulovou hmotnost 1500 Daltonú nebo méné protože 1500 Daltonú je nejmenäí molekulová velikost délená v této koloné.

Frakce THF-7 pripravené jak je popsáno výše byly spojený a zahuštény do sucha za sníženého tlaku. Sušený materiál byl pák rozpuštšn ve vodé a aplikován na kolonu s reverzní fésí pro vysokotlakovou kapaiinovou chromatógrafii z© použití Nucleosilu C^g /5 mikrometrú/. Kolona byla 4,3 mm v prúméru a 250 mm dlouhé a byla pŕedem uvedená do rovnováhy 0,\% obj. kyseliny tŕifluoroctové /TFA/ pri pH 2,0. Obsahy kolony byly eluovány prúchodem 0, \% TFA pri pH 2,0 kolonou prútokovou rýchlostí 24 ml/h po 12 min. Prútoková rychlost pak byla udržována na stejné hodnoté po 12 minút a TFA byla z části náhrazována n-propanolem pri lineárním gradientu od 0 do 8 % obj. Prútoková rychlost pak byla udržována na stejné hodnoté po 86 min pri nahrazování určitého množství TFA n-propanolem pri lineárním gradientu od 8 do 35 % obj. Frakce po 1 ml byly odebírány pri teploté místnosti /asi 22 °C/· Každá frakce eluovaná n-propanolem byla pak analyzována na celkový obsah aminokyselín po hydrolýze a byla poď

-17robená in vitro biologickým zkcuškám MLC, PH A a ConA· *rakce, obsahující materiál eluovaný z kolony za použití 16-22 % obj. n-propanolu mšl maximálni obsah aminokyselín a môl také pozitívni výsledky ve výše uvedených t?ech studiích. .Aktivní materiál v téchto frakcích byl označen jako TKF-8.

Frakce THF-8 pripravené jak je popsáno výše byly vložený na kolonu a reverzní fázi pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii /4,3 x 200 mm/, jako je Nucleosil Cjg /5 mikrometrú/, která byle pŕedem uvedená do rovnováhy s roztokem 0,1 M chloristanu sodného, 0,1% kyselinou orthofosforečnou a 22 % acetonitrilu. Obsahy kolony byly eluovány roztokem výše uvedeného složení pri prútokové rýchlosti 1,5 ml/min. Frakce po 1 ml byly sbírány pri teploté okolí /asi 25 °C/. Eluce byla sledována UV absorpcí pri 210 nm. Frakce, mající zvýšené absorpční piky byly. zadrženy· &ýlo takto izolovéno šesť hlávnich frakcí. Tytó byly označený jako THf’.-8 alfa, beta, gama, delta, epsilon a theta frakce. Podíly všech frakcí jiných než alfa byly kompletné štépeny pronasou a byly alespoň částečné ôtépeny proteinásou K. Toto indikuje, že alfa frakce neni peptid a ostatní frakce jsou zvela peptidy.

THF-8 beta, gama, delta, epsilon a theta frakce pak byly každá oddélené sušený za sníženého tlaku, rozpuštény ve vodé a odsoleny jejich aplikaci na seperátní kolony s reverzní fázi pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii výše uvedeného složení, které byly pŕedem uvedený do rovnováhy se 2 otf mravenčonem amónnym pri pH 7,8 v 5% obj. ©cetonitrilu. Odsolený materiál byl eluován z každé kolony 2 mM mravenčanem amonným za použití lineárního gradientu 5-50 % acetonitrilu pri prútokové rýchlosti 1,5 ml/min. ^luce byla sledována absorpcí pri 210 nm. frakce po 1 ml byly sbírány. Frakce, majicí zvýšené absorpční piky byly zadrženy. 3eta frakce poskytla dve separátni odsolené peptidové frakce, zatímco další frakce poskytly každá jednu odsolenou peptidovou

-18frekei. Výsledných Šest odsolených peptidových frakci bylo označeno jako THF-8 beta-1, beta-2, gama, delta, epšilon a theta. Každá z téchto odsolených peptidových frakcí byla oddSlené suäena za sniženého tlaku a rozpušténa ve vodé. Podíly každé z frakci byly pak podrobený aminokyselinové analýze po kyselé hydrolýze 0 in vitro'MLC/thymus/, MLC /slezina/, PH Ä a ^onA biozkouškúm. THF-8 gama frakce byly nejaktivnéjáí ve výäe uvedených čtyŕech zkouákách.

Biologická aktivita výše uvedené THF-8 gama frakce byla asi tisíckrát vétáí než THF-1. Toto je prokázáno skutečností, že výše uvedené biozkouáky mohly být provedeny pro THF-8 gama frakci za použití nanogramových hladín, z fotíme o srovnatolné biozkouáky pro THF-I byly v míkrogrranových hladinách.

Klinická vhodnost THF-8 gama frakce byla.také démon-»·, strována. Byla použite pro obnovení imunologické funkce' T-bunék u lidského pacienta trpícího defektom epitelu thymu, zpdsobeným neznalostí T-bunék.

Výše pripravený THF-8 gama materiál byl eluován z chromatografické kolony pred odsolením pri retenční dobé asi 20 minút. Výše uvedený postup pro prípravu gama frakce THF-8 vycházející z telecího thymu byl nékolikrát opakován, gama frakce z každé preparace eluované pri retenční dobé asi 20 minút, byly$>eparátné shromažďovány a uchovány. ^yto edeéraáélE’rekce pak byly oddélené suäeny za sniženého tlaku, ro2puätény; ve vodé a odsoleny výše popsaným postupem za použití systému vysokotlakové kapalinové chromatografie s reverzní fází. Eluce byla sledovéna pri absorpci 210 nm. ^rakce, mající zvýšené absorpční piky byly zadrženy.

-19·

Takto byly pripravený tri separátni peptidy THF-8 gama frakce. Tyto peptidy byly analyzovóny na obsah aminokyselín a jejich aminokyselinová sekvence. Byly tako podrobený MLC, PHA a ConA biozkouškám. Tyto peptidy byly označený THF gama 2, THF gama 4 a THF gama 5. Výsledky jsou uvedený dále.

THP gama 2 = Leu-Glu-Agp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu

THF gama 4 = His-Pro-Leu-Pro-Asp-^eu-Týr

THP gama 5 = Phe-Val-Leu

Asp = aspartové kyselina

Glu s glutamová kyselina

Gly = glycin

His = histidin

Leu « leucin

Lys - lysín

Phe = fenylalanin

Pro = prolin

Tyr = tyrosin

Val * vrlin

Všechny tyto nové peptidy mély biologickou aktivitu v každé z MLC, PHA a ConA bio zkoušek.

Syntetické príprave peptidú THF gsmcna 2, THF gama 4 a THF gama 5 z aminokyselinového surového materiálu je popsána v nésledujících pŕíkladech.

Príklad 2

Zo použití aminokyselinové sekvenční informace pro THP game 2, THF gama 5 a THF gama 4 získaná v príkladu 1 výše, byly pripravený syntetické formy téchto peptidú ze. použití modifikované Merrifieldovy techniky obecné popsané v J.Am.Chem.3oc. 85, str. 2149-2154 /1963/. V každém prípad š byl karboxyterminálni zbytek požadovaného peptidu, chránéný na aminoskupiné terc.butyloxykarbonylem /Boe/, byl

kopulován ke ehlormethylátovanému kopolyméru polystyrendivinylbenzen /1%/, 200-400 mesh /obsah chlóru 0,7 mekv./g/ ve vroucím ethanolu pod refluxem po 72 hodin. Polymerni pryskyrice byla použitá v množství 2-10 g a počáteční množství terc.-3oc-fimlnokyseliny bylo použito asi 0,7 mmol/g pryskyrice. Výtéžek kopulace byl 0,15 -0,3 mmol Boc-aminokyseliny/g polyméru. N-chránéné aminokyselinové pryskyrice byla postupné promývána 100 ml ethanolu, 100 ml obj.50% ethanolu v dichlormethanu a 100 ml dichloraethanu. í’romytá N-chrénéná aminokyselinové pryskyrice byla pŕemísténa do 250 ml teflónové nádoby a umístena na míchadlo, tŕepačku nebo do syntetizátoru peptidú jako je &odel OO1 Peptider /Pftninsuls Laboratories Inc., ôelmont, Calif./. Postupné syntézové stupné byly provedeny ve stejné nádobé. Vôechny stupné syntézy byly provádény pri teploté mistnosti. Pro každou následujíci skupinu aminokyseliny pridávanou k peptidu byl proveden následujíci cyklus operácí, vycházející z, N-chrénéné aminokyselinové pryskyŕiceí 1/ promytí trikrát 40 až 80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /2/ odstranéní prítomné 8oc chránicí skupiny dvôma seperátními zpracováníai se 40-80 ml 50% obj. kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu vždy po 15 min,/3/ promytí trikrát 40-80 ml ôichlormethanu pro každé promytí, /4/ promytí trikrát 40-80 ml 50$ obj. ethanolu v dichlormethanu pro každé promytí, /5/ promytí trikrát 40-80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /6/ neutralizace po 5 min vždy s dvéma 40-80 ml podíly 5% obj. diisopropylethylaminu v dichlormethanu, /7/ promytí šesťkrát 40*80 ml dichlormethanu pro každá promytí, /8/ pridání 3 ekvivalentft další požadované 3oc-chránčné aminokyseliny ve 48 ml dimethylformamidu a 3 ekvivalenty N,N*-dicyklohexylkarbodíimidu ve 30-72 ml dichlormethanu a mísení po 2 hodiny, /9/ premytí trikrát 40-80 ml 50% obj. ethanolu v dichlormethanu pro každé promytí, /10/ promytí trikrát 40 -80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /11/ opakování stupné /8/ výše pŕes noc, a /12/ promytí trikrát 40-80 ml 50 % obj. ethanolu v dichlormethanu pro každé promytí.

Výše uvedený dvanáctistupňový cyklus se opakuje v dostatečném počtu pro syntézu požadovaného peptidu, chránéný peptidová pryskyŕice se pak cykluje výše uvedenými stupni /1/ až /5/ a suší. Potom se 2pracuje s kapalným HF /4 ml/g/, anisolem / 1 ml/g/ a thioanisolem /1,5 ml/g/ po 30 min pri 0 °C pro odstranéní chrénících skupin a oddélení peptidu z pryskyŕice. HF se pak odparí. Surový peptid se vysráží pŕídavkem 100-200 ml diethyletheru pri 0 °C. Sraženina se oddélí z etherového roztoku filtrací a suší se. Suchá peptidová sraženina se pak extrahuje 100300 ml 50% obj. vodné kyseliny octové a nerozpustné látky se odfiltrují. Rozpouštédlo se pak odparí a výsledný zbytek se rozpustí ve vodé a nechá projít pŕes Sephadex G-15 nebo Biogel P-2 gélovou filtrační kolonu. Absorbovaný peptid se eluuje vodou a eluát se sleduje ultrafialovou-absorpcí pri 254 nm. Frakce, mající peptidový pík pri této absorpci vlnové délky se oddelí, ^yto peptidová frakce se potom vloží na kolonu Lichrosorb s. reverzní fázi pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii /10 x 250 mm/, která byla pŕedem uvedená do rovnovážného stavu 3 0,1 M chloristanem sodným a 0,1% obj. kyseliny fosforečné ve 23% obj. vodného acetonitrilu. Materiál se pak eluuje z kolony stojným rozpouätédlem za isokratických podmínek pri prôtokové rýchlosti 5 ml/min. Eluce se sleduje pri absorpci 210 nm. Odebírají se frakce po 7,5 ml. Zadrží se frakce, mající zvýšené absorpční piky. Frakce, obsahující požadovaný peptid se zahustí za sniženého tlsiku a nanesou na HPLC kolonu s reverzní fázi /jak je popsána výše/, která byla pŕedem uvedená do rovnováhy s 0,1 obj.% kyseliny trifluoroctové v 5 % obj. vodného acetonitrilu. Peptid pak byl eluován 0,1% obj. vedné kyseliny trifluoroctové za použití lineárního gradientu 5-50 % acetonitrilu pri prítokové rýchlosti 5 ml/min. Eluce byla sledována pbsorpcí pri 210 nm. Frakce po 7,5 ml byly odebrény. i’rakce, mající zvýšenou absorpci byly zatfrŽeny, nebot obsahují požadovaný peptid. ČiŠtôný peptid pak

-22M.

byl analyzován na obsah aminokyselín a byla ovéŕena struk-, tura aminokyselinové sekvence.

Výše uvedený postup byl proveden pro prípravu syntetického THF gama 2 ve výtéžku 11 mol procent vztaženo na počáteční množstvi první aminokyselinové skupiny kopulpváné . k pryskyŕici. Béhem syntézy byly trifunkční aminokyseliny kyselina glutamová a aspartovó dále chránény benzylestery a * lysin byl dále chránšn p-chlorbenzyloxykarbonylem· Výsledný syntetický peptid mél následující aminokyselinovou sekvenci:

Leu-Glu-Äap-Qly-Pro-Lys-Phe-Leu

Tento materiál byl biologicky aktivní v, rozsahu 0,5 až 50 ng/ml v in vitro biozkouškách v rozmazí 1 až 80 ng/kg télesné hmotnosti v biozkouškách in vivo. in vivo biozkoušky opravnují k použití syntetického THF gama 2 pri obnové zlepšených imunologických funkcích neonatélné thymektomizovaných myší.

Príklad 3 * Výše uvedený postup byl použit pro prípravu syntetic« kého THF gama 4 ve výtéžku 24 mol procent, který mél násle* dující aminokyselinovou sekvenci:

His-Pro-Deu-Pro--Asp-Leu-Tyr

3ghem syntetického postupu byla kyselina aspartová dále chránená benzylesterem, a histidin byl dále chrénén H-tosylimidazolem. Tento materiál byl biologicky aktivní v rozmezí 5-80 ng/ml v biozkouškách in vitro-.

Príklad 4

Výše uvedený postup byl použit pro prípravu syntetického THF gama 5 ve výtéžku 35 mol. procent, který mél následující sekvenci aminokyselín5

Phe-V al-Leu

Tento materiál byl biologicky aktívni v rozmezí 50250 ng/ml v biozkouškách in vitro © v rozmezí 20-10.00 ng/kg telesné hmotnosti v biozkouäkách in vivo. in vivo bio zkoušky opravňují k použití syntetického THF gama 5 pri . obnové zlepšených imunologických funkcí neonatálné thymektomizovaných myší.

Claims (2)

1. PATENTOVÍ N A*R O K Y

   1. Materiál, mojící humorální thymovou aktivitu a vybraný ze skupiny, zohrnújíc í peptidy, aající následují cí aminokyselinovú sekvence:

   i-eu-Glu- /tep-Gly-^ro-kys-Phe’-Leu, hí a-Pro-^eu-l'ro- Asp-Leu-Tyr a

   Phe-Val-Leu.
2. 2. Peptidový materiál, aající humorální thymovou aktivitu a mají c í náaisdující aainokyselinovou sekvenci Leu-3lu~ Α3ρ-01.γ-?Γθ-ΐΛΓ3-ΡΗ©-1.(ϊυ.

   j. Peptidový materiál, mající humordlní thymovou akti» vitú a ranjící náaledující aminokyselinovou sekvenci His-Pro-Lau-Pro-Asp-Leu-Tyr.

   4.

   vitú

   Phe-Vqí-Lou

   Peptidový materiál, m ojíc í humoráloí thvaovot mají c í následující omlnokyselinovou sekvenci