JPH03294292A

JPH03294292A - 接着剤として有用なペプチドおよびその製造方法

Info

Publication number: JPH03294292A
Application number: JP2096138A
Authority: JP
Inventors: O Brugio Louis; ルイス　オー．ブルジオ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-04-11
Filing date: 1990-04-11
Publication date: 1991-12-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は接着剤として有用なペプチドおよびその製造方
法に関る、。

発明の背景接着剤として有用なペプチドがミチルス（Ｍｙｔｉｌｕ
ｓ　）属のムラサキガイ（ｍｕｓｓｅｌｓ　）から、さ
らに詳細に言えば、この種のムラサキガイのボＪフェノ
ール系腺（ｇｔａｎｄ　）から得ることかできることは
知られている。この種のデカペプチドは、１９８６年４
月２９日付でνＢｉｔｅに対し発行された米国特許第４
，５８５．５８５号に記載されている。Ｗａｉｔｅおよ
び彼の共同研究者達は、このデカペプチドおよびその接
着剤としての使用を次の刊行物に記載している：　Ｂｊ
ｏｃｈｅＩｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏ＋ｕｕｎ、、９６：１５５４〜１５６１頁（１９８
０年）＋５ｃｉｅｎｃｅ、２２１２　：１０３８〜１０
４０頁（１９８１年）　　；Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅ
ｗ、、　２５８．２９１１〜２９１５頁（１９８３年）
　　；　ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ。

２４：５０１０〜５０１４頁（１９８５年）；」。

Ｃｏｌ１ｐ、　Ｐｈｙｓｉｏ１肌１５６：４９１〜４９
６頁（１９８６年）　　　；　　Ｉｎｔ、　　Ｊ、　　
Ａｄｈｅｓｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ。

＆：９〜１．４（１９８７年）；およびＪＡＤＡ、　１
１２　＋　８７９頁（１９８６年）。これらの刊行物に
記載されている接着剤は、水中に沈めた表面を含む、か
なり多くの表面に対し、異常なほど効果的な接着性を示
す。しかしながら、Ｗａｉｖｅによって記載された、生
体接着性（ｂｉｏａｄｈｅｓｌｖｅ　）タンパり質の精
製方法は、ムラサキイガイの足からの腺の分離（ｄｊｓ
ｅｃｔｉｏｎ　）　、分画抽出処理および数個のクロマ
トグラフィ工程を包含し、これによって、高純度のポリ
フェノール系タンパク質を得る方法である。

本発明により、ミチルス（Ｍｙｔｉｌｕｓ　）属の成る
種のムラサキイガイのフェノール腺（ｐｈｅｎｏ　１ｇ
１ａｎｄ　）から、ｙａｉｔｅによって記載されたもの
とは異なっており、ヘプタペプチド反復単位にもとづく
、接着性ペプチドを生成る、ことができることが見い出
された。さらにまた、ムラサキイガイからの、この新規
な接着性ペプチドの抽出は、Ｗａｉｔｅによって記載さ
れた方法に比較して、さらに簡単であり、かつまた安価
であり、従って、この方法を商業レベルにまで規模を拡
大る、場合における困難を減少させることができること
が見い出された。

本発明の要旨従って、本発明は下記の式で示されるペプチドをｔｉ供
る、：（式中、置換基Ｘは、それぞれ独立して、水素原子また
はヒドロキシル基であり、ｉｆ換基Ｒは、それぞれメチ
ルエチル、１−メチルプロピルまたは２−メチルプロピ
ル基であり、したがって、ｎ単位のそれぞれのＣ末端か
ら二番目の基はバリン、イソロイシンまたはロイシンで
あり、そしてｎは１〜約１０００の整数である）。

本発明はまた、上記式において、置換基Ｘが、それぞれ
独立して、水素原子またはヒドロキシル基であり、そし
て置換基Ｒがメチルエチル、１−メチルプロピルまたは
２−メチルプロピル基であり、したがって、各反復単位
のＣ末端がら二番目の基かバリン、イソロイシンまたは
ロイシンである、反復単位２〜約１０００個からなり、
この反復単位の隣接る、２個は、ペプチド結合、オリゴ
ペプチドまたは二官能性ペプチドカップリング剤により
相互に連結している、ペプチドを提供る、。

このヘプタペプチド配列のアミノ酸配列は次のとおりで
ある：ｒ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−（ＴＹＲまたはＤＯＰＡ）−ＧＬ
Ｙ−ＧＬＹ−（ＶＡＬまたハＬ　Ｅ　ＵまタハＩＬＥ）
−（ＬＹＳまたはＨＯ−ＬＹＳ）−Ｊさらにまた、本発
明は接着性タンパク質の製造方法を提供し、この方法は
、（イ）アウラフミア　エチル（ＡｕｌａｃｏＩｌｙａ　
ａｔｅｒ）、コロミチルス　コルス（Ｃｈｏｒｏｍｙｔ
Ｈｕｓ　　ｃｈｏｒｕｓ）、ミチルス　キレンシス（Ｍ
ｙｔＮｕｓ　ｃｈｌｌｅｎｓｊｓ　）およびベルミチル
ス　ブルブラタス（Ｐｅｒｕ■ｙｔｉｌｕｓｐｕｒｐｕ
ｒａｔｕｓ）よりなる群から選ばれるムラサキイガイの
足からの組織をホモゲナイズし、而して、この均質化は
不活性雰囲気の下で行ない：（ロ）生成したホモゲネー
トから固体相を分離し；（ハ）この固体相を酸溶液中で再びホモゲヅイズし、次
いで生成したホモゲネートから上澄液を分離し；（ニ）この上澄液を水性溶液に対して透析し−次いで（ホ）工程（二〕で生成された非透析フラクションに、
少なくとも１容量のアセトンまたは３容量のエタノール
を添加る、ことによって、このフラクションから接着性
タンパク質を沈殿させる、ことよりなる方法である。工
程（ホ）においては、メタノールまたはその他の溶剤を
使用る、ことができる。上記均質化工程（イ）において
はフェノール腺を予め分離る、必要はない。

発明の詳細な説明本発明の重合体状ペプチドは、中性または弱塩基性緩衝
剤中でトリプシンで処理る、ことによって、その単量体
状ヘプタペプチド形に解重合させることができる。

このようにして生成されたヘプタペプチドは、Ｃカラム
における逆相高圧液体クロマトグラフィにより精製る、
ことができ、次いで二官能性試薬、たとえばグルタルア
ルデヒドで処理る、ことにより、または結合性基、たと
えばアミノ酸、オリゴペプチドまたはその他の二官能性
スペーサーを介してカップリングさせることにより結合
させ、接着性重合体を形成る、ことができる。少なくと
も２００個のヘプタペプチド単位を含有る、、この生体
接着性ポリフェノール系タンパク質は非常に粘性の溶液
を生じるが、最良の接着性を示す。

般に、この接着性重合体は重合体約１０＄■／ｍｌを超
えない溶液中で保存る、ことが奨められる。

これは、さらに濃厚な溶液がゲル化る、傾向を示すから
である。また、この溶液は不活性気体、たとえば窒素雰
囲気の下に、または減圧下に保存る、ことが望ましい。

この重合体溶液は、ｐＨ３付近の酸溶液中に保持る、か
ぎり、非接着性であり、かつまた安定である。このｐｌ
（は、好ましくは酢酸緩衝液により保持る、。この重合
体溶液を接着剤として使用る、ためには、そのｐＨをほ
ぼ中性にまで、好ましくは酸溶液にアルカリ性緩衝剤を
添加る、ことによって、上昇させる必要があるだけであ
り、この中性にされた溶液を接着させる表面と相互に接
触させればよい。

本発明の接着性重合体は、たとえば下記の用途に使用る
、ことができる：（ａ）細胞のベトリ皿またはその他の固体支持体への接
着を達成る、ことができる。

（ｂ）医療および歯医療におけるいくつかの接着用途に
提供る、ことができる。医療用途には、裂けたあるいは
その他の様相で損傷した器管の修復、特に骨折、網膜剥
離および角膜剥離の治癒が含まれる。また、この接着剤
は避妊法として女性の卵管をブロックる、ために使用る
、ことができる。

歯医療用途には、むし歯の治療に、永久閉鎖剤として、
および歯根手術における接着剤としての使用が含まれる
。

（ｃ）本発明の接着剤は、たとえばＥＬＩＳＡ検定法に
おいて、抗原または抗体の担体への接着に使用る、こと
ができる。この用途においては、常用のプラスチック担
体壁に、この接着剤を塗布し、次いで抗原または抗体を
接着剤の上に置き、担体に接着させる。

（ｄ）工業的用途にも使用る、ことができる。これらの
用途には、マイクロエレクトロニクス部品のコーティン
グが含まれる。本発明の接着剤は腐蝕防止剤および導電
性接着剤として作用る、。これはこの生体接着剤が導電
性であることによる。

船舶工業において、この接着剤は海洋生物の生育および
腐蝕による汚染を防止る、ために、船体の塗布に使用る
、ことができる。

（ｅ）本発明の接着剤は、工業的バイオリアクターの構
築において、酵素および細菌をガラスピーズまたはその
他のプラスチック担体に不動化る、ことができる。

本発明の好ましいペプチドは、その置換基Ｘがそれぞれ
ヒドロキシル基であるもの、およびその置換５Ｒがメチ
ルエチル基であり、したがって、各単位のＣ末端から二
番目の残基がバリン残基であるものである。

本発明の接着性ペプチドの抽出に好適なムラサキイガイ
は、アウラコミア　エチル（Ａｕｌａｃｏｍｙａａｔｃ
ｒ）である。これは、このムラサキイガイが本発明に記
載のヘプタペプチドが単離されるポリフェノール系タン
パク質を産生ずることが見い出されたからである。さら
にまた、このムラサキイガイは接着性タンパク質を高収
率でもたらす。

Ｗａｉｔｅによって記載された方法（上記参照）では、
代表的に、たとえばミチルス　エダリス（ＭｙＬｉｌｕ
ｓ　ｅｄｕｌｉｓ）からのムラサキイガイの足またはフ
ェノール腺１００個当りで、彼の接着性タンパク質的２
〜３ｍｇが生成されているのに対し、本発明の方法では
、ムラサキイガイの足１００個当りで接着性タンパク質
的１５ｍｇにのぼる約５倍の塁でアウラコミア　エチル
の本発明の接着性タンパク質が生成される。

本発明の方法においては、痕跡量の重金属（たとえば、
使用しなければならない試薬のうちのかなりに、しばし
ば見い出される重金属）の存在でさえも、接着性ペプチ
ドの早過ぎる硬化を生じさせることができる。この問題
を克服る、ために、工程（イ）におけるホモゲネートに
、およびまた。

工程（ニ）における、ホウ酸ナトリウムに対る、透析媒
質中に、キレート剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸
を添加る、ことが望ましい。しかしながら、このキレー
ト剤は工程（ホ）における沈殿の前に、透析により除去
し、この沈殿に関与しないようにすべきである。また、
本発明の接着性ペプチドは大気中酸素に対して感受性で
あるので、工程（ハ）における再均質化に使用される溶
液中に、酸素捕獲剤を含有させることが望ましい。この
目的に奨励される捕獲剤は２−メルカプトエタノールで
ある。１回目の均質化に使用される溶液には、ムラサキ
イガイに天然に存在る、、トリプシン様活性体のいずれ
かによる、接着性ペプチドの分解を回避る、ために、ト
リプシン阻害剤を含有させることが望ましい。さらにま
た、ホウ酸ナトリウムに対る、透析に使用される水性溶
液中に界面活性剤を含有させると有利であることが見い
出された。適当な界面活性剤は市販されている。

このような界面活性剤は、ｒＴＲＩＴＯＮ　　Ｘ−１０
０」の商品名で販売されている。

本発明の方法は、３回の透析工程を包含る、ことができ
る。第１回の透析工程は酢酸の濃度を下げるための冷水
に対る、ものであり、その後０、ＩＭホウ酸ナトリウム
（＋その他の成分）に対る、第二回の透析を行なう。こ
の第２回の透析工程は、夾雑る、コラーゲンを沈殿させ
、ポリフェノール系タンパク質を溶液中に残すことから
、重要である。第三回の酢酸に対る、透析工程は、ホウ
酸ナトリウムおよびＥＤＴＡの大部分を除去し、かつま
たポリフェノール系タンパク質を含有る、溶液のｐＨを
低下させる。

本発明のペプチドは、上記記載において、特定のムラサ
キイガイからの抽出によって生成されているが、このよ
うなペプチドはまた、ペプチド合成技術の当業者に周知
の技術を使用して、それらの構成アミノ酸から合成る、
ことができることは勿論のことである。たとえば、単量
体状ヘプタペプチドを固体状態で合成し、次いで所望に
より、このヘプタペプチドを、すでに開示されている重
合技術のいずれかによって重合させる。

次例は本発明の方法の好適態様で使用される試薬、条件
および技術の詳細を例示る、だけの目的で示すものであ
る。

例アウロコミア　エチル（Ａｕｌｏｃｏａ＋ｙａ　ａｔｅ
ｒ）種のムラサキイガイをＣｈｉ　１ｅａｎ海岸の漁獲
物から入手し、各ムラサキイガイの足をその基部から切
り取り、液状窒素中に移す。この方法で２５０〜１００
０ｇの足を得る。本発明の方法では、時間がかかり、か
つまた実施が難しい、ムラサキイガイの足からのフェノ
ール腺の分離を予め行なう必要はない。従って、凍結し
た足１０ｇ−をｄａｒｉｎｇブレンダー内において窒素
雰囲気の下に、５０　ｓＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（
ｐＨ７，５）　、ＩＭ　　Ｎａｃｌ、２５−Ｍエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、５１Ｍエチレングリコ
ール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ
’　、Ｎ’　−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｇＭフェニルメ
チルスルホニルクロライド、１ｇＭシアン化カリウムお
よび１０１　Ｎ−エチルマレイミドよりなり、１ｍｌ当
り２０μｇの大豆トリプシン阻ｌＦ剤を含有る、溶液１
００ｍ１中で、４℃においてホモゲナイズる、。生成る
、ホモゲネートを３０００Ｇで１０分間、遠心処理し、
上澄液は粟る。この遠心分離物を上記した条件と同一の
条件の下であるが、０．９Ｍ酢酸、１０ｄ２−メルカプ
トエタノールおよび１１Ｍフェニルメチルスルホニル　
フルオライドよりなる溶液ｌ。

０ｍｌ中で再均質化る、。生成る、ホモゲネートを４℃
において、１０，０ＯＯＧで３０分間遠心処理し、遠心
分離物は棄て、上澄液（ポリフェノール系タンパク質を
含有る、）だけを採取る、。

この上澄液を冷蒸留水１００容量に対して４時間、次い
でＴＲＩＴＯＮ　　Ｘ−１００界面活性剤０．１％およ
び５１Ｍエチレンジアミン四酢酸を含有る、０、１Ｍホ
ウ酸ナナトリウム溶液ｐＨ８，７）１００容量に対して
、透析る、。非透析フラクションを５０００Ｇで１５分
間遠心処理し、得られた清明な上澄液を、０．９Ｍ酢酸
に対して４℃で４時間、再び透析る、。

このようにして得られた非透析フラクションを次いで、
１容量のアセトンと、あるいは３容量のエタノールと混
合し、０．０１％　ＴＲＩＴＯＮＸ−１００，０，１５
Ｍ　　ＨＣｊ！、１ｓＭエチレンジアミン四酢酸および
２５５Ｍ　　２−メルカプトエタノールを含有る、溶液
を生成る、成分をここに加える。生成した溶液を一２０
℃で一夜にわたり放置し、そこから沈殿したポリフェノ
ール系タンパク質を、４℃において、５，０ＯＯＧで１
０分間遠心処理る、ことにより分離る、。この遠心分離
物を少量の０．９Ｍ酢酸中に溶解し、適量づつ分離し、
窒素雰囲気の下に、プラスティック製管に封入して保存
る、。

さらに精製る、場合には、上記の濃厚フラクションを高
圧液体クロマトグラフィ用のカラムを使用し、ゲル透過
クロマトグラフィ処理る、。このクロマトグラフィはポ
リスチレン多ヒドロキシル化カラム（Ｓｈｉｓａｄｚｕ
製；　Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｘ、　　Ｓ　ＨＧ　−３ＯＷ、
　　７．　９ｖｘ嘗Ｘ２５Ｃ１＋ｍ）＋こおいて、３０
％アセトン、５％酢酸、１１Ｘエチレンジアミン四酢酸
および０．０２％セチルトリメチルアンモニウムブロマ
イドを含有る、溶剤混合物を使用し、１ｍ１Ｚ分の流速
で行なう。ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）
を含有る、フラクションを集め、前記したように、アセ
トンまたはエタノールで沈殿させ、０．９Ｎ酢酸に溶解
し、封鎖管内で窒素雰囲気の下に保存る、。

必要に応じて、ｖａｉｔｅ等により記載された方法（Ｂ
ｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　　２４　　：　　５　０
　１　０〜５　０　１　４　頁。

１９８５年）に従い、Ｃ−８カラム（Ｍｅｒｃｋからの
Ｌｌｃｈｒｏｓｏｒｂ　；　２５０　ａｍ　Ｘ　４　、
　５　ｍｍ）において、０．１％三フッ化酢酸中のアセ
トニトリルの薄い直線の勾配の溶出剤を使用し、逆相ク
ロマトグラフィによって、最終精製を行なう。

このようにして得られたポリフェノール系タンパク質の
構造を決定る、ために、このタンパク質の試料を、％ｌ
ａｉ　Ｌｅの前記米国特許箱４，５８５゜５８５号の例
２に記載の方法（この記載を引用してここに組入れる）
で、トリプシンで消化させる。

この消化により、ＧＬＹ、ＡＬＡ、ＤＯＰＡまたはＴＹ
ＲおよびＬＹＳまたはＨＹＬの共通アミノ酸組成を有る
、６種のヘプタペプチドの混合物が得られた。さらに、
この生成物中に、アミノ酸ＶＡＬ、ＩＬＥおよびＬＥυ
が見い出された。これらのペプチドを分解させ、Ｃ８カ
ラムで逆相高圧液体クロマトグラフィ処理により精製し
、次いでシークエンサーで分析した。この分析の結果は
、アウラコミア　エチル（Ａｕｌａｃｏｇｙａ　ａｔｅ
ｒ）から単離されたポリフェノール系タンパク質から単
離された、このヘプタペプチド混合物が下記の共通構造
を有る、ことを示した；（式中、置換基Ｘは、それぞれ独立して、水素原子また
はヒドロキシル基であり、置換基Ｒは、それぞれ、メチ
ルエチル、１−メチルプロピルまたは２−メチルプロピ
ル基であり、従って、このペプチドのＣ末端から二番目
の基はバリン、イソロイシンまたはロイシンである）。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、置換基Ｘは、それぞれ独立して、水素原子また
はヒドロキシル基であり、置換基Ｒは、それぞれメチル
エチル、１−メチルプロピルまたは２−メチルプロピル
基であり、従ってｎ単位のそれぞれのＣ末端から二番目
の基はバリン、イソロイシンまたはロイシンであり、そ
してｎは１〜約１０００の整数である）で示されるペプチド。
（２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、置換基Ｘは、それぞれ独立して、水素原子また
はヒドロキシル基であり、そして置換基Ｒはメチルエチ
ル、１−メチルプロピルまたは２−メチルプロピル基で
あり、従って、このペプチドのＣ末端から二番目の基は
バリン、イソロイシンまたはロイシンである）で示されるヘプタペプチド。
（３）置換基Ｘが、それぞれヒドロキシル基であり、そ
して置換基Ｒがメチルエチル基である、請求項２に記載
のヘプタペプチド。
（４）次式で示される反復単位： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、置換基Ｘは、それぞれ独立して、水素原子また
はヒドロキシル基であり、そして置換基Ｒは、それぞれ
メチルエチル、１−メチルプロピルまたは２−メチルプ
ロピル基であり、従ってこの反復単位のそれぞれのＣ末
端から二番目の基はバリン、イソロイシンまたはロイシ
ンである）の２個〜約１０００個よりなり、この反復単
位の隣接する２個の単位はペプチド結合、オリゴペプチ
ドまたは二官能性ペプチドカップリング剤により相互に
連結されている、ペプチド。
（５）二官能性ペプチドカップリング剤がグルタルアル
デヒドである、請求項４に記載のペプチド。
（６）接着性タンパク質の製造方法であって、イ）アウラコミアアテル（Ａｕｌａｃｏｍｙａ　ａｔｅ
ｒ）、コロミチルスコルス（Ｃｈｏｒｏｍｙｔｉｌｕｓ
　ｃｈｏｒｕｓ）、ミチルスキレンシス（Ｍｙｔｉｌｕ
ｓ　ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ）およびペルミチルスプルプラ
ツス（Ｐｅｒｕｍｙｔｉｌｕｓｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）
よりなる群から選ばれるムラサキイガイ（ｍｕｓｓｅｉ
）の足からの組織を、窒素雰囲気の下に、ホモゲナイズ
しロ）生成したホモゲネートから固体相を、遠心処理によ
り分離し、ハ）この固体相を酸溶液中で再びホモゲナイズし、次い
で生成したホモゲネートから上澄液を分離し、ニ）この上澄液をホウ酸ナトリウムの水溶液に対して透
析し、次いでホ）工程（ニ）で得られた非透析フラクションに少なく
とも１容量のアセトンまたは３容量のエタノールを加え
、このフラクションから接着性タンパク質を沈殿させる
、ことを特徴とする製造方法。
（７）工程（ニ）で使用する水溶液が界面活性剤を含有
する、請求項６に記載の製造方法。
（８）工程（イ）のホモゲネートに、および透析工程（
ニ）において、キレート剤を添加する、請求項６に記載
の製造方法。
（９）キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、請
求項８に記載の製造方法。
（１０）使用するムラサキイガイがアウラコミアアテル
（Ａｕｌａｃｏｍｙａ　ａｔｅｒ）である、請求項６に
記載の製造方法。