NO151157B

NO151157B - Fremgangsmaate til rensing av hoeymolekylaere proteiner, saerlig interferoner, ved hoeytrykksvaeskekromatografi (hplc)

Info

Publication number: NO151157B
Application number: NO793819A
Authority: NO
Inventors: Sidney Pestka; Menachem Rubinstein
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-11-23
Publication date: 1984-11-12
Also published as: CH653347A5; AU1586683A; ES8100502A1; IL58759A0; DE2947134A1; PT70495A; IL58759A; CA1129409A; GR72828B; CH658459A5; DK496779A; DE2947134C2; FR2442054A1; FI793649A; BE880201A; US4289690A; NO151157C; GB2037296A; NL193085C; FI69476B

Description

Rensingen av proteiner har lenge vært et problem i peptidkjemien. De teknikker som anvendes for dette formål er .utfelling, gelfiltrering, ionebyttekromatografi, gelelektroforese, affinitets-kromatografi og mange andre. Fremgangsmåter for isolering av naturlige forekommende, høymolekulære proteiner som forekommer i ekstremt lave konsentrasjoner i biologisk materiale omfatter flere av de foran nevnte metoder. I mange tilfeller må over-ordentlig store mengder av råmateriale anvendes og behandles på grunn av de store tap under den totale prosess. Derav følger at rensningsmetodene for slike proteiner er særdeles arbeids-krevende og dyre. Et godt eksempel på dette er de forskjellige forsøk på isolering og karakterisering av interferon. Siden oppdagelsen av dette ved Isaacs og Lindenmann i året 1957 har forskere over hele verden i to årtier forgjeves forsøkt å

isolere interferon både fra leukozyter og fibroblaster som homogent peptid i slike mengder som ville muliggjøre en karakterisering og bestemmelse av dets spesifike biologiske og kje-miske egenskaper.

I U.S. patent 3 699 222 som omhandler de første arbeidene til Isaacs og Lindenmann over interferon, består rensingen av det aktive materiale bare i en ammoniumsulfatfelling og etterfølgende dialyse. Da en slik metode er relativt uspesifik er det erholdte produkt fremdeles svært urent.

En flertrinnsmetode for rensing av interferon beskrives i U.S. patent 3 414 6 51 hvilken omfatter de følgende skritt: selektiv adsorpsjon på amorft aluminium-silikat, eluering med jod- eller tiocyanat-løsning, ytterligere felling av uønskede proteiner med vandig HC1 og vandig natronlut, felling av interferon ved hjelp av løsningsmidler som er blandbare med vann så som meta-noi, etanol eller aceton og til slutt kromatografi av det gjen-oppløste interferon på en ionebytterharpiks så som 2-dietyl-aminoetyl-cellulose. Gjennom denne rensemetoden kunne den spesifike aktiviteten til .interferonet økes med faktoren 6000. Som spesifike interferoner nevnes i U.S. patentet kylling- og ape-i nterferon.

En ytterligere rensemetode beskrives i U.S. patent 3 975 344 ifølge hvilket en løsning av urenset human-fibroblast-interferon ble renset gjennom densitetsgradient-ultrasentrifugering. Det ble angitt at ifølge denne metoden oppnås et høyere utbytte og renhet enn ved metoden under anvendelse av søylekromatografi på Sephadex G-100.

De følgende oppførte publikasjoner beskjeftiger seg likeledes med rensing og forsøk på karakterisering av Interferoner: Knight, E., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 73, 520-3 (1976);

Torma, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251, 4810-6 (1976),"

Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 252, 6585-7 (1977); DeMaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271, 622-5 (1978); Kawakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253, 598-602 (1978); Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-11 (1978); Jankowski, W.J. et al., J. Virology 16, 1124-30 (1975);

Davey M.W. et al., J. Biol. Chem. 251, 7620-5 (1976);

Chadha, K.C. et al., Biochemistry 1/7, 196-200 (1978).

Selv om det i mange av de ovenfor nevnte publikasjoner på-

stås at muse- eller human-interferoner kan renses fram til homogenitet, er hverken en av de klassiske påvisninger av homogenitet av proteiner angitt eller egenskapene til de an-givelige rene forbindelser beskrevet.

Anvendelsen av høytrykks-væske-kromatografi (HPLC) for rensing

av proteiner er generelt kjent på fagområdet, hvorunder spesielt ionebytter og utelukkelseskromatografi beskrives [se eks. Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sei. 1A_, 316-20 (1976) og Chang, S.-H. et al., Anal. Chem. 48, 1839-45 (1976)].

I omvendingsfase-kromatografien er f.eks. "Lichrosorb" RP-18 (søyler på basis av oktadecyl -modifisert SiG^) anvendt med

hell for rensning av peptid så som (3-endorfin, [se f.eks. Ru-binstein, M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 7_4 , 4969-72

(1977) ] .

Den delvise karakterisering av tre interferonarter er beskrevet fra Ehrlich Ascites-Tumorceller fra mus (MW = 33 000, 26 000

og 20 000 av Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254, 3681-4

(1978) .

Hancock et al. [FEBS Lett. 1976, 72(1), side 139-42] og

Molnar et al. [Peptides, Proe. 5th Amer. Peptide Symposium, University of Calif., San Diego, 1977, Eds.: Goodmann, Mein-hofer; John Wiley & Sons, Inc., 1977, side 48-51] beskriver bare anvendelse av HPLC på peptider som er lavmolekylære i forhold til interferon. På tidspunktet for foreliggende oppfinnelse var det overraskende for fagmannen at HPLC også lot seg anvende på proteiner med en molekylvekt på over 12 000.

Disse søyler som kan anvendes etter hverandre og under forskjellige betingelser med hensyn til pH og organiske løsnings-midler gir den mulighet å rense proteiner som forekommer i ekstremt små mengder i naturlige materialer fram til homogenitet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen av den innledningsvis beskrevne art er karakterisert ved at man sender en.vandig løsning av det urene protein gjennom en søyle ekvilibrert med en puffer på basis av en porøs SiC^-matrise modifisert med cyanopropyl, cykloheksyl, fenyl, oktyl, oktadecyl eller glyserylgrupper under HPLC-betingelser, idet proteiner først adsorberes og deretter elueres med en stigende eller fallende gradient av et løs-ningsmiddel som er blandbart med vann, slik at det til slutt erholdes i ren form i bestemte fraksjoner av eluatet.

I en foretrukket utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved rensning av interferon som gir tilstrekkelige homogene mengder til for første gang å mulig-gjøre en kjemisk karakterisering av denne medisinske verdifulle substans. Den mulighet å kjemisk karakterisere interferon

utgjør et bemerkelsesverdig fremskritt i utviklingen av denne substans, da dette er en forutsetning for å syntetisere sub-

stansen enten gjennom konvensjonell peptid-syntese eller gjennom genmanipulasjon under bistand av egnede organismer, fortrinnsvis av bakterier.

Fremgangsmåten ved fremstilling av interferon som enhetlig protein er karakterisert ved at man

A) sender en vandig løsning av interferon i uren tilstand

under HPLC-betingelser gjennom en søyle på basis av SiC^-matrise modifisert med oktyl-grupper og ekvilibrert med en puffer, idet interferonet først adsorberes og deretter elueres med en stigende gradient av et løsningsmiddel som er blandbart med vann i en puffer, således at det erholdes i ren form i bestemte fraksjoner av eluatet; B) sender disse i trinn A) erholdte bestemte fraksjoner gjennom en søyle ekvilibrert med en puffer på basis av en SiC>2-matrise modifisert med glyserylgrupper, idet interferonet

først adsorberes og deretter elueres med en fallende gradient av et løsningsmiddel som er blandbart med vann i en puffer,

slik at det erholdes i ren form i utpregede hovedtopper i bestemte fraksjoner av eluatet;

C) sender disse i trinn B erholdte fraksjoner som tilsvarer

de utpregede hovedtopper under HPLC-betingelser gjennom en søyle ekvilibrert med en puffer på basis av en SiC^ matrise modifisert med oktylgrupper, idet interferonet først adsorberes og deretter elueres med en blanding av et løsningsmiddel som er blandbart med vann og en vandig puffer, således at man i en eneste, utpreget pott får det som homogent protein i bestemte fraksjoner av eluatet og om ønsket gjentar trinnet C) for å oppnå den ytterst mulig renhet av produktet.

HPLC-søyler på basis av porøs SiC^-matriks (partikkelstørrelse

= 10 u midlere porestørrelse = 100 Å) modifisert med oktyl eller glyserylgrupper, hvilke benyttes ved gjennomføringen av foreliggende oppfinnelse, er handelsvarer som kan fås f.eks. fra EM Laboratories av Elmsford, N.Y., U.S.A. under merkebetegnelsen "likrosorb RP-8" og "1 ikrosorb-diol". Ekvivalente oktyl-modif iserte porøse Si02-søyler kalt "kromegabond C-8" fås fra E.S. Indu-stries, Marlton, N.J. U.S.A.

Et egnet HPLC-system som kan anvendes i de forannevnte søyler

er beskrevet i U.S. patent nr. 4 116 046.

I utførelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse sendes løsningen av de urene høymolekylære peptid, fortrinnsvis i nærvær av en vandig puffer ved en for dette proteinet egnet pH, gjennom SiO^-søylen. Normalt skjer dette under trykk, fortrinnsvis i området fra 3,4 -340 atm. Det på søylefyllingen adsorberte protein elueres deretter trinnvis og selektivt under anvendelse av en gradient av et løsningsmiddel blandbart med vann. For dette formål egnede løsningsmiddel er f.eks. alka-noler så som n-propanol, 2-propanol, etanol, metanol, tert. bu-tanol eller cykliske etere så som dioksan. Fraksjoneringen av eluatet skjer på i og for seg kjent måte, hvorunder innholdet av det aktive protein i de enkelte fraksjoner bestemmes ved siden av meget fintfølende monitorer. Et egnet system for dette formål er beskrevet av Bohlen et al., Anal. Biochem. 67_, 438 (1975).

Det anbefales også å overvåke nærvær av det ønskede protein gjennom en egnet biologisk målemetode.

Avgjørelsen om hvilken av de to søyletyper (søyler for normal fordelingskromatografi eller søyler for omvendt fasekromatografi) og i hvilken rekkefølge søylene skal anvendes, avhenger i stor grad av type protein som skal renses. Man har funnet at f.eks.

i det spesielle tilfelle av human-leukozyt-interferon oppnås de beste resultater når man først sender den urene interferonløsning gjennom en søyle på basis av en Si02-matriks modifisert med oktyl-grupper (omvendt fasekromatografi) under anvendelse av en puffer med en pH på 7,5 (fotrinnsvis 1 M natriumacetat/eddiksyre)

og eluerer med en stigende n-propanol-gradient, deretter sender de samlede aktive fraksjoner gjennom en søyle på basis av en SiG^-matriks modifisert med glycerylgrupper i en 0,1 M natriumacetat-puffer og eluerer med en fallende n-propanol-gradient og til slutt setter de adskilte interferon komponenter på en søyle på basis av SiG^-matriks modifisert med oktylgrupper under anvendelse av en puffer med en pH på 4,0 fortrinnsvis IM pyridin/2 M maursyre, og/eller eluerer med en stigende n-propanol-gradient. På denne måten kan hver av de tre adskilte human-leukozyt-interferoner (a,0 og y) oppspaltes videre, hvorunder topper som er skarpt adskilte fra hverandre erholdes i kromatogrammet, hvilket er de rene proteiner. Gjennom den totale rensemetode som begynner med inkubasjonsmediet frem til

kromatografi på den andre SiC^-matriks modifisert med oktyl-grupper ble det oppnådd en økning av renhetsgraden med faktor 60 000 til 80 000.

I en spesiell utførelsesform av fremgangsmåten ved rensing av human-leukozyt-interferon sammenslås de i trinn B) erholdte fraksjoner som tilsvarer hovedtoppene, ekstraheres med n-heksan for å fjerne n-propanolen og befris for spor av n-heksan før trinn C) utføres.

De erholdte homogene human-leukozyt-interferon-typer

er karakterisert ved en skarp topp på de foran nevnte HPLC-søyler og gjennom et enkelt smalt bånd ved polyacrylamid-gelelektroforese på natriumdodecylsulfat (NaDodSO^) i nærvær av 2-mercaptoetanol. Ekstraksjonen av gelen gir en enkel skarp topp med antivirus aktivitet som stemmer overens med proteinbåndet. De spesifike aktiviteter for de rene interferon-typer ligger i området

.fra 2,6 - 4,0 x 10 g enheter/mg med MDBK-celler (epiteliale nyreceller fra storfe) og i området fra 1,5 - 4 x 10 g enheter/mg med human-cellelinie Ag 1732. Molekylvekten lå mellom 16 000 og 21 000 (sammenlign tabell 4, side 17). Resultatene fra aminosyreanalysen er sammenfattet i tabell 5 (side 19).

Interferonet har antivirus, antitumor-, veksthemmende- og immun-suppresiv aktivitet. Disse aktiviteter kan til og med konstateres i klinisk målestokk ved anvendelse av 1-10 x 10^ enheter/ dag med relativt urene preparater som inneholder mindre enn 1 % human-interferdn. De rensede homogene interferon-typer som erholdes kan anvendes på samme måte som de alle-

rede kjente interferonpreparater under tilpasning av doseringen til den oppnådde renhetsgrad. De enkelte interferontyper kan gis enkeltvis eller i blandinger med hverandre. Slike blandinger kan enten erholdes ved blanding av de isolerte typer eller gjennom avbrytelse av renseprosessen på et punkt hvor flere interferontyper, men ingen interferon-inaktive proteiner er til stede.

Rensemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse, selv om den bare er eksemplifisert på human-1eukozyt-interferon,. kan også benyttes for rensing av andre interferoner, f.eks. av human-fi-broplast-interferon og interferoner fra dyrekilder og for rensing av andre proteiner med en molekylvekt over 12 000.

Således er f.eks. pro-opiokortin (MW ca. 30 000) blitt renset under anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen frem til homogenitet [sml. Kimura et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76, 1756-9 (1979)]. Trekk som er egnet for å anvende fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse optimalt for rensing av andre preparater ligger innenfor området av den generelle fag-viden.

Induksjonen av interferon-produksjon, første konsentrasjon og fraksjonering av interferon inklusive gelfiltrering kan utføres ved i og for seg kjente metoder. Disse fremgangsmåtetrinn som gir en vandig løsning av interferon i uren tilstand er ikke gjenstand for foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse

illustreres gjennom de etterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Homogent humant- leukozyt- interferon fra normale kilder

A. Fremstilling av interferonet

Interferon ble fremstilt ved 16-timers inkubasjon av numan-leukozyter fra blodet til normale givere (10 7 celler/ml) med Newcastle-sykdom-virus (15 hemmagglutinin-enheter/ml) i et serumfritt minimalmedium som inneholdt 10 mg/ml Casein. Man fikk en midlere interferonstyrke på 5000 enheter/ml. De anvendte metoder tilsvarte de av Mogensen,-K.E. et al., Pharmacology and Therapeutics A. 1977, 369-381; Wheelock, E.F., J. Bacteriol. 9^2 , 1415-1421 (1966) og Cantell, K.et al., Appl. Microbiol. 22.- 625-628 (1971) angitte med noen minimale endringer. Interferonstyrken ble bestemt med en måling på basis av hemningen til den cytopatiske virkning som kunne utføres i løpet av 16 timer. Alle interferonstyrker er angitt i enheter/ml, kalibrert mot referansestandarden for human-leukozyt-interferon fra National Institut of Health (USA).

B. Konsentrering av første fraksjonering av interferon

Såfremt intet annet er angitt arbeider man ved en temperatur på 0-4°C. Etter ferdig inkubasjon ble cellene og cellerestene fjernet ved sentrifugering (15 minutter, 500 x g). Caseinet ble utfelt ved surgjøring med HC1 til pH 4,0. Etter to timer ble blandingen sentrifugert (10 minutter, 12 000 x g) og fellingen kastet. Supernatanten (10 1) ble innstilt på et innhold på 1,5 %

(vekt/volum) trikloreddiksyre. Etter 1 time ble fellingen fra-sentrifugert (10 minutter, 12 000 x g) og igjen oppløst i 50 ml 0,1 M NaIIC03. Etter tilsetning av 0,5 g "Triton" x-100 og 1,5 ml eddiksyre (dråpevis under røring) ble blandingen oppbevart 1

time ved 0°C og deretter 16 timer ved -20°C. Etter opptining ble det sentrifugert 10 minutter med 17 000 x g. Resten ble kastet og supernatanten innstilt på 4 S trikloreddiksyre. Etter 1 time ble blandingen sentrifugert 10 minutter med 12 000 x g og fellingen oppløst i 5 ml 0,5 M NaHC03.

C. Gelfiltrering

Den erholdte konsentrerte interferonløsning ble blandet med 1,5 g urea og bragt på en søyle av "Sephadex" G-100 fin (2,6 x 90 cm) forut-ekvilibrert med 4 M urea/0,1 M natriumacetatpuffer. Søy-

len ble eluert ved romtemperatur og under en gjennomløpshastig-

het på 0,5 ml/min. med 4 M urea/0,1 M natriumacetat, pH 7,5.

Det ble samlet fraksjoner på 12,5 ml. Interferon-aktivitet

ble eluert i fraksjonen 19-23.

Rensing ifølge oppfinnelsen

D. HPLC

De samlede fraksjoner 19-23 fra "Sephadex" G-100-søylen ble gitt direkte gjennom pumpen til en 'Likrosorb" RP-8-søyle (10 u, 4,6 x 250 mm). Søylen ble forekvilibrert med 1 M natriumacetatpuffer (pH 7,5) som inneholdt 0,01 % (volum/volum) tiodiglycol og eluert med en liniær gradient av n-propanol i den samme puffer [1 time, 0-20 % ; 3 timer, 20-40 % (v/v)] med en gjennomløps-hastighet på 0,25 ml/min. Det ble samlet fraksjoner på 0,75 ml. Interferonet ble eluert i fraksjonene 23-40 [25-30 % (v/v) n-propanol] .

Fraksjonene 27-33 som inneholdt den største delen av interferon-aktiviteten ble slått sammen, blandet med n-propanol til en sluttkonsentrasjon på 80 % (v/v) og direkte gjennom en pumpe satt på en "Likrosorb-Diol^søyle (10 p 4 ,6 x 250 mm) som ble f or-ekvilibrert med en løsning av 0,1 M natriumacetat med et innhold på 80 % (v/v) n-propanol. Søylen ble så eluert 4 timer med en lineær gradient på 72-50 % (v/v) n-propanol i 0,1 M natrium-acetat ved en gjennomløpshastighet på 0,25 ml/min. Det ble samlet fraksjoner på 0,75 ml. Interferon-aktiviteten ble eluert i form av tre tydlige hovedtopper som varierte kvantitativt fra preparat til preparat. Disse toppene ble i elueringsrekkefølgen kalt a,3,Y- ct-fraksjonen ble eluert ved en konsentrajson på 68 % n-propanol, &-fraksjonen ved en konsentrasjon på 66,5 % n-propanol og Y-fraksjonen ved en konsentrasjon på 65,5 % n-propanol. Det samlede utbytte av interferonaktivitet var større enn 80 %.

Fraksjonene som hører til hver topp ble slått sammen og renset videre i etterfølgende trinn. Da toppen y i særklasse var den største og synes å være best adskilt fra andre komponenter, ble den tatt ut for den videre rensing. Fraksjonene 54-56 fra diol-søylen, som inneholdt toppen y, ble slått sammen og n-propanolet ble fjernet ved to ekstraksjoner med samme mengde n-heksan. Spor av heksan ble fjernet under nitrogenstrøm. Man tilsatte pyridin og maursyre til sluttkonsentrasjonen på 1 M henholdsvis 2M og løsningen satt på en <;>,Likrosorb" R<p->8 søyle (10 u; 4,6 x 250 mm) forekvilibrert med 1 M pyridin og 2 M maursyre (pH 4,0). Søylen ble eluert 3 timer med en lineær gradient med etanol 20-40 %) i 1 M pyridin/formiat-puffer med en gjennomløpshastighet på 0,2 ml /min. Det ble samlet fraksjoner på 0,6 ml. Hovedtoppen av aktiviteten stemte overens med en proteintopp. Fraksjonene 45 og 46 (32 % (v/v) propanol) som tilsvarte denne toppen ble slått sammen og rekromatografert under samme betingelser. Interferon ble eluert i fraksjon 31 (32 % (v/v) propanol). Den spesifike aktiviteten til disse fraksjonene ble beregnet med 4 x 10 8enheter/mg sammenlignet med storfeserumalubumin. Dette materialet ble anvendt for den videre karakterisering. Fluoresensprofilen av HPLC var så godt reproduserbar at den ga et fast "fingeravtrykk" av hele fremgangsmåten.

Resultatene av rensingen er sammenfattet i tabell 1. Hele rens-ningen ut fra inkubasjonsmediet fram til andre RP-8-søylen var 60 000 - 80 000 ganger. Det kumultative utbytte fra trinn 1 til dioltrinnet lå på 30-50 %. Etter dette trinnet ble hver av de tre interferon-toppene renset videre separat.

E. Polyakrylamid gel-elektroforese

Interferonprøve' r (1,5 x 10 5" enheter) ble inkubert med Na-dcdecylsulfat og 2-merkaptoetanol og satt på en plategel. Etter elektrofore-sen fikk man etter farging med Coomassie-blått et enkelt skarpt bånd. Den tilsynelatende molekylarvekt ble bestemt med 17 500 (i sammenligning med standard proteiner). Gelen ble skåret i st-rimler på 1 mm, hver strimmel ble homogenisert i 0,4 ml 0,5 M NaHCO3/0,l % Na-dodecylsulfat og undersøkt med hensyn til interferon-aktivitet. Det ble funnet en enkel topp med antivirus-aktivitet som stemte overens med det eneste proteinbåndet.

F. Aminosyreanalyse

Aminosyreanalysen av det homogene human- leukozyten-interferon (topp y) ble utført med fluorescamin-aminosyre-analysator på 0,5 til 1 ^ig prøver av opprinnelig og S-karboksymetylert interferon. For å bestemme cystein/cystin-forholdet ble opprinnelig interferon karboksymetylert i 6 M HC1 under reduserende betingelser (0,1 % tioglykolsyre). Under disse betingelser måles cystein som S-kar-boksymetylcystein oq cystin som fritt cystein. Resultatene av aminosyreanalysen er sammenfattet i tabell 2. Den spesifike aktivitet beregnet på aminosyreinnholdet ble bestemt til 2-4 x 10 g enheter /mg.

EKSEMPEL 2

Homogent human- leukozyt- interferon fra leukozyter hos leukemi pasienter

Interferonet erholdtes gjennom inkubasjon av Human-Leukozyter isolert fra blodet til leukemi pasienter ( kronisk myelogént leukemi, CML) gjennom leukoforese med Newcastle-sykdom-virus i et serumfritt, kaseinholdig me'dium. Interferonstyrken lå på

5 000 - 40 000 enheter/ml.

Rensemetoden var den samme som beskrevet i eksempel 1 for interferon fra blod hos normale givere og omfattet den.selektive felling med 0,5 M eddiksyre i nærvær av "Triton" X-100, gelfiltrering på "Sephadex<M> G-100 i 4 M urea, HPLC ved pH 7,5 på "Likrosorb" RP-8, HPLC på "Likrosorb-Diol" og HPLC på"Lichrosorb" RP-8 ved pH 4,0.

Fraksjonene som tilsvarte a-, f}- og y-toppene fra Lichrosrob-Diolsøylen ble slått sammen og deretter adskilt renset fra hverandre i ytterligere trinn.

Fra de samlede fraksjoner 43-46 (a-topp) ble n-propanol fjernet gjennom to ekstraksjoner med sammen mengde n-heksan. Spor av heksanen ble fjernet under en nitrogenstrøm. Det ble tilsatt pyridin og maursyre til sluttkonsentrasjon på 1 M henholdsvis 2M og løsningen påført en Lichrosorb RP-8-søyle (10 yi, 4,6 x 250 mm) som var forekvilibrert med 1 M pyridin/2 M maursyre (pH 4,0). Søylen ble eluert over 3 timer med en lineær n-propanolgradient

(20 - 40 %, v/v) i 1 M pyridinformiat-puffer ved en gjennomløps-hastighet på 0,2 ml/min. Det ble samlet fraksjoner på 0,6 ml. Interferon-aktiviteten ble eluert i brede topper ved konsentrasjoner mellom 31 og 35 % (v/v). Disse fraksjoner ble kombinert og rekromatografert under samme betingelser. Interferonaktiviteten ble eluert i to hovedto<p>per (a og a2) ved 31 og 32 % (v/v) n-propanol. Underordnede komponenter ble eluert ved en konsentrasjon på 34 % (v/v) n-propanol.

De samlede fraksjoner 47-50 (topp (3) fra Lichrosorb-Diolsøylen

ble opparbeidet på samme måte og kromatografert på Lichrosorb RP-8 som beskrevet for toppen a. Interferon-aktiviteten ble

eluert i to hovedtopper: 32 vec^ 32 % (v/v) n-propanol og 3^ ved 34 % (v/v) n-propano<l.> Rekromatografering var ikke nødvendig i dette tilfelle. I noen preparater kunne man fastslå en topp 3^ ved 31 % (v/v) n-propanol.

De samlede fraksjoner 52-54 (topp y) fra"Lichrosorb-Diol<M>søylen ble opparbeidet på samme måte og kromatografert på"Lichrosorb" RP-8 som beskrevet for toppen a. Interferonaktiviteten ble eluert i 5 hovedtopper: y, (ved 31 % n-propanol, v/v), Y2 (ved 32 % n-propanol, v/v), y^ (ved 34 % n-propanol, v/v) , y^ (ved 35 % n-propanol, v/v) og y5 (ved 35,5 % n-propanol, v/v). Rekromato-graf ering var ikke nødvendig i dette tilfelle.

Resultatene fra rensingen ved fremstilling av de enkelte interferon-arter er sammenfattet i tabell 3.

Typene og 32 kan videre adskilles ved sine elueringskarakteris-tika på"Lichrosorb-Diol": elueres med 68 %-ig (v/v) n-propanol og 3 med 6 6,5 %-ig (v/v) n-propanol.

Prøver av jnterferon-typer (1,5 x IO<5> enheter) ble inkubert med NaDodSO^ og 2-mercaptoetanol og satt på en plategel. Etter elektro-forese ga toppenec^, a2,32, Y-^Y2 og y4 hver et enkelt bånd, mens toppene 3^, Y3 og y5 hver ga to bånd. De tilsynelatende molekyl-vekter lå mellom 16 000 og 18 000 ved unntagelse av 33 som ga et bånd ved 16 500 og et ved 21 000 og Y4 som ga et bånd ved 21 000 (se tabell 4). Aminosyreanalysen av rensede human-1eukozyt-interferon-fraksjoner ble utført med en fluorescamin-aminosyre-analysator på 0,1-1 ug prøve. Hydrolysen ble utført i 6N HC1 under reduserende betingelser (0,1 % tioglykolsyre). Resultatene av analysen er sammenfattet i tabell 5.

Trypsinspalting og HPLC av fragmenter

300 pmol av renset human- leukozyt-interferon-typer ble opp-løst i vandig natriumbikarbonat (50 mmol, pH 8, 50 ul). Etter tilsetning av 0,1 ug trypsin i 2 ul HC1 (ph 3) inkuberte man 14 timer ved 37°C blandet med 5 ul eddiksyre og blandingen ble satt på en"Lichrosorb" RP-8-søyle (partikkelstørrelse 10 p.) 4,6

x 250 mm). Søylen ble eluert i 1 time med en lineær gradient på 0-40 % (v/v) n-propanol i en 0,1 M maursyre/0,03 M pyridin-puffer (pH 3) ved en gjennomløpshastighet på 0,5 ml/min.

Fragmentene ble påvist ved fluorescamin-metoden. Resultatene er sammenfattet i tabell 6, hvorved posisjonen til toppene er angitt som % n-propanol og den relative størrelsen av fragmentene (S = liten; M = middelstor; L - stor) :

De rensede homan- leukozyt-interferon-typer ble underkastet en aminosukkeranalyse hvormed aminosukkeret kan konstateres i området fra 50-100 pmol. I alle tilfeller ble det funnet mindre enn en rest glukosamin, galaktosamin henholdsvis mannosamin pr. molekyl. I de fleste tilfeller interferte flere småpeptider som ble eluert i nærheten av aminosukkeret med analysen. Det er derfor mulig at de topper som ble tilordnet aminosukkerene delvis eller sogar fullstendig må tilordnes peptider.

Endelig ga et forsøk på å sekvensere 1 n-mol rent Y-> interferon ved en manuell Edman-nedbrytning som omfattet tilbake hy-drolyse og aminosyreanalyse under anvendelse av fluorescamin ingen aminosyrer i de første to cykler. Behandlingen av 100 pmol rent Y2 numan-leukozyt-interferon med leucinaminopeptidase og aminopeptidase M i 20 timer ved 3 7°C påvirket ikke den biologiske aktivitet, og i inkubasjonsmediet kunne det ikke konstateres noen aminosyrer. Ved behandling av supernantanten i et induksjonsmedie (leukozyter og Newcastle-sykdom-virus i minimalmedium) med aminopeptidase M kunne det ikke observeres noe tap av interferon-aktivitet. Dette tyder på at interferon-molekylet allerede før renseprosessen inneholder en blokkert aminoendestående aminosyre. For kontroll ble rått interferon, rent interferon og (3-kjeden av insulin inkubert sammen med aminopeptidase M. Mens insulin delvis ble nedbrutt (aminosyrer påviselige) inntraff ikke noe tap av interferon-aktivitet.

Claims

1. Fremgangsmåte ved rensning av proteiner med en molekylvekt over 12 000, karakterisert ved at man sender en vandig løsning av det urene protein gjennom en søyle ekvilibrert med en puffer på basis av en porøs Si02- matrise modifisert med cyanopropyl, cykloheksyl, fenyl, oktyl, oktadecyl eller glyserylgrupper under HPLC-betingelser, idet proteiner først adsorberes og deretter elueres med en stigende eller fallende gradient av et løsningsmiddel som er blandbart med vann, slik at det til slutt erholdes i ren form i bestemte fraksjoner av eluatet.

2. Fremgangsmåte ved rensing av proteiner med molekylvekt over 12 000 ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender en søyle på basis av en porøs Si02~matrise modifisert med oktyl eller glyserylgrupper.

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av interferon som homogent protein ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at man,A) sender en vandig løsning av interferon i uren tilstand under HPLC-betingelser gjennom en søyle på basis av Si02~matrise modifisert med oktyl-grupper og ekvilibrert med en puffer, idet: interferonet først adsorberes og deretter elueres med en stigende gradient av et løsningsmiddel som er blandbart med vann i en puffer, således at det erholdes i ren form i bestemt fraksjoner av eluatet', B) sender disse i trinn A) erholdte bestemte fraksjoner gjennom en søyle ekvilibrert med en puffer på basis av en Si02~matrise modifisert med glyserylgrupper, idet interferonet først adsorberes og deretter elueres med en fallende gradient av et løs-ningsmiddel som er blandbart med vann i en puffer, slik at det erholdes i ren form i utpregede hovedtopper i bestemte fraksjoner av elutatet )C) sender disse i trinn b) erholdte fraksjoner som tilsvarer de utpregede hovedtopper under HPLC-betingelser gjennom en søy-le ekvilibrert med en puffer på basis av en Si02 matrise modifisert med oktylgrupper, idet interferonet først adsorberes og deretter elueres med en blanding av et løsningsmiddel som er blandbart med vann og en vandig puffer, således at man i en eneste, utpreget pott får det som homogent protein i bestemte fraksjoner av eluatet og om ønsket gjentar trinnet C) for å oppnå den ytterst mulig renhet av produktet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man går ut fra human- interf eron.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at man går ut fra leukozyt- interferon.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man som vannblandbart løsningsmiddel anvender en al-kanol eller en cyklisk eter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man som vannblandbart løsningsmiddel anvender n-propanol, i trinn A) en puffer med en pH på 7,5 og i trinn B) en puffer med en pH på 4,0.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at man i trinn A) som puffer anvender 1 M natriumacetat /eddiksyre og n-propanol-gradienten stiger fra 0-40 % (v/v) , at man i trinn B) som puffer anvender 0,1 M natrium-acetat og n-propanol-gradienten avtar fra 72,5-50 % (v/v) og at man i trinn C) som puffer anvender 1 M pyridin/2 M maursyre og innstiller en fra 20-40 % (v/v) stigende n-propanol-gradient.