FI69476C

FI69476C - Foerfarande foer rening av maenniskans leukocyt-interferon

Info

Publication number: FI69476C
Application number: FI793649A
Authority: FI
Inventors: Sidney Pestka; Menachem Rubinstein
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-11-21
Publication date: 1986-02-10
Also published as: SE454276B; FI69476B; PT70495A; JPH07224098A; IN150740B; AU535936B2; NO793819L; KR830000910A; CH654843A5; BE880201A; IL58759A0; IT7927524A0; NZ192201A; US4289690A; AU1586683A; IE792247L; GB2037296B; LU81918A1; CA1129409A; SE7909721L

Description

l*AÄr*l KUULUTUSJULKAISU

B 11 UTLÄG G NIN G SSKRIFT 6 9476 • C (45) Patentti Ή;.·5'· -.--tty ^ ^ (51) Kv.ik.*/lnt.CI.* C 07 K 15/26, A 61 K <»5/02 SUOMI —FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansökning 793649 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 21.11.79 (Fl) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 21.11,79 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 25.05*80

Patentti- ja rekisterihallitus /44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. — 31.10.85

Patent- och registerstyrelsen V ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prlorltet 2<». 1 1 . 78 , 31.07.79, 21.09.79 USA (US) 963257, 6237<*, 77710 (71) F. Hoffmann-La Roche δ Co. Aktiengesel1schaft, Basel, Sveitsi-Schweiz(CH) (72) Sidney Pestka, North Caldwell, New Jersey, Menachem Rubinstein, Passaic, New Jersey, USA(US) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä ihmisen 1eukosyytti-interferonin puhdistamiseksi - Förfarande för rening av människans 1eukocyt-interferon

Proteiinin puhdistus on ollut kauan ongelma peptidi-kemiassa. Tähän tarkoitukseen käytetyt menetelmät käsittävät saostamisen, geelisuodatuksen, ioninvaihtokromatografiän, geelisähköforeesin, affiniteettikromatografiän ja monia muita. Menetelmät luonnossa esiintyvien, suurmolekyylisten proteiinien, joita biologisessa aineksessa on äärimmäisen pieninä pitoisuuksina, eristämiseksi käsittävät edellä mainittuja menettelytapoja. Monissa tapauksissa täytyy käyttää ja käsitellä erittäin suuria määriä raaka-ainetta ottaen huomioon suuret häviöt koko prosessin aikana. Tästä johtuu, että puhdistusmenetelmät tällaisia proteiineja varten ovat erittäin työläitä ja kalliita. Hyvän esimerkin muodostavat tässä suhteessa erilaiset yritykset interferonin eristämiseksi ja karakte-risoimiseksi. Siitä lähtien, kun Isaacs ja Lindenmann vuonna 1957 löysivät interferonin, on tämä proteiini,sekä valkosoluista että fibroblasteista saatu, menestyksellisesti vastustanut tutkijoiden koko maailmassa kahden vuosikymmenen aikana tekemiä yrityksiä sen eristämiseksi homogeenisena peptidinä sellaisissa määrissä, jotka 2 69476 sallivat sen spesifisten biologisten ja kemiallisten ominaisuuksien karakterisoinnin ja määrittämisen.

US-patenttijulkaisussa 3 699 222, jonka kohteena ovat Isaacs'in ja Lindenmann'in ensimmäiset interferonitutkimukset, käsittää aktiivisen aineksen puhdistus ainoastaan ammoniumsulfaat-tisaostuksen ja sitä seuraavan dialyysin. Koska tällainen menetelmä on suhteellisen epäspesifinen, on saatu tuote vielä erittäin epäpuhdas .

US-patenttijulkaisussa 3 414 651 kuvataan interferonin puhdistamiseksi monivaihemenetelmä, joka käsittää seuraavat vaiheet: selektiivisen adsorption aluminiumoksidi-silikaatilla, eluoinnin jodi- tai tiosyanaattiliuoksella, ei-toivottujen proteiinien edelleen saostamisen vesipitoisella HCl:llä ja vesipitoisella NaOH:lla, interferonin saostamisen veden kanssa sekoittuvan liuottimen, kuten metanolin, etanolin tai asetonin avulla ja lopuksi uudelleen liuotetun interferonin kromatografoinnin ioninvaihtohartsilla, kuten 2-dietyyliaminoetyyli-selluloosalla. Tällä puhdistusmenetelmällä voitiin interferonin spesifinen aktiivisuus nostaa n. kertoimeen 6000. Spesifisinä interferoneina mainitaan tässä US-patentissa kananpoikasten ja apinoiden interferoni.

Vielä eräs puhdistusmenetelmä kuvataan US-patenttijulkaisussa 3 975 344, jonka mukaisesti puhdistettiin puhdistamaton ihmisen fibroblastien interferoni tiheysgradientti-ultrasentri-fugointimenetelmällä. Esitettiin, että tämän menetelmän mukaisesti saavutetaan suurempi saanto ja puhtaus kuin menetelmällä, jossa käytetään pylväskromatografiaa Sephadex G-100:lla.

Seuraavassa esitetyt julkaisut käsittävät samoin interferonin puhdistusta ja karakterisointia:

Kningth. E.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_3, 520-3 (1976); Törmä, E.T. et ai., J. Biol. Chem. 251, 4810-6 (1976);

Bridgen, P.J. et ai., J. Biol. Chem. 252, 6585-7 (1977);

DeMaeyer-Guignard, J. et ai., Nature 271, 622-5 (1978);

Kawakita, M. et ai., J. Biol. Chem. 253, 598-602 (1978);

Berthold, W. et ai., J. Biol. Chem. 253, 5206-11 (1978);

Jankowski, W. J. et ai., J. Virology _16, 1124-30 (1975); 3 69476

Davey M.W. et ai., J. Biol. Chem. 251, 7620-5 (1976);

Chadha, K.C. et al., Biochemistry 1_7, 196-200 (1978).

Vaikka monissa edellä mainituista julkaisuista väitetään, että hiiren tai ihmisen interferonia voitiin puhdistaa homogeenisuuteen asti, ei ole esitetty mitään proteiinien homogeenisuuden klassista osoitustapaa eikä liioin kuvattu puhtaaksi luultujen yhdisteiden ominaisuuksia.

Suurpaine-nestekromatografiän (HPLC) käyttö proteiinien puhdistukseen on ammattimaa!lmassa yleisesti tunnettu, jolloin kuvataan erityisesti ioninvaihto- ja erotus-kromatografiaa /ks. esim. Regier, F.E. et ai., J. Chromatog. Sei. 14, 316-20 (1976) ja Chang. S.-H. et ai., Anal. Chem. 48, 1839-45 (1976)/.

Käänteisfaasi-kromatografiässä käytettiin esim. Lichrosorb RP-18 (pylväitä, joissa on oktadekyyli-modifioitua SiC^) menestyksellisesti peptidien, kuten ft -endorfiinin, puhdistukseen /ks. esim. Rubinstein, M. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 74, 4969-72 (1977)/.

Lopuksi on Cabrer, B. et ai., J. Biol. Chem. 254, 3681-4 (1979) kuvannut hiirien Ehrlich Ascites-kasvainsoluista saatujen kolmen interferonilajin (MW = 33'000, 261000 ja 20'000) osittaista karakterisointia.

Keksinnön kohteena on parannettu menetelmä ihmisen leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi, jolloin saadaan hyvin liukeneva tuote hyvillä saannoilla preparatiivisessa mittakaavassa.

Menetelmälle on tunnusomaista, että epäpuhtaan proteiinin vesipitoinen liuos viedään puskurilla tasapainoitetun pylvään läpi, joka pohjautuu syaanipropyyli-, sykloheksyyli-, fenyyli-, oktyyli-, oktadekyyli- tai glyseryyliryhmillä modifioituun huokoiseen SiC^-matriisiin, HPLC-olosuhteissa, jolloin proteiini ensin adsorboidaan ja sitten eluoidaan veden kanssa sekoittuvan liuottimen nousevalla tai laskevalla gradientilla, niin että se lopuksi eluaatin tietyissä jakeissa saadaan puhtaammassa muodossa.

Nämä pylväät, joita voidaan käyttää peräkkäin ja eri olosuhteissa mitä pH:hon ja orgaanisiin liuottimiin tulee, tarjoavat mahdollisuuden puhdistaa interferonia, jota luonnon aineksessa esiin-äärimmäisen pienissä määrissä, homogeenisuuteen asti.

69476

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa keksintö käsittää menetelmän ihmisen leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi homogeeniseksi tuotteeksi ja vieläpä määrissä, jotka ovat riittäviä tämän lääketieteellisesti arvokkaan aineen tarkan karakterisoinnin tekemiseksi mahdolliseksi ensimmäistä kertaa. Mahdollisuus karakterisoida interferoni kemiallisesti muodostaa huomattavan edistysaskeleen tämän aineen valmistuksessa, koska tämä on edellytys aineen syntetisoimiseksi, tapahtuipa se sitten tavanomaisilla peptidisynteeseillä, tai geenimaninuloinnilla käyttäen apuna sopivia organismeja, edullisesti bakteereita.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen leukosyytti-interferonin valmistamiseksi homogeenisena proteiinina on tunnusomaista, että A) epäpuhtaassa tilassa olevan ihmisen leukosyytti-interferonin vesipitoinen liuos HPLC-olosuhteissa viedään puskurilla tasapainotetun pylvään läpi, jossa on oktyyliryhmillä modifioitu SiC^-mat-riisi, jolloin interferoni ensin adsorboituu ja sitten eluoidaan puskurissa olevan veden kanssa sekoittuvan liuottimen nousevalla gradientilla, niin että se eluaatin tietyissä jakeissa saadaan puhtaammassa muodossa; B) nämä vaiheessa A) saadut tietyt jakeet viedään puskurilla tasapainoitetun pylvään läpi, jossa on glyseryyli-ryhmillä modifioitu Si02_matriisi, jolloin interferoni ensin adsorboituu ja sitten eluoidaan puskurissa olevan veden kanssa sekoittuvan liuoksen laskevalla gradientilla, niin että se selvissä päähuipuis-sa tietyissä eluaatin jakeissa saadaan puhtaammassa muodossa; C) Nämä vaiheessa B) saadut jakeet, jotka vastaavat selvää päähuippua, HPLC-olosuhteissa viedään puskurilla tasapainoitetun pylvään läpi, jossa on oktyyli-ryhmillä modifioitu SiO^-matriisi, jolloin interferoni ensin adsorboituu ja sitten eluoidaan veden kanssa sekoittuvan liuottimen ja vesipitoisen puskurin seoksella, niin että se saadaan yhdessä ainoassa, selvässä huipussa eluaatin tietyissä jakeissa homogeenisena proteiinina ja mahdollisesti toistetaan vaihe C) tuotteen äärimmäiseen puhtauteen pääsemiseksi.

HPLC-pylväät, jotka pohjautuvat oktyyli- tai glyseryyli-ryhmillä modifioituun huokoiseen SiC^-matriisiin (osaskoko = 10 yu keskimääräinen huokoskoko = 100 A) ja joita käytetään tämän keksinnön

II

5 69476 toteutuksessa, ovat kauppatuotteita, joita tuottavat esim. EM Laboratories of Elmsford, N.Y. USA, kauppanimellä Lichrosorb RP-8 ja Lichrosorb-Diol. Ekvivalenttisia oktyylimodifioituja huokoisia Si02~pylväitä (nimeltään Chromegabond C-8) tuottaa E.S. Industries, Marlton, N.J., USA).

Sopiva HPLC-systeemi, jossa edellä mainittuja pylväitä voidaan käyttää, on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 116 046.

Keksinnön mukaisesti viedään epäpuhtaan interferonin liuos, edullisesti vesipitoisen puskurin läsnäollessa ko. proteiinille sopivassa pH:ssa Si02~pylvään läpi. Normaalisti tämä tapahtuu paineen alaisena, edullisesti välillä n. 50-5000 psi (3,4-340 atm). Pylväsnäytteelle adsorboitunut proteiini eluoidaan sitten vaiheittain ja selektiivisesti käyttäen veden kanssa sekoittuvan liuottimen gradienttia. Tähän tarkoitukseen sopivia liuottimia ovat esim. alkanolit, kuten n-propanoli, 2-propanoli, etanoli, metanoli, tert.-butanoli. Eluaatin fraktiointi tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin yksittäisten jakeiden interferonipitoisuus määritetään hyvin herkillä monitoreilla. Erästä tähän tarkoitukseen sopivaa systeemiä kuvaa Bohlen et ai., Anal. Biochem. 67, 438 (1975). On myös suositeltavaa tarkkailla interferonin läsnäoloa sopivalla biomäärityksellä.

Sen ratkaiseminen, kumpaa kahdesta pylvästyypistä (pylvästä normaalia fraktiokromatografiaa varten vai pylvästä käänteisfaasi-kromatografiaa varten) ja missä järjestyksessä pylväitä käytetään, riippuu pitkälti puhdistettavan proteiinin luonteesta. Havaittiin, että ihmisen valkosolujen interferonin ollessa kyseessä parhaat tulokset saavutetaan, kun epäpuhdas interferoni-liuos ensin viedään pylvään, jossa on oktyyli-ryhmillä modifioitu SiC^-matriisi (käänteisfaasi-kromatografia) läpi käyttäen puskuria, jonka pH on n. 7,5 (edullisesti 1 M natriumasetaatti/etikkahappo) ja eluoidaan nousevalla n-propanoli-gradientilla, viedään sitten kootut aktiiviset jakeet pylvään läpi, jossa on glyseryyli-ryhmillä modifioitu SiC^-matriisi 0,1 M natriumasetaatti-puskurissa ja eluoidaan laskevalla n-propanoli-gradientilla ja lopuksi viedään erotetut in-terferonikomponentit pylvääseen, jossa on oktyyli-ryhmillä modifioitu SiC^-matriisi käyttäen puskuria, jonka pH on n. 4,0, edul- 6 69476 lisesti IM pyridiini/2M muurahaishappoa, ja eluoidaan nousevalla n-propanoligradientilla. Tällä tavalla voidaan jokainen kolmesta erotetusta ihmisen valkosolu-interferonista , ja)' ) edelleen erottaa, jolloin kromatogrammissa saadaan terävästi toisistaan erilliset huiput, jotka kuvaavat näitä homogeenisia proteiineja. Koko puhdistusmenetelmällä lähtien inkubointiväliaineesta kroma-tografiaan asti toisella oktyyliryhmällä modifioidulla Si02-mat-riisilla saatiin puhtausasteen nousun kertoimeksi 60000-80000.

Menetelmän eräässä erikoissuoritusmuodossa ihmisen valko-soluinterferonin puhdistamiseksi yhdistetään vaiheessa B) saadut jakeet, jotka vastaavat päähuippuja, uutetaan n-heksaanilla n-pro-panolin poistamiseksi ja jäljelle jäänyt n-heksaani poistetaan ennen vaiheen C toteuttamista.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuille homogeenisille ihmisen valkosolu-interferonilajeille on tunnusomaista terävä huippu edellä mainituilla HPLC-pylväillä sekä yksi ainoa kapea nauha polyakryyliamidigeelisähköforeesissa natriumdodekyyli-sulfaatilla (SDS-PAGE) 2-merkaptoetanolin läsnäollessa. Geelin uutto antoi yhden ainoan virusvastaisen aktiivisuuden terävän huipun, joka oli yhtäpitävä proteiininauhan kanssa. Puhtaiden interferoni-lajien spesifiset aktiivisuudet ovat väliltä n.

g 2,6-4,0 x 10 yksikköä/mg MDBK-solujen kanssa (nautaeläinten epi- g teelisten munuaissolujen kanssa) ja väliltä 1,5-4 x 10 yksikköä/ mg ihmisen solukannan Agl732 kanssa. Molekyylipainot olivat väliltä n. 16.000-21.000 (vrt. taulukko 4, sivu 22). Aminohappo-analyysin tulokset on koottu taulukkoon 5 (sivu 24).

Interferoneilla on virusvastainen, kasvainvastainen, kasvua estävä ja hylkimistä vastustava vaikutus. Nämä vaikutukset voitiin todeta jopa kliinisessä mittakaavassa antamalla 1-10 x 10^ yksik-köä/päivä suhteellisen epäpuhtaita valmisteita, jotka sisälsivät vähemmän kuin 1 % ihmis-interferonia. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä puhdistettuja, homogeenisiä interferoni-lajeja voidaan käyttää samalla tavalla kuin ennestään tunnettuja interferoni-valmisteita sovittamalla annostus saavutetun puhtausasteen mukaan. Yksittäisiä interferoni-lajeja voidaan antaa yksinään tai seoksina keskenään. Tälläisia seoksia voidaan saada joko sekoittamalla eristetyt lajit tai keskeyttämällä puhdistusmene 69476 telmä kohdassa, jossa läsnä on useampia interferoni-lajeja mutta ei lainkaan interferoni-inaktiivisia proteiineja.

Interferoni-tuotannon indusoiminen, interferonin ensirikas-taminen ja fraktiointi geelisuodatus mukaanlukien, voidaan suorittaa sinänsä tunnetuin menetelmin. Nämä menetelmävaiheet, jotka antavat epäpuhtaassa tilassa olevien interferonien vesipitoisen liuoksen, eivät ole tämän keksinnön kohteena.

Keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein.

Esimerkki 1

Homogeeninen ihmisen valkosolu-interferoni normaaleilta verenluovut-tai ilta__ A. Interferonin valmistus

Interferonia valmistettiin inkuboimalla 16 tuntia ihmisen valkosoluja, jotka oli saatu normaalien verenluovuttajien verestä, (10 solua/ml) Newcastlen taudin virusten kanssa (15 hemagglutinii-niyksikköä/ml) seerumivapaassa minimiväliaineessa, joka sisälsi 10 mg/ml kaseiinia. Saatiin keskimääräinen interferoni-tiitteri 5000 yksikköä/ml. Käytetyt menetelmät vastasivat menetelmiä, joita ovat käyttäneet Mogensen, K.E. et ai.. Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369-381; Wheelock, E.F., J. Bacteriol. 92, 1415-1421 (1966) ja Cantell, K. et ai., Appi. Microbiol. 22, 625-628 (1971), muutamin vähäisin muutoksin. Interferoni-tiitteri määritettiin määritysmenetelmällä, joka pohjautuu sytopaattisen vaikutuksen estoon ja joka voitiin suorittaa 16 tunnin ajassa. Kaikki interfero-ni-tiitterit on annettu yksikköinä/ml ja kalibroitu National Institut of Health (USA) vertailustandardia vastaan ihmisen valkosolu-interferonille .

B. Interferonin rikastaminen ja ensimmäinen fraktiointi

Ellei toisin ole ilmoitettu, työskenneltiin lämpötilassa välitä 0-4°C. Inkuboinnin päätyttyä poistettiin solut ja solujäte linkoamalla (15 minuuttia, 500 x g). Kaseiini saostettiin tekemällä happa-meksi HCl:llä pH 4,0:aan. 2 tunnin kuluttua seosta lingottiin (10 minuuttia, 12000 x g) ja sakka heitettiin pois. Sakan päällä ollut neste (10 1) säädettiin 1,5 %:n (paino/tilav.) trikloorietikkahap-po-pitoisuuteen. 1 tunnin kuluttua saostuma lingottiin erilleen (10 minuuttia, 12000 χ-g) ja liuotettiin uudelleen 50 mlraan 0,1 M

69476

NaHCO^. Senjälkeen kun oli lisätty 0,5 g Triton X-100 ja 1,5 ml etikkahappoa (tiputtaen ja sekoittaen) annettiin seoksen seistä 1 tunti 0°C:ssa ja senjälkeen 16 tuntia -20°C:ssa. Sulattamisen jälkeen lingottiin 10 minuuttia 17000 x g:ssä. Jäännös heitettiin pois ja sen päällä ollut neste säädettiin 4 %:n trikloorietikkahappopi-toisuuteen. Yhden tunnin kuluttua seosta lingottiin 10 minuuttia 12000 x g:ssä ja sakka liuotettiin 5 mlraan 0,5 M NaHCC^.

C. Geelisuodatus

Saatuun väkevöityyn interferoni-liuokseen sekoitettiin 1,5 g virtsa-ainetta ja pantiin pylvääseen (2,6 x 90 cm), jossa oli hienoa Sephadex G-100, joka oli esitasapainoitettu 4M virtsa-aine/0,1 M natriumasetaattipuskurilla. Pylväs eluoitiin huoneen lämpötilassa ja 0,5 ml/min. läpivirtausnopeudella 4M virtsa-aine/0,1 M natrium-asetaatilla, pH 7,5. Kerättiin 12,5 ml:n jakeita. Interferoni-aktiivisuus eluoitui jakeisiin 19-23.

D. HPLC

Yhdistetyt jakeet 19-23 siirrettiin Sephadex G-100-pylväästä suoraan pumpun kautta Lichrosorb RP-8-pylvääseen (10^,u, 4,6 x 250 mm). Pylväs esitasapainotettiin IM natriumasetaattipuskurilla (pH 7,5). joka sisälsi 0,01 % (tilav./tilav.) tiodiglykolia, ja eluoitiin n-propanolin suoraviivaisella gradientilla samassa puskurissa /1 tunti, 0-20 %, 3 tuntia, 20-40 % tilav./tilav.)_/läpivirtausnopeudella 0,25 ml/min. Kerättiin 0,75 ml:n jakeita. Interferoni eluoitui jakeisiin 23-40 /25-30 % (tilav./tilav.)n-propanolia/.

Jakeet 27-33, jotka sisälsivät suurimman osan interferoni-aktiivisuudesta, yhdistettiin, sekoitettiin n-propanolin kanssa 80 %:n (tilav./tilav.) loppupitoisuuteen ja siirrettiin pumpun kautta suoraan Lichrosorb-Diol-pylvääseen (10^,u, 4,6 x 250 mm), joka esi-tasapainoitettiin 0,1 M natriumasetaatti-liuoksella, jonka n-propa-noli-pitoisuus oli 80 % (tilav./tilav.). Pylvästä eluoitiin sitten 4 tunnin ajan n-propanolin 72-50 %:n (tilav./tilav.)suoraviivaisella gradientilla 0,1M natriumasetaatissa läpivirtausnopeudella 0,25 ml/min. Kerättiin 0,75 ml:n jakeita. Interferoni-aktiivisuus eluoitiin kolmen selvän päähuipun muodossa,jotka vaihtelivat kvantitatiivisesti näytteestä toiseen. Näitä huippuja nimitettiin eluoi-tumisjärjestyksensä mukaan.^ (ksi, P :ksi ja f":ksi. jae eluoitui 68 %:n n-propanoli-pitoisuudessa, F -jae 66,5 %:n n-propanoli-pitoisuudessa ja /-jae 65,5 %:n n-propanoli-pitoisuudessa. Koko inter- 9 69476 feroni-aktiivisuuden saanto oli suurempi kuin 80 %.

Jokaiseen huippuun kuuluvat jakeet yhdistettiin ja puhdistettiin edelleen useissa vaiheissa. Koska huippu ;v oli verrattomasti suurin ja näytti olevan parhaiten muista komponenteista erottuva, valittiin se jatkopuhdistusta varten. Jakeet 54-56 diolipylväästä, jotka sisälsivät huipun /v , yhdistettiin ja n-propanoli poistettiin kahdella uutolla yhtä suurilla määrillä heksaania. Jäljelle jäänyt heksaani poistettiin typpivirrassa. Lisättiin pyridiiniä ja muurahaishappoa loppupitoi-suuteen IM ja vastaavasti 2M ja liuos vietiin Lichrosorb RP-8-pylvääseen (10 u; 4,6 x 250 mm), joka oli esitasapainotettu IM py-ridiinillä ja 2M muurahaishapolla (pH muurahaishapolla 4,0). Pylvästä eluoitiin 3 tunnin ajan n-propanolin (20-40 %) suoraviivaisella gradientilla IM pyridiini/formiaatti-puskurissa läpivir-tausnopeudella 0,2 ml/min. Kerättiin 0,6 ml:n jakeita. Aktiivisuuden päähuippu oli yhtäpitävä proteiinihuipun kanssa. Jakeet 45 ja 46 (32 % tilav./tilav.) propanolia), jotka vastasivat tätä huippua, yhdistettiin ja kromatografioitiin uudelleen samoissa olosuhteissa. Interferoni eluoitui jakeeseen 31 (32 % tilav./tilav.)

O

propanolia). Tämän jakeen spesifinen aktiivisuus arvioitiin 4 x 10 yksiköksi/mg verrattuna naudan seerumialbumiin. Tätä ainetta käytettiin edelleen karakterisointiin. HPLCrn fluoresenssiprofiilit olivat niin hyvin toistettavia, että ne antoivat pysyvän tunnusmerkin koko menetelmälle.

Puhdistustulokset on koottu taulukkoon 1. Koko puhdistuminen, lähtien inkuboimisväliaineesta toiseen RP-8-pylvääseen asti oli 60000-80000-kertainen. Kumulatiivinen saanto vaiheesta 1 dioli-vaiheeseen oli 30-50 %. Tämän vaiheen jälkeen puhdistettiin jokainen näistä interferoni-huipuista.

10 Λ 2 ο ο η 69476 (Π Οι\ o o o o o o oo i> X' | O '—1'—( CTi CT\ i—I CT vo rs dP I O I I I I I I il 9(131 ^ O O O O O o oo ςπ -p 'nj co t"·- co i" oc r— ^ h ™ ΐ

I -P CU <U

CQ G G X!

Zj ·γ| Q) *rl fÖ

5cu f—( lo co <n O 04 O O O O O

X +3 n p- -p O- O CQ O O O § '3 ·> d

2 3 - " ° z ° °. o λ § - S

1/1 3 2 8 « S. 3 »

•P O tfi G

e e x -h 3 O CU rt u χ -p tn Q) . :o3

c g CU G UJ rP

• Φ 3 π ρ· p· tn in en eo i". r- co co 1,1 ,rl ^ l! d .5 O O O O O O O O OOO elJtnij -Utn-PdJ^^^^njlOin Ή corner P Λ .d m X 0) 4-1 · - -- ^ P 4-( -no tn 3 dXI-H CN i—( CD CN 5 \H :9 d C/3 tn m \) G U M Ό - :<d -X 43 -5 1 -S *

äJnk d m ™ o °. ΐ « >, -S

o 'cui &1 O O O O m r~- p Ή2000 asooo p

-ad^OOO^r-inrH $ O oo P

XpcäOOOrNP

CQ :Q M -r) s . » O ίΗ CU

9 M d G o nj ,_| 'X4J

_, a d -h 01 -h

H 2 UI 3 I M

O Ό ^ 3 rs O

XX CU tn 3 M 3 :ra cu -h -h en 3 ^4 pH 4-J Ή ^ r*H »

3' c ä-nco d d ^ d. ε -H o O

H I W -r-' •CJ'^D v s »frt ,_j I .

d 1 '9 OJXI O O O O· en (N 00 '—1 (N ci 1—(co 3 M . s,

C;B ^Οιλιχρ-ρρο,™ M p P £ :rä Φ -P

5 :Q X „„ -H (Ö -H χ 4-> <u χ >1 x ρ rp -p cu V. :cä e -P (0 4->

m :rö CU tn > -P

P g e >1 P

3 *P · i(3 '3 (0 C P H co :rä 3 X <tf -H -H 3 g r—1 X G X e tn e rt

O Π3 tä X -p CU 3 4-> -P

w 2: tn x m -p d o en cu Q d 1 (ötu en cu tn d <u ;5 o cop 1 4-> d cu 11 m cudocno-r o e g 2

> 4-)ddUdLri P (U X -p CQ

0) « QC d - ~ d G O (ä Z

3 CU ns ITJ ^ ^ ^ -P G %> 6 e 3 2<o x „ _ „ e p -h 3l · H X <ä> (0 k K X :m 4J g ^ σι g cuidx^ccu^: ^ ddg^tneo .2 e > -H Λί-Ι X ^ '"'^'c^PrHra H -H CU 4-> dO -H _ 4-> r-4 O rH 4-1 (C3iH(U4J4->5'0Or2j 00 CO ^Oi-HPcn •p o -h emä cu 0 1 o il :ra en d <u 1—I U Sd Ή ^ l) Pj (¾ tn d tö -P eu :iä :<ä O OP KK -p^-p3x;

> rp o Q(ä O „ _ ^ tn tn 3 -P

tn ip rp ^ptä Λ Λ ·<υ 3 •h « iän v ^ 3-P(UC> g :<ä -P X X X O O x> ä' ·χ O O cu tn x: -p p d P -P d S * ^ en tn cu x -p -p e

o ρίρρ'ΟΟΟ OO XC-prä-PCU

XJP 04-)^^3333¾¾ 3O>-Pr0

3 fä n,a 4-) -2 XJ XI ^ Xj X -t 1 cu -P

ACrX^n-P eLpPdddP^ 3 3 4-> CU

Ciö " 3 1)0 QJ -3 -3 -P -P -P -3 -p e nd 3 -P 4-) •P to '—t Eht· CO G m 33 3GG :räGdP4-> XXX g rä -P o >i ........ · · :rä 4-· 3 3 :tö

^Hoiroirinvor-ao ctnO E-iU)XtnC

1—I

11 li 69 4 7 6 E. Polyakryyliamidi-geeli-sähköforeesi 5

Interferoni-näytteitä (1,5 x 10 yksikköä) inkuboitiin SDS-PAGE:n ja 2-merkaptoetanolin kanssa ja levitettiin levygeelille. Sähköforeesin jälkeen saatiin värjäämisen jälkeen Coomassie-sinisellä yksi ainoa terävä nauha. Näennäiseksi molekyylipainoksi määritettiin 17500 (vertaamalla standardiproteiineihin). Geeli leikattiin 1 mm:n suikaleiksi, jokainen suikale homogenoitiin 0,4 ml:ssa 0,5 M NaHCO^/O,! % SDS-PAGE Da tutkittiin interferoni-aktiivisuuden suhteen . Löydettiin yksi ainoa huippu, jolla oli virusvastainen aktiivisuus ja joka oli yhtäpitävä ainoan proteiininauhan kanssa.

F. Aminohappoanalyys i

Homogeenisen ihmis-valkosolu-interferonin {huippu γ- ) aminohappo-analyysi suoritettiin Fluorescamin-aminohappo-analysaattorilla luonnollisen ja S-karboksimetyloidun interferonin 0,5-l^,ug:n näytteillä, kysteiini/kystiinisuhteen määrittämiseksi karboksimetyloitiin luonnon interferonia ja hydrolysoitiin sitten 6M HClrssa pelkistävissä olosuhteissa (0,1 % tioglykolihappoa). Näissä olosuhteissa mitataan kysteiini S-karboksimetyylikysteiininä ja kystiini vapaana kysteiini-nä. Aminohappoanalyysin tulokset on koottu taulukkoon 2. Spesifinen aktiivisuus, laskettuna aminohappopitoisuudesta, määritettiin g 2-4 x 10 yksiköksi/mg.

12 69476

Taulukko 2

Ihmisen valkosolu-interferonin aminohappo-koostumus

Amino- Tähteet happo -

Asp 15,2+1,2

Thr* 7,5+0,5

Ser* 8,0+0,5

Glh 24,0+0,6

Pro 6,3+0,3

Gly 5,5+0,5

Ala 8,2+0,2

Kys (yht.) 3,3+0,7 1/2 kystiini+ 1,8+0,2

Kysteiini + 1,5+0,5

Vai 7,8+0,2

Met 3,9+0,2

Ile 8,9+0,4

Leu 21,8+1 ,3

Tyr 5,1+0,2

Phe 9,1+0,3

His 3,3+0,4

Lys 11,6+0,5

Arg 7,3+0,5

Trp++ 0,7+0,1 * Korjattu aikaan 0.

+ Mitattu luonnon interferonin karboksimetyloinnin jälkeen ++ Mitattu hydrolyysin jälkeen 6M Hcl/4 % tioglykoliha-possa

II

13 69476

Esimerkki 2

Homogeeninen ihmisen valkosolu-interferoni leukemiapotilaiden valkosoluista_

Interferoni saatiin inkuboimalla ihmisen valkosoluja, jotka oli eristetty leukemia-potilaiden (krooninen myelogeeninen leukemia, (CML) verestä leukoforeesilla Newcastlen taudin virusten kanssa seerumivapaassa, proteiinipitoisessa väliaineessa. Interferoni-titterit olivat 5000-40000 yksikköä/ml.

Puhdistusmenetelmä oli sama kuin esimerkissä 1 interferonille kuvattu normaalien verenluovuttajien verestä ja käsitti selektiivisen saostamisen 0,5 M etikkahapolla Triton X-100:n läsnäollessa, geeli-suodatuksen Sephadex G-100:lla 4M virtsa-aineessa, HPLC:n pH 7,5:ssä Lichrosorb RP-8:lla, HPLC:n Lichrosorb-Diol:illa ja HPLC:n Lichrosorb RP-8:lla pH 4,0:ssa.

Jakeet, jotka vastasivat Lichrosorb-Diol-pylvään /-, * - ja ^-huippuja, koottiin ja puhdistettiin sitten toisistaan erillään jatkovaiheissa .

Yhdistetyistä jakeista 43-46 ( ^-huippu) poistettiin n-propano-li kahdella uutolla samoilla määrillä n-heksaania. Heksaanin jäljet poistettiin typpikaasuvirralla. Lisättiin pyridiiniä ja muurahaishappoa loppupitoisuuteen IM ja vastaavasti 2M ja liuos vietiin Lichrosorb RP-8-pylvääseen (10^u, 4,6 x 250 mm), joka oli esitasapai-noitettu IM pyridiini/2M muurahaishapolla (pH 4,0). Pylvästä eluoi-tiin kolmen tunnin ajan suoraviivaisella n-propanoligradientiliä (20-40 %), tilav./tilav.) IM pyridiiniformiaatti-puskurissa läpi-virtausnopeudella 0,2 ml/min. Kerättiin 0,6 ml:n jakeita. Interferoni-aktiivisuus eluoitui leveinä huippuina n-propanolin pitoisuuksissa välillä 31-35 % (tilav./tilav.). Nämä jakeet yhdistettiin ja kromatografoitiin uudelleen samoissa olosuhteissa. Interferoni-aktiivisuus eluoitui kahteen päähuippuun (<^ ja Λ 2) 31 ja 32 %:ssa (tilav./tilav.) n-propanolia. Toissijaiset komponentit eluoituivat 35 %:n (tilav./tilav.) n-propanolin pitoisuudessa.

Yhdistettyjä jakeita 47-50 (huippu β )Lichrosorb-Diol-pylväästä käsiteltiin samalla tavalla ja kromatografoitiin Lichrosorb RP-8:lla kuten huipulle,a kuvattiin. Interferoni-aktiivisuus eluoitui kahdella päähuipulla: β^ 32 %:ssa (tilav./tilav.)n-propanolia ja P> 2 34 %.ssa (tilav./tilav.) n-propanolia. Uudelleen kromatogra-fointi ei ollut tässä tapauksessa tarpeen. Joissakin näytteissä voitiin todeta huippu^ 31%:ssa (tilav./tilav.) n-propanolia.

14 69476

Lichrosorb-dioli-pylvään yhdistettyjä jakeita 52-54 (huippu ^*) käsiteltiin samalla tavalla ja kromatografoitiin Lichrosorb RP-8:lla kuten huipulle ^ kuvattiin. Interferoni-aktiivisuus eluoitui viidellä päähuipulla: (31 %:ssa n-propanolia, tilav./tilav.) , (32%:ssa n-propanolia, tilav./tilav.),)/^ (34 %:ssa n-propanolia, tilav./tilav.), (35 %:ssa n-propanolia, tilav./tilav.) ja (35,5 %:ssa n-propanolia, tilav./tilav.). Uudelleen kromatografointi ei ollut tässä tapauksessa tarpeen.

Puhdistustulokset yksittäisten interferoni-lajien valmistamiseksi on koottu taulukkoon 3.

Lajit^2 3a 2 v°idaan edelleen erottaa eluoitumisominaisuuk-siensa perusteella Lichrosorb-Diol: 11a:-1 2 eluoituu 68 %:sella (tilav./ tilav.) n-propanolilla ja 66,5-%:sella (tilav./tilav.) n-propanolilla.

5

Interferoni-lajien näytteitä (1,5 x 10 yksikköä) inkuboitiin SDS-PAGE:n ja 2-merkaptoetanolin kanssa ja levitettiin levygeelille. Sähköforeesin jälkeen antoivat huiput A1,Λ 2,P2> 3a ^4 kukin yhden ainoan nauhan, kun taas huiput F ja antoivat kukin kaksi nauhaa. Näennäiset molekyylipainot olivat väliltä 16000-18000 lukuunottamatta j'\j» joka antoi 16500 :ssa yhden nauhan ja toisen 21000:ssa ja^'4, joka antoi nauhan 21000:ssa (ks.taulukko 4).

Il 15 69476 o •H^OOr-tnotN^' ^

(rt I Ή rH -H

t/5 \J

g oo m m

d ., rH m en r- r·' oo o OOO

g h ro m cn o m m O

-g % rH uo r~ cm o

(¾ (6 Ή CN

Π

Si, _ »s' m tn vo vo to r- t"· r~

g1 0¾ OOOOOOO OOO

.¾ .1 c: (—H f—I rH rH rH '“H rH rH rH rH

Μη>·<ΪΧΧΧΧΧΧΧ XXX

Η·Η·τ}<(Ν<ηιηηΓ-((Ν ro in co tn -h tn ....

---- tn (0 ro ro ro S >,c ° ° ° tn -fr-Six, 'd v v ^

•n -p -rH 0Ί XXX

Ό ΘΦΒΟν-γνΟΟΟ^ο tn ro -H

Xl Ό -Pl <N rH in ro cn

^ U tn ro rH

O e ^ α rX ‘3

Λί S

3 2 3 « (OP >1 :rö

eh S -p -P

c m;omOOOOOOO οί oo σ\ to •H it3^lOO0DvOrHU3-H o· ro ro I ίρΡΙ ocoaor^r-covom i—i rH r-t d :Q tn h H ΡΛ g >, X £

O QJ

X rH

g 0 > :t0

rH

S 1—^ P d ‘Su 1/5 J § 5 to +j tn ^ 2 p tn I (3 (3 tn φ n tn tn •d c & ~ o 5 £ & ä tn cd ro to d Γ' j 5 o £ -S § a S 'd :t0 +j ^ ^ ^

d Q) rH Φ vH -H

> £ rH -rH -P -P 00 rH

H :d P <L> O) O I o g :& 8 O ‘0 3 fe m a +J »3 ·Η I i-H V-lO^H -j^ ,τί V.

.s-sö^^asMsä

S ω dp H Qi ϋ n § § & o. oj S

g 'ψ -P-P .c .c cn si S S 53 Φ 2 I m HM# Dl o- O -d -d -d -g c.w * pj) ro -h -h dddi

H 54 rH EHC^ W J Pl K X K >H

h n m if m id h oo JC IS 69476 S 1\, 16 3 0) ΟΟΟΟΟΟΟΟΌ I i Ä -M OOOOOOinmiD 2¾ ^ LnOOOinor^r^cN --1¾ ^o.ooo«JO®ootN (d w a H -1 "i * ί-4 ·η

t -S

c g h 4

m D|\ O S

e (/] rn I OOOOOOOOOOQOQOCOOO Ψ % £ -d js ΟΟΟΟΟΟΟΟΟ A θ ^ ^ ^ ^ΉΉι—iiHf-Hf-HrHrH rn m !h yj ' X X x x * x X X X S -d

'^OOOuj'Tiomcri SE

α^ι>ι ... k. H

w <0 \j cN^rrr^riN ro m o -l?3 P φ

3 ω ti B

2 «^tronnnnnnm :3¾ >,c I I I I I I I I I S ti 4J ·Ρι\ ΟΟΟΟΟΟΟΟΟ rn'ä

-P-r-tCTi --ΙΉ,—(i—1,—i,Hr-ti—i^h g R

Ä xxxxxxxxx 5-h §.n\i LDLnu-)rMoor^«TOO wc :qm '^^Dr-mmr^r'rHin -e* ^ Λ -H O)

•H -P

-4 I S

t >,w nj >1.03 , * w 4J ti LO m Φ :0 _ · m Ό ,ν i ^voO^uiiHvom^ oo >i -H O CNfOrHiHroCN m 9 iS^ ^ ^ 2 >, x

'B

E^J

— 3 O :¾ . -ΓΊ o ^ q x: = d

'H Cu S

> w o «o m CU & 02 3

X) S

p P

O * -K H

W ^HtNfMr^r-irjm^Ln ^ o o σ ca <a > :nt e .C 93 2. 3 3 3 3 9 9 2 φ 3 1¾ ä ä S s H ä | 2!

j 11 3 3 1 313 3s S

a> « 17 694 7 6 :CJ + + + + + + + + + 3 to

a) a I

gs si x; > 3 .

30 cocoaocooooor^oovo .5 S ooooooooo

•H g o I

Ιί 5 1/1 xxxxxxxxx i 7¾ j?' + ! vo m ld , C (NOOCNOOCNr-(<—' ®h m

q ·· M

H o\j >-· 4-t 00

Hr--*. S

to H (0 g Φ ·Γ"Ϊ & 5 3 g

^ I

Ή

K :S

··» W -r- (Ö 2 & to 3 £ to

ooaogoaoaoaococoao -H

^ >w OOOOOOOOO $ £ 2 -h >, in m I—j * xxxxxxxxx £> — 2 .[5, +i vo to inmcri Ώ § g q 3 · .... 2 oo

3 Hi Γ—I (N’f'fTPOIvfoOO H

Ό q 0 to E-I -H to -H 04

+J q rH VO

•H +j m Γ4 to 3 ffi £i I s t * I S 2 1 ^ ^ 1 £1 >p ω O OOOOOOOOO o §

O OOOOOOOOO ft S

,Ο moNuoor-r^o^Ovn 1 s s -...... ^ · 2 νονονΟ'-ΙΓ^Γ'Γ'ΓΗνΟ S 73 g +1 r-t I—I iH (N >-H r—| Ή fN >H rrj § 10 2 5 (0 q + I a td s C jjj

<N CO

4* -M -K

·—ICNCNOHi—(Osloo^TiT) oocaca + ^- + + ^ * * * 18 69476

Puhdistettujen ihmis-valkosolu-interferoni-jakeiden aminohappo-analyysi suoritettiin Fluorescamin-aminohappo-analysaattorilla 0,l-^ug:n näytteillä. Hydrolyysi suoritettiin 6N Helissä pelkistävissä olosuhteissa (0,1 % tioglykolihappo). Analyysien tulokset on koottu taulukkoon 5.

i9 6 94 7 6

CO to δ ÖQ CN O CQ ^I ^ Ό «3 'l' ® o O cn I

O cn nr'iriO'f'ffl'iriTriflffin^oiM^o) k Ο Η· Ή CN Ή Ή in LO Η >· Ό

rH

oininO'C'®')'t!'mrNHOrC®|,11C'rC

O O r-~r-'f'")r--vo,*J'Or~N,cr>'3,Ln<T\r'"tcN00'T

O oo Ή >—i cn <—i cn —i N* O ·-*

>- ' I

cn cn £ o C ai OO^oocxjcNnmcocoLnr^cNcTccofHi—i cn iH e#·#····**···***·

JS O 00 tncoocN'i'mcTcminkooc'-ir-CNi'-Ofo G

g k O N« rH H N CN i—I CO

? m cn <—i .G

O v. _ H

ä ^ * s- e 5 mcocooooO'-cOcr'O'-'ooof^OcOCTi -h h ^

Ξ . O f*! ncTir^-inkrLncnr^rnaao^c^c^iocncN G

S OcDiHCN CN M <3

CN C^ H S

G >- ' I

I [ *-> G « 2 * Φ i—ikrcNiTiLnr^r^r^rocTirooovor^r-coco Ή .................

j.., O m mcoof^^cnoOr^^r^O^aonocnm ld ai ! O cn Ή l <N CN Ή

_p r-H P- »H

0 G > r* Ή Γ" 3 '*

1 1 I—I

GO cNtTiinmcncDinLnocn'N'Ocnajrncon G cn .................

Eho O ή cocriTraommiHr-vocTi^incrimcrtOcN

^ k O 00 Ή rH <N rH CN r-t iH cn O Ή G cQ « ►> ή

CN

G

O

en inoOcTiOOcTit^^^cricor^Ocnooo -H ·················

S O cn icnO^n^cOf^corrr^aO-sroomoocoH

,G O N< -H rH (N rH

M CN m rH

CQ -

CO

I—<

r-mocnc^cncncNcaooON'OooO'-cO

O σ> >—tcooO^^oovomr^ao^rcocNiTir-. h·’ 4J

O m r-ι cn H a; (N (N H m

O +J

CD i H

ή i :G

-P

(»r'CNm'HHN'rrr^N'OOcriOcocNaN tn 1 · I »

I O cn rnr^criOeotnaor-.rQC^-co^Tcomocot·'·) rH

On'·—! cn <h 1—1

•—I Ln rH “t" I

D

to tn

rH G

. G

λ;

G

H eS

•ho H

•n Q) G jJ 3 j XUHXO^GrH-uoGiHCDcncncncn M s ¢3 Gx:a)rHH-HrHGajtJaj>ix:-H>iSH>,

Σ <E-'CQO0<O<>SMr-]EHa1a:Gl/<U

20 69476

Osasten trypsiini-hajotus ja HPLC

Puhdistettuja ihmisen valkosolu-interferoni-lajeja liuotettiin kutakin 300 p-moolia vesipitoiseen natriumbikarbonaattiin (50 mmoo-lia pH 8, 50^ul) . Senjälkeen kun kuhunkin oli lisätty 0,l^,ug trypsii-niä 2^ul HC1 (pH 3) inkuboitiin 14 tuntia 37°C:ssa, lisättiin 5yUl etikkahappoa ja seos vietiin Lichrosorb RP-8-pylvääseen (osaskoko 10^,u; 4,6 x 250 mm). Pylvästä eluoitiin yhden tonnin ajan 0-40 %:sen (tilav./tilav.) n-propanolin suoraviivaisella gradientilla 0,IM muurahaishappo/O,03 M pyridiini-puskurissa (pH 3) läpivirtausnopeu-della 0,5 ml/min.

Osaset osoitettiin Fluorescamin-menetelmällä. Tulokset on koottu taulukkoon 6, jolloin huippujen asema on ilmaistu %:teinä n-propano-lia ja osasten suhteelliset koot on annettu (S = pieni; M = keskisuuri; L = suuri).

Taulukko 6

Ihmisen valkosolu-interferonin tryptisiä peptidejä

Laji Eluoituminen %:ssa n-propanolia a-, 3L, HL, H,2M, 12,5S, 1H.5M, 16S, 18M,

20S, 21S, 22,5S, 29M

a2 3L, HL, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 1-8M,

27S, 29M

»2 3L, HL, H,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,SS,

18m, 29M

Ä3 3L, HL, H,2M, H,5S, 10M, 12,5S, 14S, 1H,5M,

16S, 18L, 19,5M, 27M, 32M

Y·, 3L, HL, H,2M, H,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S,

1H ,5M, 16S, 17,5M, 18M, 29M

Y2 3L, HL, H,2M, H,5S, 5S, 11,5S, 12,5S, 1H,5S,

16S, 18L, 29M

Y3 3M, HM, H,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M,

16S, 18L, 20S, 32M

Y5 3L, HL, H,2M, H,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L,

12,5S, 1 HS, 1H,5M, 16S, 18L, 2H,5S, 25,5S, 32S

21 69476

Puhdistetut ihmisen valkosolu-interferoni-lajit saatettiin aminosokerianalyysiin, jolla aminosokeri voidaan todeta välillä 50-100 pmol. Kaikissa tapauksissa löydettiin vähemmän kuin yksi tähde glukoosiamiinia, galaktoosiamiinia tai mannoosiamiinia molekyyliä kohti. Useimmissa tapauksissa häiritsi pieni määrä peptidejä, jotka eluoituivat aminosokerin läheisyydessä tällä analyysillä. On sentähden mahdollista, että aminosokereille kuuluviksi lasketut huiput osittain tai kokonaan kuuluvat peptideille.

Lopuksi ei yritys sekventoida 1 nmoolia puhdasta y 2~^-nter-feronia manuaalisella Edman-hajoituksella, joka käsitti takaisin-hydrolyysin ja maitohappoanalyysin käyttäen Fluorescamiinia, antanut aminohappoja kahdessa ensimmäisessä syklissä. 100 pmoolin puhdasta ihmisen valkosolujen Ϋ 2~interferonia käsittely leusiini-aminopeptidaasilla ja aminopeptidaasilla M20 tunnin ajan 37°C:ssa eivät vaikuta biologiseen aktiivisuuteen; inkubointiväliaineessa ei voitu todeta aminohappoja. Käsittelemällä indusointiväliaineen (valkosoluja ja Newcastlen taudin viruksia minimiväliaineessa) sakan päälle jäävää nestettä aminopeptididaasilla M ei voitu havaita interferoni-aktiivisuuden häviötä. Tämä viittaa siihen, että interferoni-molekyyli jo ennen puhdistusmenettelyä sisältää suojatun aminopäättei en aminohapon. Vertailua varten inkuboitiin raakaa interferonia, puhdasta interferonia ja insuliinin /^-ketjua yhdessä aminopeptidaasin M kanssa. Samalla kun insuliini osittain hajosi (aminohappoja osoitettavissa) ei interferoni-aktiivisuudessa esiintynyt häviötä.

Claims

22 6 9 4 7 6

1. Menetelmä ihmisen leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että epäpuhtaan proteiinin vesipitoinen liuos viedään puskurilla tasapainoitetun pylvään läpi, jossa on syanopropyyli-, sykloheksyyli-, fenyyli-, oktyyli-, okta-dekyyli- tai glyseryyli-ryhmillä modifioitu huokoinen SiC^-mat-riisi, HPLC-olosuhteissa, jolloin proteiini ensin adsorboituu ja sitten eluoidaan veden kanssa sekoittuvan liuottimen nousevalla tai laskevalla gradientilla, niin että se lopuksi saadaan puhtaammassa muodossa eluaatin tietyissä jakeissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetään puskurilla tasapainoitettua pylvästä, jossa on oktyyli- tai glyseryyliryhmillä modifioitu huokoinen SiO2-matriisi.

3. Menetelmä leukosyytti-interferonin valmistamiseksi homogeenisena proteiinina, tunnettu siitä, että A) epäpuhtaassa tilassa olevan leukosyytti-interferonin vesipitoinen liuos HPLC-olosuhteissa viedään puskurilla tasapainoitetun pylvään läpi, jossa on oktyyli-ryhmillä modifioitu SiC^-matriisi, jolloin interferoni ensin adsorboituu ja sitten eluoidaan puskurissa olevan, veden kanssa sekoittuvan liuottimen nousevalla gradientilla, niin että se saadaan puhtaammassa muodossa eluaatin määrätyissä jakeissa; Ei nämä vaiheessa A) saadut määrätyt jakeet viedään puskurilla tasapainoitetun pylvään läpi, jossa on glyseryyli-ryhmillä modifioitu SiC^-matriisi, jolloin interferoni ensin adsorboituu ja sitten eluoidaan puskurissa olevan, veden kanssa sekoittuvan liuottimen laskevalla gradientilla niin, että se saadaan puhtaammassa muodossa selvinä päähuippuina määrätyissä jakeissa; C) nämä vaiheessa B) saadut jakeet, jotka vastaavat selvää huippua HPLC-olosuhteissa viedään puskurilla tasapainoitetun pylvään läpi, jossa on oktyyli-ryhmillä modifioitu SiC^-matriisi, jolloin interferoni ensin adsorboituu ja sitten eluoidaan veden kanssa sekoittuvan liuottimen ja vesipitoisen puskurin seoksella, niin että se saadaan yhtenä ainoana selvänä huippuna eluaatin 23 69476 määrätyissä jakeissa homogeenisena proteiinina ja mahdollisesti toistetaan vaihe C) tuotteen äärimmäisen puhtauden saavuttamiseksi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t. u siitä, että veden kanssa sekoittuvana liuottimena käytetään alkanolia.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että veden kanssa sekoittuvana liuottimena käytetään n-propanolia, vaiheessa A) puskuria, jonka pH on n. 7,5, ja vaiheessa B) puskuria, jonka pH on n. 4,0.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vaiheessa A) käytettynä puskurina on 1 M natrium-asetaatti/etikkahappo ja n-propanoli-gradientti nousee 0:sta 40 %:iin (tilav./tilav.), vaiheessa B) käytettynä puskurina on noin 0,1M natriumasetaatti ja n-propanoli-gradientti laskee 72,5:stä 50 %:iin (tilav./tilav.) ja että vaiheessa C) käytettynä puskurina on IM pyridiini/2M muurahaishappo ja n-propanoli-gradientti asetetaan nousemaan 20:stä 40 %:iin (tilav./tilav.).

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä,<että määrätyt, selville päähuipuille kuuluviksi katsottavat jakeet yhdistetään, n-propanoli poistetaan uuttamalla n-hek-saanilla ja ennen vaihetta C jäljelle jäänyt n-heksaani poistetaan vesipitoisesta faasista.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni ·

9. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni^.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni/1,.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni/^·

12. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni f^.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni \v2·

14. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni ^ . 24 6 9 4 7 6

15. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan interferoni )v^.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunn ettu siitä, että saadaan interferoni 69476