NL193085C

NL193085C - Werkwijze voor de winning van humaan leucocyten-interferon, alsmede farmaceutisch preparaat met het aldus verkregen interferon.

Info

Publication number: NL193085C
Application number: NL7908516A
Authority: NL
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-11-22
Publication date: 1998-10-05
Also published as: JPH07224098A; IL58759A0; IL58759A; ES486263A0; CA1129409A; DOP1979002953A; DK161048C; FI793649A7; DE2947134C2; NO151157B; MY8500222A; CH653347A5; FI69476B; US4289690A; PH20763A; RO79132B; DE2947134A1; RO79132A; KR830002616B1; DK496779A

Description

1 193085

Werkwijze voor de winning van human leucocyten-interferon, alsmede farmaceutisch preparaat met het aldus verkregen interferon

De onderhavige aanvrage heeft betrekking op een werkwijze voor de winning van humaan leucocyten-5 interferon door toepassing van een chromatografische techniek, alsmede op een farmaceutisch preparaat, dat het aldus verkregen humaan leucocyten-interferon bevat.

Chromatografische werkwijzen voor het zuiveren van humaan leucocyten-interferon (ook wel aangeduid als IFN-α), alsmede preparaten die het aldus gezuiverde humane leucocyten-interferon bevatten, zijn bekend.

10 Het Amerikaanse octrooischrift 3.699.222 heeft betrekking op de eerste proeven, zoals uitgevoerd door Isaacs en Lindenmann, de ontdekkers van interferon in 1957. De in dit octrooischrift beschreven zuivering van het interferon bevattende ruwe materiaal bestaat slechts uit een ammoniumsulfaatprecipitatie en een daaropvolgende dialyse.

Het Amerikaanse octrooischrift 3.414.651 beschrijft een meertrapswerkwijze voor de zuivering van 15 interferon bevattend materiaal, welke de volgende trappen omvat: (a) absorptie van het interferon aan een alumino-silicaat, zoals is beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.265.581; (b) eluatie van het interferon met een waterige oplossing van een in water oplosbaar thiocyanaat of jodidezout bij een pH van meer dan 5,5; 20 (c) precipitatie van ongewenst proteïne met een waterige oplossing van een in water oplosbaar thiocyanaat of jodidezout bij een pH van minder dan 5; d) precipitatie van interferon met een met water mengbaar oplosmiddel; en (e) chromatografie van het opnieuw opgeloste interferon met een anionuitwisselingshars diethylaminoethyl-cellulose.

25 Hoewel de voorbeelden in dit Amerikaanse octrooischrift 3.414.651 betrekking hebben op kuiken- en apeninterferon is volgens de beschrijving de werkwijze ook toepasbaar voor de zuivering van interferon uit cellen van menselijke vruchtvliezen en er is ook sprake van niercellen. Van menselijke leucocyten-interferon wordt echter geen enkele melding gemaakt.

Een andere zuiveringsmethode voor humane interferonen wordt beschreven in het Amerikaanse 30 octrooischrift 3.975.344. Hierbij wordt een oplossing van ongezuiverd humaan interferon door centrifugeren met een ultracentrifuge onder benutting van de dichtheidsgradiënt gezuiverd. Er is aangegeven dat volgens deze methode een grotere opbrengst en zuiverheid wordt bereikt dan volgens de methode onder toepassing van kolomchromatografie aan Sephadex G-100. Hoewel dit octrooischrift in hoofdzaak betrekking heeft op de zuivering van humaan fibroblasten-interferon, wordt in voorbeeld 3 de zuivering van humaan leucocyten-35 interferon vermeld.

De onderstaand vermelde publicaties hebben eveneens betrekking op de zuivering en een gepoogde karakterisering van humane interferonen: Törma, E. T. c.s., J. Biol. Chem. 251, 4810-6 (1976) beschrijven de zuivering van humaan leucocyten-interferon door middel van zure ethanolextractie of affiniteitschromatografie met antilichamen, gevolgd door 40 gelchromatografie in aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat (SDS). Hierbij werd een ogenschijnlijk homogeen product met een moleculegewicht van 26 600 verkregen, dat echter door hydroxylapatietadsorp-tiechromatografie in twee fracties met antivirale activiteit kon worden gescheiden. Deze bestanddelen, die onderscheiden konden worden door iso-elektrisch focusseren en polyacrylamidegelelektroforese, vertoonden moleculegewichten van respectievelijk 20 000 tot 16 000 en 16 000, en waren in wezen even gevoelig voor 45 reductie van de disulfidebindingen met β-mercaptoethanol.

Bridgen, P. J. c.s., J. Biol. Chem. 252, 6585-7 (1977) beschrijven de productie op grote schaal en de gedeeltelijke zuivering van lymphoblastoid-interferon (een humaan leucocyten-interferon) door anti-leucocyten-interferonaffiniteitschromatografie onder toepassing van antilichamen, gevolgd door ionenuitwis-selingschromatografie over een sulfopropyl-Sephadexkolom, iso-elektrisch focusseren en SDS-50 polyacrylamidegelelektroforese, hetgeen tot een 35 000-voudige zuivering leidde. Het verkregen preparaat gaf bij gelelektroforese twee bestanddelen met moleculegewichten van respectievelijk 18 000 en 22 000, welke door elutie met een SDS-bevattende buffer uit de gels konden worden gewonnen onder behoud van de anti-virale activiteit.

Chadha, K. C., c.s., Biochemistry 17,196-200 (1978) beschrijven de zuivering van humaan leucocyten-55 interferon met behulp van een moleculaire zeef, gevolgd door SDS-gelelektroforese, waarbij een actief materiaal wordt verkregen met een moleculegewicht van 26 000. Na denaturering met guanidine-hydrochloride bij aanwezigheid van een reductiemiddel gevolgd door reactivering met zuurstof en dan 1193085 2 dialyse was dit moleculegewicht gedaald tot 21 000.

Davey, M. W., c.s., J. Biol. Chem. 251^, 7620-5 (1976) beschrijven de zuivering van onder andere humane fibroblasten-interferonen door chromatografie over concanavaline A-Sepharose, gevolgd door verdere chromatografie aan een agarosemateriaal waaraan koolwaterstoffen zijn gebonden, zoais octyl-5 agarose, of aan L-tryptofaan-agarose.

Hoewel in een aantal van de hierboven vermelde publicaties wordt aangegeven dat humane interferonen tot het bereiken van homogeniteit konden worden gezuiverd, is hierbij geen van de klassieke methoden (zoals SDS-gelelektroforese) voor het aantonen van de homogeniteit van proteïnen toegepast, noch zijn de eigenschappen van deze zogenaamd zuivere verbindingen beschreven. Sommige van deze preparaten zijn 10 nog dermate verontreinigd met andere eiwitachtige bestanddelen, dat zij niet kunnen worden toegepast in of als een farmaceutisch preparaat.

Volgens de bovengenoemde publicaties van Törma c.s., Bridgen c.s. en Chadha c.s. omvat de zuivering van het humane leucocyten-interferon SDS-gelelektrokforese of een soortgelijke stap, waarbij het eindproduct wordt verontreinigd met het schadelijke natriumdodecylsulfaat (SDS), waardoor het verkregen 15 preparaat niet goed bruikbaar is voor farmaceutische doeleinden. Bovendien is dit SDS zeer moeilijk volledig te verwijderen.

Doel van de uitvinding is derhalve het verschaffen van een werkwijze voor de zuivering van humaan leucocyten-interferon, uitgaande van een preparaat dat humaan leucocyten-interferon in onzuivere vorm bevat, waarbij een homogeen humaan leucocyten-interferonpreparaat kan worden verkregen, dat vrij is van 20 SDS en dat geschikt is voor toepassing in een farmaceutisch preparaat.

De uitvinding betreft derhalve een werkwijze voor de winning van humaan leucocyten-interferon door toepassing van een chromatografische techniek, met het kenmerk, dat men het humane leucocyten-interferon wint in homogene vorm doordat men A) een oplossing in water van interferon in onzuivere toestand onder HPLC-omstandigheden door een met 25 een buffer geëquilibreerde kolom op basis van een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix stuurt, waarbij het interferon eerst wordt geadsorbeerd en daarna met een stijgende gradiënt van n-propanol in een buffer met een pH van ongeveer 7,5 wordt geëlueerd, zodat het interferon in bepaalde fracties van het eluaat in een meer zuivere vorm wordt verkregen; B) de in trap A) verkregen bepaalde fracties onder HPLC-omstandigheden door een met een buffer 30 geëquilibreerde kolom op basis van een door glycerylgroepen gemodificeerde Si02-matrix stuurt, waarbij het interferon eerst wordt geadsorbeerd en daarna met een dalende gradiënt van n-propanol in een buffer met een pH van ongeveer 4,0 wordt geëlueerd, zodat het interferon in karakteristieke hoofdpieken in bepaalde fracties van het eluaat in een meer zuivere vorm wordt verkregen; C) de in trap B) verkregen fracties die in overeenstemming zijn met de karakteristieke hoofdpieken onder 35 HPLC-omstandigheden door een met een buffer geëquilibreerde kolom op basis van een door octylgroepen gemodificeerde SiOz-matrix stuurt, waarbij het interferon eerst wordt geadsorbeerd en daarna met een mengsel van n-propanol en een water bevattende buffer wordt geëlueerd zodat men het interferon in een enkele karakteristieke piek in bepaalde fracties van het eluaat als homogeen proteïne verkrijgt en desgewenst de trap C) herhaalt voor het bereiken van maximale zuiverheid van het product.

40 De uitvinding betreft verder een farmaceutisch preparaat, dat humaan leucocyten-interferon verkregen door toepassing van de bovenstaande werkwijze omvat, samen met een voor farmaceutische doeleinden aanvaardbare drager.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding gaat men bij voorkeur zodanig te werk, dat men in trap A) 1 M natriumacetaat/azijnzuur als buffer gebruikt en dat men de n-propanol-gradiënt van 0 tot 40% (v/v) doet 45 stijgen, dat men in trap B) 0,1 M natriumacetaat/azijnzuur als buffer gebruikt en dat men de n-propanol-gradiënt van 72,5 tot 50% doet dalen en dat men in trap C) 1 M pyridine/2 M mierenzuur als buffer gebruikt en dat men een van 20 tot 40% (v/v) stijgende n-propanol-gradiënt instelt.

Tevens verdient het de voorkeur dat men bij het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding de bepaalde fracties die tot een der karakteristieke hoofdpieken dienen te worden gerekend samenvoegt, dat 50 men het n-propanol door extractie met n-hexaan verwijdert en dat men vóór trap C) sporen van n-hexaan uit de water bevattende fase verwijdert.

De toepassing van de hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) voor de zuivering van proteïnen is bekend uit bijvoorbeeld Regnier F. E. c.s., J. Chromatog. C. 14, 316-20 (1976) en Chang, S. H. c.s., Anal. Chem. 48, 1839-45 (1976), welke in het bijzonder ionenuitwisselingschromatografie en uitsluitings-55 chromatografie beschrijven, echter niet voor de zuivering van interferonen.

Rubinstein M., c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4969-72 (1977) beschrijven de zuivering van peptiden zoals β-endorfin door chromatografie onder omkering van de fase (’’reverse phase chromatography"), 3 193085 waarbij Lichrosorb RP-18 (een medium op basis van de octadecylgroepen gemodificeerd SiOz) wordt toegepast, alsmede een elueervloeistof van 1M pyridine/0,5 M azijnzuur met een gradiënt van 0-40% propanol. Deze publicatie betreft geen interferon.

Het volgens de werkwijze van de uitvinding verkregen humane leucocyten-interferon heeft in het 5 bijzonder als eigenschappen dat het in een homogene vorm verkeert, vrij is van natriumdodecylsulfaat (SDS) en een specifieke activiteit van 0,9 x 10® - 4 x 10® eenheden/mg aan de rundercellijn MDBK (epitheliale niercellen van runderen) en van 2 x 10® - 7,6 x 10® eenheden aan humane cellijn AG 1732 bezit.

Onder homogeen wordt in het kader van de uitvinding verstaan dat het verkregen interferon-preparaat vrij 10 is van niet-interferon verontreinigingen, in het bijzonder van eiwitten anders dan interferonen. De homogeniteit van het interferon volgens de uitvinding is bepaald door standaardwerkwijzen voor de bepaling van de zuiverheid van eiwitpreparaten, met name SDS-gelelektroforese zoals hieronder nader omschreven. De onderhavige aanvrage beschrijft voor het eerst een interferonpreparaat, dat onder SDS-gelelektroforese homogeen is; verder zijn de hierboven vermelde specifieke activiteiten niet eerder bereikt in de stand der 15 techniek.

In het bijzonder worden volgens de werkwijze van de uitvinding de homogene humane leucocyten-interferonspecies verkregen, die respectievelijk worden aangeduid als α1, a2, β-2, β-3, γ-1, γ-2, γ-3, γ-4 en γ-5.

Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding α-1 heeft in het bijzonder als eigen-20 schappen, dat het (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 31% n-propanol in één afzonderlijke piek; 25 (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0—40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, uit een HPLC-koiom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een 30 deeltjesgrootte van 10 μνη bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 18, 20, 21, 22,5 en 29%; en dat voorts is gekarakteriseerd door (d) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (e) een specifieke activiteit van ongeveer 2,6 x 10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK; 35 (f) een specifieke activiteit van ongeveer 2,6 x 10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1732; (g) een moleculegewicht van ongeveer 16 500 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (h) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; (i) een positieve groei-remmingsactiviteit en (j) de volgende aminozuursamenstelling (± 15%, betrokken op een moleculegewicht van 16 500); 40 Asx 13,8 Ala 8,4 Phe 6,9

Thr 7,7 Val 7,4 His 3,0

Ser 9,2 Met 3,7 Lys 10,5

Glx 20,3 He 7,4 Arg 6,2

Pro 6,1 Leu 18,0 Cys 3,9 45 Gly 5,1 Tyr 4,0

Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding a-2 heeft in het bijzonder als eigenschappen dat het (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een 50 HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 32% n-propanol in één afzonderlijke piek; (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 55 0-40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een deeltjesgrootte van 10 μιτι bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 11,5, 193085 4 12.5, 14,5, 16, 18, 27 en 29%; (d) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,25 ml/min met een n-propanolgradiënt van 72,5-50% (v/v) in een 1 molair natriumacecaat/azijnzuurbuffer uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door glycerylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een 5 concentratie van 68% n-propanol in een afzonderlijke piek; en dat voorts is gekarakteriseerd door (e) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (f) een specifieke activiteit van ongeveer 4,0 x 10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK; (g) een specifieke activiteit van ongeveer 3x10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1732; 10 (h) een moleculegewicht van ongeveer 16 200 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (i) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; (j) een positieve groei-remmingsactiviteit en (k) de volgende aminozuursamenstelling (± 15% betrokken op een moleculegewicht van 16 200):

Asx 11,7 Ala 8,3 Phe 8,0 15 Thr 8,3 Val 6,2 His 2,8

Ser 10,0 Met 3,8 Lys 9,0

Glx 20,5 He 7,0 Arg 7,1

Pro 4,9 Leu 18,0 Cys 4,0

Gly 4,5 Tyr 4,4 20 Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding β-2 heeft in het bijzonder als eigenschappen dat het (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt 25 geëlueerd bij een concentratie van 32% n-propanol in één afzonderlijke piek; (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, 30 uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een deeltjesgrootte van 10 μιτι bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 11,5, 12.5, 14,5, 16, 17,5, 18, en 29%; (d) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,25 ml/min met een n-propanolgradiënt van 72,5-50% (v/v) in een 1 molair natriumacecaat/azijnzuurbuffer uit een HPLC-kolom 35 van 4,6 x 250 mm, die een door glycerylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 66,5% n-propanol in een afzonderlijke piek; en dat voorts is gekarakteriseerd door (e) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (f) een specifieke activiteit van ongeveer 4,0 x 10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK; 40 (g) een specifieke activiteit van ongeveer 2x10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1 732; (h) een moleculegewicht van ongeveer 16 500 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (i) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; (j) een positieve groei-remmingsactiviteit en (k) de volgende aminozuursamenstelling (± 15%, betrokken op een moleculegewicht van 16 500): 45 Asx 11,5 Ala 7,9 Phe 8,7

Thr 9,0 Val 6,7 His 3,0

Ser 10,0 Met 4,4 Lys 8,5

Glx 21,9 lie 7,4 Arg 8,0

Pro 5,0 Leu 18,9 Cys 1,8 50 Gly 5,0 Tyr 4,6

Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding β-3 heeft in het bijzonder als eigenschappen dat het (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een 55 HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 34% n-propanol in één afzonderlijke piek; (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; 5 193085 (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een 5 deeltjesgrootte van 10 jum bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 10, 12.5, 14, 14,5, 16, 18, 19,5, 27 en 32%; en dat voorts is gekarakteriseerd door (d) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (e) een specifieke activiteit van ongeveer 4,0 x 108 eenheden/mg op rundercellijn MDBK; 10 (f) een specifieke activiteit van ongeveer 3 x 108 eenheden/mg op humane cellijn AG 1 732; (g) een moleculegewicht van ongeveer 21 000 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (h) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; (i) een positieve groei-remmingsactiviteit en (j) de volgende aminozuursamenstelling: 15 Asx 18,2 Ala 11,5 Phe 9,9

Thr 9,9 Val 7,5 His 3,8

Ser 14,5 Met 6,0 Lys 9,3

Glx 28,5 lie 9,5 Arg 10,8

Pro 5,9 Leu 24,4 Cys 2,3 20 Gly 3,6 Tyr 5,0

Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding γ-1 heeft in het bijzonder als eigenschappen dat het (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een 25 HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 31% n-propanol in één afzonderlijke piek; (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 30 0-40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een deeltjesgrootte van 10 μπι bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 4,5, 6.5, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 17,5, 18, en 29%; en dat voorts is gekarakteriseerd door 35 (d) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (e) een specifieke activiteit van ongeveer 2,6 x 108 eenheden/mg op rundercellijn MDBK; (f) een specifieke activiteit van ongeveer 2x10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1 732; (g) een moleculegewicht van ongeveer 17 700 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (h) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; 40 (i) een positieve groei-remmingsactiviteit en (j) de volgende aminozuursamenstelling (± 15%, betrokken op een moleculegewicht van 17 700):

Asx 13,1 Ala 8,7 Phe 8,6

Thr 8,4 Val 7,3 His 3,7

Ser 10,2 Met 4,3 Lys 10,1 45 Glx 23,9 He 7,9 Arg 8,0

Pro 4,5 Leu 20,3 Cys 3,3

Gly 5,7 Tyr 4,8

Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding γ-2 heeft in het bijzonder als eigenschappen dat het 50 (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 32% n-propanol in één afzonderlijke piek; (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; 55 (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, 1193085 6 uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een deeltjesgrootte van 10 μιτι bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 5, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 18, en 29%; en dat voorts is gekarakteriseerd door 5 (d) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (e) een specifieke activiteit van ongeveer 4x10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK; (f) een specifieke activiteit van ongeveer 1,5 x 10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1732; (g) een moleculegewicht van ongeveer 17 700 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (h) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; 10 (i) een positieve groei-remmingsactiviteit en (j) de volgende aminozuursamenstelling (± 15%, betrokken op een moleculegewicht van 17 700);

Asx 13,3 Ala 8,1 Phe 9,0

Thr 9,6 Val 7,0 His 3,3

Ser 7,8 Met 3,9 Lys 10,0 15 Glx 25,0 lie 8,0 Arg 8,5

Pro 4,8 Leu 20,1 Cys 2,9

Gly 5,0 Tyr 4,8

Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding y-3 heeft in het bijzonder als eigenschappen dat het 20 (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 34% n-propanol in één afzonderlijke piek; (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; 25 (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een deeltjesgrootte van 10 μιτι bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 11,5, 30 12,5, 13,5, 14,5, 16, 18, 20, en 32%; en en dat voorts is gekarakteriseerd door (d) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (e) een specifieke activiteit van ongeveer 3,5 x 10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK; (f) een specifieke activiteit van ongeveer 1,5 x 10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1732; 35 (g) een moleculegewicht van ongeveer 17 200 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (h) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; (i) een positieve groei-remmingsactiviteit en (j) de volgende aminozuursamenstelling:

Asx 15,0 Ala 9,3 Phe 7,2 40 Thr 8,6 Val 5,5 His 2,9

Ser 10,1 Met 5,6 Lys 7,6

Glx 22,8 He 6,8 Arg 10,1

Pro 4,8 Leu 20,5 Cys 3,1

Gly 3,2 Tyr 3,7 45 Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding γ-4 heeft in het bijzonder als eigenschappen dat het (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt 50 geëlueerd bij een concentratie van 35% n-propanol in één afzonderlijke piek; (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; en dat voorts is gekarakteriseerd door (d) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (e) een specifieke activiteit van ongeveer 3,5 x 10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK; 55 (f) een specifieke activiteit van ongeveer 4x10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1732; (g) een moleculegewicht van ongeveer 21 000 + 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (h) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; 7 193085 (i) een positieve groei-remmingsactiviteit en (j) de volgende aminozuursamenstelling (±15%, betrokken op een moleculegewicht van 21 000):

Asx 17,9 Ala 10,4 Phe 9,1

Thr 7,3 Val 7,9 His 3,8 5 Ser 13,5 Met 4,9 Lys 12,2

Glx 27,0 lie 9,7 Arg 8,5

Pro 6,5 Leu 24,1 Cys 4,1

Gly 4,8 Tyr 5,0

Het homogene humane leucocyten-interferon met de aanduiding γ-5 heeft in het bijzonder als eigen-10 schappen dat het (a) bij een eluering bij kamertemperatuur bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met 1 mol pyridine en 2 mol mierenzuur uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix bevat, wordt geëlueerd bij een concentratie van 35,5% n-propanol in één afzonderlijke piek; 15 (b) door leucine-aminopeptidase en aminopeptidase M niet wordt geïnactiveerd; (c) door behandeling met trypsine in peptide-fragmenten wordt gesplitst, die bij een eluering bij kamertemperatuur van het reactiemengsel bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min met een n-propanolgradiënt van 0-40% (v/v) in een waterige buffer met een pH van 3, die 0,03 mol pyridine en 0,1 mol mierenzuur bevat, uit een HPLC-kolom van 4,6 x 250 mm, die een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix met een 20 deeltjesgrootte van 10 μιτι bevat, in pieken wordt geëlueerd bij n-propanol-concentraties van 3, 4, 4,2, 4,5, 7, 7,5, 10, 11,5, 12,5, 14, 14,5, 16, 18, 24,5, 25,5 en 32%; en dat voorts is gekarakteriseerd door (d) een geblokkeerd N-terminaal aminozuur; (e) een specifieke activiteit van ongeveer 0,9 x 10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK; 25 (f) een specifieke activiteit van ongeveer 2x10® eenheden/mg op humane cellijn AG 1732; (g) een moleculegewicht van ongeveer 16 500 ± 1 000 (gel-elektroforese op polyacrylamide); (h) een aminosuikergehalte van kleiner dan 1 mol per mol; (i) een positieve groei-remmingsactiviteit en (j) de volgende aminozuursamenstelling: 30 Asx 13,8 Ala 9,3 Phe 6,4

Thr 7,6 Val 5,1 His 2,8

Ser 9,0 Met 4,7 Lys 12,0

Glx 20,8 lie 6,6 Arg 9,0

Pro 4,2 Leu 19,6 Cys 2,3 35 Gly 4,0 Tyr 3,6

In een verdere uitvoeringsvorm die de voorkeur verdient heeft de uitvinding betrekking op een dergelijke werkwijze voor de zuivering van interferon tot het bereiken van homogeniteit, namelijk in hoeveelheden die voldoende zijn om voor het eerst een chemische karakterisering van dit geneeskundig waardevolle product mogelijk te maken. De mogelijkheid interferon chemisch te karakteriseren is een opmerkelijke vooruitgang in 40 de ontwikkeling van dit product, daar deze mogelijkheid de voorwaarde is voor de synthese van het product, hetzij volgens de conventionele synthese van peptiden, hetzij volgens de methode van de manipulatie van genen met behulp van geschikte organismen, bij voorkeur bacteriën.

HPLC-kolommen op basis van een door octyl- of glycerylgroepen gemodificeerde poreuze Si02-matrix (deeltjesgrootte = 10 μιτν, gemiddelde grootte van de poriën = 100 A) die voor de uitvoering van de 45 werkwijze volgens de uitvinding worden gebruikt zijn in de handel verkrijgbare producten van bijvoorbeeld de firma EM Laboratories of Elmsford, N.Y., Verenigde Staten van Amerika, met de merknaam Lichrosorb RP-8 en Lichrosorb-Diol. Equivalente, door octylgroepen gemodificeerde poreuze Si02-koiommen zijn die van de firma E. S. Industries, Marlton, N. J., Verenigde Staten van Amerika met de merknaam Chromega-bond C-8.

50 Een geschikt HPLC-systeem waarin de vermelde kolommen kunnen worden gebruikt zijn in het Amerikaanse octrooischrift 4.116.046 beschreven.

Ter uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding wordt de oplossing van het onzuivere leucocyten-interferon bijvoorbeeld bij aanwezigheid van een water bevattende buffer bij een voor het betreffende interferon geschikte pH door de Si02-kolom geleid. In het algemeen wordt deze oplossing onder druk door 55 de kolom geleid, bij voorkeur onder een druk van ongeveer 3,4-340 atm. Het aan de kolomvulling geadsorbeerde interferon wordt vervolgens trapsgewijs en selectief onder toepassing van een gradiënt van n-propanol geëlueerd. De fractionering van het eluaat wordt op zichzelf bekende wijze uitgevoerd, waarbij I het gehalte van de afzonderlijke fracties aan het actieve interferon door monitoren met een grote gevoelig heid wordt bepaald. Een daarvoor geschikt systeem is door Böhlen en medewerkers, Anal. Biochem. 67, 438 (1975) beschreven. Ook is doelmatig de aanwezigheid van het gewenste interferon door middel van een geschikte biologische assay voor het meten van de antivirale activiteit te controleren.

5 Gebleken is, dat voor humaan leucocyten-interferon de beste resultaten worden bereikt indien men de onzuivere interferonoplossing eerst door een kolom op basis van een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix (chromatografie onder omkering van de fasen) onder toepassing van een buffer met een pH van ongeveer 7,5 (bij voorkeur 1 M natriumacetaat/azijnzuur) stuurt en met een stijgende n-propanolgradiënt elueert, daarna de opgevangen en samengevoegde actieve fracties door een kolom op basis van een met 10 glycerylgroepen gemodificeerde Si02-matrix in een 0,1 M natriumacetaat/azijnzuur-buffer stuurt en met een dalend n-propanol-gradiënt elueert en tenslotte de gescheiden interferon-componenten in een kolom op basis van een met octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix onder toepassing van een buffer met een pH van ongeveer 4,0, bij voorkeur 1 M pyridine/2 M mierenzuur, brengt en met een stijgende n-propanolgradiënt elueert. Op deze wijze kan elk van de drie gescheiden humane leucocyten-interferon (α, β, γ) 15 verder worden gescheiden, waarbij in het chromatogram van elkaar scherp gescheiden pieken worden verkregen, die de homogene interferonen voorstellen. Door het totale zuiveringsproces, beginnend met het incubatiemedium tot en met de chromatografie aan de tweede door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix werd een verhoging van de zuiverheidsgraad met een factor 60 000 tot 80 000 bereikt.

Volgens een speciale uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding voor de zuivering van 20 humaan leucocyten-interferon worden de in de trap B) verkregen fracties, die met een bepaalde hoofdpiek overeenkomen verenigd, ter verwijdering van het n-propanol met n-hexaan geëxtraheerd en van sporen n-hexaan bevrijd voordat de trap C) wordt uitgevoerd.

De homogene humane leucocyten-interferon-species volgens de uitvinding worden gekarakteriseerd door een scherpe piek aan de vermelde HPLC-kolommen alsmede door een enkele smalle band bij de 25 polyacrylamide-gelelektroforese aan natriumdodecylsulfaat (SDS) bij aanwezigheid van 2-mercaptoethanol. De extractie van het gel leverde een enkele scherpe piek met een antivirale activiteit op, die met de proteïne-band overeen kwam. De specifieke activiteiten van de zuivere interferon-species liggen in het gebied van ongeveer 2,6-4,0 x 10® eenheden/mg met de rundercellijn MDBK (epitheliale niercellen van runderen) en in het gebied van 1,5 x 4 x 10® eenheden/mg met de humane cellijn AG 1732 met uitzonde-30 ring van γ5 dat een activiteit heeft van 0,9 x 10® eenheden/mg op rundercellijn MDBK en slechts een activiteit van 2 x 106 eenheden/mg op humane cellijn AG 1732. De moleculegewichten variëren tussen ongeveer 16 000 en 21 000 (zie Tabel D). De resultaten van de aminozuuranalyse zijn in Tabel E samenge-

Interferonen hebben een antivirale, anti-tumor, groeiremmende en immuunsuppressieve activiteit. Deze 35 activiteiten kunnen zelfs op klinische schaal worden vastgesteld bij een toediening van 1-10 x 106 eenheden/dag met betrekkelijk onzuivere preparaten die minder dan 1 gew.% humaan interferon bevatten, zie J. Cantell en S. Hirvonen, J. Gen. Virol. 1978, 39, 541-3. Hoewel het door deze auteurs gebruikte preparaat slechts een geringe zuiverheid bezat, is het geschikt gebleken voor toepassing bij klinisch onderzoek in mensen.

40 De gezuiverde homogene interferon-species volgens de uitvinding kunnen op gelijke wijze als de bekende interferon-preparaten worden gebruikt onder aanpassing van de dosering aan de bereikte zuiverheidsgraad. De afzonderlijke interferon-species kunnen afzonderlijk of met elkaar gemengd worden toegediend. Dergelijke mengsels kunnen of door mengen van de geïsoleerde species worden verkregen of door onderbreking van het zuiveringsproces op een plaats waar enkele interferon-species, echter geen 45 interferon-inactieve proteïnen meer aanwezig zijn.

De inductie van de interferon-productie, de primaire concentratie en de fractionering van het interferon alsmede de gel-filtratie kunnen volgens op zichzelf bekende methoden worden uitgevoerd. Deze procestrappen die een oplossing in water van interferonen in onzuivere toestand opleveren zijn geen onderwerp van de onderhavige uitvinding.

50 De uitvinding wordt door de volgende voorbeelden geïllustreerd.

Voorbeeld I

Homogeen humaan leucocyten-interferon van normale donors 55 A. Bereiding van het interferon

Interferon werd bereid door een 16 uur durende incubatie van humane leucocyten uit bloed van normale donors 107 cellen/ml) met het Newcastle-ziektevirus (15 haemagglutinine-eenheden/ml) in een serumvrij 9 193085

Eagle’s Minimaal Essential Medium, dat 10 mg/ml caseïne bevatte. Er werd een gemiddelde interferon-titer van 5 000 eenheden/ml verkregen. De toegepaste methoden kwamen in wezen overeen met die van K. E. Mogensen en medewerkers, Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369-381; E. F. Wheelock, J. Bacteriol. 92, 1415-1421 (1966) en K. Cantell en medewerkers, Appl. Microbiol. 22, 625-628 (1971).

5 Meer in het bijzonder werd deze bereiding uitgevoerd door (1) het toevoegen aan een vat van (a) gewassen leucocytcellen tot een eindconcentratie van 1 x 107 cellen/ml; (b) een caseïneoplossing tot een eindconcentratie van 10% (v/v); (c) humaan leucocyten-interferon tot een eindconcentratie van 10 eenheden/ml en van 10 (d) Eagle’s Minimaal Essential Medium; (2) het rustig mengen van de inhoud van het vat; (3) het incuberen van de vatinhoud van 37°C gedurende een uur zonder roeren; (4) het toevoegen van het Newcastle-ziektevirus tot een eindconcentratie van 15 haemagglutine-eenheden/ ml; 15 (5) het incuberen van de vatinhoud bij 37°C gedurende een uur zonder roeren; en (6) het incuberen van de vatinhoud bij 37°C gedurende 16 uur onder voldoende roeren voor het mild suspenderen van de cellen.

De interferon-titers werden met een proef op basis van de remming van het cytopathische effect bepaald, die binnen 16 uur kon worden uitgevoerd. Alle interferon-titers zijn in eenheden/ml aangegeven, gecali-20 breerd tegen de referentiestandaard voor humaan leucocyten-interferon van het instituut ’’National Institute of Health’’ (Verenigde Staten van Amerika).

B. Concentrering en eerste fractionering van interferon

Deze trap werd, voorzover niet anders is aangegeven, bij een temperatuur van 0-4°C uitgevoerd. Na 25 beëindiging van de incubatie werden de cellen en de celresten door centrifugeren (15 min., 500 x g) als pellet verwijderd. Het caseïne werd door aanzuren van de bovenstaande vloeistof met IN HCI tot pH 4,0 geprecipiteerd. Na 2 uur werd het mengsel gecentrifugeerd (10 min., 12 000 x g) en het neerslag werd als afvalproduct afgevoerd. De bovenstaande vloeistof (10 liter) werd op een gehalte van 1,5% (w/v) trichloor-azijnzuur ingesteld. Na 1 uur werd het precipitaat door centrifugeren afgescheiden (10 min., 12 000 x g) en 30 weer opgelost in 50 ml 0,1 M NaHC03. Na toevoeging van 0,5 g Triton X-100 en 1,5 ml azijnzuur (druppelsgewijs onder roeren bij 0°C) werd het mengsel 1 uur bij 0°C en daarna 16 uur bij -20°C bewaard. Nadat het mengsel was ontdooid werd het mengsel 10 minuten gecentrifugeerd (17 000 x g). Het daarbij verkregen neerslag werd als afvalproduct afgevoerd en de bovenstaande vloeistof werd op 4% trichloorazijnzuur ingesteld. Na 1 uur op 0°C werd het mengsel 10 minuten gecentrifugeerd (12 000 x g) en het verkregen 35 neerslag werd in 5 ml 0,5 M NaHC03 opgelost.

C. Gel-filtratie

Aan de verkregen geconcentreerde interferon-oplossing werd 1,5 g ureum toegevoegd ter voorkoming van aggregatie van het interferon in oplossing, waarna de oplossing in een kolom werd gebracht die was gevuld 40 met Sephadex G-100, fijn, (2,6 x 90 cm) vooraf geëquilibreerd met 4 M ureum/0,1 M natriumacetaat/ azijnzuurbuffer. De kolom werd bij kamertemperatuur en met een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min. met 4 M ureum/0,1 M natriumacetaat, pH 7,5, geëlueerd. Er werden fracties van 12,5 ml opgevangen. Er werd interferon-activiteit in de fracties 19-23 geëlueerd.

45 D. HPLC

De samengevoegde fracties 19-23 van de Sephadex G-100-kolom werden direct via een pomp in een Lichrosorb RP-8-kolom (10pm; 4,6 x 250 mm) gebracht. De kolom werd vooraf geëquilibreerd met een 1 M natriumacetaat/azijnzuurbuffer (pH 7,5), die 0,01% (v/v) thiodiglycol bevatte en met een lineaire gradiënt van n-propanol in dezelfde buffer [1 uur, 0-20%; 3 uur, 20-40% (v/v)] bij een doorstroomsnelheid van 0,25 50 ml/min. geëlueerd. Er werden fracties van 0,75 ml opgevangen. Het interferon werd in de fracties 23-40 [25-30% (v/v) n-propanol geëlueerd.

De fracties 27-33 die het grootste gedeelte van de interferon-activiteit bevatten, werden gecombineerd, daaraan werd n-propanol tot een eindconcentratie van 80% (v/v) toegevoegd en direct via een pomp in een Lichrosorb-diol-kolom (10 μιη; 4,6 x 250 mm) gebracht, die vooraf was geëquilibreerd met een oplossing 55 van 0,1 M natriumacetaat/azijnzuurbuffer met een gehalte van 80% (v/v) n-propanol. De kolom werd vervolgens in 4 uur met een lineaire gradiënt van 72-50% (v/v) n-propanol in 0,1 M natriumacetaat/ azijnzuurbuffer bij een doorstroomsnelheid van 0,25 ml/min. geëlueerd. Er werden fracties van 0,75 193085 10 opgevangen. De interferon-activiteit werd in de vorm van drie duidelijke hoofdpieken geëlueerd die kwantitatief van preparaat tot preparaat varieerden. Deze pieken werden in de volgorde van de eluering α, β en γ genoemd. De a-fractie werd bij een concentratie van 68% n-propanol geëlueerd, de β-fractie bij een concentratie van 66,5% n-propanol en de γ-fractie bij een concentratie van 65,5% n-propanol. De totale 5 opbrengst aan interferon-activiteit was groter dan 80%.

De tot een enkele piek behorende fracties werden samengevoegd en in volgende processtappen verder gezuiverd. Daar de piek γ veruit de grootste was en van andere componenten het beste gescheiden scheen te zijn werd deze voor de verdere zuivering gekozen. De fracties 54—56 van de diol-kolom die de piek γ bevatten werden samengevoegd en het n-propanol werd door twee extracties met gelijke hoeveelheden 10 hexaan verwijderd. Sporen hexaan werden door een stikstofstroom verwijderd. Er werden pyridine en mierenzuur tot eindconcentraties van respectievelijk 1 M en 2 M toegevoegd, waarna de oplossing in een Lichrosorb RP-8-kolom (10 μιτι; 4,6 x 250 mm) werd gebracht die tevoren was geëquilibreerd met 1 M pyridine en 2 M mierenzuur, pH 4,0. De kolom werd 3 uur met een lineaire gradiënt van n-propanol (20-40%) in 1 M pyridine/formaat-buffer bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min. geëlueerd. Er werden 15 fracties van 0,6 ml opgevangen. De hoofdpiek van de activiteit kwam overeen met een interferonpiek. De fracties 45 en 46 (32% (v/v) propanol) die in overeenstemming waren met deze piek werden samengevoegd en onder gelijke omstandigheden opnieuw gechromatografeerd. Interferon werd in fractie 31 geëlueerd (32% (v/v) propanol). De berekende specifieke activiteit van deze fractie vergeleken met runderserumalbumine was 4x10® eenheden/mg. Dit materiaal werd voor de verdere karakterisering gebruikt. De fluorescentie-20 profielen van de HPLC waren zodanig goed reproduceerbaar, dat zij een constante uitkomst van de totale werkwijze opleverden.

De resultaten van de zuivering zijn in Tabel A samengaat. De totale zuivering, uitgaande van het incubatiemedium tot de tweede RP-8-kolom, was 60 000- tot 80 000-voudig. De cumulatieve opbrengst van trap 1 tot de diol-trap was ongeveer 30-50%. Na deze trap werd elk van de drie interferon-pieken apart 25 verder gezuiverd.

TABEL A

Zuivering van humaan leucocyten-interferon 30 Eenheden Interferon Relatieve Zuiverheids- Opbrengst per gevonden x gevonden specifieke graad trap (gew.%) 10® (mg) activiteit (eenheden/mg) 35 1. incubatiemedium 50 1 0 000 5 x 103 1 - 2. pH 4 bovenstaande vloeistof 50 2 000 2,5 x 104 5 1 00 3. 1,5% trichloorazijnzuur- neerslag 40 1 000 2,5 x 104 8 80-100 40 4. Triton X-100/azijnzuur- bovenstaande vloeistof 40 250 1,6x 105 3 2 70-100 5. 4% trichloorazijnzuur- neerslag 35 1 75 2 x 105 4 0 80-90 6. Sephadex G-100 32 57 5,6x 105 112 70-90 45 7. Uchrosorb RP-8 (pH 7,5) 28 11 2,5x10® 500 80-100 8. Lichrosorb-diol pieka 11 1,1 1 x 107 5 000 piek β 2,5 nb nb nb 70-90 piek γ 12,5 0,21 6x 107 1 2 000 50 9. Lichrosorb RP-8 (pH 4) 1,6 0,0064 3x 10® 60 000 40-60 10. Lichrosorb RP-8 (pH 4) 8,2 0,021 4x 10® 80 000 40-60

Ter bepaling van het in deze fracties aanwezige interferon werd runderserumalbumine als standaard gebruikt. De absolute specifieke activiteit die door aminozuur-analyse van de homogene piek van trap 10 werd bepaald, was 2—4 x 10e eenheden/mg (zie tekst). De trap 9 werd met de piek γ uit de trap 8 uitgevoerd. De trap 10 werd met het samengevoegde materiaal uit de trap 9 van verschillende preparaten 55 uitgevoerd, nb: niet bepaald.

11 193085 E. Polyacrylamide gel-elektroforese

Interferon-monsters (1,5x105 eenheden) werden met SDS en 2-mercaptoethanol geïncubeerd en op een plaat gebracht met daarop een gel. Na de elektroforese werd na verving met Coomassie-blauw een enkele scherpe band verkregen. Het bepaalde schijnbare moleculegewicht was 17 500 (in vergelijking met 5 standaard-interferonen). De gel werd in stroken van 1 mm gesneden. Elke strook werd in 0,4 ml 0,5 M NaHCOg/OI,% SDS gehomogeniseerd en op interferon-activiteit onderzocht. Er werd een enkele piek met antivirale activiteit gevonden, die overeenkwam met de enige proteïne-band.

F. Aminozuuranalyse 10 De aminozuuranalyse van het homogene humane leucocyten-interferon (piek γ) werd met de fluorescamine-aminozuur-analysator aan monsters van 0k,5-1 μg van natief en S-carboxymethyl-interferon uitgevoerd. Ter bepaling van de cysteïne/-cystine-verhouding werd natief interferon gecarboxymethyieerd en vervolgens in 6 M HCI onder reducerende omstandigheden (0,1% thioglycolzuur) gehydrolysserd. Onder deze omstandigheden werd cysteine als S-carboxymethylcysteïne en cystine als vrij cysteine gemeten. De resultaten van de 15 aminozuuranalyse zijn in Tabel B samengevat. De bepaalde specifieke activiteit, betrokken op het aminozuurgehalte was 2-4 x 10® eenheden/mg.

TABEL B

Aminozuursamenstelling van humaan leucocyten-interferon 20 -

Aminozuur Resten

Asx 15,2+1,2 thr* 7,5+0,5 25 ser* 8,0±0,5 glx 24,0±0,6 pro 6,3±0,3 gly 5,5±0,5 ala 8,2+0,2 30 cys (totaal) 3,3±0,7 1/2cystin+ 1,8+0,2 cysteïne+ 1,5+0,5 val 7,8+0,2 met 3,9±0,2 35 ile 8,9±0,4 leu 21,8±1,3 tyr 5,1 ±0,2 phe 9,1 ±0,3 his 3,3+0,4 40 lys 11,6+0,5 arg 7,3±0,5 trp++ 0,7+0,1 * gecorrigeerd en betrokken op de tijd 0 gemeten na carboxymethylering van natief interferon 45 ++ gemeten na hydrolyse in 6 M HCI/4% thioglycolzuur.

Voorbeeld II

Homogeen humaan leucocyten-interferon uit leucocyten van ieukaemiepatiënten Het interferon werd verkregen door incubatie van humane leucocyten, geïsoleerd uit het bloed van 50 leukaemie-patiënten (chronische meyelogene leukemie, CML) door leukoforese, met virus van de Newcastle-ziekte in een serumvrij caseïne bevattend medium. De interferon-titers waren ongeveer 5 000-40 000 eenheden/ml.

De zuiveringswerkwijze was gelijk aan die van Voorbeeld I voor interferon uit bloed van normale donors en omvatte 55 - de selectieve precipitatie van verontreinigingen door 0,5 M azijnzuur bij aanwezigheid van Triton X-100; - de gel-filtratie aan Sephadex G-100 in 4 M ureum; - HPLC bij pH 7,5 aan Lichrosorb RP-8; - HPLC aan Lichrosorb-diol; en - HPLC aan Lichrosorb RP-8 bij pH 4,0.

De van de Lichrosorb-diol-kolom afkomstige fracties die overeenkwamen met respectievelijk de α-, β- en γ-pieken werden samengevoegd en vervolgens afzonderlijk van elkaar in verdere trappen gezuiverd.

5 Uit de samengevoegde fracties 43-46 (α-piek) werd n-propanol door twee extracties met gelijke hoeveelheden n-hexaan verwijderd. Sporen hexaan werden door een stikstofstroom verwijderd. Er werden pyridine en mierenzuur tot eindconcentraties van respectievelijk 1 M en 2 M toegevoegd, waarna de verkregen oplossing in een Lichrosorb RP-8-kolom (10 μτη, 4,6 x 250 mm) werd gebracht, die vooraf met 1 M pyridine/2M mierenzuur (pH 4,0) was geëquilibreerd. De kolom werd in 3 uur met een lineaire 10 n-propanol-gradiënt (20-40%, v/v) in 1 M pyridineformiaat-buffer bij een doorstroomsnelheid van 0,2 ml/min. geëlueerd. Er werden fracties van 0,6 ml opgevangen. De interferon-activiteit werd in brede pieken bij concentraties tussen 31 en 35% (v/v) n-propanol geëlueerd. Deze fracties werden samengevoegd en onder gelijke omstandigheden opnieuw gechromatografeerd. De interferon-activiteit werd in twee hoofdpieken α., en a2) bij 31 en 32% (v/v) n-propanol geëlueerd. Ondergeschikte componenten werden bij een concentratie 15 van 34% (v/v) n-propanol geëlueerd.

De samengevoegde fracties 47-50 (piek β) van de lichrosorb-diol-kolom werden op gelijke wijze verder opgewerkt en aan Lichrosorb RP-8 gechromatografeerd zoals voor de piek α is beschreven. De interferon-activiteit werd in twee hoofdpieken geëlueerd: β2 bij 32% (v/v) n-propanol en β3 bij 34% (v/v) n-propanol. Opnieuw chromatograferen was in dit geval niet vereist. In enkele preparaten kon een piek β, bij 31% (v/v) 20 n-propanol worden vastgesteld.

De samengevoegde fracties 52-54 (piek γ) van de Lichrosorb-diol-kolom werden op gelijke wijze opgewerkt en aan Lichrosorb RP-8 gechromatografeerd, zoals voor de piek α is beschreven. De interferon-activiteit werd in vijf hoofdpieken geëlueerd: γ, (bij 31% (v/v) n-propanol), γ2 (bij 32% (v/v) n-propanol), γ3 (bij 34% (v/v) n-propanol), γ4 (bij 35% (v/v) n-propanol) en γ5 (bij 35% (v/v) n-propanol). Opnieuw chromatogra-25 feren was in dit geval niet vereist.

De resultaten van de zuivering ter verkrijging van de afzonderlijke interferon-species zijn in Tabel C samengevat.

De species a2 en β2 kunnen verder worden onderscheiden door de elueringskarakteristieken daarvan aan Lichrosorb-diol; a2 werd geëlueerd met 68%’s (v/v) n-propanol en β2 met 66,5%’s (v/v) n-propanol.

30 Monsters van de interferon-species (1,5 x 101 2 3 4 5 eenheden) werden met SDS en 2-mercaptoethanol geïneubeerd en op een plaat gebracht met daarop een gel. Na elektroforese leverden de pieken α„ a2, β2, yu γ2 en γ4 elk een afzonderlijke band op, terwijl de pieken β3, γ3 en γ5 elk twee banden opleverden. De schijnbare moleculegewichten lagen tussen 16 000 en 18 000, met uitzondering van β3 die een band bij 16 500 en een band bij 21 000 had en γ4 die een band bij 21 000 opleverde (zie Tabel D).

35

TABEL C

Zuivering van leucocyten-interferon uit CML-cellen

Trap Eenheden Proteïne Specifieke Zuiverheids- Opbrengst 40 gevonden x gevonden activiteit**) graad (gew.%) 10*6 (mg) (eenheden/mg) incubatiemedium 800 20x 103 4x 104 1 100 2 pH 4 bovenstaande 45 vloeistof 800 4 x 103 2 x 105 5 1 00 3 1,5% trichloorazijnzuur- neerslag 780 2x 103 3,9x 105 9,8 97 4

Triton X-100/azijnzuur- bovenstaande vloeistof 760 510 1,5x 106 37,5 95 50 5. 4% trichloorazijnzuur- 5 neerslag 810 350 2,3 x 106 57,5 1 00 6

Sephadex G-100 660 130 5,1 x 106 128 82 13 193085 TABEL C (vervolg)

Zuivering van leucocyten-interferon uit CML-cellen

Trap Eenheden Proteïne Specifieke Zuiverheids- Opbrengst 5 gevonden x gevonden activiteit**) graad (gew.%) 10'6 (mg) (eenheden/mg) 8. Lichrosorb-diol piek α 149 5 3x 107 750 10 piek β 148 3 5x 107 1 250 piek γ 139 1,7 8 X 107 2 000

Totaal 436 54 9. Lichrosorb RP-8 (pH 4.0) 15 piek a, * 9 35 x 10‘3 2,6x10® 6 500 piek a2 * 26 65 x 10'3 4,0x10® 10 000 piek β2 30 75 x 10‘3 4,0x10® 10 000 piek β3 13 32 x 10'® 4,0x10® 10 000 piek Y1 15 58 x 10.3 2,6x 10® 6 500 20 piek γ2 31 77 x 10‘3 4x10® 10 000 piek γ3 26 74 x 10‘3 3,5x10® 8 750 piek y4 3,5 10x10'® 3,5x10® 8 650 piek γ5 4,5 50 x 10'3 0,9x10® 2 250 25 Totaal 158 20 * na opnieuw chromatograferen.

** activiteit bepaald aan MDBK-cellen (rund); interferon gemeten met serumalbumine als standaard.

30 TABEL D

MWr *** Spec. act. aan Spec. act. aan AG Groeiremmende ± 1 000 MDBK (rundercellen, 1732 (Humane activiteit** eenheden/mg ± 25% cellen; eenheden/ 35 mg) ± 50% α1 16 500 2,6x 10® 2,6x10® + a2 16 200 4x 10® 3x10® + β2 16 500 4x 10® 2x10® + 40 β3* 21 000 4x 10® 3x10® + γ, 17 700 2,6x 10® 2x10® + y2 17 700 4x 10® 1,5x10® + y3* 17 200 3,5x 10® 1,5 χ107 + γ4 21 000 3,5x 10® 4x10® + 45 Υ5 16 500 0,9x 10® 2x10® + * 2 banden bij SDS-polyacrylamide-gel-elektroforese; moleculegewicht van de hoofdband.

** methode van Stewart en medewerkers, Nature 262, 300 (1976).

*** moleculegewichten 50 De aminozuuranalyse van de gezuiverde humaan leucocyten-interferonfracties werd met een fluorescamine-aminozuuranalysator aan monsters van 0,1-1 μg uitgevoerd. De hydrolyse werd in 6 N HCI onder reducerende omstandigheden (0,1% thioglycolzuur) uitgevoerd. De resultaten van de analyses zijn in Tabel E samengevat.

TABEL E

Species α1 a2 β2 β3* γ, γ2 γ3* γ4 γ5* 5 MWr ** 16 500 16 200 16 500 21 000 17 700 17 700 17 200 21 000 16 500

Resten 142 139 142 181 153 153 148 180 142 asx 13,8 11,7 11,5 18,2 13,1 13,3 15,0 17,9 13,8 10 thr 7,7 8,3 9,0 9,9 8,4 9,6 8,6 7,3 7,6 ser 9,2 10,0 10,0 14,5 10,2 7,8 10,1 13,5 9,0 glx 20,3 20,5 21,9 28,5 23,9 25,0 22,8 27,0 20,8 pro 6,1 4,9 5,0 5,9 4,5 4,8 4,8 6,5 4,2 gly 5,1 4,5 5,0 3,6 5,7 5,0 3,2 4,8 4,0 15 ala 8,4 8,3 7,9 11,5 8,7 8,1 9,3 10,4 9,3 val 7,4 6,2 6,7 7,5 7,3 7,0 5,5 7,9 5,1 met 3,7 3,8 4,4 6,0 4,3 3,9 5,6 4,9 4,7 ileu 7,4 7,0 7,4 9,5 7,9 8,0 6,8 9,7 6,6 leu 18,0 18,0 18,9 24,4 20,3 20,1 20,5 24,1 19,6 20 tyr 4,0 4,4 4,6 5,0 4,8 4,8 3,7 5,0 3,6 phe 6,9 8,0 8,7 9,9 8,6 9,0 7,2 9,1 6,4 his 3,0 2,8 3,0 3,8 3,7 3,3 2,9 3,8 2,8 lys 10,5 9,0 8,5 9,3 10,1 10,0 7,6 12,3 12,0 arg 6,2 7,1 8,0 10,8 8,0 8,5 10,1 8,5 9,0 25 cys 3,9 4,0 1,8 2,3 3,3 2,9 3,1 4,1 2,3

Nauwkeurigheid ± 1,5 resten * beide banden gemengd.

** moleculegewicht.

30 Trypsine-splitsing en HPLC van de fragmenten

Telkens 300 pmol van de gezuiverde humaan leucocyten-interferon-species werden in waterrijk natrium-waterstofcarbonaat (50 mmol, pH 8, 50 μΙ) opgelost. Na toevoegen van telkens 0,1 pg trypsine in 2 μΙ HCI (pH 3) werd 14 uur bij 37°C geïncubeerd, waarna telkens 5 μΙ azijnzuur werden toegevoegd. De mengsels werden elk in een Lichrosorb RP-8-kolom (deeltjesgrootte 10μητι; 4,6 x 250 mm) gebracht. De kolom werd 35 in één uur met een lineaire gradiënt van 0-40% (v/v) n-propanol in een 0,1 M mierenzuur/0,03 M pyridine-buffer (pH 3) bij een doorstroomsnelheid van 0,5 ml/min. geëlueerd.

De fragmenten werden volgens de fluorescamine-methode aangetoond. De resultaten zijn in Tabel F samengevat, waarbij de positie van de pieken als percentage n-propanol en de relatieve grootte van de fragmenten zijn aangegeven (k=klein; m=middelmatig groot; g=groot).

40

TABEL F

Tryptische peptiden van de humaan leucocyten-interferon Species eluering bij % n-propanol 45 - αΛ 3g, 4g, 4,2m, 11,5m 12,5k, 14,5m 16k, 18m, 20k, 21 k, 22,5k 29m a2 3g, 4g, 4,2m, 11,5m, 12,5k, 14,5m, 16k, 18m, 27k, 29m β2 3g, 4g, 4,2m, 11,5m, 12,5k, 14,5m, 16k, 17,5k, 18m, 29m β3 3k, 4k, 4,2m, 4,5k, 10m, 12,5k, 14k, 14,5m, 16k, 18g, 19,5m 27m, 32m 50 γ1 3g, 4g, 4,2m 4,5k, 5k, 6,5k, 11,5k, 12,5k, 14,5m, 16k, 17,5m, 18m, 29m γ2 3g, 4g, 4,2m, 4,5k, 5k, 11,5k, 12,5k, 14,5m, 16k, 18g, 29m γ3 3m, 4m, 4,2m, 11,5m, 12,5k, 13,5k, 14,5m, 16k, 18g, 20k, 32m

Ys 3g, 4g, 4,2m 4,5m, 7k, 7,5k, 10k, 11,5g, 12,5k, 14k, 14,5m, 16k, 18g, 24,5k, 25,5k, 32k

De gezuiverde human leucocyten-interferonspecies werden aan een aminosuikeranalyse onderworpen, waarmede aminosuikers in het gebied van 50-100 pmol kunnen worden vastgesteld. In alle gevallen werd 55

Claims

1. Werkwijze voor de winning van humaan leucocyten-interferon door toepassing van een chromotografi-sche techniek, met het kenmerk, dat men het humane leucocyten-interferon in homogene vorm wint doordat men A. een oplossing in water van interferon in onzuivere toestand onder HPLC-omstandigheden door een 40 met een buffer geëquilibreerde kolom op basis van een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix stuurt, waarbij het interferon eerst wordt geadsorbeerd en daarna met een stijgende gradiënt van n-propanol in een buffer met een pH van ongeveer 7,5 wordt geëlueerd, zodat het interferon in bepaalde fracties van het eluaat in een meer zuivere vorm wordt verkregen; B. de in trap A. verkregen bepaalde fracties onder HPLC-omstandigheden door een met een buffer 45 geëquilibreerde kolom op basis van een door glycerylgroepen gemodificeerde Si02-matrix stuurt, waarbij het interferon eerst wordt geadsorbeerd en daarna met een dalende gradiënt van n-propanol in een buffer met een pH van ongeveer 4,0 wordt geëlueerd, zodat het interferon in karakteristieke hoofdpieken in bepaalde fracties van het eluaat in een meer zuivere vorm wordt verkregen; C. de in trap B. verkregen fracties die in overeenstemming zijn met de karakteristieke hoofdpieken, 50 onder HPLC-omstandigheden door een met een buffer geëquilibreerde kolom op basis van een door octylgroepen gemodificeerde Si02-matrix stuurt, waarbij het interferon eerst wordt geadsorbeerd en daarna met een mengsel van n-propanol en een water bevattende buffer wordt geëlueerd zodat men het interferon in een enkele karakteristieke piek in bepaalde fracties van het eluaat als homogeen proteïne verkrijgt en desgewenst de trap C. herhaalt voor het bereiken van maximale zuiverheid van het product. 55

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men in trap A. 1 M natriumacetaat/azijnzuur als buffer gebruikt en dat men de n-propanol-gradiënt van 0 tot 40% n-propanol doet stijgen, dat men om trap B. 0,1 M natriumacetaat/azijnzuur als buffer gebruikt en dat men de n-propanol-gradiënt van 72,5 tot 50% 1193085 16 doet dalen en dat men in trap C. 1 M pyridine/2 M mierenzuur als buffer gebruikt en dat men een van 20 tot 40% (v/v) stijgende n-propanol-gradiënt instelt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men de fracties die tot een der karakteristieke hoofdpieken dienen te worden gerekend samenvoegt, dat men het n-propanol door extractie met n-hexaan 5 verwijdert en dat men vóór trap C. sporen van n-hexaan uit de water bevattende fase verwijdert.

4. Farmaceutisch preparaat, dat humaan leucocyten-interferon bevat, met het kenmerk, dat het humaan leucocyten-interferon bevat dat is verkregen door toepassing van de werkwijze volgens een der conclusies