JPH0210160B2 - - Google Patents

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JPH0210160B2
JPH0210160B2 JP61130431A JP13043186A JPH0210160B2 JP H0210160 B2 JPH0210160 B2 JP H0210160B2 JP 61130431 A JP61130431 A JP 61130431A JP 13043186 A JP13043186 A JP 13043186A JP H0210160 B2 JPH0210160 B2 JP H0210160B2
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thf
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amino acid
leu
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Toreinin Neisan
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Yeda Research and Development Co Ltd
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    • C07K7/065Thymic humoral factor
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は胸腺から得られる物質およびこれらの
合成法に関するものである。 従来技術 動物体特に子牛の胸腺の器官または細胞から得
られた抽出物およびこれらの免疫的特性について
は最近20年間にわたつて興味が増大しつゝあつ
た。 最近、Allan J.GoldsteinおよびJeffrey L.
Rossio氏の論文〔Comprehensive Therapy
49―59(1978)〕にはチモシンに関連する物質の他
に3つの他の胸腺因子についてよく調査されてい
る。 これらにはチモポイエチン(thymopoietins)、
血清胸腺因子(STF)および胸腺体液因子
(THF)がある。 チモポイエチン〔以前にはチミン(Thymin)
と呼称された〕およびこれらの製法、用途は
Gideon Goldsteinによつて例えばNature247P.11
―14(1974)および米国特許第4055633号;第
4077949号;第4120951号および第4124700号明細
書に記載してある。チモポイエチンはホモナイズ
した子牛の胸腺から一連の透析、分子排除クロマ
トグラフイーおよび分別クロマトグラフイーによ
つて得られる。2つの活性な生成物はチモポイエ
チンおよびとして得られた。これらの両者は
49個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであ
る。しかしながら、これらは1位置と43位置の残
基の性質において異なる。米国特許第4002740号
明細書にはトリデカペプチドの合成が記載してあ
り、またチモポイエチンの多くの性質が記載し
てある。米国特許第4369137号明細書にはチモポ
イエチンペンタペプチドの製法に役立つ特定の中
間体が記載してある。米国特許第4190646号、第
4261886号および第4397842明細書にはチモポイエ
チン活性を有するペンタペプチドが記載してあ
る。 血清胸腺因子(STF)およびその製法および
性質はJ.F.BachらによつてNature266第55―57頁
(1977)および米国特許第4093777号、第4133804
号および第4148886号明細書に記載してある。こ
れは豚の血液から一連の脱繊維素、透析、適当な
フイルターによる濃化、分子篩による分別、イオ
ン交換樹脂によるクロマトグラフイー、さらには
はく層クロマトグラフイーによる分別および電気
泳動によつて得られる。生成物は9個のアミノ酸
残基を有するポリペプチドである。STFに類似
の構造を有するペプチドは米国特許第4301065号
明細書に記載してある。 チモシンについては、前記のComprehensive
Therapyの他に米国特許第4010148号;第4079127
号;第4082737号;第4116951号;第4128637号お
よび第4148788号明細書に記載してある。米国特
許第4010148号明細書にはホモゲナイズされた哺
乳動物の胸腺からチモシン区分を作ることが記載
してある。この方法は多段精製技術であり、各段
階は“フラクシヨン”と呼ばれている。この場
合、ホモゲナイズした胸腺を単に遠心分離して得
られた生成物は“フラクシヨン1”である。ホモ
ゲナイズ、遠心分離、次の熱、アセトンおよび硫
酸アンモニウム処理、最終に硫酸アンモニウム処
理で得られた沈澱を超遠心分離し、生成物を4℃
で集め、セフアデツクスG―25(Sephadex)(精
密)カラム上で脱塩して“フラクシヨン5”とす
る。更に電気泳動で頂点に達するまでの処理、お
よび第1蛋白質ピークの収集を“フラクシヨン
8”とする。“フラクシヨン8”とする。“フラク
シヨン8”は108個のアミノ酸残基を含むポリペ
プチドである。米国特許第4128637号明細書から
上記技術によつて分子量1200―14000の各種ポリ
ペプチドが得られ、チモシン(thymosins)と名
づけられたことがわかつた。米国特許第4082737
号明細書にはチモシンフランクシヨン5よりなる
ポリペプチド混合物を含む固体の安定でしかも体
内毒性のない組成物の製造について記載してあ
る。 上記の論文Goldstein Comprehensive
Therapyにはチモシンフランクシヨン5から得ら
れチモシンα1と呼ばれる特殊のポリペプチドの性
質が記載してある。28個のアミノ酸残基を有しし
かも分子量3108で等電点4.2のポリペプチドが記
載してある。これはまた米国特許第4079127号明
細書にも記載してある。チモシンα1の放射線免疫
分析は米国特許第4264571号および第4339427号明
細書に記載してある。チモシンα1フラグメントは
米国特許第4442031号および第4470962号に記載し
てある。ビス―チモシンα1は米国特許第4396605
号明細書に記載してある。2つの関連したポリペ
プチドであるチモシンβ3およびチモシンβ4はチモ
シンフアクター5から得た。第1物質は50個のア
ミノ酸残基を有し、一方第2物質は43個のアミノ
酸残基を有する。これは米国特許第4297276号明
細書に記載してある。チモシンβ3およびβ4のフラ
グメントは米国特許第4395404号明細書に記載し
てある。チモシンβ8およびβ9は米国特許第
4388234号および第4389343号明細書に記載してあ
る。 更に、胸腺から得られた生成物は同時に介在す
る免疫形成ポリペプチド(UB IP)であり、米
国特許第4002602号および第4167557号明細書に記
載してあり、またProceedings of the National
Academy of Sciences72第11―15頁(1975)に
も記載してある。その分子量は約8500で、74個の
アミノ酸残基を含んでいる。関連するペプチドは
米国特許第4215111号および第4190647号明細書に
記載してある。 他の胸腺エキストラクトは米国特許第3438859
号;第3466367号;第3657417号;第4239498号;
第4377511号および第4394374号明細書に記載され
ており、エキストラクトを生産するが、特定のポ
リペプチドの生産については記載してある。米国
特許第4374828号明細書には特定のアミノ酸含有
を有するが、いかなる特定のアミノ酸配列をもた
ない胸腺エキストラクトが記載してある。胸腺ホ
ルモン様性質を有するヒト血清プレアルブミンは
米国特許第4046877号明細書に記載してある。バ
クテリアRNAからの免疫刺戟性物質の製法につ
いては米国特許第4389396号明細書に記載してあ
る。胸腺機能域において役立つものとして記載さ
れているペプチドは米国特許第4250086号;第
4320118号;第4361673号;第4389342号および第
4428938号明細書に記載してある。 これらの生成物のすべては免疫欠損の問題につ
いての会合においてある用途が報告されている。
しかしながら、チモポイエチン、UBIPおよび血
清胸腺因子は無傷の動物においては意味のある胸
腺依存性免疫・受容能力を誘起するのに効果がな
いことがProceedings of the Society for
Experimental Biology and Medicine159、第
195―200頁(1978)に報告されている。 いかなる従来技術にも本発明の特定のペプチド
組成物が胸腺体液活性を有することが記載されて
いないしまた何等の提案もされていない。 胸腺体液因子(THF)は例えばJournal of
Experimental Medicine132第885―897頁
(1970);Journal of Experimental Medicine
138第1521―1532頁(1972);Cellular
Immunology19第151―157頁(1975)、米国特許
第4250084号明細書に記載してある。これらのす
べてはヒトのリン床試験結果で成功をおさめてい
る。リン床試験結果は1979年2月26日においてニ
ユーヨークアカデミーオブサイエンスの会合で報
告された。従来の胸腺体液因子はTHFIと名づけ
られた。 上記の文献および米国特許第4250084号明細書
に記載の従来法に従えば、リン床的に役立つ
THFIでは、精製方法で作つた各活性区分を7つ
の異なつた生物検定について試験した。すべての
7つの試料に対して正反応を発揮する区分につい
てのみさらに精製と使用とを行なつた。THFI区
分の活性はcAMP,PHA,ConAおよびMLCの
生物検定における活性に対して測定し、リン床的
に投与できる微生物学的活性区分を得た。 現在まで、米国特許第4250084号明細書に記載
されたTHFI試料は例えば簡単なポリペプチドで
あつたと考えられていた。その理由は、PH3.5で
はく層クロマトグラフイーおよびペーパー電気泳
動で単一のニンヒドリン―ポジテイブスポツトと
して泳動したからである。更に、等電点5.6―5.9
のポリアクリルアミドゲル上を等電的に集合して
単一バンドとして泳動した。試料中に含まれたア
ミノ酸は芳香族でなかつた。THFI試料は典型的
な芳香族を示す280nmにおける紫外線を吸収する
ことがわかつた。この特性は所望のTHFI区分の
分離に役立つことがわかつた。また、例えば上記
の米国特許明細書に記載されたTHFI試料は実質
的に分子量約3200の純粋なポリペプチドであつ
た。この従来公知のTHFI試料はさらに数区分に
分離でき、簡単なゲル濾過手段によつて分子量は
約3200以下に変化するかまたは分子量約3200以下
の新しい区分でしかも以前にTHFIとして報告さ
れた同じ完全な生物検定プロヒルを保持した区分
に分離できることは考えられなかつた。 以前に公知であつた胸腺体液因子(THFI)が
事実単一化合物ではなく、特定のゲル濾過をうけ
た場合、生成物の分離が起り、また所望の生物学
的活性が現われ、特定の因子であると確認された
ことがわかつたことは驚くべきことであつた。更
に、所望の生物学的活性区分は280nmにおいて実
質的に紫外線吸収を示さない区分であることがわ
かつた。ゲル区分から溶出した区分は280nmにお
いて著しい紫外線吸収を示した生成物に含まれた
活性区分の前後の区分であつた。 先の米国出願第153644号明細書には、胸腺体液
型生物学的活性物質(THFと名づけた)の分
離について記載してある。該物質は見かけの分子
量約1800以下でしかも280nmにおいて実質的に紫
外線吸収が存在せずしかもcAMP,PHA,ConA
およびMLCのすべての生物検定において活性を
有する特性がある。また従来の出願にはTHF
を得る方法が記載してあり、該方法はTHFIをゲ
ル濾過し、約1800ダルトンの排出限界を有するゲ
ル濾過媒体を用い、しかも280nmで実質的に紫外
線吸収を欠きしかもcAMP,MLC,PHAおよび
ConAのすべての生物検定において活性を示す区
分を集めることである。THFを得るための所
望の区分に対して有効であることがわかつた特定
のゲル濾過媒体はポリアクリドアミドゲルビーズ
型でしかも1800ダルトンの排出限界を有する
BiogelP―2樹脂である。この樹脂はリツチモン
ドカルフオニア94804のバイオーラードラボラト
リーから得られる。 得られた区分を分析するために使用したcAMP
生物検定については例えば、Kookおよび
Trainin;J.Exp.Med.139第193頁(1974)、Kook
およびTrainin;J.Immunol.114第157頁(1975)
およびKook,UmielおよびAlbala;Ann.N.Y.
Acad.Sci.249第349頁(1975)に記載してある。 得られた区分を分析するために使用したMLC
生物検定については例えばUmielおよび
Trainin:Eur.J.Immuno.第85頁(1975)およ
びKook,UmielおよびAlbala;Ann.N.Y.Acad.
Sci.249第349頁(1975)に記載してある。 得られた区分を分析するために使用したPHA
およびConA生物検定については、例えばRotter
およびTrainin;Cell.Immunol.16第413頁
(1975)に記載されている。 先の米国出願第227299号明細書には胸腺体液型
の生物活性物質(THF)の分離について記載
してある。該物質は見かけの分子量約1500以下で
しかもcAMP,PHA,ConAおよびMLCのすべ
ての生物検定について生物学的活性を示す特徴が
ある。この先の出願にはTHFを得る方法が記
載され、該方法では逆相高速液体クロマトグラフ
イーカラムに吸着され、吸着された物質はカラム
から溶出され、cAMP,PHA,ConAおよび
MLCのすべての生物検定に活性を示す区分を集
めた。 先の米国出願第300330号および第394571号明細
書には胸腺体液型生物的活性物質(THF―7)
の分離について記載してある。該物質の特徴は見
かけの分子量1500以下でしかもcAMP,PHA,
ConAおよびMLCのすべてについての生物検定に
おいて活性である特徴がある。また、先の出願に
は、THF―7を得る方法について記載してあり、
該方法ではTHFをピリジンホーメイトで前以
で平衡にした逆相高速液体クロマトグラフイーカ
ラムに吸着させ、吸着された物質をカラムからピ
リジンホーメイトとノルマルプロパノールとの混
合液から溶出し、cAMP,PHA,ConAおよび
MLCのすべての生物検定で活性を示す区分を集
めた。 先の米国出願第475175号および第535539号明細
書にはTHF―7を更に逆相高速液体クロマトグ
ラフイーによつて精製してTHF―8γ区分として
名づけられる生物的活性物質を作る。先の米国出
願第559393号明細書には更にTHF―8γ区分をγ
―2、γ―4およびγ―5の数種の生物活性物質
に分離することが記載してある。THFγ―2、
THFγ―4、およびTHFγ―5のアミノ酸配列は
先の出願に記載してある。更に、分析の結果、先
に報告されたTHFγ―2およびTHFγ―4に対す
るアミノ酸配列は誤りであつた。 問題点を解決するための手段 本発明は、胸腺体液活性を有ししかも次のアミ
ノ酸配列 Leu―Glu―Asp―Gly―Pro―Lys―Phe―Leu を有する物質を提供するにある。 これらの物質は天然の胸腺器管から分離でき、
また合成により製造できる。 本発明の新規物質の製造に使用するTHFIの原
料物質は上記の米国特許第4250084号明細書に概
要が記載された方法で製造する。その文献は本願
明細書にも引用されている。 THF1を製造するためには、凍結した胸腺、便
宜上子牛の胸腺を適当な液状媒体例えば緩衝液ま
たは塩水でホモゲナイスする。細胞デイプリスを
除き、さらに好ましくない成分を超遠心分離機
(例えば90000―150000gで2―5時間)により除
去した。次に適当な濾過膜例えば細孔径0.8―
0.2μmを通して濾過し、体内毒素を作る微生物を
含まない液状物を作る。次に得られた滅菌した液
状物は透析し、得られた生成物は凍結乾燥し、適
当な液状媒体中で再溶解した。透析は典型的には
多量の水、塩水またはリン酸塩緩衝塩水(PBS)
に対して24―60時間冷時にて実施する。分子量
10000以下の物質を通す適当な透析膜が使用でき
る。適当な膜はセロフアン透析バツクである。凍
結乾燥した透析物は例えば蒸留水、重炭酸アンモ
ニウム、PBSまたはトリス―緩衝液に再溶解さ
れ、1―15mg/mlの適当なポリペプチドの溶媒濃
度に稀釈し、次に得られた溶液をゲル濾過する。 本発明のTHFI原料物質を作るに当り、ゲル濾
過に使用する溶媒および所要工程数はある程度透
析工程で使用する予備処理、特に使用する溶媒の
特性に左右される。透析により比較的低分子量の
物質のみを通す場合には、ゲル濾過工程を最小限
度にすることができる。しかしながら、いかなる
場合でも、低分子量の物質を除くことが必要であ
る。数100ダルトンの排出限界を有するカラム例
えばセフアデツクスG―10(フアーマシア)
(Pharmacia)のカラムのボイドボリウムを溶出
および保持することによつてなしうる。セフアデ
ツクスG―10は700ダルトンの排出限界を有する。 更に、THFI原料物質を作るための区分は排出
限界約5000ダルトンを有するゲル濾過物質例えば
セフアデツクスG―25(フアーマシカ)を用いて
ゲル濾過を行なつた。代表的には、カラムPH8.0
で10-3M重炭酸アンモニウムで溶出する。活性区
分は上記の4個の生物検定によつて測定した。の
ぞむならば、更なる区分は例えば0.1Mトリス―
HClまたは0.1MNH4HCO3を用いてPH8.0で
DEAE―セフアデツクスA―25(フアーマシカ)
を用いしかもNaclの直線的濃度勾配を用いて展
開する。塩は低分子量の排出限界を有する物質例
えばセフアデツクスG―10を用いて濾過し次にボ
イドボリウムを回収することによつて除く。 このようにして得られたTHFI原料物質は先の
米国出願第153644号明細書の記載に従つて約1800
ダルトンの排出限界を有するゲル濾過物質の床を
通した。次に吸着物質は水で溶出し、溶出した物
質は区分に集めた。280nmにおける紫外線吸収が
各区分について監視され、各区分はcAMP,
PHA,ConAおよびMLCの生物検出について分
析した。得られた最初の区分は実質的に280nmで
紫外線吸収を示したが、上記の4つの生物検出の
すべてに生物活性を示さなかつた。得られた区分
の次のグループは実質的に280nmにおいて紫外線
吸収を示さなかつた。区分の後続するグループは
280nmにおいて実質的に紫外線吸収を示したが、
上記の4つの生物検定のすべてについて生物活性
を示さなかつた。上記の4つの生物検定のすべて
について生物活性を有する所望のTHF物質は
ゲル濾過媒体のボイドボリウム(Vo)に対する
溶出液の容量(Ve)の比が約1.1―1.4である区分
に見出された。ゲル濾過媒体のボイドボリウムは
公知の方法で測定する。ボイドボリウムの測定法
の一つではブルーデキストラン2000が使用され
る。これはブルー染料を含む分子量2000000を有
する高分子量デキストランであり、Pharmacia
Fine Chemicals Inc.から得られる。ブルーデキ
ストラン2000の0.1%(重量/容積比)の水溶液
がゲル濾過媒体の全容量を基準にして1%(容
量)の量をゲル濾過媒体のカラムに加えた。次に
水をカラムに加え、0.95ml/分の速度で溶出し
た。5.75ミリリツターの溶出区分が集められた。
600nmにおける吸収が各区分に対して監視され
た。全溶出物を集め、600nmにおいて最大吸収を
有する区分を含み、ゲル濾過媒体のボイドボリウ
ムを示した。 上記のようにして得られたTHFの生物活性
区分は合せて逆相高速液体クロマトグラフイー媒
体に通した。吸着された内容物は適当な溶液で溶
出し、上記の4つの生物検定のすべてにおいて生
物活性を有する区分が吸着された。この吸着され
た物質はTHFと名づけた。 THFを作るのに役立つ適当なクロマトグラ
フイー媒体はオクチル(C8)またはオクタデシ
ル(C18)を結合した相を有する市販の表面変性
無機担体である。逆相高速液体クロマトグラフイ
ーに使用する疎水性の他の結合相例えばビフエニ
ルまたはヘキシル(C6)ないしオクタデシル
(C18)が使用できる。2つの有用の物質はリクロ
ソルブRP―18(LichrosorbRP―18)およびニユ
クレオシルC18(NucleosilC18)の商品名で市販さ
れている。ニユクレオシルC18物質は粒径5およ
び10ミクロンの物質で西独デユレン(Duren)所
在のMacherey―Nagelcoから発売されている。
他の有用な物質は、カルフオルニア.バークレー
所在のAltex Scientific Inc.から入手したHPLC
カラムである。 THF物質はいかなる使用上の濃度で上記の
クロマトグラフイー媒体に適用できるが、約3mg
の蛋白質を含むTHF溶液を冷凍乾燥し、次に
冷凍乾燥した物質を1リミツターの蒸留水に溶解
して作つた溶液を使用するのが適当である。 上記のクロマトグラフイー媒体から吸着された
THF物質を溶出するのに役立つ水性液は例え
ばPH3.5―7.5のナトリウム、カリウム、アンモニ
ウムまたはピリジニウムカチオンおよびアセテー
ト、ホスフエートまたはホルマートアニオンを有
する塩を含む。塩濃度は約50mMないし300mM
である。次にこれらの水溶液は適当な有機溶離剤
例えばノルマルプロパノール、イソプロパノー
ル、エタノールまたはアセトニトリルを0―20%
ないし0―60%の有機溶媒の直線的または非直線
的濃度勾配で混合した。THFを得るためには、
50mMのナトリウムまたはアンモニウムアセテー
ト中、PH6.5で0―50%の濃度勾配を有するノル
マルプロパノールを用いるのが適当である。 上記のようにして作られたTHFの生物学的
活性区分は合併され、逆相高速液体クロマトグラ
フイー媒体を通した。THFの製造に適する同
一のクロマトグラフイー媒体はTHF―7の分離
および回収に役立つ。クロマトグラフイー媒体は
好ましくはピリジンホルマートで例えば0.3mM
の濃度およびPH4.0で予じめ平衡化する。カラム
に吸着された物質はピリジンホルマートとノルマ
ルプロパノールの混合物で溶出するのが好まし
い。7.5―25%(容量)のノルマルプロパノール
の濃度勾配を用いるのが最も適当である。上記4
つの生物検出のすべてにおいて生物活性を有する
溶出物質はTHF―7と名づけた。 次に上記のようにして作つたTHF―7の生物
学活性区分は合され、逆相高速液体クロマトグラ
フイーカラムを通した。THF―7の製造に適す
る同一のクロマトグラフイー媒体はTHF―8の
分離および採取に役立つ。適当な物質はニユクレ
オシルC18(5ミクロン)である。クロマトグラフ
イー媒体はPH2.0で0.1%(容量)のトリフルオロ
アセテートで予じめ平衡化することが適当であ
る。カラムに吸着した物質はトリフルオロ酢酸と
ノルマルプロパノールとの混合物で溶出すること
が適当である。8―35%(容量)の濃度勾配を有
するノルマルプロパノールが最も適当である。カ
ラム上の吸着物質はトリフルオロアセテートおよ
びノルマルプロパノールの混合物で溶出するのが
適当である。PHA,ConAおよびMLCの生物検
定において生物活性を有する溶出物質はTHF―
8と名づけた。 THF―8は数種のペプチツド物質よりなる。
これらのペプチツド物質はイソクラテイツク分離
によつて個々の成分に分離できる。これは上記の
ようにして製造したTHF―8をTHF―8の採取
に使用した同一種類の逆相高速液体クロマトグラ
フイー媒体に通して実施した。この場合、0.1M
ナトリウムパークロレート、0.1%オルトリン酸
および22%アセトニトリルの混合液で予じめ平衡
化する。カラムに吸着された物質は予じめ平衡化
した混合物と同一組成の溶媒で溶出するのが適当
である。この溶離パターンは210nmでの紫外線吸
収によつて監視する。更に考察するための吸着さ
れるべき区分は210nmの吸収データでピークを示
した区分である。また、吸着物質はペプチドの存
在のために試験されなければならない。またペプ
チド含有物質のみが更に処理されるべきである。
次にペプチドである上記の採取した区分の各々は
適当な揮発性緩衝液で予じめ平衡化するのに使用
したと同じ種類の逆相高速液体クロマトグラフイ
ー媒体におのおのを通して個別に脱塩する。適当
な緩衝液系はPH7.8で2mMアンモニウムホルマー
トかまたは5%アセトニトリル中で0.1%トルフ
ルオロ酢酸の濃度である。次に脱塩したペプチド
は適当な揮発性緩衝剤および溶媒を用いてカラム
から脱塩する。脱塩は5―50%アセトニトリルの
直線的濃度勾配を用いたアンモニウムホルマート
またはトリフルオロアセテートで行なうのが好ま
しい。次に溶離液パターンは210nmにおける監視
を行なつた。更に考慮するため保持される区分は
吸収域において210nmにおけるピークで示される
区分である。得られた脱塩ペプチド区分はPHA,
ConAおよびMLC検定において生物活性を試験し
た。上記の3種の生物検定のすべてにおいて活性
を有するTHF―8区分はそれぞれTHFγ―2,
THFγ―4およびTHFγ―5と名づけた。 実施例 胸腺から本発明の新規ペプチドを製造する方法
は次の実施例に詳細に記載してある。 実施例 1 米国特許第4250084号の実施例に従つて調製し
たTHFIの生物学的活性区分は、THFI産出開始
以前に最初の胸腺が凍結したことを除き、組み合
わせられ、1mgのタンパク質を含有する液体混合
物を提供した。この液体混合物を凍結乾燥した。
凍結乾燥物質を5mlの蒸留水に溶解し、カリフオ
ルニア、リツチモンドのBio Rad Laboratories
から得たBio Gel P―2のカラムに充てんした。
カラムは直径2.9cmで130cmの深さであつた。ブル
ーデキストラン2000を用いてカラムの空隙量
(Vo)を270mlであるとあらかじめ決めた。カラ
ム内容物を2倍希釈、発熱原物質の存在しない水
で、0.95ml/分の流出速度で溶出し、5.75mlの区
分を4℃で集めた。230及び280nmの紫外線吸収
を各区分で検出した。各区分をまたcAMP,
PHA,ConA及びMLCの生物検定における生物
学的活性を試験した。2つの明白なはつきり別れ
た吸収のピークを得た。溶出量(Ve)が250mlか
ら330mlに及び、溶出された区分に最初のピーク
を得た。(Ve/Vo割合は0.93から1.22)。溶出量
が490mlから550mlに及び、溶出された区分に第2
のピークを得た。(Ve/Vo割合は1.82から2.04)。
上記の4生物検定の全てにおける生物学的活性を
有する区分を主に溶出量322mlから345mlで得た
(Ve/Vo割合は2.29から1.28)。実質上、望まし
い生物学的活性を有するこれらの区分の全てに
180nmでの吸収があるわけではない。最初、約
1800ダルトン(Daltons)の排出限度を有するバ
イオゲルP―2によりこの活性物質を保持したの
で約1800以下のはつきりした分子量を得た。これ
らの区分にある活性物質をTHFとして示した。 上に記載したように調整されたTHF区分を
組み合わせてタンパク質3mgを含有する液体混合
物を提供した。この液体混合物を凍結乾燥した。
凍結乾燥物質を蒸留水1mlに溶解し、カリフオル
ニア、バークレーのAltex Scientific Inc.から得
た逆相高速液体クロマトグラフイー(HPLC)
(C18)カラムに充てんした。カラムは直径4.6mm、
長さ250mmで50mMの酢酸ナトリウムでPH6.5にあ
らかじめ平衡化にした。流出速度48ml/時間で1
時間PH6.5で酢酸ナトリウム50mMをカラムに通
して、カラム内容物を溶出した。その後、流出速
度を45分間同様に保ち、一方酢酸ナトリウムのい
くらかは容積で0から50%の直線的濃度勾配でn
―プロパノールで代用できる。各々2mlの区分を
室温(約22℃)で集めた。カラム溶出液を230nm
の紫外線吸収及び第1級アミノ基のけい光検出に
よつて観測した(続いてPH9.5でフロロエスカミ
ンによりアリコートの後カラム反応を行つた)。
各フラクシヨンについて生物学的活性試験、即ち
インビトロcAMP,PHA,ConA及びMLC生物
検定を行つた。 2つの明瞭な、而もよく分離した、吸収帯域が
認められた。それらは更にフロロエスカミンとも
反応した。第1の吸収ピークは一つの緩衝液で得
られ、溶離したところ溶離液量は5―25mlであつ
た。フロロエスカミン陽性部は同一帯域中に溶離
した(5―45ml)。第2の紫外線吸収ピーク(フ
ロロエスカミン陽性)を次工程でプロパノールの
直線的濃度勾配を用いて溶離した(溶離容量4―
10ml、0―9%プロパノール)。上記の生物検定
で生物学的活性を示す区分は10―16%プロパノー
ルのみに見られた(12―16mlの溶離量)。所望の
生物活性を有するこれらの区分のすべては実質的
に230nmにおいてある吸収を有するが、フロロエ
スカミンに対して陰性であつた。これらの区分の
活性物質はTHFと名づけた。 上記のようにして作つたTHFの区分は合さ
れまた冷凍乾燥される。次に冷凍乾燥物は蒸留水
に溶解し、逆相高速液体クロマトグラフイーカラ
ムを用い、PH4.0で0.3Mピリジンホルマートで前
以で平衡化した。カラムの内容物はPH4.0で0.3M
ピリジンホルマートを24ml/時で12分間通して溶
離した。次に流速を同一速度にして12分間通し
た。その間ピリジンホルマートの一部をノルマル
プロパノールで直線的に0〜7.5%(容量)の濃
度勾配で配換した。次に流速を同一速度で54分間
維持した。その間、ピリジンホルマート溶液の一
部をノルマルプロパノールで直線的に7.5―25%
(容量)の濃度勾配で配換した。1ミリリツター
づつの各区分は室温(約22℃)で集めた。次にノ
ルマルプロパノールで溶出した各区分は加水分解
後全アミノ酸含量を分析した。上記の4種の生物
検定法を行なつた。14―18%の(容量)のノルマ
ルプロパノールを用いたカラムから溶出した物質
を含む区分は最大の全アミノ酸含量を示しまた上
記の4種の生物検定において陽性の結果を示し
た。これらの区分の活性物質はTHF―7と名づ
けた。 TSK―GELSW2000のカラム(東洋ソーダ製の
市販吸着剤)上のTHF―7の高速ゲル濾過はこ
のカラムによつて得られる最小の分子量が1500ダ
ルトンであるため1500ダルトンまたはそれ以下の
見掛けの分子量を提案した。 上記の如くして作つたTHF―7の区分は合せ
て減圧下で蒸発乾涸した。次に乾燥物質は水中で
溶解しニユークレオシルC18(5ミクロン)を用
い、逆相高速液体クロマトグラフイーカラムを使
用した。カラムは直径4.3mm、長さ250mmであつ
て、PH2.0で0.1%(容量)のトリフルオロ酢酸
(TFA)で前以て平衡化した。カラムの内容物は
PH2.0で0.1%TFAをカラムに24ml/時の流速で12
分間通した。次に12分間同一の流速を維持した。
その間TFAの一部を0〜8%(容量)の直線的
濃度勾配を用いて置換した。次に流速を同一速度
で86分間維持した。その間、TFAの一部を8―
35%(容量)の濃度勾配を用いてノルマルプロパ
ノールで置換した。1mlの各々の区分を室温(約
22℃)で集めた。次にノルマルプロパノールで溶
出した各区分は加水分解後全アミノ酸含量を分析
し、インビトロで生物検定をMLC,PHAおよび
ConAについて行なつた。16―22%(容量)のノ
ルマルプロパノールを用いてカラムから溶出した
物質を含む区分は最大の全アミノ酸含量を有し、
上記3種の生物検出において陽性の結果を示し
た。これらの区分において活性物質はTHF―8
と名づけた。 上記の如くして作つたTHF―8の区分は例え
ばニユークレオジルC18(5ミクロン)の逆相高速
液体クロマトグラフイーカラム(4.3×200mm)に
て処理した。該カラムは0.1Mのナトリウムパー
クロレート、0.1%のオルトリン酸および22%の
アセトニトリルの溶液で前以て平衡化した。カラ
ムの内容物は上記組成の液で1.5ml/分の流速で
溶出した。1ミリリツターの各区分は室温(約25
℃)で集めた。溶出物のパターンは210nmにおけ
る紫外線吸収によつて監視した。増加した吸収ピ
ークを有する区分を保留した。この場合、6個の
主な区分を分離した。これらの区分はTHF―8
のα,β,γ,δ,ξおよびη区分と名づけた。
α区分を除く他のすべての区分はプロナーゼによ
つて完全に消化され、またプロテイナーゼKによ
つて少なくとも1部消化した。このα区分はペプ
チドでなく、他の区分はすべてペプチドであるこ
とがわかつた。 次にTHF―8のβ,γ,δ,ξおよびη区分
はそれぞれ別々に減圧下で乾燥し、水に溶解し、
これらを各々上記組成の逆相高速液体クロマトグ
ラフイーを用いて脱塩した。該カラムはPH7.8で
5%(容量)のアセトニトリルに2mMのアンモ
ニウムホルマートを溶解させた溶液で予じめ平衡
化した。脱塩した物質は各カラム5―50%アセト
ニトリルの直接的濃度勾配を用い、2mMアンモ
ニウムホルメートにて流速1.5ml/分で溶出した。
溶出物のパターンは210nmの吸収を監視した。各
区分の1ミリリツターを集めた。吸収ピークの増
大した区分を保留した。β区分は2つの別個の脱
塩したペプチド区分をあたえた。他の区分はそれ
ぞれ1つの脱塩したペプチドをあたえた。得られ
た6個の脱塩したペプチド区分はTHF―8のβ
―1,β―2,γ,δ,ξおよびη区分として名
づけた。これらの脱塩ペプチド区分の各々に減圧
下で乾燥され、水に溶解した。次に各区分は酸加
水分解後アミノ酸分析を行なつた。またMLC(胸
腺)、MLC(脾臓)、PHAおよびConA生物検定を
インビトロで行なつた。THF―8γ―区分は上記
の4種の生物検定のすべてにおいて最も活性であ
つた。 上記のTHF―8γ―区分の生物的活性はTHF―
1のものより約1000倍大きいものであつた。これ
は上記生物検定がTHF―8―γ区分については
ナノグラムレベルでおこなわれ、一方THF―
についての比較生物検定ではミクログラムレベル
でおこなわれたことによつてわかる。 THF―8γ―区分の臨床的利用も明らかになつ
た。正常なT―細胞の発育不良を起す欠損胸腺上
皮原基にかゝつているヒトの患者において免疫T
―細胞機能を回復させるのに使用された。 上記の如くして作つたTHF―8γ―区分は保持
時間約20分で脱塩以前にクロマトグラフイーカラ
ムから溶出した。子牛の胸腺を原料としてTHF
―8γ区分を作る。上記の方法を数回繰返し、各
試料からのγ区分は約20分の保持時間で溶出し、
別々に集めて保留した。次にこれらの集めた区分
はそれぞれ減圧下で乾燥し、水に溶解し、逆相高
速液体クロマトグラフイー系統を用いて上記の方
法によつて脱塩した。溶出物のパターンは210nm
における吸収を監視した。増大した吸収ピークを
有する区分を保留した。 この場合、THF―8γ―区分の3つの各々のペ
プチドが作られた。これらのペプチドについてア
ミノ酸含量およびアミノ酸配列を調べた。またこ
れらのペプチドについてMLC,PHAおよび
ConA生物検定をおこなつた。これらのペプチド
はTHF―γ―2,THFγ―4およびTHFγ―5
と名づけた。その結果を次に示す。 THFγ―2:Leu―Glu―Asp―Gly―Pro―
Lys―Phe―Leu THFγ―4:His―Pro―Leu―Pro―Asp―
Leu―Tyr THFγ―5:Phe―Val―Leu Asp:アスパラギン酸 Glu:グルタミン酸 Gly:グリシン His:ヒスチジン Leu:ロイシン Lys:リジン Phe:フエニルアラニン Pro:プロリン Tyr:チロシン Val:バリン これらの新規ペプチドのすべてはMLC,PHA
およびConAの生物検定の各々について生物活性
を示した。 アミノ酸原料からのTHFγ―2、THFγ―4お
よびTHFγ―5のペプチドの合成法を以下に示
す。 実施例 2 実施例1から得られたTHFγ―2のアミノ酸配
列についての情報を用いて、上記ペプチドの合成
はJ.Am.Chem.Soc.85第2149―2154頁(1963)に
概括的に記載されたメリフイールド法
(Merrifieldtechnique)の変法を用いて行なつ
た。各々の場合、アミノ基が第3級ブチルオキシ
カルボニル(Boc)で保護された所望のペプチド
の末端カルボキシ残基はクロロメチル化したポリ
スチレンジビニルベンゼル(1%)共重合体、
200―400メツシユ(塩素含量0.7meq./g)と沸
騰エタノール中で72時間還流下でカツプリングし
た。樹脂状重合体は2―10gを使用した。t―
Boc―アミノ酸の最初の使用量は樹脂0.7ミリモ
ル/gであつた。カツプリング収率は重合体グラ
ム当り0.15―0.3ミリモルBoc―アミノ酸であつ
た。N―保護アミノ酸樹脂は順次エタノール100
ミリリツター、50%(容量)のエタノールのジク
ロロメタン溶液100ミリリツターおよびジクロロ
メタン100ミリリツターで洗滌した。洗滌された
N―保護アミノ酸樹脂は内容250ミリリツターの
テフロン製びんに移し、撹拌機またはシエーカー
にのせるか、またはペプチドシンセサイザー例え
ば001型ペプタイダー(Peninsula Laboratories,
Inc.,Belmont,California製)にかける。後続
の合成工程は同じびんで行なつた。すべての合成
は室温で行なつた。ペプチドに加えられるそれぞ
れの後続のアミノ酸分子はN―保護アミノ酸樹脂
を出発物質として次の操作サイクルで行なつた。 (1) 各洗滌毎に40―80ミリリツターのジクロロメ
タンを用いて3回洗滌した。 (2) 50%(容量)のトリフルオロ酢酸のジクロロ
メタン溶液40―80ミリリツターを毎回使用して
2回処理して先に保護したBoc保護基を除去し
た。 (3) 毎回40―80ミリリツターのジクロロメタン40
―80ミリリツターを使用して3回洗滌した。 (4) 毎回50%(容量)のエタノールのジクロロメ
タン溶液40―80ミリリツターを使用して3回洗
滌した。 (5) 毎回ジクロロメタン40―80ミリリツターを使
用して3回洗滌した。 (6) 5%(容量)のジイソプロピルエチルアミン
のジクロロメタン溶液40―80ミリリツターを使
用して2回、各回5分間中性化した。 (7) 毎回40―80ミリリツターのジクロロメタンを
使用して6回洗滌した。 (8) 4―8ミリリツターのジメチルホルムアミド
に次に所望するBoc―保護アミノ酸3当量を含
む溶液を加え、また30―72ミリリツターのジク
ロロメタンにN,N′―ジクロロヘキシルカル
ボジイミドの3当量を含む溶液を加えて2時間
混合した。 (9) 毎回、50%(容量)のエタノールを含むジク
ロロメタン溶液40―80ミリリツターを用いて3
回洗滌した。 (10) 毎回40―80ミリリツターのジクロロメタンを
使用して3回洗滌した。 (11) 上記の(8)工程を一夜くりかえした。 (12) 毎回50%(容量)のエタノールを含むジクロ
ロメタン溶液40―80ミリリツターを使用して3
回洗滌した。 上記の12工程のサイクルを所望のペプチド合成
に充分な回数繰り返した後保護したペプチド樹脂
を上記第(1)工程から第(5)工程まで繰り返し使用し
て乾燥した。次に液状の弗化水素酸(4ml/g)、
アニソール(1ml/g)およびチオアニソール
(1.5ml/g)で0℃、30分間処理して保護基を除
き、樹脂からペプチドを分離した。次に弗化水素
酸を蒸発した。ジエチルエーテル100―200ミリリ
ツターを0℃で加えて粗製ペプチドを沈澱させ
た。沈澱はエーテル溶液から濾過により分離して
乾燥した。次に乾燥ペプチドの沈澱を50%(容
量)の酢酸水溶液100―300ミリリツターを使用し
て抽出した。不溶性部分を濾別した。次に溶媒を
蒸発し、得られた残渣を水に溶解しセフアデツク
スG―15(Sephadex)またはBiogel P―2
(Biogel)の濾過用カラムを通した。吸着された
ペプチドは水で溶出し、溶出液を254nmの紫外線
吸収によつて監視した。この吸収波長域にペプチ
ド吸収(ピーク)を有する区分を集めた。次にこ
れらのペプチド区分をリクロソルブRP―18
(Lichrosorb)逆相高速液体クロマトグラフイー
カラム(10×250mm)で処理した。該カラムは
0.1Mのナトリウムパークロレートおよび0.1%
(容量)のリン酸とを含む23%(容量)のアセト
ニトリル水溶液で前以て平衡化した。次に物質は
同一溶媒を使用してアイソクラシツク条件下で5
ml/分の流速でカラムから溶出した。溶出物のパ
ターンは210nmにおける吸収を監視した。7.5ミ
リリツターの各区分を集めた。増大した吸収帯を
有する区分を保留した。所望のペプチドを含む区
分を減圧下で濃縮し、逆相HPLCカラムで処理し
た。該カラムは上記の如く、5%(容量)のアセ
トニトリル水溶液に0.1%(容量)のトリフルオ
ロ酢酸を含む溶液で前以て平衡化した。次にペプ
チドは0.1%(容量)のトリフルオロ酢酸水溶液
を使用し、直線的濃度勾配を有する5―50%(容
量)のアセトニトリル溶液を流速5ml/分にて溶
出した。溶出物のパターンは210nmにおける吸収
を監視した。7.5ミリリツターの各区分を集めた。
増大した吸収を有する区分は所望のペプチドを含
むため保留した。次に精製したペプチドはアミノ
酸含量およびアミノ酸配列を分析してその構造を
明らかにした。 上記の方法により、合成THFγ―2を樹脂にカ
ツプリングした最初のアミノ酸分子の最初の量を
基準にして11モル%の全体の収率を得た。合成工
程の中、さらに3官能性アミノ基、グルタミン酸
およびアスパラギン酸はベンジルエステルで保護
した。更にリジンはオルトクロロベンジルオキカ
ルボニルで保護した。得られた合成ペプチドは次
のアミノ酸配列を有する。 Leu―Glu―Asp―Gly―Pro―Lys―Phe―Leu. この物質はインビトロ生物検定において0.5―
50ng/mlの範囲で生物的活性を有し、またイン
ビボ生物検定において体重(Kg)当り1―80ng
の範囲で生成活性を有する。インビボ生物検定に
より合成THFγ―2は出産直後の胸腺切除マウス
の欠損した免疫機能を回復するのに使用できるこ
とがわかつた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 次のアミノ酸配列 Leu―Glu―Asp―Gly―Pro―Lys―Phe―Leu を有ししかも胸腺体液活性を有するペプチド物
    質。
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