LU81918A1

LU81918A1 - Gereinigte proteine und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: LU81918A1
Application number: LU81918A
Authority: LU
Inventors: S Pestka; M Rubinstein
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-11-22
Publication date: 1981-06-04
Also published as: CH653347A5; AU1586683A; ES8100502A1; IL58759A0; DE2947134A1; PT70495A; IL58759A; CA1129409A; GR72828B; CH658459A5; DK496779A; DE2947134C2; FR2442054A1; FI793649A; BE880201A; US4289690A; NO151157C; GB2037296A; NL193085C; FI69476B

Description

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F.Hoffmann-La Roche + Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz RAN 4100/12

Gereinigte Proteine und Verfahren zu deren Herstellung 5

Die Reinigung von Proteinen ist seit langem ein Pro-10 blem in der Peptidchemie. Die zu diesem Zweck angewandten Techniken umfassen die Präzipitation, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie und viele andere. Verfahren zur Isolierung natürlich vorkommender, hochmolekularer Proteine, 15 die in biologischem Material in extrem geringen Konzentrationen Vorkommen, umfassen eine Vielzahl der vorstehend genannten Methoden. In vielen Fällen müssen ausserordentlich grosse^ Mengen des Rohmaterials eingesetzt und verarbeitet werden im Hinblick auf die grossen Verluste wäh-20 rend des gesamten Prozederes. Daraus ergibt sich, dass die Reinigungsverfahren für derartige Proteine ausserordentlich aufwendig und teuer sind. Ein gutes Beispiel stellen diesbezüglich die verschiedenen Versuche der Isolierung und Charakterisierung des Interferons dar. Seit i 25 seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957, hat das Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus - Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von For schern in der ganzen Welt erfolgreich widerstanden, die a unternommen wurden, um es als homogenes Peptid in solchen 30 Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben würden.

Mez/15.10.79 35 - ί • * - 2 -

Im U.S. Patent 3 699 222, welches die ersten Arbeiten von Isaacs und Lindenmann über das Interferon zum Gegenstand hat, besteht die Reinigung des aktiven Materials lediglich in einer Ammonsulfatfällung und anschlies-5 sender Dialyse. Da ein derartiges Verfahren relativ un- spezifisch ist, ist das erhaltene Produkt noch ausserordentlich unrein.

Ein Mehrstufenverfahren zur Reinigung von Interferon 10 wird in Ü.S. Patent 3 414 651 beschrieben, das die folgenden Schritte umfasst: selektive Adsorption an amorphem Alumino-silikat, Elution mit Jod- oder Thiocyanat-Lösung, weitere Fällung unerwünschter Proteine mit wässriger HCl und wässriger Natronlauge, Fällung des Interferons mittels 15 mit Wasser mischbarer Lösungsmittel wie Methanol, Aethanol oder Aceton und schliesslich Chromatographie des wieder aufgelösten Interferons an einem Ionenaustauschharz wie 2-Diäthylaminoäthyl-cellulose. Durch dieses Reinigungsverfahren konnte die spezifische Aktivität des Interferons 20 um den Faktor 6000 erhöht werden. Als spezifische Inter-ferone wurden in dem Ü.S. Patent Kücken- und Affen-Inter-feron genannt.

Eine weitere Reinigungsmethode wird in Ü.S. Patent ' 25 3 975 344 beschrieben, gemäss dem eine Lösung von unge reinigtem Human-Fibroblasten-Interferon durch Dichtegra- - ~ dient-Ultrazentrifugation gereinigt wurde. Es wurde ange geben, dass nach dieser Methode eine höhere Ausbeute und * Reinheit erzielt wird als nach der Methode unter Verwendung 30 von Säulenchromatographie an Sephadex G-100.

Die im folgenden aufgeführten Publikationen beschäftigen sich ebenfalls mit der Reinigung und der versuchten Charakterisierung von Interferonen:

Knight, E., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 520-3 (1976); Törmä, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251, 4810-6 (1976); 35 — fr s - 3 -

Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 252, 6585-7 (1977); DeMaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271, 622-5 (1978): Kawakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253, 598-602 (1978);

Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-11 (1978); 5 Jankowski, W.J. et al., J. Virology 1_6, 1124-30 (1975);

Davey M.W. et al., J. Biol. Chem. 251, 7620-5 (1976); Chadha, K.C. et al., Biochemistry 17, 196-200 (1978).

X.

Obwohl in zahlreichen der oben genannten Publikatio-10 nen behauptet wird, dass Mäuse- oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt werden konnten, ist weder einer der klassischen Nachweise der Homogenität von Proteinen angegeben noch sind die Eigenschaften der angeblich reinen Verbindungen beschrieben.

15

Die Anwendung der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromato-graphie (HPLC) zur Reinigung von Proteinen ist in der Fachwelt allgemein bekannt, wobei besonders Ionenaustausch-und Ausschluss-Chromatographie beschrieben werden [siehe 20 z.B. Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sei. H, 316-20 (1976) und Chang, S.-H. et al., Anal. Chem. 48, 1839-45 (1976)].

In der Umkehrphasen-Chromatographie wurde z.B. Lichro-' 25 sorb RP-18 (Säulen auf der Basis von Octadecyl-modifizier- tem Si02) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie = ß-Endorphin, verwendet [siehe z.B. Rubinstein, M. et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei., USA 74, 4969-72 (1977)1.

30 Schliesslich wurde die teilweise Charakterisierung von drei Interferon-Spezies aus Ehrlich Ascites-Tumor-zellen von Mäusen (MW = 33*000, 26*000 und 20'000) durch Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254, 3681-4 (1979), beschrieben.

Im weitesten Sinne betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von Pro- 35 - 4 - teinen mit einem Molgewicht über etwa 12'000 mit hoher Auflösung und guten Ausbeuten in präparativem Massstab.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des unreinen Proteins durch eine mit ei-5 nem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octadecyl-oder Glycerylgruppen modifizierten porösen SiO£-Matrix unter HPLC-Bedingungen schickt, wobei das Protein zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden oder fallenden 10 Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert wird, so dass es schliesslich in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird. Diese Säulen, die nacheinander und unter verschiedenen Bedingungen bezüglich pH und organischen Lösungsmitteln verwen-15 det werden können, bieten die Möglichkeit, Proteine, die in natürlichem Material in extrem geringen Mengen Vorkommen, bis zur Homogenität zu reinigen.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die 20 vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Interferon bis zur Homogenität und zwar in Mengen, die ausreichend sind, um erstmals eine chemische Charakterisierung dieser medizinisch wertvollen Substanz zu erlauben. Die Möglichkeit, Interferon chemisch zu charakteri-* 25 sieren, stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der

Entwicklung dieser Substanz dar, da dies eine Voraussetzung dafür ist, die Substanz zu synthetisieren, sei es durch konventionelle Peptidsynthese, sei es auf dem Wege der - Genmanipulation unter Zuhilfenahme geeigneter Organis- 30 men, vorzugsweise von Bakterien.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Interferon als einheitliches Protein ist dadurch gekennzeichnet, dass man 35 A) eine wässrige Lösung von Interferon in unreinem Zustand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puf- & ψ » ' - 5 - fer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten SiC^-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungs-5 mittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird; B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktio-10 nen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, 15 so dass es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird; C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedin- 20 gungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02~ Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und eines wässrigen Puffers eluiert wird, 25 so dass man es in einem einzigen, ausgeprägten Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes Protein erhält und gewünschtenfalls den Schritt C) wiederholt, um äusserste Reinheit des Produktes zu erzielen.

30 Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlichen homogenen Interferon-Spezies.

HPLC-Säulen auf der Basis von durch Octyl- oder Gly-35 cerylgruppen modifizierter poröser Si02-Matrix (Partikelgrösse = 10 μ; mittlere Porengrösse = 100 8), die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden, - 6 - fr sind Handelsartikel, erhältlich z.B. von EM Laboratories of Elmsford, N.Y., USA, unter der Markenbezeichnung Lichrosorb RP-8 und Lichrosorb-Diol. Aequivalente Octyl-mo-difizierte poröse SiC^-Säulen (Chromegabond C-8 bezeich- 5 net) sind erhältlich von E.S. Industries, Marlton, N.J., USA.

Ein geeignetes HPLC-System, in dem die vorstehend genannten Säulen verwendet werden können, sind in U.S.

10 Patent No. 4 116 046 beschrieben.

In Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Lösung des unreinen hochmolekularen Peptids, vorzugsweise in Gegenwart eines wässrigen Puffers bei einem für 15 das zur Diskussion stehende Protein geeigneten pH, durch die SiOg-Säule geschickt. Normalerweise geschieht dies unter Druck, vorzugsweise im Bereich von etwa 50-5000 psi (3)4-340 Atm). Das auf der Säulenfüllung adsorbierte Protein wird dann schrittweise und selektiv unter Ver- 20 wendung eines Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert. Für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel sind z.B. Alkanole, wie n-Propanol, 2-Propanol, Aethanol, Methanol, tert.-Butanol, oder cyclische Aether, wie Dioxan. Die Fraktionierung des Eluats erfolgt in an 25 sich bekannter Weise, wobei der Gehalt der einzelnen Fraktionen an dem aktiven Protein durch hochempfindliche Monitoren bestimmt wird. Ein für diesen Zweck geeignetes System wird von Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 (1975), beschrieben. Es ist auch empfehlenswert, die Anwesenheit qn ou des Ziel-Proteins durch einen geeigneten Bioassay zu überwachen.

Die Entscheidung, welcher der beiden Säulentypen (Säule für normale Verteilungschromatographie oder Säule für qc 03 Umkehrphasen-Chromatographie) und in welcher Reihenfolge die Säulen eingesetzt werden, hängt weitgehend von der Natur des zu reinigenden Proteins ab. Es wurde gefunden, - 7 - dass beispielsweise im speziellen Fall des Human-Leuko-zyten-Interferons die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn man die unreine Interferon-Lösung zunächst durch eine Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modi-5 fizierten SiO^-Matrix (Umkehrphasen-Chromatographie) unter Verwendung eines Puffers mit einem pH von etwa 7,5 (vorzugsweise 1 M Natriumacetat/Essigsäure) schickt und mit einem steigenden n-Propanol-Gradienten eluiert, dann die gesammelten aktiven Fraktionen durch eine Säule auf 10 der Basis einer mit Glycerylgruppen modifizierten SiO^-Ma-trix in einem 0,1 M Natriumacetat-Puffer schickt und mit einem fallenden n-Propanol-Gradienten eluiert und schliesslich die getrennten Interferon-Komponenten auf eine Säule auf der Basis einer mit Octylgruppen modifizierten SiOg-Ma-15 trix unter Verwendung eines Puffers mit einem pH von etwa 4,0, vorzugsweise 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure, aufgibt und mit einem steigenden n-Propanol-Gradienten eluiert.

Auf diese Weise kann jede der drei getrennten Human-Leukozy-ten-Interferone (a, fi und γ) weiteraufgetrennt werden, 20 wobei im Chromatogramm scharf voneinander getrennte Peaks erhalten werden, die die homogenen Proteine darstellen.

Durch das gesamte Reinigungsverfahren, beginnend mit dem Inkubationsmedium bis hin zur Chromatographie an der zweiten durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix wurde eine 25 Steigerung des Reinheitsgrades um den Faktor 60'000 bis 80'000 erreicht.

In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens zur Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon werden die 30 in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den Hauptpeaks entsprechen, vereinigt, zur Entfernung des n-Propanols mit n-Hexan extrahiert und von Spuren n-Hexan befreit bevor Schritt C) durchgeführt wird.

35 Die erfindungsgemässen homogenen Human-Leukozyten-

Interferon-Spezies sind gekennzeichnet durch einen scharfen Peak an den vorstehend genannten HPLC-Säulen sowie durch • - 8 - ' eine einzige enge Bande bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese an Natriumdodecylsulfat (NaDodSO^) in Gegenwart von 2-Mercaptoäthanol. Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen scharfen Peak antiviraler Aktivität, der 5 mit der Proteinbande übereinstimmte. Die spezifischen

Aktivitäten der reinen Interferon-Spezies liegen im Bereich o von etwa 2,6 - 4,0 x 10 Einheiten/mg mit MDBK-Zellen (epitheliale Nierenzellen von Rindern) und im Bereich o von 1,5 - 4 x 10 Einheiten/mg mit der Human-Zellinie " 10 Ag 1732. Die Molekulargewichte lagen zwischen etwa 16’000 und 21Ό00 (vgl. Tabelle 4, Seite 22). Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 5 zusammengefasst (Seite 24).

15 Interferone besitzen antivirale, antitumor-, wachs tumshemmende- und immunsuppressive Aktivität. Diese Aktivitäten konnten sogar in klinischem Massstab festgestellt werden bei Verabreichung von 1-10 x 10^ Einhei-ten/Tag mit relativ unsauberen Präparaten, die weniger 20 als 1 °/o Human-Interferon enthielten. Die gereinigten, homogenen Interferon-Spezies der vorliegenden Erfindung können in der gleichen Weise wie die bereits bekannten Interferon-Präparate verwendet werden unter Anpassung der Dosierung an den erreichten Reinheitsgrad. Die einzelnen - 25 Interferon-Spezies können einzeln oder in Gemischen miteinander verabreicht werden. Derartige Gemische können entweder durch Vermischen der isolierten Spezies erhalten werden oder durch Unterbrechung des Reinigungsverfahrens an einer Stelle,an der mehrere Interferon-Spezies aber 30 keine Interferon-inaktive Proteine vorhanden sind.

Das erfindungsgemässe Reinigungsverfahren, obgleich lediglich an Human-Leukozyten-Interferon exemplifiziert, kann auch zur Reinigung anderer Interferone, z.B. von 35 Human-Fibroblasten-Interferon und Interferonen aus tierischen Quellen sowie zur Reinigung anderer Proteine mit einem Molekulargewicht über 12’000 herangezogen werden.

« - 9 -

So ist beispielsweise Pro-Opiocortin (MW ca. 30*000) unter Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens bis zur Homogenität gereinigt worden [vgl. Kimura et al., Proo. Natl. Acad. Sei. USA 76, 1756-9 (1969)]· Massnahmen, die geeig-5 net sind, das erfindungsgemässe Verfahren optimal zur

Reinigung anderer Proteine einzusetzen, liegen im Bereich des Fachwissens des Fachmannes.

Die Induktion der Interferon-Produktion, die Erst-10 konzentration und Fraktionierung des Interferons einschliesslich der Gelfiltration können nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden. Diese Verfahrensschritte, die eine wässrige Lösung von Interferonen in unreinem Zustand liefern, sind nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

15

Die Verfahrens- und Produktaspekte der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele illustriert.

20 25 30 35 . = - 10 - - Λ

Beispiel 1

Homogenes Human-Leukozyten-Interferon von normalen Spendern 5 A. Herstellung des Interferons

Interferon wurde hergestellt durch 16-stündige Inkubation von Human-Leukozyten aus dem Blut normaler Spender 10 (10 Zellen/ml) mit Newcastle-Krankheit-Virus (15 Häm-agglutinin-Einheiten/ml) in einem serumfreien Minimalmedium, das 10 mg/ml Casein enthielt. Es wurde ein mittlerer Interferon-Titer von 5000 Einheiten/ml erhalten.

Die angewandten Methoden entsprachen den von Mogensen, 15 K.E. et al., Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369-381; Wheelock, E.F., J. Bacteriol. 92, 1415-1421 (1966) und Cantell, K. et al., Appl. Microbiol. 22_, 625-628 (1971) angegebenen mit einigen geringfügigen Aenderungen. Die Interferon-Titer wurden mit einem Assay auf der Basis 20 der Hemmung des cytopathischen Effekts, der innerhalb von 16 Stunden durchgeführt werden konnte, bestimmt. Alle Interferon-Titer sind in Einheiten/ml angegeben, kalibriert gegen den Referenzstandard für Human-Leukozyten-Interferon vom National Institute of Health (USA).

25 B. Konzentrierung und erste Fraktionierung von Interferon

Sofern nicht anders angegeben, wurde bei einer Temperatur von 0-4°C gearbeitet. Nach beendeter Inkubation 30 wurden die Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugieren (15 Minuten, 500 x g) entfernt. Casein wurde durch Ansäuern mit HCl auf pH 4,0 präzipitiert. Nach 2 Stunden wurde das Gemisch zentrifugiert (10 Minuten, 12000 x g) und der Niederschlag verworfen. Der Ueberstand (10 1) 35 wurde auf einen Gehalt von 1,5 °/o (w/v) Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Präzipitat abzentrifugiert (10 Minuten, 12000 x g) und in 50 ml 0,1 M NaHCO^ - 11 - wieder aufgelöst. Nach Zusatz von 0,5 g Triton X-100 und 1,5 ml Essigsäure (tropfenweise unter Rühren) wurde das Gemisch 1 Stunde bei 0°C und anschliessend 16 Stunden bei -20°C aufbewahrt. Nach Auftauen wurde 10 Minuten mit 5 17000 x g zentrifugiert. Der Rückstand wurde verworfen und der üeberstand auf 4 °/o Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch 10 Minuten mit 12000 x g zentrifugiert und der Niederschlag in 5 ml 0,5 M NaHCO^ aufgelöst.

10 C. Gelfiltration

Die erhaltene konzentrierte Interferon-Lösung wurde. mit 1,5 g Harnstoff versetzt und auf eine Säule von Sepha-15 dex G-100 fein (2,6 x 90 cm), voräquilibriert mit 4 M Harnstoff/O,1 M Natriumacetatpuffer, aufgebracht. Die Säule wurde bei Raumtemperatur und einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. mit 4 M Harnstoff/0,1 M Natriumacetat, pH 7,5, eluiert. Es wurden Fraktionen von 12,5 ml gesam-20 melt. Interferon-Aktivität wurde in den Fraktionen 19-23 eluiert.

D. HPLC

25 Die vereinigten Fraktionen 19-23 von der Sephadex G-100-Säule wurden direkt über die Pumpe auf eine Liehro-„ - sorb RP-8-Säule (10 μ, 4,6 x 250 mm) gegeben. Die Säule wurde voräquilibriert mit einem 1 M Natriumacetatpuffer (pH 7,5), der 0,01 °/o (v/v) Thiodiglycol enthielt, und 30 mit einem linearen Gradienten von n-Propanol in dem gleichen Puffer [1 Stunde, 0-20 °/o; 3 Stunden, 20-40 °/o (v/v)] bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/Min. eluiert.

Es wurden Fraktionen von 0,75 ml gesammelt. Das Interferon wurde in den Fraktionen 23-40 [25-30 °/o (v/v) 35 n-Propanol] eluiert.

Die Fraktionen 27-33, die den grössten Anteil der - 12 -

Interferon-Aktivität enthielten, wurden kombiniert, mit n-Propanol bis zu einer Endkonzentration von 80 °/o (v/v) versetzt und direkt über die Pumpe auf eine Lichrosorb-Diol-Säule (10 μ, 4,6 x 250 mm) gegeben, die 5 voräquilibriert wurde mit einer Lösung von 0,1 M Natriumacetat mit einem Gehalt von 80 °/o (v/v) n-Propanol, Die Säule wurde dann während 4 Stunden mit einem linearen Gradienten von 72-50 °/o (v/v) n-Propanol in 0,1 M Natriumacetat bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/Min.

10 eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,75 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in Form von drei deutlichen Hauptpeaks, die quantitativ von Präparat zu Präparat variierten, eluiert. Diese Peaks wurden in der Reihenfolge ihrer Elution a, ß und γ genannt. Die α-Fraktion wurde 15 bei einer Konzentration von 68 °/o n-Propanol eluiert, die ß-Fraktion bei einer Konzentration von 66,5 °/o n-Pro-panol und die γ-Fraktion bei einer Konzentration von 65,5 °/o n-Propanol. Die gesamte Ausbeute an Interferon-Aktivität war grösser als 80 °/o.

20

Die zu jedem Peak gehörenden Fraktionen wurden vereinigt und in Folgestufen weitergereinigt. Da der Peak γ der bei weitem grösste war und von anderen Komponenten am besten getrennt zu sein schien, wurde er für die 25 weitere Reinigung ausgesucht. Die Fraktionen 54-56 von der Diolsäule, die den Peak γ enthielten, wurden vereinigt und das n-Propanol wurde durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffström entfernt. Es wurde Pyridin und Amei-30 sensäure zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung wurde auf einer Lichrosorb RP-8-Säule (10 μ; 4,6 x 250 mm), voräquilibriert mit 1 M Pyridin und 2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgegeben. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen Gradienten von n-Propanol 35 (20-40 °/o) in 1 M Pyridin/Formiat-Puffer bei einer

Durchflussrate von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Der Hauptpeak der Aktivität - 13 - stimmte überein mit einem Proteinpeak. Die Fraktionen 45 und 46 (32 °/o (v/v) Propanol) die diesem Peak entsprachen, wurden vereinigt und unter gleichen Bedingungen rechromatographiert. Interferon wurde in Fraktion 31 elu-5 iert (32 °/o (v/v) Propanol). Die spezifische Aktivität

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dieser Fraktion wurde mit 4 x 10 Einheiten/mg berechnet verglichen mit Rinderserumalbumin. Dieses Material wurde für die weitere Charakterisierung verwendet. Die Fluoreszenzprofile der HPLC waren so gut reproduzierbar, 10 dass sie einen ständigen Fingerprint des gesamten Verfahrens lieferten.

Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die gesamte Reinigung, ausgehend vom In-15 kubationsmedium bis zur zweiten RP-8-Säule war 60000-bis 80000-fach. Die kumulative Ausbeute von Stufe 1 bis zur Diolstufe lag bei 30-50 °/o. Nach dieser Stufe wurde jeder der drei Interferon-Peaks separat weiter gereinigt.

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h N x; > en ft - 15 - E. Polyacrylamid Gel-Elektrophorese

Interferon-Proben (1,5 x 10^ Einheiten) wurden mit NaDodSOjj und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein 5 Plattengel aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurde nach Färbung mit Coomassie-Blau eine einzige scharfe Bande erhalten. Das scheinbare Molekulargewicht wurde mit 17500 (im Vergleich zu Standardproteinen) bestimmt. Das Gel wurde in Streifen von 1 mm geschnitten, jeder Streifen 10 wurde in 0,4 ml 0,5 M NaHCO^/Ojl °/o NaDodSO^ homogenisiert und auf Interferon-Aktivität hin untersucht. Es wurde ein einziger Peak mit antiviraler Aktivität gefunden, der mit der einzigen Proteinbande übereinstimmte.

15 F. Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse des homogenen Human-Leukozy-ten-Interferons (Peak γ) wurde mit dem Fluorescamin-Amino-saure-Analysator an 0,5 bis 1 yg Proben von nativem und 20 S-carboxymethyliertem Interferon durchgeführt. Zur Bestimmung des Cystein/Cystin-Verhältnisses wurde natives Interferon carboxymethyliert und dann in 6 M HCl unter reduzierenden Bedingungen (0,1 °/o Thioglycolsäure) hydrolysiert. Unter diesen Bedingungen wird Cystein als 25 S-Carboxymethylcystein und Cystin als freies Cystein gemessen. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die spezifische Aktivität, berechnet

Q

auf den Aminosäuregehalt, wurde mit 2-4 x 10 Einheiten/mg r bestimmt.

30 35 - 16 - t fr

Tabelle 2

Aminosäurezusammensetzung von Human-Leukozyten-Interferon 5 Aminosäure Reste

Asx 15,2+1,2

Thr1 . 7,5+0,5

Ser1 8,0+0,5

Glx 24,0+0,6 10 Pro 6,3+0,3

Gly 5,5+0,5

Ala 8,2+0,2

Cys (Total) 3,3+0,7 1/2 Cystin+ 1,8+0,2 15 Cystein1 1,5+0,5

Val 7,8+0,2

Met 3,9+0,2

Ile 8,9+0,4

Leu 21,8+1,3 20 Tyr 5,1+0,2

Phe 9,1+0,3

His 3,3+0,4

Lys 11,6+0,5

Arg 7,3+0,5 25 Trp++ 0,7+0,1 35

Korrigiert auf die Zeit 0.

+ Gemessen nach Carboxymethylierung von nativem Interferon.

30 ++ Gemessen nach Hydrolyse in 6 M HC1/4 °/o Thiogly- colsäure.

- 17 -

Beispiel 2

Homogenes Human-Leukozyten-Interferon aus Leukozyten von leukämischen Patienten 5

Das Interferon wurde erhalten durch Inkubation von Human-Leukozyten, isoliert aus dem Blut von leukämischen Patienten (chronische myelogene Leukämie, CML) durch Leuko-phoresis mit Newcastle-Krankheit-Virus in einem serumfreien, 10 caseinhaltigen Medium. Die Interferon-Titer lagen bei 5000-40000 Einheiten/ml.

Das Reinigungsverfahren war das gleiche wie das in Beispiel 1 beschriebene für Interferon aus Blut von nor-15 malen Spendern und umfasste die selektive Präzipitation durch 0,5 M Essigsäure in Gegenwart von Triton X-100, Gelfiltration an Sephadex G-100 in 4 M Harnstoff, HPLC bei pH 7,5 an Lichrosorb RP-8, HPLC an Lichrosorb-Diol und HPLC an Lichrosorb RP-8 bei pH 4,0.

20

Die Fraktionen, die den a-,ß- und γ-Peaks der Lichro-sorb-Diolsäule entsprachen, wurden zusammengefasst und dann getrennt voneinander in weiteren Schritten gereinigt.

25

Aus den vereinigten Fraktionen 43-46 (α-Peak) wurde n-Propanol durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen n-Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffström entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisen-30 säure bis zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (10 μ, 4,6 x 250 mm), die voräquilibriert war mit 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgebracht. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen n-Propanol-Gradienten (20-35 40 °/o, v/v) in 1 M Pyridinformiat-Puffer bei einer Durch flussgeschwindigkeit von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivi- 1 - 18 - ¥ ·* tät wurde in breiten Peaks bei Konzentrationen zwischen 31 und 35 °/o (v/v) n-Propanol eluiert. Diese Fraktionen wurden kombiniert und unter gleichen Bedingungen rechroma-tographiert. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Haupt-5 peaks (a^ und a^) bei 31 und 32 °/o (v/v) n-Propanol eluiert. Untergeordnete Komponenten wurden bei einer Konzentration von 34 °/o (v/v) n-Propanol eluiert.

Die vereinigten Fraktionen 47-50 (Peak ß) der Lichro-10 sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet und an Lichrosorb RP-8 chromatographiert wie sie für den Peak α beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks eluiert: ß2 bei 32 °/o (v/v) n-Propanol und ß^ bei 34 °/o (v/v) n-Propanol. Rechromato-15 graphie war in diesem Falle nicht nötig. In einigen Präparaten konnte ein Peak ß^ bei 31 °/o (v/v) n-Pröpanol festgestellt werden.

Die vereinigten Fraktionen 52-54 (Peak γ) der Lichro-2o sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet und an Lichrosorb RP-8 chromatographiert wie sie für den Peak α beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in fünf Hauptpeaks eluiert: (bei 31 °/o n-Pro- panol, v/v), (bei 32 °/o n-Propanol, v/v), y^ (bei 25 34 °/o n-Propanol, v/v), (bei 35 °/o n-Propanol, v/v) und (bei 35,5 °/o n-Propanol, v/v). Rechromatographie war in diesem Fall nicht notwendig.

Die Ergebnisse der Reinigung zur Herstellung der einzel-30 nen Interferon-Spezies sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Die Spezies und ß^ können ferner unterschieden werden durch ihre Elutionscharakteristiken an Lichrosorb-Diol: ctg wird eluiert mit 68 °/oigem (v/v) n-Propanol 35 und ß mit 66,5 °/oigem (v/v) n-Propanol.

Proben der Interferon-Spezies (1,5 x 10^ Einheiten) - 19 - « wurden mit NaDodSO^ und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach Elektrophorese lieferten die Peaks , a2, ß2> Ύρ Ï2 und Ύ4 jeweils eine einzige Bande, während die Peaks ß^, Ύ3 und Ύ5 jeweils 5 zwei Banden lieferten. Die scheinbaren Molekulargewichte lagen zwischen 16000 und 18000 mit Ausnahme von ß^, das eine Bande bei 16500 und eine bei 21000 aufwies und γ^, das eine Bande bei 21000 lieferte (siehe Tabelle 4).

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Die Aminosäureanalyse der gereinigten Human-Leuko-zyten-Interferon-Fraktionen wurde mit einem Fluoresea-min-Aminosäure-Analysator an 0,1-1 yg Proben durchgeführt. Die Hydrolyse wurde in 6N HCl unter reduzierenden Bedin-5 gungen (0,1 °/o Thioglycolsäure) durchgeführt. Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

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Trypsin-Spaltung und HPLC der Fragmente

Jeweils 300 pMol der gereinigten Human-Leukozyten-Interferon-Spezies wurden in wässrigem Natriumbicarbonat 5 (50 mMol, pH 8, 50 μΐ) gelöst. Nach Zusatz von jeweils 0,1 yg Trypsin in 2 μΐ HCl (pH 3) wurde 14 Stunden bei 37°C inkubiert, mit 5 μΐ Essigsäure versetzt und das Gemisch auf eine Liohrosorb RP-8-Säule (Teilchengrösse 10 μ; 4,6 x 250 mm) aufgebracht. Die Säule wurde während einer Stunde 10 mit einem linearen Gradienten von 0-40 °/o (v/v) n-Propanol in einem 0,1 M Ameisensäure/0,03 M Pyridin-Puffer (pH 3) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min. eluiert.

Die Fragmente wurden nach der Fluorescamin-Methode 15 nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst, wobei die Position der Peaks als °/o n-Propanol und die relative Grösse der Fragmente angegeben sind (S = klein; M = mittelgross; L = gross): 20 25 30 35 ί * 9 - 26 -

Tabelle 6

Tryptisohe Peptide der Human-Leukozyten-Interferone 5 Spezies Elution bei °/o n-Propanol o1 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M,

20S, 21S, 22,5S, 29M

a2 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,53, 14,5M, 16S, 18m,

- 10 27S, 29M

ß2 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5S,

18M, 29M

ß3 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M,

163, 18L, 19,5M, 27M, 32M

15 Y-| 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5M,- 18M, 29M γ2 · 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 11,5S, 12,5S, 14,5S,

16S, 18l, 29M

γ3 3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M,

20 16S, 18L, 20S, 32M

Y5 3L, 4L, 4,2M, 4,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L,

12,5S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 24,5S, 25,5S, 32S

25 Die gereinigten Human-Leukozyten-Interferon-Spezies wurden einer Aminozuckeranalyse unterworfen mit der Aminozucker im Bereich von 50-100 pMol festgestellt werden können. In allen Fällen wurde weniger als ein Rest Glucos-amin, Galactosamin bzw. Mannosamin pro Molekül gefunden.

30 In den meisten Fällen interferierte eine Anzahl kleiner Peptide, die in der Nähe der Aminozucker eluiert wurden, mit der Analyse. Es ist daher möglich, dass die den Ami-nozuckern zugeordneten Peaks teilweise oder sogar ganz Peptiden zuzuordnen sind.

Schliesslich lieferte ein Versuch, 1 nMol reines γ2 Interferon durch einen manuellen Edman-Abbau, der Rückhy- 35 T * - 27 - * drolyse und Aminosäureanalyse unter Verwendung von Fluor-escamin beinhaltet, zu sequenzieren, keine Aminosäuren in den ersten beiden Zyklen. Die Behandlung von 100 pMol reinem γ2 Human-Leukozyten-Interferon mit Leucinamino-5 peptidase und Aminopeptidase M während 20 Stunden bei 37°C beeinflusste die biologische Aktivität nicht; im Inkubationsmedium konnten keine Aminosäuren festgestellt werden. Durch Behandlung des Ueberstandes eines Induktionsmediums (Leukozyten und Newcastle-Krankheit-Virus - 10 in Minimalmedium) mit Aminopeptidase M konnte ein Verlust an Interferon-Aktivität nicht beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass das Interferon-Molekül bereits vor dem Reinigungsverfahren eine blockierte aminoendstän-dige Aminosäure enthält. Zur Kontrolle wurden rohes In-15 terferon, reines Interferon und die ß-Kette von Insulin gemeinsam mit Aminopeptidase M inkubiert. Während Insulin teilweise abgebaut' wurde (Aminosäuren nachweisbar) trat kein Verlust an Interferon-Aktivität auf.

20 Beispiel 3

In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Rinder-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form 25 einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.

- Beispiel 4

In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfah-30 ren wurden Schweine-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.

Beispiel 5 35

In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Schafs-Leukozyten zur Interferon-Produktion - 28 - 4 t * angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.

Beispiel 6 5

In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Pferde-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.

10

Beispiel 7

In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Hunde-Leukozyten zur Interferon-Produktion 15 angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.

Beispiel 8 20 In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Katzen-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.

25 Beispiel 9 j

In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Affen-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form 30 einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.

Beispiel 10 (a) 3 mg homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit.einer·

Q

35 spezifischen Aktivität von 2 x 10° Einheiten/mg wurde in 25 ml 5 °/oigem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter fil- s * - 29 - * fcriert und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt 6 x 10^ Einheiten reines Interferon, das sich für die parenterale Applikation eignet. Die Ampullen werden bis zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei -20°C) aufbewahrt.

5 (b) Eine wässrige Lösung, enthaltend 1,5 mg der vereinigten homogenen Human-Leukozyten-Interferon-Spezies , <*£, β>2> Ύ-j und ^2 (jedes etwa im Verhältnis zu seiner natürlichen Häufigkeit), mit einer spezifischen Aktivität 8 10 von etwa 2 x 10 Einheiten/mg, und 100 mg normales

Human-Serumalbumin, wird durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die Lösung aseptisch auf 100 Ampullen gleichmässig verteilt. Jede Ampulle enthält etwa 3 x 10^ Einheiten reines Human-Leukozyten-Interferon und 1 mg 15 Serumalbumin. Die Ampullen, die für parenterale Applikation geeignetes Interferon enthalten, werden zweokmässigerweise kühl (-20°C) gelagert.

20 25 ' 30 35

Claims

30. DS 4100/12
1. Interferon als homogenes Protein.
2. Homogenes Interferon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Human-Interferon ist.
3. Homogenes Human-Interferon gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Leukozyten-Inter- - 10 feron handelt.
4. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der Bezeichnung , welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es 15 (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/rain), bei einer Konzentration 20 von 31 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht tr ' 25 inaktiviert wird; (c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3), 00 enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 11.5, 12.5, 14.5, 16, 18, 20, 21, 22.5 und 29 °/o n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule (10 μ 35 Teilchengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiO^-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch - 31 » DS 4100/12 (d) eine blockierte N-terrainale Aminosäure; (e) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 10^ Ein-heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); 5 o (f) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 10° Ein-heiten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); (g) ein Molgewicht von etwa 16,500 + 1000 (Gelelektro- - 10 phorese auf Polyacrylamid); (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; 15 (i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und (j) die folgende Aminosäurezusammensetzung (+ 15 °/o, berechnet auf ein Molgewicht von 16,500); 20__ Asx 13,8 Ala 8,4 Phe 6,9 Thr 7,7 Val 7,4 His 3,0 Ser 9,2 Met 3,7 Lys 10,5
25 Glx 20,3 Ile 7,4 Arg 6,2 Pro 6,1 Leu 18,0 Cys 3,9 Gly 5,1 Tyr 4,0
5. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der Bezeichnung a2, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässri-33 gen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min), bei einer Konzentration i * , ' _ 32 - DS 4100/12 von 32 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten SiOg-Matrix eluiert wird; 5 (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; (o) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespal-e ten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemi- =? 10 sches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3), enthaltend 0,03 Hol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 11.5, 12.5, 14.5, 16, 18, 27 und 29 °/o n-Pro-15 panol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule (10 μ Teilchengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten S1O2-Matrix eluiert werden; (d) durch Gradientenelution mit n-Propanol in wässrigem, 20. molarem Natriumacetat-Puffer (Gradient 72,5-50 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,25 ml/min) bei einer Konzentration von 68 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten SiOg-Matrix eluiert 25 wird; und das ferner charakterisiert ist durch (e) eine blockierte N-terminale Aminosäure; Q (f) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 10 Ein-30 heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); 8 (g) eine spezifische Aktivität von etwa 3 x 10 Einhei-ten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); 35 (h) ein Molgewicht von etwa 16,200 + 1000 (Gelelektrophorese auf Polyacrylamid);
33. DS 4100/12 t * (i) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Hol pro Hol; (j) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und 5 (k) die folgende Aminosäurezusamraensetzung (+ 15 °/o, berechnet auf ein Molgewicht von 16,200): , 10 Asx 11,7 Ala 8,3 Phe 8,0 Thr 8,3 · Val 6,2 His 2,8 Ser 10,0 Met 3,8 , Lys 9,0 Glx 20,5 Ile 7,0 Arg 7,1
15 Pro 4,9 Leu 18,0 Cys 4,0 Gly 4,5 Tyr 4,4
6. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der 20 Bezeichnung ß2, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisen- 25 säure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min), bei einer Konzentration von 32 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; 30 (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; (c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespal-35 ten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3), enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro , - 34 - DS 4100/12 Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 11.5, 12.5, 14.5, 16, 17.5, 18 und 29 °/o n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule (10 μ Teil-5 ehengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiO^-Matrix eluiert werden; (d) durch Gradientenelution mit n-Propanol in wässrigem, 1 molarem Natriumacetat-Puffer (Gradient 72,5-50 °/o (v/v), ^ ~ 10 Raumtemperatur, Durchflussrate 0,25 ml/min) bei einer Konzentration von 66,5 °/o in einem einzigen Peak von · einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; und das ferner charakterisiert ist durch 15 (e) eine blockierte N-terminale Aminosäure; g (f) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 10 Ein-heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); 20 o (g) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 10 Einhei-ten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); (h) ein Molgewicht von eta 16,500 + 1000 (Gelelektrophorese 25 auf Polyacrylamid); (i) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; 30 (j) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und (k) die folgende Aminosäurezusammensetzung (+ 15 °/o, berechnet auf ein Molgewicht von 16,500):
35. DS 4100/12 Asx 11,5 Ala 7,9 Phe 8,7 Thr 9,0 Val 6,7 His 3,0
5 Ser 10,0 Met 4,4 Lys 8,5 Glx 21,9 Ile 7,4 Arg 8,0 Pro 5,0 Leu 18,9 Cys 1,8 » ' Gly 5,0 Tyr 4,6 , v 10
7. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der Bezeichnung ß^,. welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es 15 (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässri gen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min), bei einer Konzentration von 32 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 2o 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten SiO^-Matrix eluiert wird; (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; 25 ' (c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespal- „ ten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemi sches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3), enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro
30 Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 4.5, 10, 12.5, 14, 14.5, 16, 18, 19.5, 27 und 32 °/o n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule (10 μ Teilchengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen 35 modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch ’ - 36 - DS 4100/12 (d) eine blockierte N-terminale Aminosäure; ο (e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 10 Ein-heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); 5 g (f) eine spezifische Aktivität von etwa 3 x 10 Einhei-ten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); " (g) ein Molgewicht von etwa 21,000 + 1000 (Gelelektro- -, " 10 phorese auf Polyacrylamid); (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; 15 (i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und (j) die folgende Aminosäurezusammensetzung: 20 Asx 18,2 Ala 11,5 Phe 9,9 Thr 9,9 Val 7,5 His 3,8 Ser 14,5 Met 6,0 Lys 9,3 Glx 28,5 Ile 9,5 Arg 10,8
25 Pro 5,9 Leu 24,4 Cys 2,3 Gly 3,6 Tyr 5,0 - 8. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der
30 Bezeichnung γ^, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisen-35 säure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min), bei einer Konzentration von 31 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer
37. DS 4100/12 Μ,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht 5 inaktiviert wird; • „ (c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespal- - ten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemi sches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3)j - 10 enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 4.5, 6.5, 11.5, 12.5, 14.5, 16, 17.5, 18 und 29 °/o n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule (10 μ 15 Teilchengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiO^-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch (d) eine blockierte N-terminale Aminosäure; 20 o (e) eine spézifische Aktivität von etwa 2,6 x 10 Ein-heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); g (f) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 10 Einhei-25 ten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); (g) ein Molgewicht von etwa 17,700 + 1000 (Gelelektrophorese auf Polyacrylamid); 30 (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; (i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und 35 (j) die folgende Aminosäurezusammensetzung (+ 15 °/o, berechnet auf ein Molgewicht von 17,700): ' - 38 - DS 4100/12 i Asx 13,1 Ala 8,7 Phe 8,6 Thr 8,U Val 7,3 His 3,7
5 Ser 10,2 Met 4,3 Lys 10,1 Glx 23,9 Ile 7,9 Arg 8,0 j Pro 4,5 Leu 20,3 Cys 3,3 Gly 5,7 Tyr 4,8 T 10
9. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der Bezeichnung y welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es 15 (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässri gen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ral/min), bei einer Konzentration von 32 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 20 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten Si02~Matrix eluiert wird; (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; 25 ' - ; (c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespal- : ten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemi sches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3), : enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro
30 Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 4.5, 5, 11.5, 12.5, 14.5, 16, 18 und 29 °/o n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule (10 μ Teilchengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen modifi-35 zierten SiOg-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch 4 ï: ' - 39 - DS 4100/12 (d) eine blockierte N-terminale Aminosäure; Ο (e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 10 Ein-heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); 5 o (f) eine spezifische Aktivität von etwa 1,5 x 10 Ein-heiten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); (g) ein Molgewicht von etwa 17,700 + 1000 (Gelelektro-10 phorese auf Polyacrylamid) ; (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; 15 (i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und (j) die folgende Aminosäurezusammensetzung (+ 15 °/o, berechnet auf ein Molgewicht von 17,700): 20___ Asx 13,3 Ala 8,1 Phe 9,0 Thr 9,6 Val 7,0 His 3,3 Ser 7,8 Met 3,9 Lys 10,0
25 Glx 25,0 Ile 8,0 Arg 8,5 . , Pro 4,8 Leu 20,1 Cys 2,9 Gly 5,0 Tyr 4,8
10. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der Bezeichnung γ^, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wäss-35 rigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min), bei einer Konzentration _ 1|0 - DS 4100/12 von 34 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten SiOg-Matrix eluiert wird; 5 (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; 'S ^ ’ (c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespal ten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemi-_ 10 sches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3)> enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 11.5, 12.5, 13.5, 14.5, 16, 18, 20 und 32 °/o 15 n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule (10 μ Teilchengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch 20 (d) eine blockierte N-terminale Aminosäure; o (e) eine spezifische Aktivität von etwa 3,5 x 10 Ein-heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); 25 (f) eine spezifische Aktivität von etwa 1,5 x 10° Ein-heiten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); (g) ein Molgewicht von etwa 17,200 + 1000 (Gelelektrophorese auf Polyacrylamid); 30 (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; 1 eine positive Wachstumshemmungsaktivität und 35 (j) die folgende Aminosäurezusammensetzung:
41. DS 4100/12 Asx 15,0 Ala 9,3 Phe 7,2 Thr 8,6 Val 5,5 His 2,9
5 Ser 10,1 Met 5,6 Lys 7,6 Glx 22,8 Ile 6,8 Arg 10,1 Pro 4,8 Leu 20,5 Cys 3,1 ; ' Gly 3,2 Tyr 3,7 η 10
11. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit der Bezeichnung Ym welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es 15 (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wäss rigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min), bei einer Konzentration von 35 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 20 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; und das ferner charakterisiert ist durch 25 ’ (c) eine blockierte N-terminale Aminosäure; (d) eine spezifische Aktivität von etwa 3,5 x 10^ Ein- L- heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); 30 o (e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 10 Ein-heiten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); (f) ein Molgewicht von etwa 21,000 + 1000 (Gelelektro-35 phorese auf Polyacrylamid);
42. DS 4100/12 (g) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; (h) eine positive Wachstumshemmungsaktivitat und 5 (i) die folgende Aminosäurezusammensetzung (+ 15 °/o, berechnet auf ein Molgewicht von 21,000): - : 10 Asx 17,9 Ala 10,4 Phe 9,1 Thr 7,3 Val 7,9 His 3,8 Ser 13,5 Met 4,9 Lys 12,2 Glx 27,0 Ile 9,7 Arg 8,5
15 Pro 6,5 Leu 24,1 Cys 4,1 Gly 4,8 Tyr 5,0
12. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit 20 der Bezeichnung γ^, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisen- 25 säure pro Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Rauratempera-tur, Durchflussrate 0,2 ml/min), bei einer Konzentration 1 von 31 °/o n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 5 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octyl- gruppen modifizierten SiO^-Matrix eluiert wird; 30 (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; (c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespal-35 ten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer (pH 3), enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro f - - 43 - DS 4100/12 Liter (Gradient 0-40 °/o (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min) in Peaks bei Konzentrationen von 3, 4, 4.2, 4.5, 7, 7.5, 10, 11.5, 12.5, 14, 14.5, 16, 18, 24.5, 25.5 und 32 °/o n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm 5 HPLC-Säule (10 μ Teilchengrösse) auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiOg-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch (d) eine blockierte N-terminale Aminosäure; ’i 10 g (e) eine spezifische Aktivität von etwa 0,9 x 10 Ein-heiten/mg auf MDBK (Rinderzellen); (f) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 10^ Einhei-15 ten/mg auf Ag 1732-Zellen (Human-Linie); (g) ein Molgewicht von etwa 16,500 + 1000 (Gelelektrophorese auf Polyacrylamid); 20 (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol; (i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und 25 (j) die folgende Aminosäurezusammensetzung: '1 - Asx 13,8 Ala 9,3 Phe 6,4
30 Thr 7,6 Val 5,1 His 2,8 Ser 9,0 Met 4,7 Lys 12,0 Glx 20,8 Ile 6,6 Arg 9,0 Pro 4,2 Leu 19,6 Cys 2,3 Gly 4,0 Tyr 3,6 35 2|1{ _ DS 4100/12 ►.
13. Homogenes Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-12 als pharmazeutischer Wirkstoff.
14. Homogenes Interferon gemäss einem der Ansprüche 5 1-12 als antiviraler Wirkstoff.
15. Homogenes Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-12 als Antitumor-Wirkstoff. t 10 16. Homogenes Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-12 als wachstumshemmender Wirkstoff.
17· Homogenes Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-12 als immunsuppressiver Wirkstoff. 15
18. Verfahren zur Reinigung von Proteinen mit einem Molgewicht über etwa 12,000, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des unreinen Proteins durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer 20 durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octa-decyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen Si02-Matrix unter HPLC-Bedingungen schickt, wobei das Protein zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden oder fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungs-25 mittels eluiert wird, so dass es schliesslich in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird. - 19. Verfahren zur Reinigung von Proteinen mit einem Molgewicht über etwa 12,000, dadurch gekennzeichnet, dass 30 man eine wässrige Lösung des unreinen Proteins durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen SiOg-Matrix unter HPLC-Bedingungen schickt, wobei das Protein zunächst adsorbiert und dann mit einem steigen-35 den oder fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert wird, so dass es schliesslich in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten * » 45 - DS 4100/12 fr wird.
20. Verfahren zur Herstellung von Interferon als homogenes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass man 5 A) eine wässrige Lösung von Interferon in unreinem Zu-„ . stand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgrup-~ pen modifizierten Si02~Matrix schickt, wobei das Inter- > 10 feron zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
15 B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktionen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten S1O2-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser 20 mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird; C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den 25 ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedin-: gungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-' Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert _= und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren
30 Lösungsmittels und eines wässrigen Puffers eluiert wird, so dass man es in einem einzigen, ausgeprägten Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes Protein erhält und gewünschtenfalls den Schritt C) wiederholt, um äusserste Reinheit des Produktes zu erzielen. 35
21. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man von Human-Interferon ausgeht. _ 45 _ DS 4100/12 î
22. Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass man von Leukozyten-Interferon ausgeht.
23. Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeich-5 net, dass man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel ein Alkanol oder einen cyclischen Aether verwendet.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel n-Pro- - 10 panol, in Schritt A) einen Puffer mit einem pH von etwa 7,5 und in Schritt B) einen Puffer mit einem pH von etwa 4,0 verwendet.
25. Verfahren gemäss Anspruch 24, dadurch gekennzeich-15 net, dass es sich bei dem in Schritt A) verwendeten Puffer um 1 M Natriumacetat/Essigsäure handelt und der n-Propa-nol-Gradient von 0 auf 40 °/o (v/v) ansteigt, dass es sich bei dem in Schritt B) verwendeten Puffer um 0,1 M Natriumacetat handelt und der n-Propanol-Gradient von 20 72,5 auf 50 °/o (v/v) abnimmt und dass es sich bei dem in Schritt C) verwendeten Puffer um 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure handelt und ein von 20 auf 40 /0 (v/v) ansteigender n-Propanol-Gradient eingestellt wird.
26. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeich net, dass die bestimmten, den ausgeprägten Hauptpeaks zuzuordnenden Fraktionen zusammengefasst werden, das n-Pro-panol durch Extraktion mit n-Hexan entfernt wird und vor Schritt C) Spuren von n-Hexan aus der wässrigen Phase 30 entfernt werden.
27. Arzneimittel auf der Basis eines homogenen Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-12.
28. Antivirale Mittel auf der Basis eines homogenen Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-12. - H7 - DS 4100/12
29. Antitumor-Mittel auf der Basis eines homogenen Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-12.
30. Wachstumshemmende Mittel auf der Basis eines homo-5 genen Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-12.
31. Immunsuppressive Mittel auf der Basis eines homogenen Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-12.
32. Verwendung eines homogenen Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-12 bei der Therapie bzw. Prophylaxe von Krankheiten.
33. Verwendung eines homogenen Interferons gemäss 15 einem der Ansprüche 1-12 bei der Therapie bzw. Prophylaxe von viralen Infektionen. 3¾. Verwendung eines homogenen Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-12 bei der Therapie bzw. Prophylaxe 20 von Tumoren. «»** ' 25 ' 30 35