JPH07224098A - ヒト血液由来のインタフェロン生成物 - Google Patents

ヒト血液由来のインタフェロン生成物

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JPH07224098A
JPH07224098A JP6328671A JP32867194A JPH07224098A JP H07224098 A JPH07224098 A JP H07224098A JP 6328671 A JP6328671 A JP 6328671A JP 32867194 A JP32867194 A JP 32867194A JP H07224098 A JPH07224098 A JP H07224098A
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propanol
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Sidney Pestka
シドニイ・ペストカ
Menachem Rubinstein
メナヘム・ルビンシユタイン
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はインターフェロン感受性疾患に有効
なヒト血液由来のインターフェロン生成物を提供する。 【構成】 本発明は（ａ） ドデシル硫酸ナトリウムを
含まず、（ｂ） ウシ細胞ＭＤＢＫにて測定される０．
９×１０8 −４．０×１０8 単位／mg蛋白質の比活性値
およびヒト細胞系ＡＧ１７３２にて測定される２×１０
6 −４．０×１０8 単位／mg蛋白質の比活性値を有する
ことを特徴とするヒト血液由来のインターフェロン生成
物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】タンパク質の精製は長い間ペプチド化学に
おける大きな問題であった。これまで用いられてきた技
術としては、沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーおよ
びその他非常に多くの方法がある。天然に産出する、極
めて低濃度で生物学的試料中に存在する高分子量のタン
パク質を単離しようとする計画は、前述の技術を利用す
る多工程法であった。このような多くの場合、精製の後
段階において生成物のかなりのロスがあるので、極めて
大量の粗製出発物質を集め、そして処理しなくてはなら
ない。これには高い経費と通常多くの労力を要する。
【０００２】問題の１つの適当なケースはインターフェ
ロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）を単離および特徴づける
多数の試みの歴史である。アイザック（Ｉｓａａｃｓ）
およびリンデンマン（Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ）による最
初の発見以来、２０年にわたって全世界の研究者達はイ
ンターフェロンをそれが白血球型であろうとまた線維芽
細胞型であろうと、均質なペプチドとして、その特定の
生物学的または化学的性質を特徴づけ且つ同定できるの
に十分な量で単離しようとしたが、不成功に終った。ア
イザックおよびリンデンマンのインターフェロンを用い
る元の研究に関する米国特許第３６９９２２２号におい
て、活性物質の精製は硫酸アンモニウムの沈殿およびそ
れに引き続く透析に限定されている。このような方法は
比較的非特定的であり、こうしてそれによって得られる
生成物はなお極めて粗製状態である。
【０００３】インターフェロンを精製する多工程法は米
国特許第３４１４６５１号に開示されており、この多工
程法は非晶質アルミノ−シリケート上の選択的吸着、ヨ
ウ素またはチオシアネートの溶液を用いる溶離、さらに
ＨＣｌ水溶液、次いでＮａＯＨを用いる望まないタンパ
ク質の沈殿、水混和性溶媒、たとえばメタノール、エタ
ノールまたはアセトンを用いるインターフェロンの塩基
溶液からの沈殿、および最後に２−ジエチルアミノエチ
ル−セルロースのような陰イオン交換樹脂による再溶解
したインターフェロンのクロマトグラフィーを用いて、
その比活性がこの全プロセスにより６０００倍に高めら
れたと示されるインターフェロンを生成する。例示され
た特定のインターフェロンはヒヨコとサルのインターフ
ェロンであった。
【０００４】ほかの精製法は米国特許第３９７５３４４
号に教示されており、ここでは細胞培養の培地から誘導
された粗製の人の線維芽細胞のインターフェロン溶液が
区域密度勾配の超遠心分離によって精製されている。こ
の技術はセファデックス（Ｓｅｐｈｄｅｘ）Ｇ−１００
を用いる普通のカラムクロマトグラフィーで得られるよ
り高い収率および精製を与えることが示された。
【０００５】インターフェロンの精製および特性づけに
関する最近の科学文献は、次のように要約することがで
きる：Ｋｎｉｇｈｔ，Ｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３，５２０−３（１９７６）；
Ｔｏｅｒｍａｅ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５１４８１０−６（１９７６）；Ｂｒ
ｉｄｇｅｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．ｃｈｅ
ｍ，２５２，６５８５−７（１９７７）；ＤｅＭａｅｙ
ｅｒ−Ｇｕｉｇｎｏｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ２７１，６２２−５（１９７８）；Ｋａｗａｋｅ
ｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５３，５９８−６０２（１９７８）；Ｂｅｒｔｈｏｌ
ｄ，Ｗ．ａｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２５
３，５２０６−１１（１９７８）；Ｊａｎｋｏｗａｋ
ｉ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １
６，１１２４−３０（１９７５）；Ｄａｖｅｙ，Ｍ．
Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，
７６２０−５（１９７６）；Ｃｈａｄｈａ，Ｋ．Ｃ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７，１９６
−２００（１９７８）。
【０００６】上記の文献のいくつかはマウスまたは人の
インターフェロンを均質に精製したと述べているが、タ
ンパク質の均質性の古典的証明が与えられておらず、あ
るいは記載されている純粋といわれる化合物の性質は記
載されていない。タンパク質の精製に高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することは一般に技術
的に知られている。これらの参考書は特定的にタンパク
質の精製におけるイオン交換および大きさ排除型のカラ
ムを記載している。たとえば、Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．
Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｓｃｉ．
１４、３１６−２０（１９７６）およびＣｈａｎｇ、
Ｓ．−１１．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４
８，１８３９−４５（１９７６）参照。逆相（ｒｅｖｅ
ｒｓｅ ｐｈａｓｅ）分配クロマトグラフィーにおける
リクロソルブ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ）ＲＰ−１８（オ
クタデシル結合シリカ微粒子カラム）の使用は、β−エ
ンドルフィンのようなペプチドを精製するために成功し
たものである。［たとえば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，
Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ ７４，４９６９−７２（１９７
７）］。最後に、マウスのＥｈｒｌｉｃｈ腹水症の腫瘍
細胞からのインターフェロンの３種（分子量＝３３００
０、２６０００および２００００）の部分的特性づけ
は、Ｃａｂｒｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．ｃｈ
ｅｍ．２５４，３６８１−４（１９７９）に記載されて
いる。
【０００７】本発明は均質なタンパク質としてのヒト白
血球インタフェロンに関する。より詳細には、本発明は （ａ） ドデシル硫酸ナトリウムを含まず； （ｂ） 順相および／または逆相高速液体クロマトグラ
フィーにおいてヒト白血球インタフェロン活性に合致す
るピークを示し； （ｃ） 分子量約１６２００±１０００〜約２１０００
±１０００であり；ならびに （ｄ） 次の工程、 Ａ ヒト白血球インタフェロンを含む水溶液を、緩衝液
で平衡化した、シアノプロピル、シクロヘキシル、フェ
ニル、オクチル、またはオクタデシル基が結合した、シ
リカマトリクスカラムに、高速液体クロマトグラフィー
条件下に通してインタフェロンをカラムに吸着させ、そ
の後インタフェロンを増加する勾配の水性の水混和性溶
媒で溶離し、そしてインタフェロンを溶出液の選定フラ
クション中に高純度の状態で得、 Ｂ ヒト白血球インタフェロンの水溶液を、緩衝液で平
衡化した、シアノプロピルまたはグリセリル基が結合し
た、シリカマトリクスカラムに、高速液体クロマトグラ
フィー条件下に通してインタフェロンをカラムに吸着さ
せ、その後インタフェロンを減少する勾配の水性の水混
和性溶媒で溶離し、そしてインタフェロンを溶出液の選
定フラクション中に高純度の状態で得、および Ｃ 工程Ａ）を反復し、ならびに、所望により工程Ａ）
および／または工程Ｂ）を繰返すことにより最終的に均
質性を得る、を組合せることからなる方法により得るこ
とができる；均質な蛋白質としてのヒト白血球インタフ
ェロンに関する。
【０００８】本発明の均質なタンパク質としてのインタ
フェロンは、この医薬として重要な物質の化学特性づけ
を初めて可能にする純すいなインタフェロンを十分な量
で提供する新規製造方法により得られた。インタフェロ
ンの化学的特性づけを可能にしたことはこの物質の開発
における有意な進歩を表わす。なぜなら、これにより、
普通のペプチド合成法により、或いはインタフェロンア
ミノ酸配列に相当するＤＮＡを合成し、そしてこのよう
なＤＮＡを適当な有機体、好ましくはバクテリア中に、
ＤＮＡ−組換え技術により導入することによって、イン
タフェロンを合成できるからである。次いで、生ずる有
機体はインタフェロンを生成する能力を有し、これは醗
酵技術を応用して商業的なレベルで従来まれな化合物の
便利な源を提供するように規模を大きくすることができ
る。
【０００９】インタフェロンを均質なタンパク質として
製造する方法は、不純な状態のインタフェロンの水溶液
をシアノプロピル、シクロヘキシル、フェニル、オクチ
ル、オクタデシルまたはグリセリル基を結合した多孔質
シリカマトリックスの緩衝液で平衡化したカラムに、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の条件下に通し
てインターフェロンをカラム上に吸着させ、その後この
インタフェロンを増加する勾配または減少する勾配の水
性の水混和性溶媒で溶離し、そしてインタフェロンを溶
出液の選定フラクション中に高純度の状態で得ることか
らなる。
【００１０】インターフェロンを均質のタンパク質とし
て製造する方法の例としては、次の工程の組み合わせか
らなる方法をあげることができる： Ａ 不純な状態のヒト白血球インターフェロンの水溶液
を緩衝液で平衡化したオクチル基が結合したシリカのマ
トリックスのカラムに、高速液体クロマトグラフィー条
件下に通してインターフェロンをカラム上へ吸着させ、
その後インタフェロンをカラムから増加する勾配の水性
の緩衝した水混和性溶媒で溶離し、そしてインタフェロ
ンを溶出液の選定フラクション中に高純度の状態で得； Ｂ 工程Ａ）において得られる選ばれたインターフェロ
ンのフラクションを、緩衝液で平衡化したグリセリル基
が結合したシリカのマトリックスのカラムに高速液体ク
ロマトグラフィー条件下に通してインターフェロンをカ
ラム上へ吸着させ、その後インターフェロンをカラムか
ら減少する勾配の水性の緩衝した水混和性溶媒で溶離
し、そしてインターフェロンを明確な主ピークとして溶
出液の選定フラクション中に高純度の状態で得； Ｃ 工程Ｂにおいて得られる明確な主ピークの１つに相
当するインタフェロンの選定フラクションの緩衝溶液
を、緩衝液で平衡化したオクチル結合シリカのマトリッ
クスのカラムに、高速液体クロマトグラフィー条件下に
通してインタフェロンをカラム上へ吸着させ、その後イ
ンターフェロンをカラムから増加する勾配の水性の緩衝
した水混和性溶媒で溶離し、そしてインターフェロンを
単一の明確なピークとして溶出液の選定フラクション中
に均質なタンパク質の状態で得、そして、必要に応じ
て、工程Ｃの操作を反復して究極の均質性を達成する。
本発明はまたこの改良された方法によって得られる純す
いかつ均質なインタフェロン種に関する。
【００１１】この方法において使用するオクチルまたは
グリセリル変性多孔質シリカの微粒子のカラム（粒度＝
１０μ；平均孔大きさ＝１００Å）としては、アメリカ
合衆国ニューヨーク州エルムスフォードのＥＭラボラト
リーズ（ＥＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｅｌ
ｍｓｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）から、商標Ｌｉｃｈ
ｒｏｓｏｒｂ ＲＰ−８およびＬｉｃｈｒｅｓｏｒｂジ
オールとして入手できる商品が例示できる。同等のオク
チル変性多孔質カラム（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ Ｃ
−８として識別される）は、アメリカ合衆国ニュージャ
ージー州マールトのＥＳインダストリーズ（Ｅ．Ｓ．Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍａｒｌｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳ
Ａ）から入手することができる。前述のカラムを利用す
る便利な高圧液体クロマトグラフィー系は米国特許第４
１１６０４６号に記載されている。
【００１２】この方法を実施する場合、不純な高分子量
のペプチドの、好ましくは問題のタンパク質の性質と適
合する pＨにおける緩衝水溶液中の溶液をシリカのマト
リックスのカラムに通す。通常、この操作は加圧下に、
好ましくは約５０〜約５０００ｐｓｉ（３．４〜３４０
気圧）の範囲において実施する。タンパク質をカラムに
吸着させ、次いで水と混和性の溶媒の勾配を用いて選択
的方式で継続して溶離する。この目的に適した水混和性
の溶媒の例は、アルカノール、たとえばｎ−プロパノー
ル、２−プロパノール、エタノール、メタノール、ｔ−
ブタノールまたは環式エーテル、たとえばジオキサンで
ある。溶離液の分別は、フラクション・コレクターを使
用し、それ自体知られた方法により、各フラクション中
のタンパク質含量を、高感度で動作するペプチドモニタ
ーで同時に監視することによって達成する。この目的に
適当な系はＢｏｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．６７，４３８（１９７５）に開示されて
いる。また、ターゲット・タンパク質の存在を適当な生
物検定により監視することが好ましい。
【００１３】両方のカラム（「順相」分配クロマトグラ
フィーのためのカラムおよび逆相クロマトグラフィーの
ためのカラム）を用いるかどうか、そうする場合どの順
序を選ぶかについての決定は、大部分精製すべきタンパ
ク質の性質に依存する。たとえば、人の白血球のインタ
ーフェロンの特定の場合において、まず不純なインター
フェロン溶液を、 pＨ約７．５の緩衝液、望ましくは１
Ｍの酢酸ナトリウム−酢酸系を用いるオクチル結合シリ
カマトリクスカラムに通して分離し、増加する濃度勾配
のｎ−プロパノールで溶離し、次いで集めた活性なフラ
クションを０．１Ｍの酢酸ナトリウム中のグリセリル結
合シリカマトリックスカラムに通し、低下する濃度勾配
のｎ−プロパノールで溶離し、最後に分離したインター
フェロン成分をオクチル結合シリカマトリックスカラム
に、約４．０の緩衝液の pＨ、好ましくは１Ｍのピリジ
ン−２Ｍのギ酸系を用いて通し、そして増加する濃度勾
配のｎ−プロパノールで溶離することによって、最良の
結果が達成されることがわかった。
【００１４】このようにして、人の白血球のインターフ
ェロンの３つの別々の形態（α，βおよびγ）の各々は
均質なタンパク質を表わす別々の鋭いピークに分離する
ことができる。第２のオクチル結合シリカマトリックス
クロマトグラフィー工程に対する培地を用いて出発する
全体の精製は、６００００〜８００００倍であったが、
グリセロール結合シリカマトリックスのクロマトグラフ
ィー工程を通した累積収率は３０〜５０％の範囲であっ
た。人の白血球のインターフェロンの精製法の特定の態
様において、工程Ｂからの選定ピークフラクションを集
め、ｎ−プロパノールをｎ−ヘキサンで抽出して除去
し、そして微量のｎ−ヘキサンを工程Ｃへ進む前に水相
から除去する。
【００１５】この新規方法により得られる均質な人の白
血球のインターフェロンの種の各々は、前述のＨＰＬＣ
カラム上の鋭いピークと、２−メルカプトエタノールの
存在下のドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ4 ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動上の単一の狭い帯とを
示した。このゲルを抽出すると、タンパク質帯と一致す
る抗ウイルス活性の単一の鋭いピークが得られた。この
純粋なインターフェロンの種の比活性は、ＭＤＢＫの牛
の細胞で約０．９〜４．０×１０8 の範囲であり、そし
てＡＧ１７３２の人の細胞系で約２×１０6 〜４×１０
8 であることがわかった。各インターフェロン種の比活
性を表４に示す。この比活性は、ウイルスの細胞変性効
果に基づくインターフェロンの抗ウイルス活性の測定方
法であるＣＰＥ分析（細胞変性効果阻止検定）により測
定した。
【００１６】用いた細胞系はウシ細胞ＭＤＢＫおよびヒ
ト細胞ＡＧ１７３２であり、これらはイーグルの最小必
須培地ＭＥＭ−１０に単層培養されているものである。
用いたウイルスは、マウスＬ細胞の単層培養中に生育さ
せ、ＭＥＭ−１０中に凍結保存した水疱性口内炎ウイル
ス（ＶＳＶ）である。被験インターフェロンサンプルは
ＭＥＭ−１０を用いて希釈する。マイクロタイタープレ
ートにまずインターフェロンサンプルを注入し、ＭＥＭ
−１０中のＭＤＢＫおよびＡＧ１７３２細胞系を加え、
ＶＳＶを接種し、そして３７℃で１６時間アンキュベー
トする。ＶＳＶによる細胞変性を５０％抑制するインタ
ーフェロン濃度（ＩＤ50）を１Ｕ／mlとし、この値に希
釈倍率を乗じ、更に同時に測定した標準インターフェロ
ンのＩＤ50を示す濃度（Ｕ／ml）に基づく補正を行なっ
てインターフェロンサンプルの抗ウイルス活性、つまり
表４に示す比活性を得た。分子量は表４に見られるよう
に約１６０００〜２１０００の範囲であった。アミノ酸
分析の結果は表５に要約されている。
【００１７】インターフェロン類は抗ウイルス活性、制
癌活性、発育阻害活性および免疫抑制活性を示す。これ
らの活性、人のインターフェロンが１％より少ない比較
的粗製の製剤を用いて１〜１０×１０6 単位／日を用い
る臨床レベルにおいてさえ得られた。本発明の精製され
た均質なインターフェロン類は、従来用いられた粗製の
製剤と同じ方法で投与量を調整して望むレベルのインタ
ーフェロン単位を与えるようにして使用することができ
る。個々の種はそのまま使用することができ、或いはこ
のような種の２種以上の混合物を使用することもでき
る。このような混合物は、単離した種を望むように混合
することによって得ることができ、或いはインターフェ
ロンの幾つかの種が存在するが、非インターフェロンの
活性なタンパク質が存在しないところで精製を停止し、
組成物が均質なインターフェロンタンパク質の混合物で
あるようにすることによって、得ることができる。
【００１８】インターフェロンの産生の誘導、インター
フェロンの初期濃度およびゲル濾過を含むインターフェ
ロンの分別はこの分野でよく知られた方法を用いて達成
することができる。不純な状態のインターフェロンの水
溶液を生成するこれらの操作は本発明の一部分ではな
い。
【００１９】本発明をさらに以下の実施例により例証す
る。 実施例 １ 正常提供者からの均質なヒト白血球のインターフェロン Ａ インターフェロンの製造 カゼイン（１０mg／ml）を含有する血清不含最小必須培
地中で、正常の提供者の血液からのヒト白血球（１０7
細胞／ml）を、ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）
病ウイルス（１５血球凝集単位／ml）と１６時間培養す
ることによって、インターフェロンを産生させた。５０
００単位／mlの平均インターフェロンの力価を得た。用
いた操作はＭｏｇｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ Ａ，１９７７，３６９−３８１；Ｗｈｅｅｌ
ｏｃｋ，Ｅ．Ｆ．，Ｊ．Ｂａｃｔａｒｉｏｌ．９２，１
４１５−１４２１（１９６６）およびＣａｎｔｅｌｌ，
Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
２，６２５−６２８（１９７１）に報告された方法を多
少変更したものであった。
【００２０】インターフェロンの力価は、細胞変性効果
−阻止検定によって測定し、この検定は１６時間以内で
実施することができた。すべてのインターフェロンの力
価は参照単位／mlで表わし、これはナショナル・インス
シチュート・オブ・ヘルス［ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＵＳ
Ａ）］により提供されたヒト白血球インターフェロンの
参照標準品に対して補正した。
【００２１】Ｂ インターフェロンの濃度および初期の
分画 特に示さないかぎり、これらの操作は０〜４℃で実施し
た。培養の終りにおいて、細胞および残屑（ｄｅｂｒｉ
ｓ）を低速遠心分離（１５分、５００×ｇ）により除去
した。カゼインをＨＣｌで pＨ４．０に酸性化すること
によって沈殿した。２時間後、この混合物を遠心分離
（１０分、１２０００×ｇ）し、そしてペレットを廃棄
した。上層（１０リットル）を１５％（Ｗ／Ｖ）のトリ
クロロ酢酸に調整した。１時間後、沈殿を遠心分離（１
０分、１２０００×ｇ）により集め、そして５０mlの
０．１ＭのＮａＨＣＯ3 中に再溶解した。トリトンＸ−
１００（０．５ｇ）を加え、次いで酢酸（１５ml）をか
きまぜながら滴々加えた。この混合物を０℃で１時間、
次いで−２０℃で１６時間貯蔵した。次いでそれを解凍
し、遠心分離（１０分、１７０００×ｇ）した。ペレッ
トを廃棄し、上層を４％のトリクロロ酢酸に調整した。
１時間後、この混合物を遠心分離（１０分、１２０００
×ｇ）した。沈殿物を集め、そして５mlの０．５モルの
ＮａＨＣＯ3 中に再溶解した。
【００２２】Ｃ ゲル濾過 尿素（１．５ｇ）をインターフェロンの濃縮物に加え、
そしてこの溶液を４Ｍの尿素／０．１Ｍの酢酸ナトリウ
ム緩衝液で前もって平衡化したセファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ）Ｇ−１００の微細粒子のカラム（２．６×
９０cm）に通した。このカラムを４Ｍの尿素／０．１Ｍ
の酢酸ナトリウム、 pＨ７．５で、室温において０．５
ml／分の流速で溶離した。１２．５mlのフラクションを
集めた。インターフェロンの活性はフラクション１９−
２３中に溶出された。
【００２３】Ｄ 高速液体クロマトグラフィー セファデックスＧ−１００の試験のフラクション１９−
２３を合わせ、直接ポンプを経てリクロソルブ（Ｌｉｃ
ｈｒｏｓｏｒｂ）Ｒ．Ｐ−８カラム（１０μ、４．６×
２５０mm）に通した。このカラムは０．０１％（Ｖ／
Ｖ）のチオジグリコールを含有する１モルの酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ pＨ７．５）で前もって平衡化し、次いで
直線の濃度勾配のｎ−プロパノールで同一緩衝液中で
０．２５ml／分の流速で溶離した［１時間、０〜２０
％；３時間、２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）］。０．７５mlの
フラクションを集めた。インターフェロンはフラクショ
ン２３〜４０［２５〜３０％（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロパノ
ール］中に溶出された。
【００２４】インターフェロン活性のほとんどを含有す
るフラクション２７〜３３を合わせ、ｎ−プロパノール
を８０％（Ｖ／Ｖ）の最終濃度まで加え、そしてこの溶
液を、８０％（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロパノールを含有する
０．１Ｍの酢酸ナトリウムの溶液で前もって平衡化した
リクロソルブ・ジオールのカラム（１０μ、４．６×２
５０mm）にポンプを経て通した。次いでこのカラムを
０．１Ｍの酢酸ナトリウム中で４時間の直線の勾配の７
２〜５０％（Ｖ／Ｖ）のプロパノールで０．２５ml／分
の流速で溶離した。０．７５mlのフラクションを集め
た。インターフェロン活性は３つの明確な主ピークとし
て溶出され、それらのピークは製造ごとに定量的に変化
した。これらのピークは溶出の順序に従ってα、βおよ
びγと表示した。α−フラクションは６８％のｎ−プロ
パノールの濃度で、β−フラクションは６６．５％のｎ
−プロパノールで、γ−フラクションは６５．５％のｎ
−プロパノールで溶出された。インターフェロンの活性
の合計の回収率は８０％より高かった。
【００２５】各ピークからなるフラクションを別々に集
め、継続する工程を経て個々に精製した。ピークγは多
量で存在しそして他の成分からよく分割されるように思
われたので、それをさらに精製するために選んだ。ジオ
ールカラムからのピークγからなるフラクション５４−
５６を集め、そして１−プロパノールを等体積のヘキサ
ンで２回抽出することによって除去した。微量のヘキサ
ンを窒素流のもとに除去した。ピリジンとギ酸をそれぞ
れ１Ｍと２Ｍの最終濃度に加え、そしてこの溶液を１Ｍ
のピリジンおよび２Ｍのギ酸（ pＨ４．０）で前もって
平衡化したリクロソルブＲ．Ｐ−８カラム（１０μ；
４．６×２５０mm）に加える。このカラムを１Ｍのピリ
ジン／ホルメート緩衝液中で直線の２０〜４０％の１−
プロパノールの勾配で３時間以内で０．２ml／分の流速
で溶離した。０．６mlのフラクションを集めた。活性の
主ピークはタンパク質のピークと一致した。
【００２６】このピークからなるフラクション４５およ
び４６（３２％、Ｖ／Ｖ、プロパノール）を合わせ、同
様な条件で再クロマトグラフ処理した。インターフェロ
ンはフラクション３１（３２％、Ｖ／Ｖ、プロパノー
ル）中に溶出された（第１図参照）。このフラクション
の比活性は牛血清アルブミンに関して４×１０8 単位／
mgであると計算された。この物質（フラクション３１）
はさらに以下に述べるアミノ酸分析等に使用した。この
高速液体クロマトグラフィーのパターンを蛍光検出にか
けたところ、その再現性は顕著で、そのパターンの同一
性を証明することができた。
【００２７】精製の結果を表１に要約する。最初の培地
から第２のＲ．Ｐ−８カラムまでの全体の精製度は６０
０００〜８００００倍であった。工程１からジオール工
程を通じた累積収率は３０〜５０％の範囲であった。こ
の工程以降は、インターフェロンの３つのピークの各々
は別々に精製した。
【表１】
【００２８】各フラクション中に回収されたタンパク質
を測定するため、牛血清アルブミンを標準として使用し
た。工程１０の均質なピークのアミノ酸分析によって測
定した絶対比活性は２〜４×１０8 単位／mgであること
がわかった（明細書参照）。工程９は工程８のピークγ
について実施した。工程１０はいくつかの調製物の工程
９から集めた物質について実施した。ＮＤ＝測定せず。
【００２９】Ｅ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 インターフェロンの試料（１．５×１０5 単位）をＮａ
ＤｏｄＳＯ4 および２−メルカプトエタノール中にイン
キュベートし、次いでスラブ・ゲル（ｓｌａｂｇｅｌ）
に加えた。電気泳動後、クーマッシー・ブルー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）を用いて着色すると単一の鋭い
帯が得られた。見掛けの分子量は標準タンパク質と比較
して１７５００と推定された。次いでゲルを１mmの薄片
に切った。各薄片を０．４mlの０．５ＭのＮａＨＣＯ3
／０．１％のＮａＤｏｄＳＯ4中で均質化し、そしてイ
ンターフェロンの活性を測定した。抗ウイルス活性の単
一ピークが得られ、これは上記単一のタンパク質の帯と
一致した（第２図参照）。その他の活性ピークは観測さ
れなかった。
【００３０】Ｆ アミノ酸の分析 均質なヒト白血球インターフェロン（ピークγ）のアミ
ノ酸分析を、フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍ
ｉｎｅ）のアミノ酸分析器で、０．５〜１μｇの生来の
（ｎａｔｉｖｅ）インターフェロンおよびＳ−カルボキ
シメチル化したインターフェロンの資料について実施し
た。システイン／シスチンの比を測定するため、生来の
インターフェロンをカルボキシメチル化し、次いで６Ｍ
のＨＣｌ中で還元条件（０．１％のチオグリコール酸）
のもとで加水分解した。これらの条件下で、システイン
はＳ−カルボキシメチル化システインとして測定され、
これに対しシスチンは遊離のシステインとして測定され
る。
【００３１】アミノ酸の分析値を表２中に要約する。ア
ミノ酸含量に基づく比活性は２〜４×１０8 単位／mgで
あることがわかった。
【表２】 表 ２ ヒト白血球インターフェロンのアミノ酸組成 アミノ酸 残 基 Ａｓｘ １５．２±１．２ Ｔｈｒ* ７．５±０．５ Ｓｅｒ* ８．０±０．５ Ｇｌｘ ２４．０±０．６ Ｐｒｏ ６．３±０．３ Ｇｌｙ ５．５±０．５ Ａｌａ ８．２±０．２ Ｃｙｓ（合計） ３．３±０．７ １／２シスチン+ １．８±０．２ システイン+ １．５±０．５ Ｖａｌ ７．８±０．２ Ｍｅｔ ３．９±０．２ Ｉｌｅ ８．９±０．４ Ｌｅｕ ２１．８±１．３ Ｔｙｒ ５．１±０．２ Ｐｈｅ ９．１±０．３ Ｈｉｓ ３．３±０．４ Ｌｙｓ １１．６±０．５ Ａｒｇ ７．３±０．５ ＴｒＰ++ ０．７±０．１ ＊ 時間０に補正した。 ＋ 生来のインターフェロンのカルボキシメチル化後に
測定した。 ＋＋ ６モルのＨＣｌ／４％のチオグリコール酸中で加
水分解後に測定した。
【００３２】実施例 ２ 白血病患者の白血球からの均一なヒトの白血球のインタ
ーフェロン ロイコフォレシス（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によ
り、白血病患者（慢性骨髄性白血病、ＣＭＬ）の血液か
ら単離したヒトの白血球を、カゼイン含有血清不含培地
中でニューカッスル病ウイルスと培養することによって
インターフェロンを製造した。５０００〜４００００単
位／mlのインターフェロンの力価が普通の試験で得られ
た。精製操作は正常の血液（実施例１）からのインター
フェロンについて記載したものと同一であり、そしてト
リトンＸ−１００の存在下の０．５Ｍの酢酸による沈
殿、４Ｍの尿素中のセファデックスＧ−１００を用いる
ゲル濾過、 pＨ７．５におけるリクロソルブＲＰ−８を
用いるＨＰＬＣ、リクロソルブ・ジオールを用いるＨＰ
ＬＣおよび pＨ４．０におけるリクロソルブＲＰ−８を
用いるＨＰＬＣを包含していた。
【００３３】リクロソルブ・ジオールのカラムからのα
−、βおよびγ−ピークからなるフラクションを別々に
集め、そして継続する工程で個々に精製した。フラクシ
ョン４３−４６（α−ピーク）を集め、ｎ−プロパノー
ルを等体積のｎ−ヘキサンで２回抽出することによって
除去した。微量のヘキサンを窒素流のもとで除去した。
ピリジンとギ酸をそれぞれ１Ｍと２Ｍの最終濃度に加
え、この溶液を１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸（ pＨ４．
０）で前もって平衡化したリクロソルブＲＰ−８カラム
（１０μ、４．６×２５０mm）に通し、このカラムを１
Ｍのピリジンホルメート緩衝液中で直線の２０〜４０％
（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールの勾配で３時間以内に０．
２ml／分の流速で溶離した。０．６mlのフラクションを
集めた。インターフェロンの活性を３１〜３５％（Ｖ／
Ｖ）ｎ−プロパノールの範囲の広いピークとして溶離し
た。これらのフラクションを合わせ、同一条件下に再ク
ロマトグラフ処理した。インターフェロンの活性は３１
％および３２％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールにおいて２
つの主ピーク（α1 およびα2 ）中に溶出された。小量
の成分は３４％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールにより溶出
された。
【００３４】リクロソルブ・ジオールのカラムからのフ
ラクション４７〜５０（ピークβ）を集め、ピークαに
ついて前述したように処理し、リクロソルブＲＰ−８で
クロマトグラフ処理した。インターフェロンの活性は２
つの主ピーク：３２％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールにお
いてβ2 および３４％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールにお
いてβ3 中に溶出された。この場合、再クロマトグラフ
処理は不必要であった。いくつかの製造において、３１
％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで溶出されるβ 1 と表示
するピークが観測された。リクロソルブ・ジオールのカ
ラムからのフラクション５２−５４（ピークγ）を集
め、そしてピークαについて前述したように処理し、リ
クロソルブＲＰ−８でクロマトグラフ処理した。インタ
ーフェロン活性は５つの主ピーク、すなわち：γ1 （３
１％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ2 （３２％ｎ−プ
ロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ3 （３４％ｎ−プロパノー
ル、Ｖ／Ｖ）、γ4 （３５％ｎ−プロパノール、Ｖ／
Ｖ）、およびγ5 （３５．５％ｎ−プロパノール、Ｖ／
Ｖ）中に溶出された。この場合、再クロマトグラフ処理
は不必要であった。
【００３５】インターフェロンの個々の種を得た精製の
結果を表３に要約する。
【表３】
【００３６】種α2 およびβ2 はリクロソルブ・ジオー
ルのカラムの溶出特性によってさらに区別される：α2
は６８％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで、そしてβ2 は
６６．５％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで、それぞれ溶
出される。インターフェロン種の資料（１．５×１０5
単位）をＮａＤｏｄＳＯ4 および２−メルカプトエタノ
ール中にインキュベートし、次いでスラブ・ゲルに加え
た。電気泳動後、ピークα1 ，α2 ，β2 ，γ1 ，γ2
およびγ4 は単一の帯を与えたが、ピークβ3 ，γ3 お
よびγ5 は２つの帯を与えた。見掛けの分子量はすべて
１６０００〜１８０００の範囲に入るが、ただしβ3 は
１６５００と２１０００の帯を与え、そしてγ4 は２１
０００の帯を与えた（表４参照）。
【表４】
【００３７】精製したヒト白血球インターフェロンのフ
ラクションのアミノ酸分析は、フルオレスカミン（ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）アミノ酸分析器を用い０．５
〜１μｇのインターフェロンの試料について実施した。
加水分解を６ＮのＨＣｌ中で還元条件（０．１％のチオ
グリコール酸）下に行った。分析の結果を表５に要約す
る。
【００３８】この方法は感受性のヒトリンパダウデイセ
ルライン（バーキットリンパ腫細胞）に対するインター
フェロン発育阻害作用を測定するものである。同発育阻
害作用は、１〜２×１０5 ダウデイ細胞／mlにインター
フェロンを加え、３７℃で３日間培養後、細胞数を測定
し、無処理培養中の細胞数とインターフェロン処理培養
物中の細胞数とを比較して細胞数減少を示すものを＋と
した。
【表５】
【００３９】精製したヒトの白血球のインターフェロン
のいろいろな種（３００ピコモル、６μｇ）を重炭酸ナ
トリウムの水溶液（５０ｍＭ、 pＨ８．５、５０μｌ）
中に溶かした。トリプシン（２μｌのＨＣｌ、 pＨ３、
中の０．１μｇ）を加え、この混合物を３７℃で１４時
間培養した。酢酸（５μｌ）を加え、この混合物をリク
ロソルブＲＰ−８カラム（１０μの粒度、４．６×２５
０mm）に通した。このカラムを０．５ml／分において１
時間０．１Ｍのギ酸／０．０３Ｍのピリジン緩衝液（ p
Ｈ３）中で０〜４０％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールの直
線の勾配を用いて溶離した。ペプチドをフルオレスカミ
ン監視系により検知した。結果は表６に記載されてお
り、そして％ｎ−プロパノールおよびピークの相対大き
さ（Ｓ＝小、Ｍ＝中、Ｌ＝大）で表わされている。
【表６】 表 ６ 人の白血球のインターフェロンのトリプシンペプチド 種 溶出位置（％ｈ−プロパノール） α1 ３Ｌ、４Ｌ、 4.2Ｍ、11.5Ｍ、12.5Ｓ、14.5Ｍ、16Ｓ、18Ｍ、 20Ｓ、21Ｓ、22.5Ｓ、29Ｍ α2 ３Ｌ、４Ｌ、 4.2Ｍ、11.5Ｍ、12.5Ｓ、14.5Ｍ、16Ｓ、18Ｍ、 27Ｓ、19Ｍ β2 ３Ｌ、４Ｌ、 4.2Ｍ、11.5Ｍ、12.5Ｓ、14.5Ｍ、16Ｓ、 17.5Ｓ、18Ｍ、29Ｍ β3 ３Ｌ、４Ｌ、 4.2Ｍ、 4.5Ｓ、10Ｍ、12.5Ｓ、14Ｓ、14.5Ｍ、 16Ｓ、18Ｌ、19.5Ｍ、５Ｍ、27Ｍ、32Ｍ γ1 ３Ｌ、４Ｌ、 4.2Ｍ、 4.5Ｓ、５Ｓ、 6.5Ｓ、11.5Ｓ、12.5Ｓ、 14.5Ｍ、16Ｓ、17.5Ｍ、18Ｍ、29Ｍ γ2 ３Ｌ、４Ｌ、 4.2Ｍ、 4.5Ｓ、５Ｓ、11.5Ｓ、12.5Ｓ、14.5Ｓ、 16Ｓ、18Ｌ、29Ｍ γ3 ３Ｍ、４Ｍ、 4.2Ｍ、11.5Ｍ、12.5Ｓ、13.5Ｓ、14.5Ｍ、 16Ｓ、18Ｌ、20Ｓ、32Ｍ γ5 ３Ｌ、４Ｌ、 4.2Ｍ、 4.5Ｍ、７Ｓ、7.5 Ｓ、10Ｓ、11.5Ｌ 12.5Ｓ、14Ｓ、14.5Ｍ、16Ｓ、18Ｌ、24.5Ｓ、25.5Ｓ、 32Ｓ
【００４０】精製したヒト白血球インターフェロンの種
を、アミノ糖を５０〜１００ピコモルのレベルで同定で
きるアミノ糖分析に付した。すべての場合において、グ
ルコースアミンおよびガラクトース／マンノースアミン
は１残基／分子より小であった。ほとんどの場合におい
て、アミノ糖の近くに溶出される多くの小さなペプチド
がこの分析をさまたげた。こうして、アミノ糖に割当て
られたピークでさえも少なくともこの一部はペプチドに
よるものでありうる。
【００４１】最後に、逆加水分解（ｂａｃｋ ｈｙｄｒ
ｏｌｙｓｉｓ）およびフルオレスカミンを用いるアミノ
酸分析を含むエドマン（Ｅｄｍａｎ）法により１ナノモ
ルの純粋なγ2 インターフェロンの配列を決定する試み
は、サイクル１および２についてアミノ酸を与えなかっ
た。１００ピコモルの純粋なγ2 のヒト白血球のインタ
ーフェロンをロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノ
ペプチダーゼＭで３７℃で２０時間処理したが、生物学
的活性は影響を受けず、そしていかなるアミノ酸も反応
液中に検出されなかった。誘導培地（最小必須培地中の
白血球およびニューカッスル病ウイルス）の上清をアミ
ノペプチダーゼで処理しても、インターフェロンの活性
の損失はみられなかった。このことはインターフェロン
分子は精製前にさえブロックされたＮＨ2 末端を有する
ことを示す。対照として粗製インターフェロンならびに
純粋なインターフェロンおよびインシュリンのβ−鎖を
アミノペプチダーゼＭと一緒にインキュベートした。イ
ンシュリンはアミノ酸の放出によってわかるように部分
的に消化されたが、インターフェロン活性の損失は観測
されなかった。
【００４２】実施例 ３ （ａ） ２×１０8 単位／mgの比活性をもつ均質なヒト
の白血球のインターフェロンの合計で３mgを、５％の正
常な人の血清アルブミンの２５ml中に溶かした。この溶
液を細菌学的フィルターに通し、濾過した溶液を無菌的
に１００個の小びんに分割して入れた。各小びんは、非
経口投与に適した６×１０6単位の純粋なインターフェ
ロンを含有した。小びんは使用前冷蔵（−２０℃）する
ことが好ましい。
【００４３】（ｂ） 各々がほぼ自然に得られる比率で
存在する、１．５mgの集めた均質なインターフェロンの
種α1 ，α2 ，β2 ，γ1 およびγ2 を含有し、この貯
蔵した混合物が約２×１０8 単位／mgの比活性を有し、
そしてさらに１００mgの正常なヒト血清アルブミンを含
有する水溶液を細菌学的フィルターに通し、そして濾過
した溶液を無菌的に１００個の小びんに分割して入れ
た。各小びんは約３×１０6 単位の純粋な集めたインタ
ーフェロンと１mgのヒト血清アルブミンを含有するであ
ろう。非経口投与に適したインターフェロンを含有する
小びんは使用前冷蔵（−２０℃）することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト白血球インターフェロン活性に合致するピ
ークを示す本発明のヒト白血球インターフェロンの高速
液体クロマトグラフィーである。
【図２】本発明のヒト白血球インターフェロンが単一の
バンドを示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/21 ＡＤＹ // Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｆ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＹ (72)発明者 メナヘム・ルビンシユタイン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州・パサ イツク ハイ ストリート 266

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ドデシル硫酸ナトリウムを含ま
    ず、 （ｂ）ウシ細胞ＭＤＢＫにて測定される０．９×１０8
    −４．０×１０8 単位／mg蛋白質の比活性値およびヒト
    細胞系ＡＧ１７３２にて測定される２×１０6−４．０
    ×１０8 単位／mg蛋白質の比活性値を有することを特徴
    とするヒト血液由来のインタフェロン生成物。
JP6328671A 1978-11-24 1994-12-28 ヒト血液由来のインタフェロン生成物 Pending JPH07224098A (ja)

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US963257 1978-11-24
US6237479A 1979-07-31 1979-07-31
US062374 1979-07-31
US7771079A 1979-09-21 1979-09-21
US077710 1979-09-21

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DE (1) DE2947134A1 (ja)
DK (1) DK161048C (ja)
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