CH654843A5

CH654843A5 - Homogenes human-leukozyten-interferon.

Info

Publication number: CH654843A5
Application number: CH2099/85A
Authority: CH
Inventors: Sidney Pestka; Menachem Rubinstein
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-10-25
Publication date: 1986-03-14
Also published as: SE454276B; FI69476B; PT70495A; JPH07224098A; IN150740B; AU535936B2; NO793819L; KR830000910A; BE880201A; IL58759A0; IT7927524A0; NZ192201A; US4289690A; AU1586683A; IE792247L; GB2037296B; LU81918A1; CA1129409A; SE7909721L; DK496779A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft homogenes Human-Leukocyten-Interferon wie in Anspruch 1 definiert und Arzneimittel enthaltend ein solches frei von Interferon-inaktiven i5 Proteinverunreinigungen.

Dieses wird mit guten Ausbeuten in präparativem Massstab dadurch enthalten, dass man eine wässrige Lösung unreinen Interferons durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, 2o Phenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen Si02-Matrix unter HPLC-Bedingungen schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden oder fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert wird, so dass es schliesslich in 25 bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird. Diese Säulen, die nacheinander und unter verschiedenen Bedingungen bezüglich pH und organischen Lösungsmitteln verwendet werden können, bieten die Möglichkeit, Interferon, das in natürlichem Material in extrem geringen Men-3° gen vorkommen, bis zur Homogenität zu reinigen und zwar in Mengen, die ausreichend sind, um erstmals eine chemische Charakterisierung dieser medizinisch wertvollen Substanz zu erlauben. Die Möglichkeit, Interferon chemisch zu charakterisieren, stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Ent-35 wicklung dieser Substanz dar, da dies eine Voraussetzung dafür ist, die Substanz zu synthetisieren, sei es durch konventionelle Peptidsynthese, sei es auf dem Wege der Genmanipulation unter Zuhilfenahme geeigneter Organismen, vorzugsweise von Bakterien, und ihre pharmakologischen Aktivitä-40 ten zu bestimmen.

Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des erfin-dungsgemässen Interferons als homogenes Protein ist dadurch gekennzeichnet, dass man

45 A) eine wässrige Lösung von Interferon in unreinem Zustand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden Gradienten so eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;

B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktionen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis

55 einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Fraktionen des Eluats 60 in reinerer Form erhalten wird;

C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedingungen ein- oder mehrmals durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifiés zierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und eines wässrigen Puffers eluiert wird, so dass man es in einem einzigen, ausgeprägten

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Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes Polyacrylamid-Gelelektrophorese an Natriumdodecylsulfat Protein erhält. (NaDodS04 bzw. SDS) in Gegenwart von 2-Mercaptoätha-HPLC-Säulen auf der Basis von durch Octyl- oder Glyce- noi. Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen scharfen rylgruppen modifizierter poröser SiOi-Matrix (Partikelgrösse Peak antiviraler Aktivität, der mit der Proteinbande überein-= 10 n; mittlere Porengrösse =100 Ä), die bei der Gewin- s stimmte. Die spezifischen Aktivitäten der reinen Interferon-nung der erfindungsgemässen Verbindungen benutzt werden, Spezies liegen im Bereich von etwa 0,9 4,0 x 108 Einheiten/ sind Handelsartikel, erhältlich z.B. von EM Laboratories of mg mit MDBK-Zellen (epitheliale Nierenzellen von Rindern) Elmsford, N.Y., USA, unter der Markenbezeichnung Lichro- und im Bereich von 2 x 106-4 x 108 Einheiten/mg mit der Hu-sorb RP-8 und Lichrosorb-Diol. Äquivalente Octyl-modifi- man-Zellinie AG 1732. Die Molekulargewichte lagen zwi-zierte poröse Si02-Säulen (Chromegabond C-8 bezeichnet) loschen etwa 16 000 und 21 000 (vgl. Tabelle 4, Seite 9). Die Ersind erhältlich von E.S. Industries, Marlton, N.J., USA. gebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 5 zusammen-

Ein geeignetes HPLC-System, in dem die vorstehend ge- gefasst (Seite 10).

nannten Säulen verwendet werden können, sind in U.S. Pa- Interferone besitzen antivirale, antitumor-, wachstums-tent No. 4 116 046 beschrieben. hemmende- und immunsuppressive Aktivität. Diese Aktivitä-Die Lösung des unreinen Interferons, vorzugsweise in Ge- is ten konnten sogar in klinischem Massstab festgestellt werden genwart eines wässrigen Puffers wird bei einem geeigneten pH bei Verabreichung von 1-10 x 10f' Einheiten/Tag mit relativ durch die Si02-Säule geschickt. Normalerweise geschieht dies unsauberen Präparaten, die weniger als 1 % Human-Interfe-unter Druck, vorzugsweise im Bereich von etwa 50-5000 psi ron enthielten. Die gereinigten, homogenen Interferon-Spe-(3,4-340 Atm). Das auf der Säulenfüllung adsorbierte Protein zies der vorliegenden Erfindung können in der gleichen Weise wird dann schrittweise und selektiv unter Verwendung eines 20 wie die bereits bekannten Interferon-Präparate verwendet Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels werden unter Anpassung der Dosierung an den erreichten eluiert. Für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel sind z.B. Reinheitsgrad. Die einzelnen Interferon-Spezies können ein-Alkanole, wie n-Propanol, 2-Propanol, Äthanol, Methanol, zeln oder in Gemischen miteinander verabreicht werden. Der-tert.-Butanol, oder cyclische Äther, wie Dioxan. Die Fraktio- artige Gemische können entweder durch Vermischen der iso-nierung des Eluats erfolgt in an sich bekannter Weise, wobei 25 Herten Spezies erhalten werden oder durch Unterbrechung der Gehalt der einzelnen Fraktionen an Interferon durch des Reinigungsverfahrens an einer Stelle, an der mehrere Inhochempfindliche Monitoren bestimmt wird. Ein für diesen terferon-Spezies aber keine Interferon-inaktive Proteine vor-Zweck geeignetes System wird von Bohlen et al., Anal. Bio- handen sind.

chem. 67,438 (1975), beschrieben. Es ist andererseits empfeh- Die Induktion der Interferon-Produktion, die Erstkon-

lenswert, die Anwesenheit von Interferon durch einen geeig- 30 zentration und Fraktionierung des Interferons einschliesslich neten Bioassay zu überwachen. der Gelfiltration können nach an sich bekannten Methoden

Es wurde gefunden, dass im Fall des Human-Leukozyten- durchgeführt werden.

Interferons die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn man Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Bei-

die unreine Interferon-Lösung zunächst durch eine Säule auf spiele illustriert.

der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Ma- 35

trix (Umkehrphasen-Chromatographie) unter Verwendung Beispiel 1

eines Puffers mit einem pH von etwa 7,5 (vorzugsweise 1 M Homogenes Human-Leukozyten-Interferon von normalen

Natriumacetat/Essigsäure) schickt und mit einem steigenden Spendern n-Propanol-Gradienten eluiert, dann die gesammelten akti- A. Herstellung des Interferons ven Fraktionen durch eine Säule auf der Basis einer mit Gly- 40 Interferon wurde hergestellt durch 16 stündige Inkubation cerylgruppen modifizierten Si02-Matrix in einem 0,1 M Na- von Human-Leukozyten aus dem Blut normaler Spender ( 107

triumacetat-Puffer schickt und mit einem fallenden n-Propa- Zellen/ml) mit Newcastle-Krankheit-Virus ( 15 Hämmagglu-

nol-Gradienten eluiert und schliesslich die getrennten Interfe- tinin-Einheiten/ml) in einem serumfreien Minimalmedium,

ron-Komponenten auf eine Säule auf der Basis einer mit Oc- das 10 mg/ml Casein enthielt. Es wurde ein mittlerer Interfe-

tylgruppen modifizierten Si02-Matrix unter Verwendung ei- 45 ron-Titer von 5000 Einheiten/ml erhalten. Die angewandten nes Puffers mit einem pH von etwa 4,0, vorzugsweise 1 M Methoden entsprachen den von Mogensen, K.E. et al., Phar-

Pyridin/2 M Ameisensäure, aufgibt und mit einem steigenden macology and Therapeutics A, 1977,369-381; Wheelock,

n-Propanol-Gradienten eluiert. Auf diese Weise kann jede der E.F., J. Bacteriol, 92,1415-1421 (1966) und Cantell, K. et al.,

drei getrennten Human-Leukozyten-Interferone (a, ß und y) Appi. Microbiol. 22,625-628 (1971) angegebenen mit einigen weiteraufgetrennt werden, wobei im Chromatogramm scharf 50 geringfügigen Änderungen. Die Interferon-Titer wurden mit voneinander getrennte Peaks erhalten werden, die die homo- einem Assay auf der Basis der Hemmung des cytopathischen genen Proteine darstellen. Durch das gesamte Reinigungsver- Effekts, der innerhalb von 16 Stunden durchgeführt werden fahren, beginnend mit dem Inkubationsmedium bis hin zur konnte, bestimmt. Alle Interferon-Titer sind in Einheiten/ml

Chromatographie an der zweiten durch Octylgruppen modifi- angegeben, kalibriert gegen den Referenzstandard für Hu-

zierten Si02-Matrix wurde eine Steigerung des Reinheitsgra- 55 man-Leukozyten-Interferon vom National Institute of des um den Faktor 60 000 bis 80 000 erreicht. Health (USA).

In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens zur Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon werden die in

Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den Hauptpeaks ent- B. Konzentrierung und erste Fraktionierung von Interferon sprechen, vereinigt, zur Entfernung des n-Propanols mit n- 6C Sofern nicht anders angegeben, wurde bei einer Tempera-

Hexan extrahiert und von Spuren n-Hexan befreit bevor tur von 0-4 °C gearbeitet. Nach beendeter Inkubation wur-

Schritt C) durchgeführt wird. den die Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugieren ( 15 Mi-

Das erfindungsgemässe homogene Human-Leukozyten- nuten, 500 x g) entfernt. Casein wurde durch Ansäuern mit

Interferon ist gekennzeichnet durch einen scharfen Peak bei HCl auf pH 4,0 präzipitiert. Nach 2 Stunden wurde das Ge-

der HPLC an einer mit einem Puffer äquilibrierten Säule auf 65 misch zentrifugiert (10 Minuten, 12 000 x g) und der Nieder-

der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, schlag verworfen. Der Überstand (101) wurde auf einen Ge-

Octyl-, Octadecyl- oder Glycerylgruppen modifizierten, porö- halt von 1,5% (w/v) Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1

sen Si02-Matrix sowie durch eine einzige enge Bande bei der Stunde wurde das Präzipitat abzentrifugiert (10 Minuten,

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12 000 x g) und in 50 ml 0,1 M NaHC03 wieder aufgelöst. Nach Zusatz von 0,5 g Triton X-100 und 1,5 ml Essigsäure (tropfenweise unter Rühren) wurde das Gemisch 1 Stunde bei 0 C und anschliessend 16 Stunden bei —20 C aufbewahrt. Nach Auftauen wurde 10 Minuten mit 17 000 x g zentrifu-giert. Der Rückstand wurde verworfen und der Überstand auf 4% Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch 10 Minuten mit 12 000 x g zentrifugiert und der Niederschlag in 5 ml 0,5 M NaHC03 aufgelöst.

C. Gelfiltration

Die erhaltene konzentrierte Interferon-Lösung wurde mit

1.5 g Harnstoff versetzt und auf eine Säule von Sephadex G-100 fein (2,6 x 90 cm), voräquilibriert und 4 M Harnstoff/0,1 M Natriumacetatpuffer, aufgebracht. Die Säule wurde bei Raumtemperatur und einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. mit 4 M Harnstoff/0,1 M Natriumacetat, pH 7,5, eluiert. Es wurden Fraktionen von 12,5 ml gesammelt. Interferon-Aktivität wurde in den Fraktionen 19-23 eluiert.

D. HPLC

Die vereinigten Fraktionen 19-23 von der Sephadex G-100-Säule wurden direkt über die Pumpe auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (10 n, 4,6 x 250 mm) gegeben. Die Säule wurde voräquilibriert mit einem 1 M Natriumacetatpuffer (pH 7,5), der 0,01 % (v/v) Thiodiglycol enthielt, und mit einem linearen Gradienten von n-Propanol in dem gleichen Puffer [1 Stunde, 0-20%; 3 Stunden, 20-40% (v/v)] bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen von 0,75 ml gesammelt. Das Interferon wurde in den Fraktionen 23-40 [25-30% (v/v) n-Propanol] eluiert.

Die Fraktionen 27-33, die den grössten Anteil der Interferon-Aktivität enthielten, wurden kombiniert, mit n-Propanol bis zu einer Endkonzentration von 80% (v/v) versetzt und direkt über die Pumpe auf eine Lichrosorb-Diol-Säule (10 (i,

4.6 x 250 mm) gegeben, die voräquilibriert wurde mit einer Lösung von 0,1 M Natriumacetat mit einem Gehalt von 80% (v/v) n-Propanol. Die Säule wurde dann während 4 Stunden mit einem linearen Gradienten von 72-50% (v/v) n-Propanol in 0,1 M Natriumacetat bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/ Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,75 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in Form von drei deutlichen

Tabelle 1

Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon

Hauptpeaks, die quantitativ von Präparat zu Präparat variierten, eluiert. Diese Peaks wurden in der Reihenfolge ihrer Elution a, ß und y genannt. Die a-Fraktion wurde bei einer Konzentration von 68% n-Propanol eluiert, die ß-Fraktion 5 bei einer Konzentration von 66,5% n-Propanol und die y-Fraktion bei einer Konzentration von 65,5% n-Propanol. Die gesamte Ausbeute an Interferon-Aktivität war grösser als 80%.

Die zu jedem Peak gehörenden Fraktionen wurden verei-io nigt und in Folgestufen weitergereinigt. Da der Peak y der bei weitem grösste war und von anderen Komponenten am besten getrennt zu sein schien, wurde er für die weitere Reinigung ausgesucht. Die Fraktionen 54-56 von der Diolsäule, die den Peak y enthielten, wurden vereinigt und das n-Propa-ls noi wurde durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisensäure zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung wurde auf einer Lichrosorb RP-8-Säule (10 n; 20 4,6 x 250 mm), voräquilibriert mit 1 M Pyridin und 2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgegeben. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen Gradienten von n-Propa-nol (20-40%) in 1 M Pyridin/Formiat-Puffer bei einer Durchflussrate von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktio-25 nen zu 0,6 ml gesammelt. Der Hauptpeak der Aktivität stimmte überein mit einem Proteinpeak. Die Fraktionen 45 und 46 (32% (v/v) Propanol) die diesem Peak entsprachen, wurden vereinigt und unter gleichen Bedingungen rechroma-tographiert. Interferon wurde in Fraktion 31 eluiert (32% 30 (v/v) Propanol). Die spezifische Aktivität dieser Fraktion wurde mit 4 x io8 Einheiten/mg berechnet verglichen mit Rinderserumalbumin. Dieses Material wurde für die weitere Charakterisierung verwendet. Die Fluoreszenzprofile der HPLC waren so gut reproduzierbar, dass sie einen ständigen Finger-35 print des gesamten Verfahrens lieferten.

Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 1 zusam-mengefasst. Die gesamte Reinigung, ausgehend vom Inkubationsmedium bis zur zweiten RP-8-Säule war 60 000-80 000-40 fach. Die kumulative Ausbeute von Stufe 1 bis zur Diolstufe lag bei 30-50%. Nach dieser Stufe wurde jeder der drei Inter-feron-Peaks separat weiter gereinigt.

Einheiten

Protein

Relative

Reinheits

Ausbeute

gefunden gefunden spezifische grad pro Stufe

x IO"6

[mg]

Aktivität [Einh./mg]

[%]

1. Inkubationsmedium

50

10,000

5 xlO3

1

2. pH 4 Überstand

50

2,000

2,5 x 104

5

100

3.1,5% Trichloressigsäure-Niederschlag

40

1,000

4 xlO4

8

80-100

4. Triton X-100/Essigsäure-Überstand

40

250

1,6 xlO5

32

70-100

5.4% Trichloressigsäure-Niederschlag

35

175

2 xlO5

40

80-90

6. Sephadex G-100

32

57

5,6 xlO5

112

70-90

7. Lichrosorb RP-8 (pH 7,5)

28

11

2,5 xlO6

500

80-100

8. Lichrosorb-Diol

Peak a

11

1,1

lxlO7

5,000

Peak ß

2,5

NB

70-90

Peak y

12,5

0,21

6 x 107

12,000

9. Lichrosorb RP-8 (pH 4)

1,6

0,0064

3 x 108

60,000

40-60

10. Lichrosorb RP-8 (pH 4)

8,2

0,021

4 xlO8

80,000

40-60

Zur Bestimmung des in dieser Fraktion enthaltenden Proteins wurde Rinderserumalbumin als Standard herangezogen. Die absolute spezifische Aktivität, die durch Aminosäureanalyse des homogenen Peaks von Stufe 10 bestimmt wurde, war 2-4 x 108 Einheiten/mg (siehe Text). Stufe 9 wurde mit Peak y aus Stufe 8 durchgeführt. Stufe 10 wurde mit dem vereinigten Material aus Stufe 9 von verschiedenen Präparaten durchgeführt. NB = nicht bestimmt.

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E. Polyacrylamid Gel-Elektrophorese

Interferon-Proben (1,5 x IO5 Einheiten) wurden mit Na-DodS04 und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurde nach Färbung mit Coomassie-Blau eine einzige scharfe Bande erhalten. Das scheinbare Molekulargewicht wurde mit 17 500 (im Vergleich zu Standardproteinen) bestimmt. Das Gel wurde in Streifen von 1 mm geschnitten, jeder Streifen wurde in 0,4 ml 0,5 M NaHC03/0,1 % NaDodS04 homogenisiert und auf Interferon-Aktivität hin untersucht. Es wurde ein einziger Peak mit antiviraler Aktivität gefunden, der mit der einzigen Proteinbande übereinstimmte.

F. Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse des homogenen Human-Leuko-zyten-Interferons (Peak y) wurde mit dem Fluorescamin-Aminosäure-Analysator an 0,5 bis 1 (ig Proben von nativem und S-carboxymethyliertem Interferon durchgeführt. Zur Bestimmung des Cystein/Cystin-Verhältnisses wurde natives Interferon carboxymethyliert und dann in 6 M HCl unter reduzierenden Bedingungen (0,1% Thioglycolsäure) hydrolysiert. Unter diesen Bedingungen wird Cystein als S-Carboxyme-thylcystein und Cystin als freies Cystein gemessen. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 2 zusammenge-fasst. Die spezifische Aktivität, berechnet auf den Aminosäuregehalt, wurde mit 2-4 x 108 Einheiten/mg bestimmt.

Tabelle 2

Aminosäurezusammensetzung von Human-Leukozyten-In-terferon

Aminosäure Reste

Asx 15,2 ±1,2

Thr* 7,5 ±0,5

Ser* 8,0 ±0,5

Glx 24,0 ±0,6

Pro 6,3 ±0,3

Gly 5,5 ±0,5

Ala 8,2 ±0,2

Cys (Total) 3,3 ±0,7

>/2 Cystin+ 1,8 ±0,2

Cystein + 1,5 ±0,5

Val 7,8 ±0,2

Met 3,9 ± 0,2

Ile 8,9 ±0,4

Leu 21,8 ±1,3

Tyr 5,1 ±0,2

Phe 9,1 ±0,3

His 3,3 ± 0,4

Lys 11,6 ±0,5

Arg 7,3 ±0,5

Trp++ 0,7 ±0,1

*Korrigiert auf die Zeit 0.

+ Gemessen nach Carboxymethylierung von nativem Interferon.

+ + Gemessen nach Hydrolyse in 6 M HCl/4% Thioglycolsäure.

Beispiel 2

Homogenes Human-Leukozyten-Interferon aus Leukozyten von leukämischen Patienten

Das Interferon wurde erhalten durch Inkubation von Hu-man-Leukozyten, isoliert aus dem Blut von leukämischen Patienten (chronische myelogene Leukämie, CML) durch Leu-

kophoresis mit Newcastle-Krankheit-Virus in einem serumfreien, caseinhaltigen Medium. Die Interferon-Titer lagen bei 5000-40 000 Einheiten/ml.

Das Reinigungsverfahren war das gleiche wie das in Bei-s spiel 1 beschriebene für Interferon aus Blut von normalen Spendern und umfasste die selektive Präzipitation durch 0,5 M Essigsäure in Gegenwart von Triton X-100, Gelfiltration an Sephadex G-100 in 4 M Harnstoff, HPLC bei pH 7,5 an Lichrosorb RP-8, HPLC an Lichrosorb-Diol und HPLC io an Lichrosorb RP-8 bei pH 4,0.

Die Fraktionen, die den a-, ß- und y-Peaks der Lichro-sorb-Diolsäule entsprechen, wurden zusammengefasst und dann getrennt voneinander in weiteren Schritten gereinigt.

Aus den vereinigten Fraktionen 43-46 (a-Peak) wurde n-ls Propanol durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen n-Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisensäure bis zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (10 (i, 4,6 x 25 20 mm), die voräquilibriert war mit 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgebracht. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen n-Propanol-Gradienten (20-40%, v/v) in 1 M Pyridinformiat-Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden 25 Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in breiten Peaks bei Konzentrationen zwischen 31 und 35% (v/v) n-Propanol eluiert. Diese Fraktionen wurden kombiniert und unter gleichen Bedingungen rechromatographiert. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks (c^ und 30 a2) bei 31 und 32% (v/v) n-Propanol eluiert. Untergeordnete Komponenten wurden bei einer Konzentration von 34% (v/v) n-Propanol eluiert.

Die vereinigten Fraktionen 47-50 (Peak ß) der Lichro-35 sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet und an Lichrosorb RP-8 chromatographiert wie sie für den Peak a beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks eluiert: ß2 bei 32% (v/v) n-Propanol und ß3 bei 34% (v/v) n-Propanol. Rechromatographie war in diesem 40 Falle nicht nötig. In einigen Präparaten konnte ein Peak ß, bei 31% (v/v) n-Propanol festgestellt werden.

Die vereinigten Fraktionen 52-54 (Peak y) der Lichro-sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet und an Lichrosorb RP-8 chromatographiert wie sie für den « Peak a beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in fünf Hauptpeaks eluiert: y | (bei 31 % n-Propanol, v/v), y2 (bei 32% n-Propanol, v/v), y3 (bei 34% n-Propanol, v/v), y4 (bei 35% n-Propanol, v/v) und y5 (bei 35,5% n-Propanol, v/v). Rechromatographie war in diesem Fall nicht notwendig, so Die Ergebnisse der Reinigung zur Herstellung der einzelnen Interferon-Spezies sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Die Spezies a2 und ß2 können ferner unterschieden werden durch ihre Elutionscharakteristiken an Lichrosorb-Diol: a2 wird eluiert mit 68%igem (v/v) n-Propanol und ß mit ss 66,5%igem (v/v) n-Propanol.

Proben der Interferon-Spezies (1,5 x 105 Einheiten) wurden mit NaDodS04 und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach Elektrophorese lieferten die Peaks a]5 a2, ß2, yh y2 und y4 jeweils eine einzige Bande, 60während die Peaks ß3, y3 und y5 jeweils zwei Banden lieferten. Die scheinbaren Molekulargewichte lagen zwischen 16 000 und 18 000 mit Ausnahme von ß3, das eine Bande bei 16 500 und eine bei 21 000 aufwies und y4, das eine Bande bei 21 000 lieferte (siehe Tabelle 4).

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Tabelle 3

Reinigung von Leukozyten-Interferon aus CML-Zellen

Stufe Einheiten gefunden x 10~6

1. Inkubationsmedium 800

2. pH 4-Überstand 800 3.1,5% Trichloressigsäure-Niederschlag 780 4. Triton X-100/Essigsäure-Überstand 760 5.4% Trichloressigsäure-Niederschlag 810

6. Sephadex G-100 660

7. Lichrosorb RP-8 (pH 7,5) 510 (2 Ansätze)

8. Lichrosorb-Diol

Peak a 149

Peak ß 148

Peak y 139

Total 436

9. Lichrosorb RP-8 (pH 4,0)

Peaka]* 9

Peak cc2* 26

Peak ß2 30

Peakß3 13

Peak y ! 15

Peaky2 31

Peak y3 26

Peak y4 3,5

Peak y5 4,5

Total 158

Protein Spezifische Reinheits- Ausbeute gefunden

Aktivität**)

grad

[%}

[mg]

[Einh./mg]

20 xlO3

4x 104

1

100

4xl03

2x 105

5

100

2 xlO3

3,9 x 105

9,8

97

510

1,5 x 106

37,5

95

350

2,3 x 106

57,5

100

130

5,1 x 106

128

82

26

2 xlO7

500

64

5

3 x 107

750

3

5 xlO7

1250

1,7

8 xlO7

2000

54

35 x 10"3

2,6 xlO8

6,500

65 x 10 3

4,0 x 108

10,000

75 x 10~3

4,0 x 108

10,000

32 x 10~3

4,0 x 108

10,000

58 x 10~3

2,6 xlO8

6,500

77 x 10~3

4 xlO8

10,000

74 xlO"3

3,5 xlO8

8,750

lOxlO3

3,5 x 108

8,750

50 x 103

0,9 xlO8

2,250

20

*nach Rechromatographie

**Aktivität bestimmt an MDBK-Zellen (Rind); Protein gemessen mit Serumalbumin als Standard

Tabelle 4

MW,

Spez. Akt. an MDBK

Spez. Akt. an Ag 1732

Wachstums

±1000

(Rinderzellen, Einh./mg)

(Human-Zellen; Einh./mg)

hemmende

±25%

±50%

Aktivität**

«i

16,500

2,6 x 108

2,6 xlO8

+

a->

16,200

4 xlO8

3 xlO8

+

Pï

16,500

4 x 108

2 xlO8

+

ß3*

21,000

4 xlO8

3 x 108

+

Yi

17,700

2,6 xlO8

2 xlO8

+

72

17,700

4 xlO8

1,5 xlO8

+

73*

17,200

3,5 x 108

1,5 xlO7

+

74

21,000

3,5 x 108

4 xlO8

+

75*

16,500

0,9 x 108

2 xlO6

+

*2 Banden bei NaDodS04-Polyacrylamidgelelektrophorese; MW der Hauptbande **Methode von Stewart et al., Nature 262,300 (1976)

Die Aminosäureanalyse der gereinigten Human-Leukozy-ten-Interferon-Fraktionen wurde mit einem Fluorescamin-Aminosäure-Analysator an 0,1-1 (ig Proben durchgeführt. Die Hydrolyse wurde in 6N HCl unter reduzierenden Bedingungen (0,1% Thioglycolsäure) durchgeführt. Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

654 843

10

Tabelle 5

Aminosäureanalyse von Human-Leukozyten-Interferon

Spezies a.

a2

h

ßa*

Yi

Y2

Y3*

Y4

Ys*

MWr

16,500

16,200

16,500

21,000

17,700

17,200

21,000

16,500

Reste

142

139

142

181

153

148

180

142

Asx

13,8

11,7

11,5

18,2

13,1

13,3

15,0

17,9

13,8

Thr

7,7

8,3

9,0

9,9

8,4

9,6

8,6

7,3

7,6

Ser

9,2

10,0

14,5

10,2

7,8

10,1

13,5

9,0

Glx

20,3

20,5

21,9

28,5

23,9

25,0

22,8

27,0

20,8

Pro

6,1

4,9

5,0

5,9

4,5

4,8

6,5

4,2

Gly

5,1

4,5

5,0

3,6

5,7

5,0

3,2

4,8

4,0

Ala

8,4

8,3

7,9

11,5

8,7

8,1

9,3

10,4

9,3

Val

7,4

6,2

6,7

7,5

7,3

7,0

5,5

7,9

5,1

Met

3,7

3,8

4,4

6,0

4,3

3,9

5,6

4,9

4,7

ILeu

7,4

7,0

7,4

9,5

7,9

8,0

6,8

9,7

6,6

Leu

18,0

18,9

24,4

20,3

20,1

20,5

24,1

19,6

Tyr

4,0

4,4

4,6

5,0

4,8

3,7

5,0

3,6

Phe

6,9

8,0

8,7

9,9

8,6

9,0

7,2

9,1

6,4

His

3,0

2,8

3,0

3,8

3,7

3,3

2,9

3,8

2,8

Lys

10,5

9,0

8,5

9,3

10,1

10,0

7,6

12,3

12,0

Arg

6,2

7,1

8,0

10,8

8,0

8,5

10,1

8,5

9,0

Cys

3,9

4,0

1,8

2,3

3,3

2,9

3,1

4,1

2,3

Genauigkeit ±1,5 Reste *Gemische beider Banden

Trypsin-Spaltung und HPLC der Fragmente

Jeweils 300 pMol der gereinigten Human-Leukozyten-In-terferon-Spezies wurden in wässrigem Natriumbicarbonat (50 mMol, pH 8,50 ^1) gelöst. Nach Zusatz von jeweils 0,1 jag Trypsin in 2 jxl HCl (pH 3) wurde 14 Stunden bei 37 °C inkubiert, mit 5 nl Essigsäure versetzt und das Gemisch auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (Teilchengrösse 10 \x; 4,6 x 250 mm) aufgebracht. Die Säule wurde während einer Stunde mit einem linearen Gradienten von 0-40% (v/v) n-Propanol in einem 0,1 M Ameisensäure/0,03 M Pyridin-Puffer (pH 3) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. eluiert.

Die Fragmente wurden nach der Fluorescamin-Methode nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst, wobei die Position der Peaks als % n-Propanol und die relative Grösse der Fragmente angegeben sind (S = klein; M = mittelgross; L = gross):

Tabelle 6

Tryptische Peptide der Human-Leukozyten-Interferone

Spezies

Elution bei % n-Propanol a,

3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M,

20S, 21S, 22,5S, 29M

a2

3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M,

27S, 29 M

ß2

3L, 4L, 4,2M, 11,5M 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5S,

18M, 29M

ß3

3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M,

16S, 18L, 19,5M, 27M, 32M

Yi

3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S,

14,5M, 16S, 17,5M, 18M, 29M

Y2

3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 11,5S 12,5S 14,5S, 16S,

I8L, 29M

Y3

3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M,

16S, 18L, 20S, 32M

Ys

3L, 4L, 4,2M, 4,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L, 12,5S,

14S, 14,5M, 16S, 18L, 24,5S, 25,5S, 32S

30

Die gereinigten Human-Leukozyten-Interferon-Spezies wurden einer Aminozuckeranalyse unterworfen mit der Ami-nozucker im Bereich von 50-100 pMol festgestellt werden können. In allen Fällen wurde weniger als ein Rest Glucos-35 amin, Galactosamin bzw. Mannosamin pro Molekül gefunden. In den meisten Fällen interferierte eine Anzahl kleiner Peptide, die in der Nähe der Aminozucker eluiert wurden, mit der Analyse. Es ist daher möglich, dass die den Aminozuk-kern zugeordneten Peaks teilweise oder sogar ganz Peptiden 40 zuzuordnen sind.

Schliesslich lieferte ein Versuch, 1 nMol reines y2 Interferon durch einen manuellen Edman-Abbau, der Rückhydroly-se und Aminosäureanalyse unter Verwendung von Fluor-escamin beinhaltet, zu sequenzieren, keine Aminosäuren in 45 den ersten beiden Zyklen. Die Behandlung von 100 pMol reinem y2 Human-Leukozyten-Interferon mit Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M während 20 Stunden bei 37 °C beeinflusste die biologische Aktivität nicht; im Inkubationsmedium konnten keine Aminosäuren festgestellt werden, so Durch Behandlung des Überstandes eines Induktionsmediums (Leukozyten und Newcastle-Krankheits-Virus in Minimalmedium) mit Aminopeptidase M konnte ein Verlust an Interferon-Aktivität nicht beobachtet werden. Dies deutet daraufhin, dass das Interferon-Molekül bereits vor dem Rei-55 nigungsverfahren eine blockierte aminoendständige Aminosäure enthält. Zur Kontrolle wurden rohes Interferon, reines Interferon und die ß-Kette von Insulin gemeinsam mit Aminopeptidase M inkubiert. Während Insulin teilweise abgebaut wurde (Aminosäuren nachweisbar) trat kein Verlust an Inter-60 feron-Aktivität auf.

Beispiel 3

(a) 3 mg homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit einer spezifischen Aktivität von 2 x 108 Einheiten/mg wurde 65 in 25 ml 5%igem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter filtriert und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt 6 x 106 Einheiten reines Interferon, das sich für die par-

enterale Applikation eignet. Die Ampullen werden bis zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei — 20 °C) aufbewahrt.

(b) Eine wässrige Lösung, enthaltend 1,5 mg der vereinigten homogenen Human-Leukozyten-Interferon-Spezies ab cb, ß:. Yi und y2 (jedes etwa im Verhältnis zu seiner natürlichen Häufigkeit), mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 x 108

1 654 843

Einheiten/mg, und 100 mg normales Human-Serumalbumin, wird durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die Lösung aseptisch auf 100 Ampullen gleichmässig verteilt. Jede Ampulle enthält etwa 3 x 106 Einheiten reines Human-Leu-5 kozyten-Interferon und 1 mg Serumalbumin. Die Ampullen, die für parenterale Applikation geeignetes Interferon enthalten, werden zweckmässigerweise kühl (—20 °C) gelagert.

C

Claims

654 843

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Homogenes Human-Leukocyten-Interferon, gekennzeichnet durch eine einzige enge Bande bei der SDS-Poly-acrylamidgelelektrophorese und einen scharfen Peak bei der HPLC an einer mit einem Puffer äquilibrierten Säule auf der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Oc-tyl-, Octadecyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen Si02-Matrix.
2. Homogenes Human-Leukocyten-Interferon gemäss Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine spezifische Aktivität von 0.9-4.0 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen und

2 x 106-4.0 x io8 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen.
3. Ein homogenes Human-Leukocyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung ai, dadurch gekennzeichnet, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 31 % n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,11.5, 12.5,14.5,16,18,20,21,22.5 und 29% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 |i Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 16,500 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ±15%, berechnet auf ein Molgewicht von 16,500:

Asx

13,8

Ala

8,4

Phe

6,9

Thr

7,7

Val

7,4

His

3,0

Ser

9,2

Met

3,7

Lys

10,5

Glx

20,3

Ile

7,4

Arg

6,2

Pro

6,1

Leu

18,0

Cys

3,9

Gly

5,1

Tyr

4,0
4. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung a2, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur,

Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 32% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,11.5, 5 12.5,14.5,16,18,27 und 29% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 (i Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden;

(d) durch Gradientenelution mit n-Propanol in wässri-io gern, 1 molarem Natriumacetat-Puffer, Gradient 72,5-50%

(v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,25 ml/min, bei einer Konzentration von 68% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert 15 wird; und das ferner charakterisiert ist durch

(e) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(g) eine spezifische Aktivität von etwa 3 x 108 Einhei-20 ten/mg an AG 1732-Zellen;

(h) ein Molgewicht von etwa 16,200 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(i) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

25 (j) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(k) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ± 15%, berechnet auf ein Molgewicht von 16,200:

Asx

11,7

Ala

8,3

Phe

8,0

3o Thr

8,3

Val

6,2

His

2,8

Ser

10,0

Met

3,8

Lys

9,0

Glx

20,5

Ile

7,0

Arg

7,1

Pro

4,9

Leu

18,0

Cys

4,0

Gly

4,5

Tyr

4,4

35
5. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung ß2, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es 40 (a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 32% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm 45 HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente ge-50 spalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,11.5,

5512.5,14.5,16,17.5,18 und 29% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 |i Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden;

(d) durch Gradientenelution mit n-Propanol in wässri-6o gern, 1 molarem Natriumacetat-Puffer, Gradient 72,5-50%

(v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,25 ml/min, bei einer Konzentration von 66,5% in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird; und das « ferner charakterisiert ist durch

(e) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 10s Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

3

654 843

(g) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(h) ein Molgewicht von etwa 16,500± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(i) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(j) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und (k) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ±15%, berechnet auf ein Molgewicht von 16,500:

Asx

11,5

Ala

7,9

Phe

8,7

Thr

9,0

Val

6,7

His

3,0

Ser

10,0

Met

4,4

Lys

8,5

Glx

21,9

Ile

7,4

Arg

8,0

Pro

5,0

Leu

18,9

Cys

1,8

Gly

5,0

Tyr

4,6
6. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung ß3, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 34% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0- 40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,4.5, 10,12.5,14,14.5,16,18,19.5,27 und 32% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 |4. Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 10s Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 3 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 21,000± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung:

Asx

18,2

Ala

11,5

Phe

9,9

Thr

9,9

Val

7,5

His

3,8

Ser

14,5

Met

6,0

Lys

9,3

Glx

28,5

Ile

9,5

Arg

10,8

Pro

5,9

Leu

24,4

Cys

2,3

Gly

3,6

Tyr

5,0
7. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung yi, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 31 % n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsge-

5 misches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,4.5, 6.5,11.5,12.5,14.5,16,17.5,18 und 29% n-Propanol von ei-lo ner 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 jj. Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 2,6 x 10s Einhei-15 ten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 17,700 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

20 (h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ± 15%, berechnet auf ein Molgewicht von 17,700:

Asx

13,1

Ala

8,7

Phe

8,6

Thr

8,4

Val

7,3

His

3,7

Ser

10,2

Met

4,3

Lys

10,1

Glx

23,9

Ile

7,9

Arg

8,0

30 Pro

4,5

Leu

20,3

Cys

3,3

Gly

5,7

Tyr

4,8

35 8. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung y2, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Amei-40 sensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 32% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

45 (b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, ent-

50 haltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,4.5, 5, 11.5,12.5,14.5,16,18und29% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 jx Teilchengrösse, auf der Ba-55 sis einer durch Octylgruppen modifizierten SiOrMatrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

60 (f) eine spezifische Aktivität von etwa 1,5 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 17,700 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro «s Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ± 15%, berechnet auf ein Molgewicht von 17,700:

654 843

4

Asx

13,3

Ala

8,1

Phe

9,0

Thr

9,6

Val

7,0

His

3,3

Ser

7,8

Met

3,9

Lys

10,0

Glx

25,0

Ile

8,0

Arg

8,5

Pro

4,8

Leu

20,1

Cys

2,9

Gly

5,0

Tyr

4,8

(g) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(h) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(i) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ± 15%, s berechnet auf ein Molgewicht von 21,000:
9. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung y3, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 34% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,11.5, 12.5,13.5,14.5,16,18,20 und 32% n-Propanol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 p. Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 3,5 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(f) eine spezifische Aktivität von etwa 1,5 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 17,200 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als 1 Mol pro Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung:

Asx

17,9

Ala

10,4

Phe

9,1

Thr

7,3

Val

7,9

His

3,8

Ser

13,5

Met

4,9

Lys

12,2

io Glx

27,0

Ile

9,7

Arg

8,5

Pro

6,5

Leu

24,1

Cys

4,1

Gly

4,8

Tyr

5,0

Asx

15,0

Ala

9,3

Phe

7,2

Thr

8,6

Val

5,5

His

2,9

Ser

10,1

Met

5,6

Lys

7,6

Glx

22,8

Ile

6,8

Arg

10,1

Pro

4,8

Leu

20,5

Cys

3,1

Gly

3,2

Tyr

3,7
11. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon ge-15 mäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung y5, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur,

20 Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 31 % n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiOi-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M 25 nicht inaktiviert wird;

(c) durch Behandlung mit Trypsin in Peptidfragmente gespalten wird, die durch Gradientenelution des Reaktionsgemisches mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, pH 3, enthaltend 0,03 Mol Pyridin und 0,1 Mol Ameisensäure pro Liso ter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate

0,5 ml/min, in Peaks bei Konzentrationen von 3,4,4.2,4.5,7, 7.5,10,11.5,12.5,14,14.5,16,18,24.5,25.5 und 32% n-Pro-panol von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule, 10 |i Teilchengrösse, auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten 35 SiOi-Matrix eluiert werden; und das ferner charakterisiert ist durch

(d) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 0,9 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

40 (f) eine spezifische Aktivität von etwa 2 x 106 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(g) ein Molgewicht von etwa 16,500 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

(h) einen Aminozuckergehalt von weniger als I Mol pro 45 Mol;

(i) eine positive Wachstumshemmungsaktivität und

(j) die folgende Aminosäurezusammensetzung:
10. Ein homogenes Human-Leukozyten-Interferon gemäss Anspruch 1 mit der Bezeichnung y4, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

(a) durch Gradientenelution mit n-Propanol in einem wässrigen Puffer, enthaltend 1 Mol Pyridin und 2 Mol Ameisensäure pro Liter, Gradient 0-40% (v/v), Raumtemperatur, Durchflussrate 0,2 ml/min, bei einer Konzentration von 35% n-Propanol in einem einzigen Peak von einer 4,6 x 250 mm HPLC-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix eluiert wird;

(b) durch Leucinaminopeptidase und Aminopeptidase M nicht inaktiviert wird; und das ferner charakterisiert ist durch

(c) eine blockierte N-terminale Aminosäure;

(d) eine spezifische Aktivität von etwa 3,5 x 108 Einheiten/mg an MDBK-Zellen;

(e) eine spezifische Aktivität von etwa 4,0 x 108 Einheiten/mg an AG 1732-Zellen;

(f) ein Molgewicht von etwa 21,000 ± 1000 bei Gelelektrophorese auf Polyacrylamid;

Asx 13,8 so Thr 7,6 Ser 9,0 Glx 20,8 Pro 4,2 Gly 4,0

55
12. Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-11 als pharmazeutischer Wirkstoff.
13. Interferon gemäss Anspruch 12 als antiviraler Wirkstoff.

60 14. Interferon gemäss Anspruch 12 als Antitumor-Wirk-stoff.
15. Interferon gemäss Anspruch 12 als wachstumshemmender Wirkstoff.
16. Interferon gemäss Anspruch 12 als immunsuppressi-65 ver Wirkstoff.
17. Arzneimittel enthaltend ein Interferon gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11 frei von Interferon-inaktiven Proteinverunreinigungen.

Ala

9,3

Val

5,1

Met

4,7

Ile

6,6

Leu

19,6

Tyr

3,6

Phe

6,4

His

2,8

Lys

12,0

Arg

9,0

Cys

2,3

5

654 843
18. Arzneimittel gemäss Anspruch 17, gekennzeichnet durch antivirale, wachstumshemmende, immunsuppressive oder Antitumor-Aktivität.

Seit seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957, hat Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von Forschern in der ganzen Welt, es als homogenes Peptid in solchen Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben würden, erfolgreich widerstanden.

Im U.S. Patent 3 699 222, welches die ersten Arbeiten von Isaacs und Lindenmann über das Interferon zum Gegenstand hat, besteht die Reinigung des aktiven Materials lediglich in einer Ammonsulfatfallung und anschliessender Dialyse. Da ein derartiges Verfahren relativ unspezifisch ist, ist das erhaltene Produkt noch ausserordentlich unrein.

Ein Mehrstufenverfahren zur Reinigung von Interferon wird im U.S. Patent 3 414 651 beschrieben, das die folgenden Schritte umfasst: selektive Adsorption an amorphem Alumi-no-silikat, Elution mit Jod- oder Thiocyanat-Lösung, weitere Fällung unerwünschter Proteine mit wässriger HCl und wäss-riger Natronlauge, Fällung des Interferons mittels mit Wasser mischbarer Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Aceton und schliesslich Chromatographie des wieder aufgelösten Interferons an einem Ionenaustauschharz wie 2-Diäthylami-noäthyl-cellulose. Durch dieses Reinigungsverfahren konnte die spezifische Aktivität des Interferons um den Faktor 6000 erhöht werden. Als spezifische Interferone wurden in dem U.S. Patent Kücken- und Affen-Interferon genannt.

Eine weitere Reinigungsmethode wird im U.S. Patent 3 975 344 beschrieben, gemäss dem eine Lösung von ungereinigtem Human-Fibroblasten-Interferon durch Dichtegra-dient-Ultrazentrifugation gereinigt wurde. Es wurde angegeben, dass nach dieser Methode eine höhere Ausbeute und Reinheit erzielt wird als nach der Methode unter Verwendung von Säulenchromatographie an Sephadex G-100.

Die im folgenden aufgeführten Publikationen beschäftigen sich ebenfalls mit der Reinigung und der versuchten Charakterisierung von Interferonen:

Knight, E., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73,520-3 (1976); Törmä, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251,4810-6 (1976);

Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 252,6585-7 (1977); DeMaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271,622-5 (1978); Kawakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253,598-602 (1978); Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253,5206-11 (1978); Jankowski, W.J. et al., J. Virology 16,1124-30 (1975);

Davey M.W. et al., J. Biol. Chem. 251,7620-5 (1976); Chadha, K.C. et al., Biochemistry H, 196-200 (1978).

Obwohl in zahlreichen der oben genannten Publikationen behauptet wird, dass Mäuse- oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt werden konnten, ist weder einer der klassischen Nachweise der Homogenität von Proteinen angegeben, z.B. Kristallisierbarkeit, Löslichkeitskinetiken, einheitliches Verhalten in der Ultrazentrifuge und/oder in der Elektrophorese, eindeutige Aussagen bei der Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung oder Aminosäuresequenz oder Einheitlichkeit in chromatographischen Verfahren, noch sind die Eigenschaften der angeblich reinen Verbindungen beschrieben.

Die Anwendung der Hochdruck-Flüssigkeits-Chroma-tographie (HPLC) zur Reinigung von Proteinen ist in der Fachwelt allgemein bekannt, wobei besonders Ionenaustausch- und Ausschluss-Chromatographie beschrieben werden [siehe z.B. Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sei. 14,

316-20 (1976) und Chang, S.-H. et al., Anal. Chem. 48, 1839-45 (1976)].

In der Umkehrphasen-Chromatographie wurde z.B. Li-chrosorb RP-18 (Säulen auf der Basis von Octadecyl-modifi-s ziertem Si02) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie ß-Endorphin, verwendet [siehe z.B. Rubinstein, M. et al., Proc. Nati. Acad. Sei., USA 74,4969-72 1977)].

Schliesslich wurde die teilweise Charakterisierung von drei Interferon-Spezies aus Ehrlich Ascites-Tumorzellen von io Mäusen (MG = 33 000,26 000 und 20 000) durch Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254,3681-4 (1979), beschrieben.