DK161048B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant interferon - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af humant interferon Download PDFInfo
- Publication number
- DK161048B DK161048B DK496779A DK496779A DK161048B DK 161048 B DK161048 B DK 161048B DK 496779 A DK496779 A DK 496779A DK 496779 A DK496779 A DK 496779A DK 161048 B DK161048 B DK 161048B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- interferon
- process according
- buffer
- propanol
- fractions
- Prior art date
Links
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims description 80
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims description 80
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims description 80
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 25
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 20
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 20
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 18
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 13
- -1 cyanopropyl Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 125000003976 glyceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C(O[H])([H])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 7
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 150000004292 cyclic ethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims 1
- 238000011328 necessary treatment Methods 0.000 claims 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 3
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 2-amino-2-deoxy-D-mannopyranose Chemical compound N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102400000748 Beta-endorphin Human genes 0.000 description 1
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000003468 Ehrlich Tumor Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- GBFLZEXEOZUWRN-VKHMYHEASA-N S-carboxymethyl-L-cysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSCC(O)=O GBFLZEXEOZUWRN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N beta-endorphin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- FDTUVFSBEYKVAP-UHFFFAOYSA-N formic acid;pyridine Chemical compound OC=O.C1=CC=NC=C1 FDTUVFSBEYKVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N thiodiglycol Chemical compound OCCSCCO YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006389 thiodiglycol Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 161048B
Rensningen af proteiner har længe været et problem inden for peptidkemien. De til dette formål anvendte metoder omfatter udfældning, gelfiltrering, ionbytningschromatografi, gelelektroforese, affini-tetschromatografi og mange andre metoder. Fremgangsmåder til iso-5 lering af naturligt forekommende, højmolekylære proteiner, som forekommer i biologiske materialer i ekstremt ringe koncentration, omfatter flere af de ovennævnte metoder. I mange tilfælde må der anvendes og forarbejdes overordentlig store mængder råmateriale på grund af de store tab under den samlede fremgangsmåde. Det fremgår 10 deraf, at rensningmetoderne til sådanne proteiner er overordentlig besværlige og kostbare. Et godt eksempel herpå er de forskellige forsøg på isolering og karakterisering af interferon. Siden Isaacs og Lindenmann's opdagelse af dette stof i 1957 har forskere over hele jorden i to årtier uden held forsøgt at isolere interferon, både fra 15 leukocyter og fra fibroblaster, som et homogent peptid i så store mængder, at det var muligt at foretage en karakterisering og bestemmelse af dets specifikke biologiske og kemiske egenskaber.
I USA patentskrift nr. 3.699.222, som angår de første arbejder af Isaacs og Lindenmann med interferon, består rensningen af det aktive 20 stof kun i en ammoniumsulfatudfældning og påfølgende dialyse. Da en sådan fremgangsmåde er relativt uspecifik, er det vundne produkt stadig overordentligt urent.
En flertrinsfremgangsmåde til rensning af interferon er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.414.651, hvilken fremgangsmåde omfatter føl-25 gende trin: selektiv adsorption på amorft aluminiumsilicat, eluering med iod- eller thiocyanatopløsning, yderligere fældning af uønskede proteiner med vandigt HC1 og vandig natriumhydroxidopløsning, fældning af interferonet ved hjælp af med vand blandbare opløsningsmidler såsom methanol, ethanol eller acetone og endelig chromatografi af det 30 igen opløste interferon på et ionbytterharpiks såsom 2-diethylamino-ethylcellulose. Ved denne rensningmetode kan interferonets specifikke aktivitet forøges med en faktor 6000. Som specifikke interferoner er i USA patentskriftet nævnt hønse- og abeinterferon.
En yderligere rensningsmetode er beskrevet i USA patentskrift nr.
35 3.975.344, hvor en opløsning af urenset human-fibroblaster-interferon 2
DK 1610 4 8 B
renses ved massefyldegradient-ultracentrifugering. Det er angivet, at der ved denne metode opnås højere udbytte og renhed end ved metoden under anvendelse af søjlechromatografi på "Sephadex" G-100.
De nedenfor anførte publikationer angår ligeledes rensningen og den 5 forsøgte karakterisering af interferoner:
Knight, E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 520-523 (1976);
Tormå, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251, 4810-4816 (1976);
Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 252, 6585-6587 (1977); DeMaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271, 622-625 (1978); LO Kawakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253, 598-602 (1978);
Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-5211 (1978);
Jankowski, W.J. et al., J. Virology 16, 1124-1130 (1975);
Davey, M.W. et al., J. Biol. Chem. 251, 7620-7625 (1976);
Chadha, K.C. et al., Biochemistry 17, 196-200 (1978).
15 Selv om det i adskillige af de ovennævnte publikationer er hævdet, at muse- eller human-interferoner kan renses, indtil de er homogene, er der hverken angivet et af de klassiske beviser på proteiners, homogenitet eller beskrevet de angiveligt rene forbindelsers egenskaber.
Anvendelsen af høj tryksvæskechromatografi (HPLC) til rensning af 20 proteiner er almindelig kendt inden for området, idet der beskrives ionbytnings- og udelukkelseschromatografi (jfr. fx Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sci. 14, 316-320 (1976) og Chang, S.-H. et al.,
Anal. Chem. 48, 1839-1845 (1976)).
I omvendtfase-chromatografien anvendes fx "Lichrosorb" RP-18 (søjler 25 på basis af octadecyl-modificeret SIO2) med held til rensning af peptider, fx ^-endorphin (jfr. fx Rubinstein, M. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 74, 4969-4972 (1977)).
Endelig er den delvise karakterisering af tre interferonkomponenter fra Ehrlich Ascites-tumorceller fra mus beskrevet (molvægt = 33.000, 30 26.000 og 20.000) af Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254, 3681-3684 (1979). Dertil blev anvendt en konventionel oprensningsrutine, dvs. én uden anvendelse af højtryksvæskechromatografi.
DK 161048 B
3
Hancock et al. [FEBS Lett. 72, 139-142 (1976)] og Moluar et al.
[Peptides, Proc. 5th Arner. Peptide Symposium, University of Calif.,
San Diego, 1977, Eds.: Goodmann, Meinhofer; John Wiley & Sons, Inc.; (1977), side 48-51] beskriver udelukkende anvendelse af HPLC på 5 peptider, som er lavmolekylære i forhold til interferon. På det tidspunkt, hvor den foreliggende opfindelse blev gjort, var det overraskende for fagfolk, at HPLC også kunne anvendes på proteiner med en molekylvægt på over 12.000.
Den analytiske adskillelse af en proteinblanding med komponenter, 10 hvis molekylvægte delvis ligger over 12.000 Dalton, er beskrevet af W. Monch og W. Dehnen i J. Chromat. 147, s. 415-418 (1978). Denne analytiske teknik var dog ikke udviklet så vidt, at den uden væsentlige ændringer ville kunne anvendes direkte til renfremstilling af biologisk aktive proteiner i præparativ målestok. Fx var såvel pro-15 blemet med adskillelsens skarphed som med det egnede opløsningmiddel ikke blevet løst. Visse af de i litteraturstedet angivne fremgangsmådeparametre såsom en arbejdstemperatur på 47°C og stærkt sure medier (pH = 2) afviger stærkt fra parametrene for fremgangsmåden ifølge opfindelsen og vil derfor snarere afholde fagfolk fra a priori 20 at anse denne metode for at være egnet til oprensning af biologisk aktive proteiner. Ligeledes er der heller ingen antydning af, hvorledes denne fremgangsmåde skulle modificeres for at gøre den anvendelig til renfremstilling af humant interferon.
Den foreliggende opfindelse angår en forbedret fremgangsmåde til 25 rensning af humant interferon med højere opløsning og godt udbytte i præparativ målestok. Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at en vandig opløsning af det urene protein ledes gennem en med en puffer ækvili-breret søjle på basis af en med cyanopropyl-, cyclohexyl-, phenyl-, octyl-, octadecyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs S1O2-30 matrix tinder HPLC-betingelser, hvorved proteinet først adsorberes og derefter elueres med en stigende eller faldende gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel, så at det til slut fås i bestemte eluatfraktioner i renere form, og at man eventuelt gentager behandlingen én eller flere gange med de fremkomne eluatfraktioner i renere 35 form. Disse søjler, som kan anvendes efter hinanden og under for-
DK 161048 B
4 skellige betingelser med hensyn til pH og organiske opløsningsmidler, gør det muligt at oprense humant interferon, der i naturligt materiale forekommer i ekstremt ringe mængder, indtil homogenitet.
Således angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til op-5 rensning af humant interferon til homogenitet i mængder, der er tilstrækkelige til for første gang at muliggøre en kemisk karakterisering af dette medicinsk værdifulde stof. Muligheden for kemisk at karakterisere interferon er et bemærkelsesværdigt fremskridt i udviklingen af dette stof, da dette er en forudsætning for at synteti-10 sere stoffet, enten ved konventionel peptidsyntese eller ved gelmanipulering under udnyttelse af egnede organismer, fortrinsvis bakterier.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af humant interferon som homogent protein er ejendommelig ved, at man 15 A) leder en vandig opløsning af interferon i uren tilstand under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix, hvorved interferonet først adsorberes og derefter elueres med en stigende gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel i en puffer, så at det fås i 20 bestemte eluatfraktioner i renere form; B) leder de i trin A) vundne bestemte fraktioner gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med glycerylgrupper modificeret S1θ£-matrix, hvorved interferonen først adsorberes og derefter elueres med en faldende gradient af et med vand blandbart opløsnings- 25 middel i en puffer, så at det fås i udprægede hovedtoppe i bestemte eluatfraktioner i renere form; C) leder de i trin B) vundne fraktioner, som svarer til de udprægede hovedtoppe, under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix, 30 hvorved interferonet først adsorberes og derefter elueres med en blanding af et med vand blandbart opløsningsmiddel og en vandig puffer, så at man får det i en enkelt, udpræget top i bestemte eluat-
DK 161048 B
5 fraktioner som homogent protein, og, om ønsket, gentager trin C) til opnåelse af produktet i yderste renhed.
HPLC-Søjler på basis af med octyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs SiC>2-matrix (partikelstørrelse = 10 μ, gennemsnitlig porestør-5 relse = 100 A), som anvendes ved udførelse af den foreliggende opfindelse, er handelspræparater, der fx kan fås fra EM Laboratories of Elmsford, New York, USA, under mærket "Lichrosorb" RP-8 og "Lichro-sorb-Diol". Ækvivalente octylmodificerede porøse Si02-søjler ("Chromegabond" C-8) kan fås fra E.S. Industries, Marlton, N.J., USA.
10 Et egnet HPLC-system, i hvilket de ovenfor nævnte søjler kan anvendes, er beskrevet i USA patent nr. 4.116.046.
Ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen ledes opløsningen af det urene højmolekylære peptid, fortrinsvis i nærværelse af en vandig puffer ved en til det pågældende protein egnet pH-værdi, gen-15 nem Si02-søjlen. Normalt foregår dette under tryk, fortrinsvis ved ca. 3,4-340 atmosfærers tryk. Det på søjlefyldmaterialet adsorberede protein elueres derefter trinvis og selektivt under anvendelse af en gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel.
Til dette formål egnede opløsningsmidler er fx alkanoler såsom n-20 propanol, 2-propanol, ethanol, methanol og tert.butanol og cycliske ethere såsom dioxan. Fraktioneringen af eluatet foretages på i og for sig kendt måde, idet indholdet af det aktive protein i de enkelte fraktioner bestemmes med høj følsomme monitorer. Et til dette formål egnet system er beskrevet af Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 25 (1975). Det er også anbefalelsesværdigt at iagttage nærværelse af målproteinet ved en egnet bioassay-metode.
Afgørelsen af, hvilken af de to søjletyper (søjle til normal forde-lingschromatografi og søjle til omvendtfase-chromatografi) der skal anvendes og i hvilken rækkefølge, afhænger i stor udstrækning af 30 arten af det protein, der skal renses. Det har vist sig, at der fx i det særlige tilfælde med human-leukocyt-interferon opnås de bedste resultater, når den urene interferonopløsning først ledes gennem en søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix (om-
DK 161048 B
6 i i vendtfase-chromatografi) under anvendelse af en puffer med en pH-værdi på ca. 7,5 (fortrinsvis 1M natriumacetat/eddikesyre) og elueres med en stigende n-propanol-gradient, hvorefter de opsamlede aktive fraktioner ledes gennem en søjle på basis af en med glycerylgrupper 5 modificeret S iC>2-matrix med en 0,1M natriumacetat - puffer og elueres med en faldende n-propanol-gradient, hvorefter de adskilte inter-ferohkomponenter ledes gennem en søjle på basis af en med octylgrup-per modificeret S iC>2-matrix under anvendelse af en puffer med en pH-værdi på ca. 4,0, fortrinsvis 1M pyridin/2M myresyre, og elueres med 10 en stigende n-propanol-gradient. På denne måde kan hver af de tre adskilte human-leukocyt-interferoner (α,β og γ) videreopspaltes, idet der i chromatogrammet fås skarpt adskilte toppe, som viser de homoge- j ne proteiner. Ved den totale rensnings fremgangsmåde, startende med ihkuhationsmediet og sluttende med chromatografi på den anden, med 15 octylgrupper modificerede Si02-matrix opnås en forøgelse i renhedsgraden med en faktor 60.000-80.000.
Ved en særlig udførelsesform for fremgangsmåden til rensning af human-leukocyt-interferon samles de i trin B) vundne fraktioner, som svarer til hovedtoppene, ekstraheres til fjernelse af n-propanolet 20 med n-hexan og befries for spor af n-hexan før trin C) .
De fremstillede homogene human-leukocyt-interferonkomponenter har en skarp top i chr omat o gramment fra de ovennævnte HPLC-søjler samt et enkelt snævert bånd ved polyacrylamid-gelelektroforese på natrium-dodecylsulfat (NaDodSO^ i nærværelse af 2-mercaptoethanol. Ekstrak-25 tion af gelen giver en enkelt skarp top med antiviral aktivitet, som stemmer overens med proteiribåndet. Specifikke aktiviteter af de rene interferonkomponenter ligger i området mellem ca. 2,6 og 4,0 x 10® enheder/mg med MDBK-celler (epitheliale nyreceller fra okse) og i området fra 1,5 til 4 x 10® enheder/mg med human-cellelinjen Ag 1732.
30 Molekylvægtene ligger mellem ca. 16.000 og 21.000 (jfr. tabel IV, side 17-18). Resultaterne af aminosyreanalysen er angivet i tabel V (side 18).
Interferonerne har antiviral, antitumor-, væksthæmmende og immunosup-pressiv virkning. Disse aktiviteter kunne endog fastslås i klinisk 35 målestok ved administration af 1-10 x 10® eriheder/dag med relativt
DK 161048 B
7 urene præparater, som indeholdt mindre end 1% human-interferon. De rensede, homogene interferonkomponenter isoleret ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes på samme måde som de kendte interferonpræparater under tilpasning af doseringen efter den 5 opnåede renhedsgrad. De enkelte interferonkomponenter kan administreres alene eller i blandinger med hinanden. Sådanne blandinger kan enten fås ved blanding af de enkelte komponenter eller ved afbrydelse af rensnings fremgangsmåden på et trin, hvor flere interferonkomponenter, men ingen interferon-inaktive proteiner, forekommer.
10 Den omhandlede rensnings fremgangsmåde kan, selv om den kun er eksemplificeret ved human-leukocyt-interferon, også anvendes til rensning af andre interferoner, fx af human-fibroblaster-interferon.
Foranstaltninger, som er egnede til at gøre fremgangsmåden ifølge opfindelsen optimal til rensning af andre humane interferoner, ligger 15 inden for fagmandens kunnen.
Induktionen af interferon-produktionen, den første koncentration og fraktionering af interferonet, herunder gelfiltrering, kan foretages på i og for sig kendt måde. Disse fremgangsmådetrin, som giver en vandig opløsning af interferon i uren tilstand, er ikke genstand for 20 den foreliggende opfindelse.
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse illustreres ved nedenstående eksempler: EKSEMPEL 1
Homogent human-leukocyt-interferon fra normale donorer.
25 A. Fremstilling af interferonet.
Interferon fremstilles ved 16 timers inkubering af human-leukocyter fra blodet fra normale donorer (10^ celler/ml) med Newcastle-disease-virus (15 hæmagglutininenheder/ml) i et serumfrit minimalmedium, som indeholder 10 mg/ml casein. Der fås en gennemsnitlig interferontiter
DK 161048 B
8 på 5000 enheder/ml. De anvendte metoder svarer til de af Mogensen, K.E. et al., Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369-381; Whee-lock, E.F., J. Bacterial. 92, 1415-1421 (1966) og Cantell, K. et al., Appl. Microbiol. 22, 625-628 (1971) angivne metoder med enkelte 5 mindre ændringer. Interferontiteren bestemmes ved et forsøg på basis af hæmningen af den cytopatiske effekt, der kan udføres i løbet af 16 timer. Alle interferon-titere er angivet i enheder/ ml, kalibreret mod National Institute of Health (USA) ’ s referencestandard for human-leukocyt-interferon.
10 B. Koncentrering og første fraktionering af interferon.
Såfremt intet andet er angivet, arbejdes der ved en temperatur på 0-4°C. Efter endt inkubering fjernes cellerne og cellerester ved centrifugering (15 minutter, 500 x g). Casein udfældes ved syrning med HC1 til pH-værdi 4,0. Efter 2 timers forløb centrifugeres blan-15 dingen (10 minutter, 12.000 x g), og bundfaldet kasseres. Den overstående væske (10 liter) indstilles på et indhold af 1,5 vægt/volu-menprocent trichloreddikesyre. Efter 1 times forløb fracentrifugeres præcipitatet (10 minutter, 12.000 x g) og opløses igen i 50 ml 0,1M natriumhydrogencarbonatopløsning. Efter tilsætning af 0,5 g "Triton"® 20 X-100 og 1,5 ml eddikesyre (tilsat dråbevis under omrøring) lades blandingen henstå i 1 time ved 0°C og derefter i 16 timer ved -20°C.
Efter optøning centrifugeres blandingen i 10 minutter med 17.000 x g. Remanensen kasseres, og den overstående væske indstilles på 4% trichloreddikesyre. Efter 1 times forløb centrifugeres blandingen i 10 25 minutter med 12.000 x g, og bundfaldet opløses i 5 ml 0,5M natrium-hydro gencarbonatopløsning .
C. Gelfi1 trering.
Til den vundne koncentrerede interferon-opløsning sættes 1,5 g urin-stof, og den føres på en søjle af "Sephadex" G-100 fin (2,6 x 90 30 cm), som i forvejen er ækvilibreret med 4M urinstof/0,1M natriumace-tatpuffer. Søjlen elueres ved stuetemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 0,5 ml/minut med 4M urinstof/0,1M natriumacetat, pH-værdi 7,5. Der opsamles fraktioner på 12,5 ml. Interferonaktivitet elueres i fraktionerne 19-23.
DK 161048B
9 D. HPLC.
De samlede fraktioner 19-23 fra "Sephadex" ® G-100-søjlen føres direkte via en pumpe over på en "Lichrosorb" RP-8-søjle (10 μ, 4,6 x 250 mm). Søjlen er i forvejen ækvilibreret med en 1M natriumacetat-5 puffer (pH-værdi 7,5), som indeholder 0,01 volumen/volumenprocent thiodiglycol, og der elueres med en lineær gradient af n-propanol i samme puffer (1 time, 0-20%; 3 timer, 20-40% (volumen/volumen)) med en gennemstrømningshastighed på 0,25 ml/ minut. Der opsamles fraktioner på 0,75 ml. Interferonet elueres i fraktionerne 23-40 (25-30 10 volumen/volumenprocent n-propanol).
Fraktionerne 27-33, som indeholder den største andel af interferonaktiviteten, sammenhældes, tilsættes n-propanol til en slutkoncentra-tion på 80 volumen/volumenprocent og ledes direkte via pumpen til en "Lichrosorb"-diol-søjle (10 μ, 4,6 x 250 mm), som i forvejen er 15 ækvilibreret med en opløsning af 0,1M natriumacetat med et indhold på 80 volumen/volumenprocent n-propanol. Søjlen elueres derefter i 4 timer med en lineær gradient på 72-50 volumen/volumenprocent n-pro-panol i 0,lM natriumacetat med en gennemstrømningshastighed på 0,25 ml/minut. Der opsamles fraktioner på 0,75 ml. Interferonaktiviteten 20 elueres i form af tre tydelige hovedtoppe, som kvantitativt varierer fra præparat til præparat. Disse toppe kaldes i elueringsrækkefølge a, β °g 7· a-Fraktionen elueres ved en koncentration på 68% n-propanol, β-fraktionen ved en koncentration på 66,5% n-propanol og γ-fraktionen ved en koncentration på 65,5% n-propanol. Det totale 25 udbytte af interferonaktivitet er større end 80%.
De til hver top hørende fraktioner sammenhældes og renses yderligere i de næste trin. Da toppen γ er langt den største og synes at være bedst adskilt fra andre komponenter, udvælges den til yderligere rensning. Fraktionerne 54-56 fra diolsøjlen, som indeholder toppen γ, 30 sammenhældes, og n-propanolet fjernes ved to ekstraktioner med samme mængde hexan. Spor af hexan fjernes med en nitrogenstrøm. Der tilsættes pyridin og myresyre til en s lutkoncentration på henholdsvis 1M og 2M, og opløsningen ledes på en "Lichrosorb" RP-8-søjle (10 μ;
4,6 x 250 mm), som i forvejen er ækvilibreret med 1M pyridin og 2M
DK 161048 B
10 ! myresyre) (pH-værdi 4,0). Søjlen elueres i 3 timer med en lineær gradient af n-propanol (20-40%) i 1M pyridin/formiat med en gennemstrømningshastighed på 0,2 ml/minut. Der opsamles fraktioner på 0,6 ml. Aktivitetshovedtoppen stemmer overens med en proteintop.
5 Fraktionerne 45 og 46 (32 volumen/volumenprocent propanol), som svarer til denne top, sammenhældes og genchromatograferes under samme betingelser. Interferon elueres i fraktion 31 (32 volumen/volumenprocent propanol). Denne fraktions specifikke aktivitet beregnes til 4 x 10® enheder/mg i sammenligning med okseserumalbumin. Dette materiale 10 anvendes til yderligere karakterisering. Fluorescensprofilerne fra HPLC er så godt reproducerbare, at de er et holdbart "fingeraftryk" for hele fremgangsmåden.
Resultaterne af rensningen er sammenfattet i nedenstående tabel I.
Den totale rensning, fra ihkubationsmediet til den anden RP-8-søjle, 15 er 60.000-80.000 fold. Det kumulative udbytte fra trin 1 til dioltri-net ligger ved 30-50%. Efter dette trin renses hver af de tre interferontoppe yderligere hver for sig.
Rensning af human-leukocyt-interferon.
Tabel 1 11
DK 161048 B
Enheder, Protein, Relativ Renheds Udbytte pr.
5 fundet fundet specifik grad trin (%) aktivitet aktivitet x 10"® (mg) (enh./mg) 1. Inkubationsmedium 50 10.000 5xl08 1 10 2. pH 4 overstående 50 2.000 2,5xl04 5 100 3. 1,5% trichloreddike- syre-bundfald 40 1.000 4xl04 8 80-100 4. "Triton" X-100/ed-dikesyre-overstå- 15 ende 40 250 l,6xl05 32 70-100 5. 4% trichloreddike- syre-bundfald 35 175 2x10^ 40 80-90 6. "Sephadex" G-100 32 57 5,6xl05 112 70-90 7. "Lichrosorb" RP-8 20 (pH 7,5) 28 11 2,5xl06 500 80-100 8. "Lichrosorb"-diol top α 11 1,1 lxlO7 5.000 top β 2,5 NB NB NB 70-90 top 7 12,5 0,21 6xl07 12.000 25 9. "Lichrosorb" RP-8 (pH 4) 1,6 0,0064 3xl08 60.000 40-60 10. "Lichrosorb” RP-8 (pH 4) 8,2 0,021 4xl08 80.000 40-60 30 Til bestemmelse af det i disse fraktioner værende protein anvendes okseserumalbumin som standard. Den absolutte specifikke aktivitet, som bestemmes ved aminosyreanalyse på den homogene top fra trin 10, er 2-4 x 108 eriheder/mg (jfr. teksten). Trin 9 gennemføres med top 7 fra trin 8. Trin 10 gennemføres med det samlede materiale fra trin 9 35 af forskellige præparater. NB — ikke bestemt.
DK 161048 B
12 E. Polyacrylamidgelelektroforese.
Interferonprøver (1,5 x 10·* enheder) inkuberes med natriumdodecylsul-fat og 2-mercaptoethanol og anbringes på en pladegel. Efter elektro-foresen fås et enkelt skarpt bånd efter farvning med Coomassie-blue.
5 Den tilsyneladende molekylvagt bestemmes til 17.500 (i sammenligning med standardproteiner). Gelen skæres i strimler på 1 mm, hver strimmel homogeniseres i 0,4 ml 0,5M natriumhydrogencarbonat/0,1% natrium -dodecylsulfat og undersøges med henblik på interferonaktivitet. Der findes en enkelt top med antiviral aktivitet, som stemmer overens med 10 det enkelte proteinbånd.
F. Åminosyreanalyse.
Aminosyreanalysen på det homogene human-leukocyt-interferon (top 7) udføres med fluorescamin-aminosyre-analysator på 0,5-1 /ig prøve af oprindeligt og S-carboxymethyleret interferon. Til bestemmelse af 15 cystein/cystin-forholdet carboxymethyleres oprindeligt interferon og hydrolyseres derefter i 6M HC1 under reducerende betingelser (0,1% thioglycolsyre). Under disse betingelser måles cystein som S-carboxy-methylcystein og cystin som frit cystein. Resultaterne af aminosyreanalysen er sammenstillet i nedenstående tabel II. Den specifikke
O
20 aktivitet, beregnet på aminosyre indholdet, bestemmes til 2-4 x 10° enheder/mg.
Tabel II
Aminosyresammensætning i human-leukocyt-interferon.
13
DK 161048 B
Aminosyre Andel
Asx 15,2±1,2 5 Thr* 7,5±0,5
Ser* 8,0+0,5
Glx 24,0+0,6
Pro 6,3+0,3
Gly 5,5+0,5 10 Ala 8,2+0,2
Cys (total) 3,3+0,7
Cystin+ 1,8+0,2
Cystein+ 1,5+0,5
Val 7,8+0,2 15 Met 3,9+0,2
Ile 8,9+0,4
Leu 21,8+1,3
Tyr 5,1+0,2
Phe 9,1+0,3 20 His 3,3+0,4
Lys 11,6+0,5
Arg 7,3+0,5
Trp++ 0,7+0,1 25 * Korrigeret til tid 0.
+ Målt efter carboxymethylering af oprindeligt interferon.
^ Målt efter hydrolyse i 6M HCl/4% thioglycolsyre.
DK 161048 B | !
14 I
EKSEMPEL 2 j
Homogent human-leukocyt-interferon fra leukocyter fra leukæmipatienter.
Interferonet fås ved inkubering af human-leukocyter, der er isoleret 5 fra blodet fra leukæmipatienter (kronisk myelogen leukæmi, CML) ved leukoforese med Newcastle-disease-virus i et serumfrit, caseihholdigt medium. Interferontiteren ligger ved 5000-40.000 enheder/ml.
Rensnings fremgangsmåden er den samme som beskrevet i eksempel 1 for interferon fra blod fra normale donorer og omfatter den selektive 10 udfældning med 0,5M eddikesyre i nærværelse af "Triton" X-100, gel-filtrering på "Sephadex" G-100 i 4M urinstof, HPLC ved pH-værdi 7,5 på "Lichrosorb" RP-8, HPLC på "Lichrosorb"-diol og HPLC på "Lich-rosorb" RP-8 ved pH-værdi 4,0. De fraktioner, som svarer til henholdsvis a.- , β- og γ-toppene fra "Lichrosorb"-diolsøjlen, sammen-15 hældes og skilles derefter fra hinanden i yderligere trin.
Fra de samlede fraktioner 43-46 (α-top) fjernes n-propanol ved to ganges ekstraktion med samme mængde n-hexan. Spor af hexan fjernes med en nitrogenstrøm. Der tilsættes pyridin og myresyre til en slut-koncentration på henholdsvis 1M og 2M, og opløsningen ledes gennem en 20 "Lichrosorb" RP-8-søjle (10 μ, 4,6 x 250 mm), som i forvejen er ækvilibreret med 1M pyridin/2M myresyre (pH-værdi 4,0). Søjlen elu-eres i 3 timer med en lineær n-propanol-gradient (20-40 volumen/-volumenprocent) i 1M pyridinformiat-puffer med en gennemstrømnings-hastighed på 0,2 ml/minut. Der opsamles fraktioner på 0,6 ml. Inter -25 feronaktiviteten elueres i brede toppe ved koncentrationer mellem 31 og 35 volumen/volumenprocent n-propanol. Disse fraktioner sammenhældes og chromatograferes igen under samme betingelser. Interferonaktiviteten elueres i to hovedtoppe (a^ og a^) ved 31 og 32 volumen/volumenprocent n-propanol. Underordnede komponenter elueres ved 30 en koncentration på 34 volumen/volumenprocent n-propanol.
De samlede fraktioner 47-50 (top β) fra "Lichrosorb"-diolsøjlen oparbejdes på samme måde og chromatograferes på "Lichrosorb" RP-8 som beskrevet for a-toppen. Interferonaktiviten elueres i to hovedtoppe; 0
DK 161048 B
15 /?2 ved 32 volumen/volumenprocent n-propanol og β-$ ved 34 volumen/-volumenprocent n-propanol. Genchromatografi er ikke nødvendigt i dette tilfælde. I nogle præparater kan konstateres en ^-top ved 31 volumen/volumenprocent n-propanol.
5 De samlede fraktioner 52-54 (top 7) fra "Lichrosorb"-diolsøjlen oparbejdes på samme måde og chromatograferes på "Lichrosorb" RP-8 som beskrevet for α-top. Interferonaktiviteten elueres i fem hovedtoppe: 71 (ved 31 volumen/volumenprocent n-propanol), 72 (ved 32 volumen/-volumenprocent n-propanol), 73 (ved 34 volumen/volumenprocent n-10 propanol), 74 (ved 35 volumen/volumenprocent n-propanol) og 75 (ved 35,5 volumen/volumenprocent n-propanol). Genchromatografi er ikke nødvendigt i dette tilfælde. Resultaterne af rensningen til frem- j stilling af de enkelte interferonkomponenter er sammenfattet i nedenstående tabel III.
15 Komponenterne c*2 og $2 kan endvidere adskilles ved deres eluerings-karakteristikker på "Lichrosorb"-diol: a2 elueres med 68 volumen/-volumenprocent n-propanol og med 66,5 volumen/volumenprocent n-propanol.
Prøver af interferonkomponenter (1,5 x 105 enheder) inkuberes med 20 natriumdodecylsulfat og 2-mercaptoethanol og anbringes på en plade-gel. Efter elektroforese giver toppene aa2, β2, 71ι 72 °8 14 hver et enkelt bånd, medens toppene βj, 73 og 75 hver giver to bånd. De tilsyneladende molekylvægte ligger mellem 16.000 og 18.000 med undtagelse af β$, som giver et bånd ved 16.500 og et ved 21.000, og 74, 25 der giver et bånd ved 21.000 (jfr. tabel IV).
Tabel III
Rensning af leukocyt-interferon fra CML-celler.
16
DK 161048 B
Trin Enheder, Protein, Specifik Ren- Udbytte hods /y\ 5 fundet x fundet aktivitet 10 "6 (mg) (erih,/mg) grad i. Inkubationsmedium 800 20xl03 4xl04 1 100 10 1. pH 4-overstående 800 4xl03 2xl03 5 100 3. 1,5% trichloreddi- kesyre-bundfald 780 2xl03 3,9xl05 9,8 97 4. Triton X-100/ed-dikesyre-overstå- 15 ende 760 510 l,5xl06 37,5 95 5. 4% trichloreddike- syre-bundfald 810 350 2,3x10^ 57,5 100 6. "Sephadex"® G-100 660 130 5,lxl06 128 82 20 7. "Lichrosorb" RP-8 (pH 7,5) 510 26 2xl07 500 64 (2 ansatser) 8. ,'Lichrosorb"-diol top α 149 5 3xl07 750 25 top β 148 3 5xl07 1250 top 7 139 1,7 8xl07 2000 I alt 436 54 17
DK 1610 4 8 B
Tabel III fortsat 9. "Lichrosorb" RP-8 (pH 4,0) top aj* 9 35xl0'3 2,6xl08 6500 5 top «2* 26 65x10'3 4,0xl08 10000 top β2 30 75x10'3 4,0xl08 10000 top β3 13 32xl0'3 4,0xl08 10000 top 7l 15 58x10'3 2,6xl08 6500 top 72 31 77x10'3 4xl08 10000 10 top 73 26 74x10'3 3,5xl08 8750 top 74 3,5 10x10'3 3,5xl08 8750 top 75 4,5 50x10'3 0,9xl08 2250 I alt 158 20 15 * Efter genchromatografi ** Aktivitet bestemt på MDBK-celler (okse); protein målt med serumalbumin som standard.
Tabel IV
Molvægtr Spec. akt. på Spec. akt. på Væksthæm- 20 ± 1000 MDBK (okse- Ag 1732 (hu- mende akceller, erih./ man-celler, tivitet** mg) ± 25% enh./mg) ± 50% ajL 16500 2,6xl08 2,6xl08 + 25 a2 16200 4 xl°8 3 xl°8 + β2 16500 4 xlO8 2 xlO8 + 21000 4 xlO8 3 xlO8 + 71 17700 2,6xl08 2 xlO8 + 72 17700 4 xlO8 l,5xl08 + 30 73* 17200 3,5xl08 l,5xl07 + 74 21000 3,5xl08 4 xlO8 + 75 16500 0,9xl08 2 xlO6 +
DK 161048 B
18 * 2 bånd ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; hovedbindets molvægt.
** den af Stewart et al., Nature 262, 300 (1976) angivne metode.
Aminosyreanalysen på de rensede human-leukocyt-interferonf rakt ioner 5 udføres med en fluorescamin-aminosyre-analysator på 0,1-1 /tg prøver. Hydrolysen udføres i 6N HC1 under reducerende betingelser (0,1% thioglycolsyre). Resultaterne af analysen er angivet i nedenstående tabel V.
Tabel V.
10 Amino syre analyse på human-leukocyt-interferon.
Komponenter a^ c*2 $2 ^3* 71 72 73* 74 75*
Molvægtr 16500 16200 16500 21000 17700 17700 17200 21000 16500 15 ______
Rester 142 139 142 181 153 153 148 180 142
Asx 13,8 11,7 11,5 18,2 13,1 13,3 15,0 17,9 13,8
Thr 7,7 8,3 9,0 9,9 8,4 9,6 8,6 7,3 7,6 20 Ser 9,2 10,0 10,0 14,5 10,2 7,8 10,1 13,5 9,0
Glx 20,3 20,5 21,9 28,5 23,9 25,0 22,8 27,0 20,8
Pro 6,1 4,9 5,0 5,9 4,5 4,8 4,8 6,5 4,2
Gly 5,1 4,5 5,0 3,6 5,7 5,0 3,2 4,8 4,0
Ala 8,4 8,3 7,9 11,5 8,7 8,1 9,3 10,4 9,3 25 Val 7,4 6,2 6,7 7,5 7,3 7,0 5,5 7,9 5,1
Met 3,7 3,8 4,4 6,0 4,3 3,9 5,6 4,9 4,7 ILeu 7,4 7,0 7,4 9,5 7,9 8,0 6,8 9,7 6,6
Leu 18,0 18,0 18,9 24,4 20,3 20,1 20,5 24,1 19,6
Tyr 4,0 4,4 4,6 5,0 4,8 4,8 3,7 5,0 3,6 30 Phe 6,9 8,0 8,7 9,9 8,6 9,0 7,2 9,1 6,4
His 3,0 2,8 3,0 3,8 3,7 3,3 2,9 3,8 2,8
Lys 10,5 9,0 8,5 9,3 10,1 10,0 7,6 12,3 12,0
Arg 6,2 7,1 8,0 10,8 8,0 8,5 10,1 8,5 9,0
Cys 3,9 4,0 1,8 2,3 3,3 2,9 3,1 4,1 2,3 35 __;_. __ Nøjagtighed ±1,5 rest.
*
Blandinger af begge bånd.
DK 161048 B
19
Trypsinspaltning og HPLC på fragmenterne.
300 pmol af hver af de rensede human-leukocyt-interferonkomponenter opløses i 50 millimol vandig natriumhydrogencarbonatopløsning (pH-værdi 8, 50 pliter). Efter tilsætning af 0,1 pg trypsin i 2 pliter 5 HCl (pH-værdi 3) til hver prøve inkuberes der i 14 timer ved 37°C og tilsættes 5 pliter eddikesyre, og blandingen ledes på en "Lichrosorb" RP-8-søjle (partikelstørrelse 10 μ; 4,6 x 250 mm). Søjlen elueres i 1 time med en lineær gradient på 0-40 volumen/volumenprocent n-propanol i en 0,1M myresyre/0,03M pyridinpuffer (pH-værdi 3) med en gennem-10 strømningshastighed på 0,5 ml/minut.
Fragmenterne påvises ved fluorescamin-metoden. Resultaterne er sammenfattet i nedenstående tabel VI, hvor toppenes position er angivet som procent n-propanol, og fragmenternes relative størrelse er angivet (S — lille; M = middelstor; L = stor).
15 Tabel VI
Tryptiske peptider fra human-leukocyt-interferon.
Komponent Eluering med procent n-propanol c*! 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M,
20 20S, 21S, 22,5S, 29M
a2 3L, 4L, 4,2M, 11,511, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M,
27S, 29M
β2 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5S,
18M, 29M
25 β3 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S,
18L, 19,5M, 27M, 32M
7jL 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5M, 18M, 2911 72 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 11,5S, 12,5S, 14,5S,
30 16S, 18L, 29M
73 3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M, 16S,
18L, 20S, 32M
75 3L, 4L, 4,211, 4,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L, 12,5S, 14S, 14,511, 16S, 18L, 24,5S, 25,5S, 32S 35 _
DK 161048 B
20
De rensede human- leukocyt- interferon-komponenter underkastes amino-stikker analyse, hvorved der konstateres et aminosukkerindhold i området på 50-100 pmol. I alle tilfælde findes der mindre end en rest af henholdsvis glucosamin, galactosamin og mannosamin pr. molekyle. I 5 de fleste tilfælde interfererer et antal mindre peptider, som elueres i nærheden af aminosukkeret, med analysen. Det er derfor muligt delvis eller endog helt at henføre peptiderne til de til aminosukrene hørende toppe.
Endelig viser et forsøg på sekvensering af 1 nmol rent 72-interferon 10 ved manuel Edman-nedbrydning, som omfatter tilbagehydrolyse og amino -syreanalyse under anvendelse af fluorescamin, ingen aminosyrer i de første to cykler. Behandlingen af 100 pmol rent 72 -human- leukocyt-interferon med leucinaminopeptidase og aminopeptidase M i 20 timer ved 37°C har ingen indflydelse på den biologiske aktivitet; i inkuba-15 tionsmediet kan der ikke påvises aminosyrer. Ved behandling af den overstående væske fra et induktionsmedium (leukocyter og Newcastle-disease-virus i minimalmedium) med aminopeptidase M kan der ikke iagttages tab af interferonaktivitet. Dette tyder på, at interferonmolekylet allerede før rensningsfremgangsmåden indeholder en blokeret 20 aminoterminal aminosyre. Til kontrol inkuberes råt interferon, rent interferon og /3-kæden af insulin sammen med aminopeptidase M. Medens insulin nedbrydes delvis (aminosyrer påviselige), optræder der ingen tab af interferonaktivitet.
EKSEMPEL 3 25 a) 3 mg homogent human-leukocyt-interferon med en specifik aktivitet på 2 x 10® enheder/mg opløses i 25 ml 5%'s normalt human-serumalbumin. Opløsningen filtreres gennem et bakteriologisk filter og fordeles derefter i 100 aseptiske ampuller. Hver ampul indeholder 6 x 10® enheder rent interferon, som kan anvendes til parenteral 30 applikation. Ampullerne opbevares fortrinsvis koldt (ved -20°C) indtil brug.
b) En vandig opløsning indeholdende 1,5 mg af de samlede homogene human-leukocyt-interferon-komponenter a^, <*2» @2 · 71 °S 72 (som hver
Claims (17)
1. Fremgangsmåde til rensning af humant interferon, 10 kendetegnet ved, at man leder en vandig opløsning af det urene protein gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med cyanopropyl-, cyclohexyl-, phenyl-, octyl-, octadecyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs S1O2-matrix under HPLC-betingelser, idet proteinet først adsorberes og derefter elueres med en stigende 15 eller faldende gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel, så at det til slut fås i bestemte eluatfraktioner i renere form, og at man eventuelt gentager behandlingen én eller flere gange med de fremkomne eluatfraktioner i renere form.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at der anvendes en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs S1O2-matrix.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af humant interferon som homogent protein, 25 kendetegnet ved, at man A) leder en vandig opløsning af interferon i uren tilstand under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret S1Ο2-matrix, idet interferonet først adsorberes og derefter elueres med en stigende gradient af et 30 med vand blandbart opløsningsmiddel i en puffer, så at det fås i bestemte eluatfraktioner i renere form; DK 161048 B B) leder de i trin A) vundne bestemte fraktioner gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med glycerylgrupper modificeret SiC>2-matrix, idet interferonet først adsorberes og derefter elueres med en faldende gradient af et med vand blandbart opløsnings- 5 middel i en puffer, så at det fås i udprægede hovedtoppe i bestemte eluatfraktioner i renere form; C) leder de i trin B) vundne fraktioner, som svarer til de udprægede hovedtoppe, under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix, 10 idet interferonet først adsorberes og derefter elueres med en blanding af et med vand blandbart opløsningsmiddel og en vandig puffer, så at det fremkommer i en enkelt, udpræget top i bestemte eluatfraktioner som homogent protein, og, om ønsket, gentager trin C) til opnåelse af produktet i yderste renhed.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der gås ud fra leukocyt-interferon.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at man som med vand blandbart opløsningsmiddel anvender en alkano1 eller en cyclisk ether.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man som med vand blandbart opløsningsmiddel anvender n-propanol, i trin A) en puffer med en pH-værdi på ca. 7,5 og i trin C) en puffer med en pH-værdi på ca. 4,0.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, 25 kendetegnet ved, at den i trin A) anvendte puffer er 1M natriumacetat/eddikesyre med en pH på ca. 7,5, og at n-propanol-gradienten stiger fra 0 til 40 volumen/volumenprocent, at den i trin B) anvendte puffer er 0,1M natriumacetat, og at n-propanol-gradienten falder fra 72,5 til 50 volumen/volumenprocent, og at den i trin C) 30 anvendte puffer er 1M pyridin/2M myresyre med en pH på ca. 4,0, og at n-propanol-gradienten stiger fra 20 til 40 volumen/volumenprocent. DK 161048 B
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at de bestemte fraktioner, der hører til de udprægede hovedtoppe, kombineres, at n-propanolet fjernes ved ekstraktion med n-hexan, og at spor af n-hexan fjernes fra den van- 5 dige fase før trin C).
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås - interferon som homogent protein.
10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, 10 kendetegnet ved, at der fås a2"fnterferon som homogent protein.
11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås ~ interferon som homogent protein.
12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås $3 - interferon som homogent protein.
13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 7^-interferon som homogent 20 protein.
14. Fremgangsmåde ifølge at hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 72-interferon som homogent protein.
15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, 25 kendetegnet ved, at der fås 73- interferon som homogent protein.
16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 74-interferon som homogent protein. DK 161048B
17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 75-interferon som homogent protein.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96325778A | 1978-11-24 | 1978-11-24 | |
| US96325778 | 1978-11-24 | ||
| US6237479A | 1979-07-31 | 1979-07-31 | |
| US6237479 | 1979-07-31 | ||
| US7771079A | 1979-09-21 | 1979-09-21 | |
| US7771079 | 1979-09-21 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK496779A DK496779A (da) | 1980-05-25 |
| DK161048B true DK161048B (da) | 1991-05-27 |
| DK161048C DK161048C (da) | 1991-11-04 |
Family
ID=27370266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK496779A DK161048C (da) | 1978-11-24 | 1979-11-22 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant interferon |
Country Status (34)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4289690A (da) |
| JP (1) | JPH07224098A (da) |
| KR (1) | KR830002616B1 (da) |
| AR (1) | AR222359A1 (da) |
| AU (2) | AU535936B2 (da) |
| BE (1) | BE880201A (da) |
| CA (1) | CA1129409A (da) |
| CH (3) | CH654843A5 (da) |
| DE (1) | DE2947134A1 (da) |
| DK (1) | DK161048C (da) |
| DO (1) | DOP1979002953A (da) |
| ES (1) | ES8100502A1 (da) |
| FI (1) | FI69476C (da) |
| FR (1) | FR2442054A1 (da) |
| GB (1) | GB2037296B (da) |
| GR (1) | GR72828B (da) |
| HK (1) | HK26684A (da) |
| IE (1) | IE48882B1 (da) |
| IL (1) | IL58759A (da) |
| IN (1) | IN150740B (da) |
| IT (1) | IT1127253B (da) |
| KE (1) | KE3347A (da) |
| LU (2) | LU81918A1 (da) |
| MC (1) | MC1300A1 (da) |
| MY (1) | MY8500222A (da) |
| NL (1) | NL193085C (da) |
| NO (1) | NO151157C (da) |
| NZ (1) | NZ192201A (da) |
| PH (1) | PH20763A (da) |
| PT (1) | PT70495A (da) |
| RO (1) | RO79132B (da) |
| SE (1) | SE454276B (da) |
| SG (1) | SG71183G (da) |
| YU (1) | YU286179A (da) |
Families Citing this family (120)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6410697B1 (en) * | 1979-04-20 | 2002-06-25 | Schering Corporation | Process for purifying human leukocyte interferon |
| FI77877C (fi) * | 1979-04-20 | 1989-05-10 | Technobiotic Ltd | Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US6835557B1 (en) | 1980-01-08 | 2004-12-28 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
| JP2687995B2 (ja) | 1980-04-03 | 1997-12-08 | バイオゲン インコーポレイテッド | Ｄｎａ配列、組替えｄｎａ分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法 |
| CH657141A5 (de) * | 1980-07-01 | 1986-08-15 | Hoffmann La Roche | Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen. |
| US6610830B1 (en) * | 1980-07-01 | 2003-08-26 | Hoffman-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferons |
| IT1139487B (it) * | 1980-09-25 | 1986-09-24 | Genentech Inc | Produzione microbica di interferone di fibroblasti umani |
| US4315852A (en) | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| US4364863A (en) | 1980-12-29 | 1982-12-21 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| DE3280127D1 (de) * | 1981-03-27 | 1990-04-12 | Ici Plc | Genetisch modifizierte mikroorganismen. |
| IL65475A0 (en) * | 1981-04-17 | 1982-07-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
| US4810645A (en) * | 1981-08-14 | 1989-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L |
| US4801685A (en) * | 1981-08-14 | 1989-01-31 | Hoffmann-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L |
| WO1983000693A1 (en) * | 1981-08-14 | 1983-03-03 | Berg, Kurt, Frimann | SUBJECTS RELATING TO HUMAN INTEFERON-'alpha' SUBTYPE PROTEINS AND CORRESPONDING ANTIBODIES |
| US4672108A (en) * | 1981-12-07 | 1987-06-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Crystalline human leukocyte interferon |
| EP0082481B2 (en) * | 1981-12-23 | 1990-09-12 | Schering Corporation | Stabilised alpha-interferon formulations and their preparation |
| US5098703A (en) * | 1982-01-15 | 1992-03-24 | Cetus Corporation | Interferon-alpha 76 |
| US4973479A (en) * | 1982-01-15 | 1990-11-27 | Cetus Corporation | Interferon-α61 |
| US4975276A (en) * | 1982-01-15 | 1990-12-04 | Cetus Corporation | Interferon-alpha 54 |
| ZA83768B (en) * | 1982-03-01 | 1983-10-26 | Hoffmann La Roche | Homogeneous human immune interferon and process therefor |
| US6432677B1 (en) | 1982-03-08 | 2002-08-13 | Genentech, Inc. | Non-human animal interferons |
| US5827694A (en) * | 1982-03-08 | 1998-10-27 | Genentech, Inc. | DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides |
| US5831023A (en) * | 1982-11-01 | 1998-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant animal interferon polypeptides |
| US4534906A (en) * | 1982-11-01 | 1985-08-13 | Genentech, Inc. | Removal of impurities from human leukocyte interferon preparations |
| US4432895A (en) * | 1982-11-24 | 1984-02-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Monomeric interferons |
| US4820515A (en) * | 1982-12-13 | 1989-04-11 | Texas A&M University System | Method of using interferon in low dosage to regulate appetite and efficiency of food utilization |
| JPS59137417A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-07 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 |
| IL67896A (en) * | 1983-02-13 | 1987-03-31 | Yeda Res & Dev | Two biologically active human gama interferon subtypes,purification thereof and pharmaceutical compositions containing them |
| US4599306A (en) * | 1983-04-15 | 1986-07-08 | Amgen | Monoclonal antibodies which specifically bind to human immune interferon |
| US4723000A (en) * | 1983-07-05 | 1988-02-02 | Biospectrum, Inc. | Human interferon gamma and interleukin-2 |
| US4710377A (en) * | 1983-08-19 | 1987-12-01 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of Eimeria spp. |
| US4675383A (en) * | 1983-11-15 | 1987-06-23 | The Salk Institute For Biological Studies | Purification of T-cell growth factor |
| US4568488A (en) * | 1984-01-11 | 1986-02-04 | Lee Huang Sylvia | Reverse immunoaffinity chromatography purification method |
| US4499014A (en) * | 1984-02-07 | 1985-02-12 | Interferon Sciences, Inc. | Method for purifying gamma-interferon |
| AU594014B2 (en) * | 1984-03-21 | 1990-03-01 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant DNA molecules |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| IL71555A (en) * | 1984-04-15 | 1992-06-21 | State Of Israel Israel Inst Fo | Bovine interferon |
| US6133433A (en) * | 1984-07-27 | 2000-10-17 | City Of Hope | Method for detection and prevention of human cytomegalovirus infection |
| US6242567B1 (en) | 1984-07-27 | 2001-06-05 | City Of Hope | Method for detection and prevention of human cytomegalovirus infection |
| UA29377C2 (uk) * | 1984-09-19 | 2000-11-15 | Новартіс Аг | Спосіб отримання білка з активністю колонієстимулювального фактора гранулоцитів та макрофагів(gm-csf) приматів |
| US5322837A (en) * | 1985-01-11 | 1994-06-21 | Genetics Institute, Inc. | Homogeneous erythropoietin compositions and methods of using same |
| US4677195A (en) * | 1985-01-11 | 1987-06-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions |
| US5792450A (en) * | 1985-02-05 | 1998-08-11 | Chiron Corporation | Purified human CSF-1 |
| US5532341A (en) * | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
| US4667016A (en) * | 1985-06-20 | 1987-05-19 | Kirin-Amgen, Inc. | Erythropoietin purification |
| IL79176A (en) * | 1985-06-20 | 1992-06-21 | Kirin Amgen Inc | Process for the recovery of erythropoietin from a fluid |
| NZ212523A (en) * | 1985-06-24 | 1989-01-06 | Univ Massey | Mobile phase for purification of proteins by high performance liquid chromatography |
| GB8522336D0 (en) * | 1985-09-09 | 1985-10-16 | Biogen Nv | Composition for treatment of allergies |
| US5427780A (en) * | 1985-10-30 | 1995-06-27 | Biogen, Inc. | Composition comprising Mullerian inhibiting substance-like polypeptides |
| US4677197A (en) * | 1985-10-30 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Purification method for tumor necrosis factor |
| US4894439A (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes |
| US4770781A (en) * | 1986-03-03 | 1988-09-13 | Merck & Co., Inc. | Purification of human interleukin-1 species |
| US5030559A (en) * | 1986-04-01 | 1991-07-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the identification of metastatic human tumors |
| US4935372A (en) * | 1986-05-20 | 1990-06-19 | Dana Farber Cancer Institute | Art nucleotide segments, vectors, cell lines methods of preparation and use |
| US5028422A (en) * | 1986-05-27 | 1991-07-02 | Schering Corporation | Treatment of basal cell carcinoma intralesionally with recombinant human alpha interferon |
| US4894440A (en) * | 1986-09-17 | 1990-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of isolating megakaryocyte stimulatory factor |
| IL84170A0 (en) * | 1986-10-17 | 1988-03-31 | Interferon Sciences Inc | Method for detecting interferon |
| US4851220A (en) * | 1986-11-26 | 1989-07-25 | Schering Corporation | Stable oleaginous gel |
| US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
| US5190751A (en) * | 1987-01-20 | 1993-03-02 | Schering Corporation | Treatment of certain leukemias with a combination of gamma interferon and alpha interferon |
| US4853218A (en) * | 1987-02-24 | 1989-08-01 | Schering Corporation | Zinc-protamine-alpha interferon complex |
| US5034513A (en) * | 1987-05-27 | 1991-07-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Avian interleukin-2 |
| US4871538A (en) * | 1987-07-13 | 1989-10-03 | Schering Corporation | Insoluble copper-alpha interferon complex |
| EP0313156B1 (en) * | 1987-10-21 | 1993-03-10 | Akzo N.V. | Snrnp-a antigen and fragments thereof |
| US5559212A (en) * | 1988-04-06 | 1996-09-24 | Alfacell Corporation | Frog embryo and egg-derived tumor cell anti-proliferation protein |
| US5179198A (en) * | 1988-07-11 | 1993-01-12 | Hidechika Okada | Glycoprotein and gene coding therefor |
| US5256410A (en) * | 1988-12-01 | 1993-10-26 | Schering Corporation | Treatment of squamous cell carcinoma intralesionally with recombinant human alpha interferon |
| US5661126A (en) * | 1989-01-19 | 1997-08-26 | The General Hospital Corporation | Use of mullerian inhibiting substance for treating certain tumors and for modulating class I major histocompatibility antigen expression |
| AU5104390A (en) * | 1989-02-08 | 1990-09-05 | Uab Research Foundation | Antiproliferation factor |
| ATE289350T1 (de) | 1989-04-21 | 2005-03-15 | Amgen Inc | Tnf-rezeptor, tnf bindende proteine und dafür kodierende dnas |
| US7264944B1 (en) * | 1989-04-21 | 2007-09-04 | Amgen Inc. | TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them |
| US6221675B1 (en) | 1989-04-21 | 2001-04-24 | Amgen, Inc. | TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them |
| US6100054A (en) * | 1989-05-05 | 2000-08-08 | Baylor College Of Medicine | Production for recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using DNA sequences in various organisms |
| US5849881A (en) * | 1989-05-05 | 1998-12-15 | Baylor College Medicine | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using cDNA sequences in various organisms |
| IL94183A (en) | 1989-05-05 | 2003-09-17 | Baylor College Medicine | cDNA SEQUENCE CODING FOR HUMAN LACTOFERRIN PROTEIN OR PORTION THEREOF AND LACTOFERRIN PROTEIN PRODUCED FROM SAID SEQUENCE |
| US5766939A (en) * | 1989-05-05 | 1998-06-16 | Baylor College Of Medicine | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms |
| US5571691A (en) * | 1989-05-05 | 1996-11-05 | Baylor College Of Medicine | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms |
| US5216128A (en) * | 1989-06-01 | 1993-06-01 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
| IL95031A (en) | 1989-07-18 | 2007-03-08 | Amgen Inc | Method for the production of a human recombinant tumor necrosis factor inhibitor |
| US6143866A (en) * | 1989-07-18 | 2000-11-07 | Amgen, Inc. | Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same |
| US6552170B1 (en) | 1990-04-06 | 2003-04-22 | Amgen Inc. | PEGylation reagents and compounds formed therewith |
| GB9013016D0 (en) * | 1990-06-11 | 1990-08-01 | Mars Uk Ltd | Compounds |
| JP3230091B2 (ja) * | 1990-06-25 | 2001-11-19 | ウェルファイド株式会社 | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 |
| ATE158184T1 (de) * | 1990-07-02 | 1997-10-15 | Nat Jewish Ct Immun & Respirat | Herstellung und verwendung von transfer-faktor |
| DK0538300T3 (da) * | 1990-07-10 | 1994-10-10 | Boehringer Ingelheim Int | O-Glycosyleret IFN-alfa |
| JP3015969B2 (ja) * | 1990-11-30 | 2000-03-06 | ダイナボット株式会社 | 扁平上皮癌関連抗原蛋白質及び該蛋白質をコードするｄｎａ |
| DE4113949A1 (de) * | 1991-04-29 | 1992-11-05 | Behringwerke Ag | Schizosaccharomyces spezifische polypeptide |
| EP0625991B1 (en) * | 1992-02-10 | 1999-04-28 | Interferon Sciences, Inc. | Improved alpha interferon composition and method for its production from human peripheral blood leukocytes |
| US5676942A (en) * | 1992-02-10 | 1997-10-14 | Interferon Sciences, Inc. | Composition containing human alpha interferon species proteins and method for use thereof |
| US5521287A (en) * | 1992-05-20 | 1996-05-28 | The Green Cross Corporation | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| US5440018A (en) * | 1992-05-20 | 1995-08-08 | The Green Cross Corporation | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| US5434249A (en) * | 1992-05-27 | 1995-07-18 | Viragen Inc. | Method for modulating specific activity of inteferon alpha |
| JPH08500242A (ja) * | 1992-06-24 | 1996-01-16 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | インターロイキン１β前駆体の転換酵素をコードするＤＮＡ |
| US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| EP1333093A3 (en) * | 1992-11-30 | 2008-09-10 | The Government of the United States of America, as represented by the Secretary Department of Health and Human Services | Human muscle nad: arginine adpribosyltransferase |
| FR2701263B1 (fr) * | 1993-02-09 | 1995-04-21 | Elie Stefas | Procédé d'obtention d'une composition aqueuse protéinique, composition correspondante, glycoprotéine contenue et son utilisation pour la stabilisation de l'albumine et la détection ou le dosage d'anticorps. |
| US5550114A (en) * | 1993-04-02 | 1996-08-27 | Thomas Jefferson University | Epidermal growth factor inhibitor |
| US5714344A (en) * | 1993-04-07 | 1998-02-03 | Georgetown University | Protease-derivatized CVF |
| AU695960B2 (en) * | 1993-04-07 | 1998-08-27 | Georgetown University | DNA encoding cobra C3, CVF1, and CVF2 |
| ES2370937T3 (es) | 1993-09-13 | 2011-12-23 | Protein Sciences Corporation | Un método para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina. |
| US5762939A (en) * | 1993-09-13 | 1998-06-09 | Mg-Pmc, Llc | Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus |
| DK0722501T3 (da) * | 1993-10-05 | 2000-08-21 | Miller Brewing | Klonet pullulanase |
| US5885567A (en) * | 1993-10-22 | 1999-03-23 | University Of Connecticut | Treatment of infection in fowl by oral administration of avian interferon proteins |
| US6020465A (en) * | 1993-10-22 | 2000-02-01 | University Of Connecticut | Recombinant avian type i interferon |
| US5681931A (en) * | 1995-03-15 | 1997-10-28 | Becton, Dickinson And Company | Human restrictin |
| US5883224A (en) * | 1996-04-19 | 1999-03-16 | Cytokine Sciences, Inc. | Characterization of transfer factors and methods of use |
| US6111081A (en) * | 1996-05-31 | 2000-08-29 | Baylor College Of Medicine | Lactoferrin variants and uses thereof |
| US5922320A (en) | 1996-06-14 | 1999-07-13 | Georgetown University | Recombinant proCVF |
| TW555765B (en) | 1996-07-09 | 2003-10-01 | Amgen Inc | Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins |
| ATE247974T1 (de) | 1996-12-06 | 2003-09-15 | Amgen Inc | Kombinationtherapie mit einem tnf-bindendem protein zür behandlung von durch tnf verursachten erkrangungen |
| FR2774988B1 (fr) * | 1998-02-16 | 2000-05-05 | Commissariat Energie Atomique | Procede de purification de la prpres a partir d'un echantillon biologique et ses applications |
| US6660843B1 (en) * | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| US6433144B1 (en) * | 1999-01-12 | 2002-08-13 | Viragen, Inc. | Compositions of highly-purified natural mixtures of type I Interferon derived from leukocytes and methods |
| GB9902000D0 (en) | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
| US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US8778880B2 (en) | 2004-02-02 | 2014-07-15 | Ambrx, Inc. | Human growth hormone modified at position 35 |
| US8921518B2 (en) | 2005-12-23 | 2014-12-30 | Novo Nordisk A/S | Purification of proteins using preparative reverse phase chromatography (RPC) |
| WO2008106043A2 (en) * | 2007-02-26 | 2008-09-04 | Alltech Associates Inc. | Ultra-fast chromatography |
| RU2452491C1 (ru) * | 2010-11-10 | 2012-06-10 | Александр Иванович Сотниченко | Детоксикант пищеварительного тракта позвоночных |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3699222A (en) * | 1958-03-11 | 1972-10-17 | Nat Res Dev | Production of viral interfering substances |
| US3144390A (en) * | 1960-06-28 | 1964-08-11 | Nat Res Dev | Process for the purification of interferon |
| GB980227A (en) * | 1962-08-16 | 1965-01-13 | Glaxo Lab Ltd | Purification and/or concentration of material containing interferon |
| GB1026726A (en) * | 1962-11-23 | 1966-04-20 | Ici Ltd | New assay technique |
| GB1055896A (en) * | 1963-12-10 | 1967-01-18 | Glaxo Lab Ltd | Silica adsorbents in interferon purification and/or concentration |
| US3256152A (en) * | 1965-06-14 | 1966-06-14 | Merck & Co Inc | Concentration and purification of interferons, viral inhibiting substances (vis), viral inhibiting factors (vif), or viral inhibitory material |
| US3548053A (en) * | 1965-09-07 | 1970-12-15 | Horner Frank W Ltd | Interferon production |
| DE1617401A1 (de) * | 1966-05-02 | 1972-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Verfahren zur Herstellung von Interferon-Praeparaten |
| US3652538A (en) * | 1969-08-08 | 1972-03-28 | Pfizer | Formulation process for polynucleotide homopolymers |
| DE2041735A1 (de) * | 1970-08-22 | 1972-02-24 | Merck Patent Gmbh | Thio-pyrimidin-derivate |
| US3773924A (en) * | 1970-12-24 | 1973-11-20 | M Ho | Interferon production |
| BE790953A (fr) * | 1971-11-05 | 1973-05-03 | Beecham Group Ltd | Matiere biologiquement active |
| US3800035A (en) * | 1971-12-07 | 1974-03-26 | Smithkline Corp | Production of interferon from human leukocytes in the absence of serum |
| US3948886A (en) * | 1972-03-13 | 1976-04-06 | Icn Pharmaceuticals, Inc. | 6-Substituted purine 3',5'-cyclic nucleotides |
| US3819482A (en) * | 1972-05-08 | 1974-06-25 | J Semancik | Method of preparing high yields of double-stranded ribonucleic acid |
| US3970749A (en) * | 1973-04-03 | 1976-07-20 | Baugh Clarence L | Interferon production |
| US4061538A (en) * | 1973-04-04 | 1977-12-06 | Sandoz Ltd. | Enzymatically oxidizing interferon |
| FR2244543B1 (da) * | 1973-07-27 | 1977-07-01 | Inst Nl Sante Rech Medica | |
| US3910824A (en) * | 1973-10-18 | 1975-10-07 | Searle & Co | Interferon assay |
| US4024222A (en) * | 1973-10-30 | 1977-05-17 | The Johns Hopkins University | Nucleic acid complexes |
| NL7404590A (nl) * | 1974-04-03 | 1975-10-07 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het reactiveren van interferon. |
| NL7404589A (nl) * | 1974-04-03 | 1975-10-07 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het stabiliseren van interferon. |
| US3975344A (en) * | 1974-10-02 | 1976-08-17 | G. D. Searle & Co. | Interferon purification |
| JPS5322156B2 (da) * | 1975-01-07 | 1978-07-06 | ||
| US4144126A (en) * | 1975-05-21 | 1979-03-13 | Beecham Group Limited | Cell culture method |
| US4100150A (en) * | 1975-11-04 | 1978-07-11 | G. D. Searle & Co. | Stabilization of interferon against mechanical stress using thioctic acid |
| NL7605805A (nl) * | 1976-05-28 | 1977-11-30 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| US4038139A (en) * | 1976-07-16 | 1977-07-26 | G. D. Searle & Co., Limited | Cell culture medium |
| FR2389380B1 (da) * | 1977-05-02 | 1980-02-29 | Anvar | |
| JPH031320A (ja) * | 1989-05-29 | 1991-01-08 | Hitachi Maxell Ltd | 磁性紛末とこれを用いた磁気記録媒体 |
-
1978
- 1978-12-15 IN IN1337/CAL/78A patent/IN150740B/en unknown
-
1979
- 1979-10-25 CH CH2099/85A patent/CH654843A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-10-25 CH CH9589/79A patent/CH653347A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-10-25 CH CH732/86A patent/CH658459A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-11-13 DO DO1979002953A patent/DOP1979002953A/es unknown
- 1979-11-21 FR FR7928699A patent/FR2442054A1/fr active Granted
- 1979-11-21 IL IL58759A patent/IL58759A/xx unknown
- 1979-11-21 FI FI793649A patent/FI69476C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-11-21 MC MC791416A patent/MC1300A1/fr unknown
- 1979-11-22 NZ NZ192201A patent/NZ192201A/en unknown
- 1979-11-22 AR AR278993A patent/AR222359A1/es active
- 1979-11-22 LU LU81918A patent/LU81918A1/de unknown
- 1979-11-22 BE BE0/198235A patent/BE880201A/fr not_active IP Right Cessation
- 1979-11-22 CA CA340,387A patent/CA1129409A/en not_active Expired
- 1979-11-22 DK DK496779A patent/DK161048C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-11-22 YU YU02861/79A patent/YU286179A/xx unknown
- 1979-11-22 DE DE19792947134 patent/DE2947134A1/de active Granted
- 1979-11-22 NL NL7908516A patent/NL193085C/nl not_active IP Right Cessation
- 1979-11-22 GR GR60567A patent/GR72828B/el unknown
- 1979-11-22 RO RO99322A patent/RO79132B/ro unknown
- 1979-11-23 IT IT27524/79A patent/IT1127253B/it active Protection Beyond IP Right Term
- 1979-11-23 PH PH23321A patent/PH20763A/en unknown
- 1979-11-23 SE SE7909721A patent/SE454276B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-11-23 AU AU53136/79A patent/AU535936B2/en not_active Expired
- 1979-11-23 ES ES486263A patent/ES8100502A1/es not_active Expired
- 1979-11-23 NO NO793819A patent/NO151157C/no unknown
- 1979-11-23 PT PT70495A patent/PT70495A/pt unknown
- 1979-11-23 GB GB7940634A patent/GB2037296B/en not_active Expired
- 1979-11-23 KR KR1019790004122A patent/KR830002616B1/ko not_active Expired
- 1979-11-23 IE IE2247/79A patent/IE48882B1/en not_active IP Right Cessation
-
1980
- 1980-07-09 US US06/167,165 patent/US4289690A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-06-16 AU AU15866/83A patent/AU561672B2/en not_active Expired
- 1983-11-14 SG SG711/83A patent/SG71183G/en unknown
- 1983-11-16 KE KE3347A patent/KE3347A/xx unknown
-
1984
- 1984-03-22 HK HK266/84A patent/HK26684A/xx not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-12-30 MY MY222/85A patent/MY8500222A/xx unknown
-
1993
- 1993-06-16 LU LU88314C patent/LU88314I2/fr unknown
-
1994
- 1994-12-28 JP JP6328671A patent/JPH07224098A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK161048B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af humant interferon | |
| Rubinstein et al. | Human leukocyte interferon: production, purification to homogeneity, and initial characterization. | |
| EP0043980B1 (en) | Mature human leukocyte interferon a, process for its microbial preparation, intermediates therefor and compositions containing it. | |
| Carra | Purification and N-terminal analyses of algal biliproteins | |
| US4765903A (en) | Purification of monomeric interferon | |
| FI70721C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt fibroblast-interferon som homigent protein | |
| NZ203364A (en) | Method for purifying human immune interferon;homogeneous human immune interferon | |
| Rosenstreich et al. | A human urine-derived interleukin 1 inhibitor. Homology with deoxyribonuclease I. | |
| HU182500B (en) | Process for producing homogenous interone | |
| Hobbs et al. | [68] Purification of interferon produced in a culture of human granulocytes | |
| US4617378A (en) | Purification of biologically active human immune interferon | |
| Rubinstein et al. | [67] Purification and characterization of human leukocyte interferons by high-performance liquid chromatography | |
| Gholizadeh et al. | Modifications in the purification protocol of Celosia cristata antiviral proteins lead to protein that can be N-terminally sequenced | |
| Takahashi et al. | Some properties and characterization of rice seed hemagglutinin | |
| JP2660175B2 (ja) | キクイモ由来のレクチンおよびその分離精製法 | |
| EP0446850A2 (en) | Process for purifying recombinant human beta-interferon | |
| Herring et al. | Rapid purification of leukocyte interferons by high-performance liquid chromatography | |
| WO1994005308A1 (en) | Purification of amphiphilic compounds |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |