JPS6335598A

JPS6335598A - Ｔ細胞活性化因子

Info

Publication number: JPS6335598A
Application number: JP61181013A
Authority: JP
Inventors: Yoshiharu Yokoo; 義春横尾; Motoo Yamazaki; 基生山崎; Kazuo Yamaguchi; 和夫山口; Shinji Hosoi; 細井　伸二
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-07-31
Filing date: 1986-07-31
Publication date: 1988-02-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、新規なＴＩ胞活性化因子に関する。

本発明のＴ細胞活性化因子は免疫担当細胞の機能を活性
化するので、癌その他の疾患に対する治療に用いること
ができる。

従来技術Ｔ細胞活性化因子は従来インターロイキン１（ＩＬ−１
）Ｃ１わｚｅｌ、Ｓ、Ｂ、ｅｔ　　ａｔ、、　　ジャー
ナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、Ｉ＋＋＋＋ｙ＋ｕｎｏ
１．）、１２０　．１４９７〜１５０３、　１９７８］
　、インターロイキン２　（［Ｌ−２）（Ｇｉｌｌｉｓ
、　Ｓ、ｅｔ　　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２
Ｑ　　、２０２７〜２０３２、１９７８）などが知られ
ている。

ヒトのＩＬ−２の場合、呑口らによって、ヒトＩＬ−２
産生細胞ジヤーカツト細胞由来の相補的ＤＮＡを用いて
、組換えＤＮＡ技術によりＩＬ−２が産生され、レセプ
ター解析まで進んでいる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、
　　ｅｔ　　、す１．、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）
　。

３０２　　、　３０５．　　１９８３　　；　　Ｌｅｏ
ｎａｒｄ、　　１１．Ｊ、　　ｅｔ　　　ａｌ、、Ｎａ
ｔｕｒｅ。

３１１　、６２６−６３５　１９８４３゜一方、ＩＬ−
１の場合も、最近相補的ＤＮＡが解析され（Ａｕｒｏｎ
、　　Ｄ、町射　１．、プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　８１．７９
０７〜？９１１．　１９８４；　Ｍａｒｃｈ、　Ｃ，Ｊ
、　Ｎａｔｕｒｅ、３１５．６４１〜６４７、１９８５
　）　、　　Ｉ　Ｌ−１α（等電点５．０）およびＩＬ
−１β（等電点７．０）の全アミノ酸構造が明らかとな
っている。ＩＬ−１を生産する細胞としてはマクロファ
ージ、上皮系細胞、好中球、Ｂリンパ球などと広範であ
る（Ｂｒｕｎｔ、　Ｊ、Ｖ、、バイオ／チクノロシイ（
Ｂｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＹ）　、　　３　、５９５
〜５９７　。

１９８５）。

発明の解決課題および構成本発明者は、ＩＬ−１産生細胞の培養上清より新規なＴ
細胞活性化因子を得るべく研究を重ねた。

その結果、従来報告されているものとは異なるＴ細胞活
性化因子を単離精製することに成功した。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、新規なＴ細胞活性化因子を提供する。

本発明のＴ細胞活性化因子は下記の理化学的性質を有す
る。

ａ）分子潰：約１６．１００　（ＳＯ３−ＰＡＧＩｌｉ
法）約２０．０００（ゲル濾過）ｂ）等電点：９．３±０．３（クロマトフオーカシング
法）約９．０（等電点電気泳動）Ｃ）アミノ酸組成比二６Ｎ塩酸で１１０℃、２０時間減
圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザーにより分析し
たアミノ酸組成比（モル比）はアラニン（Ａｌａ）を１
．００として以下の通りである。

アラニン（Ａｌａ）　　　　　　　１．００アルギニン
（Ａｒｇ）　　　　　　０．７４システイン（Ｃｙｓ）
　　　　　　測定せずグリシン（Ｇｌｙ）　　　　　　
　１．１１ヒスチジン（Ｈｉｓ）　　　　　　０．２２
イアｏイシン（ＩＩｅ）　　　　　０．３５０イシ７（
１，ｅｕ）　　　　　　　０．９７リジン（Ｌｙｓ）　
　　　　　　　０．７９メチオ＝ン（Ｍｅｔ）　　　　
　　０．１４フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　０．１
１プロリフ（Ｐｒｏ）　　　　　　　　０．３４セリフ
（Ｓｅｒ）　　　　　　　０．４７トリプトファン（Ｔ
ｒｐ）　　　　測定せずトレオニン（Ｔｈｒ）　　　　
　　　０．３３チロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　　０．
１９”バリン（Ｖａｌ）　　　　　　　０．５２本発明
物質は、ヒト細胞を培地に培養し、培養物中に本発明物
質を蓄積させ、該培養物から採取することによって得ら
れる。

本発明物質生産のために用いられるヒト細胞としては、
該物質を生産する細胞であればいかなる細胞株も用いる
ことができる。好適な例としては、ヒトＢリンパ腫細胞
ＳＳＹ株、バーキットリンパ腫ナマルバ株などがあげら
れる。

培地としては、ハムＦＩＯ培地、ハムＦ　１２培地（以
上フローラボ社製）、ダルベツコウＭＥＭ培地、ＭＥＭ
培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地（以上日永製薬社製）な
どの無蛋白培地が用いられる。

培地には、必要により、仔牛脂児血清１〜ｌＯ％（Ｗ／
Ｖ）、グルタミン０．５〜５　ｍ　Ｍ　／ｍｌ、抗生物
質〔ヘニンリン（２５Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシフ
（２５■／ｍ＋　）など〕、重曹（０，０１％）などを
適量加えてもよい。

培養（こは、平型々の培養ビン、シャーレ、ローラボト
ル、スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを
用いることができる。培養は、通常種細胞密度５Ｘ１０
’　〜２Ｘ１０’細胞／ｍｌとし、３０〜４０℃、２〜
４日間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に培
養液中に生成する。たとえば、ｔｘｔｏ’細胞／ｍ細胞
７細ｌ密度、３７℃、２日間の培養では、培養液中に４
４単位／ｍｌの活性物質が生成する。

培養物からの本発明物質の採取は塩析、クロマトグラフ
ィー、電気泳動法、抽出法、遠心分離法、透析法などを
単独または適宜組み合わせることにより行う。具体的に
は次のとおり行う。得られた培養液上清を、冷却遠心分
離し、限外沖適用ホロファイバーで冷却下濃縮する。

濃縮液をリン酸緩衝液に対して透析する。

透析液をＱＡＥタイプまたはＤＥＡＥタイプの陰イオン
交換樹脂たとえばＤＥＡＥ−）ヨパール（東洋四速社製
）カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜１．０ＭのＮ
ａＣβ勾配で溶出する。活性画分を集め限外ｐ過膜によ
り濃縮し、高速液体クロマトグラフィータイプの陰イオ
ン交換樹脂たとえばファルマシアＦＰＬＣモノＱ（ファ
ルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）カラムクロマト
グラフィーにかける。０〜１．ＯＭのＮａＣ１勾配で溶
出し、活性画分を回収する。活性画分を限外−過で濃縮
後、逆相高速液体クロマトグラフィーにかける。０．１
％トリフルオロ酢酸から７０％アセトニトリルを含む０
．１％トリフルオロ酢酸までの勾配溶出を行う。アセト
ニトリル約４５％で溶出される両分に活性画分が溶出さ
れる。

活性画分を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分析することにより活性画分が単一蛋白質であることを
確認する。

本発明物質の分析は以下の方法で行われる。

（１）　　分子量Ａ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（以下５ＯＳ−ＰＡＧＢという）による分子
量測定レムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）らの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ
、　Ｕ、に、。

卦　且１．ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２２７　
、６８０゜１９７０３に従い濃度１５％のポリアクリル
アミドゲルを使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する
。

Ｂ、セファデックスＧ＝１００を用いたゲルｐ適法によ
る分子量測定セファデックスＧ’−１００（ファルマシア社製）をカ
ラム（１８ｘ２４０ｍｍ、ガラスカラム）に充填し、１
０ｍＭリン酸緩衝液−ＮａＣＩｔ（ＰＢＳ）１０．３Ｍ
　ＮａＣｊ２　（ｐ　Ｈ７，２）の緩衝液を用い、本発
明物質を添加し、ゲルｐ過を行う。

分子量は溶出位置より標準分子量キット（ファルマシア
社製）から求めた標準曲線を用いて算出する。

（２）等電点Ａ、クロマトフオーカシング法０、０２５　Ｍ　）リエチルアミンー塩酸緩衝液（ｐＨ
１１，０）で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム（０，
５Ｘ２０ｃ＋ｎ、ファルマシア社製）を用い、溶出は０
．００７５ｍｍｏｌ／ｐＨ単位／ｍｌファルマライト（
ｐＨ８〜１０．５　）−塩酸（ｐＨ８，０）を用いクロ
マトフオーカシング法（Ｓｉｅｇｅｌ、　Ｌ、Ｍ、、バ
イオキミカ　エト　バイオフィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ）
、　１１２　、３４６．１９６６）により等電点測定を
行う。等電点は、溶出位置におけるｐ　Ｈの実測値より
求める。

Ｂ１等電点電気泳動等電点装置（ファルマシア社製、スウェーデン）とアン
ホライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ポリアクリルアミドプ
レー）（ｐＨ３，５〜１１．０　）＜ＬＫＢ社マニュア
ルに従い作成）を使用し、標準等電点測定マーカーキッ
ト（ファルマシア社製、スウェーデン）を使用して等電
点を測定する。等電点は銀染色法（第１化学薬品）によ
り染色後、等電点マーカーを基準に算出する。

（３）　　アミノ酸組成比６Ｎ塩酸で１１０℃、２０時間加水分解（減圧下）後、
アミノ酸アナライザー〔ピコタグ（Ｐ　ＩＣ０−ＴＡＧ
）、ウォーターズ社製、アメリカ〕によりアミノ酸組成
を分析する。

〔４）活性測定法笠原らの方法（臨床検査２８　　、（３）、　３２８１
９８４）に準じて、活性の評価をする。すなわち、４〜
６週令のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの胸腺細胞を１０％仔牛脂
児血ａ（Ｆｅ２）（ギブコ社製）およびコンカナバリア
Ａ　（ＣｏｎＡ）０．５〜１．Ｏｇ／ｍｌを加えたＲＰ
ＭＩ−１６４０培地（日水製薬社！ｌりに１〜２ＸＩＯ
’細胞／ｍｌの濃度で懸濁させる。この胸腺細胞懸濁液
Ｑ、１ｍｌおよび適当濃度に希釈した本発明試料各Ｑ、
１ｍｌを９６穴マイクロプレートの各ウェルに入れ、こ
れを５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で４８時間培１す
る。０．２５μＣ１の３Ｈ−チミジンを各ウェルにパル
スラベルして、３日目に細胞を回収する。３Ｈ−チミジ
ンの導入は続く液体シンチレーション計数により測定す
る。活性は最大胸腺細胞３Ｈ−チミジン導入の５０％を
発生させる能力を１単位とし、これに試料の希釈倍率を
乗する方法で表す。なお、比活性は、ブラッドフォード
の方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ｎ、Ｍ、ｅｔ　　旦、、
アナライザー　バイオケミストリ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）。

７２　、２４８．１９７６）または、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルの銀染色からの蛋白質定量値を基に、前
述の方法で算出した単位数をこの定量値で割った値で表
す。

本発明のＴ細胞活性化因子を先の活性測定法に従って活
性測定を行った結果、第１図に示されるように本発明因
子がＴ細胞活性化作用をもっていることが明らかである
。第１図の実験においては、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス胸腺細
胞１０７細抱／ｍ＋を、０．５ｘ／ｍｌのコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）存在下、４８時間培養後、続く２４時
間の〔３Ｈ〕−チミジンの取り込みにより活性測定を行
った。

ヒト白血病細胞株Ｈ３Ｂ、２細胞ＣＫａｓａｈａｒａ。

Ｔ、ｅｔ　（１１，、ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　１３４　、１６８２（
１９８６）　）　１０’細胞／ｒｒ１１を５０眉／ｍｌ
のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）存在下、本発明因子
１０ｎｇ／ｍｌとともに２４時間培養し、培養上清中の
ＩＬ−２活性を測定した。ＩＬ−２活性はＩＬ−２依存
性キラ−Ｔ細胞株を用いて、〔３Ｈ〕−チミジンの取り
込み看として測定した。結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 −２，８９８±８００＋　　　１２．１００±１，０００以下に本発明の実施例を示す。

実施例１（１）細胞培養ヒトリンパ腫細胞系５ＳＹ−１株（英国Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ＾ｎｉｍａｌ　Ｃｅ１
ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅに１９８５年８月１３日イ寸でＮＣ
ＡＣＣ８５０６１９０１として寄託しである。）５Ｘ１
０’細胞／ｍｌを５％仔牛脂児血清を加えたＲＰＭＩ培
地（田水製薬社製）　８０　Ｑｍｌを含むスピナーフラ
スコ（柴田製作所社製）に接種し、培養を３７℃で４８
時間行った。細胞濃度が２Ｘ１０’細胞／ｍｌに到達し
たとき、培地を１％仔牛脂児血清を加えたＲＰＭＩ−１
６４０培地８００ｍ１に交換し、サラにシリカ（マリン
クロット　ケミカルワークス社製）を培地に対して、１
００ｇ／ｍｌ加えて、３７℃で４８時間培養した。かく
してＴ細胞活性化因子が４４．４単位／ｍｌ培地に蓄積
した。同操作をくり返し、該因子を有する培養上清２７
１を得た。

（２）Ｔ細胞活性化因子の分離精製１）精製工程１上記培養上清２７１を冷却遠心分離機（４℃）で８．　
ＯＯＯ回転／分、２０〜３０分間遠心分離した。上澄液
を４℃で限外ｐ適用ホロファイバー（分画分子１３，０
００、アミコン社製）を用いて約１５倍濃縮した。濃縮
サンプルをさらに同ホロファイバーを用いて、ポリエチ
レングリコール６、０００を０．０１％含むｌＱｍＭリ
ン酸緩衝波緩衝液７．５）に対し、ＮａＣｌａ度１５ｍ
Ｍ程度まで透析を行った。

２）精製工程２工程１で得られた濃縮成約２βを０．０１％ポリエチレ
ングリコール６．０００を含む１０ｍＭＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）で平衡化したＤＥＡＥ−）　Ｅｌパール
６５０Ｍ　（２，８ｃｍＸ４０ａｍ）（東洋曹達社製）
カラムを用いるＤＥＡＥ−トヨバールクロマトグラフィ
ーで処理した。

サンプル充填後、カラム平衡緩衝液で洗浄し、次にＯ〜
１．０Ｍの塩化す）　ＩＪウム勾配で溶出した。前記活
性測定法より活性画分を同定した。主な活性は約０．６
〜０．８ＭのＮ　ａ　Ｃ１で溶出しく約１８０ｍ１）。

この方法により生理活性面の回収率は約２３％であり、
精製度は約２．５００倍であった。

３）精製工程３工程２で得られた活性画分１８　Ｑｍｌを集めて、限外
濾過膜ＹＭ５（アミコン社製）により、約１００倍濃縮
した（約２ｍ１）。この濃縮液を１０ｍＭ）リス塩酸緩
衝液（ｐ　Ｈ７，５）により、Ｎａ（１！濃度を約３０
ｍＭまで希釈の後、ファルマシアＦＰＬＣモノＱカラム
（５ｍｍｘ　５　Ｑｍｍ）（ファルマシア・ファイン・
ケミカルズ社製）に吸着させた。カラムを１０　ｍ　Ｍ
　ｌ−＋７ス塩酸緩（析液（ｐ　Ｈ７，５）で洗浄し、
次に０〜１゛Ｍの塩化す）　ＩＪウム勾配で溶出した。

活性画分は、約０．３〜０．５Ｍ　　ＮａＣ（ｌで溶出
した（約１５ｍ１＞。

この工程の活性回収率は約６０％であり、Ｍ製、文は約
１．３倍上昇する。

４）精製工程４工程３で得られた活性画分１５ｍ１を集めて、限外ｐ過
膜ＹＭ５（アミコン社製）により、約１０倍濃縮した。

濃縮液を逆相高速液体クロマトグラフィーカラムＭＭＣ
−バック　ＡＭ−３１２０ＤＳ　（１５ｃｍｘ（ｉｓ、
栗田工業社製）にかけた。ＴＲＩＲＯＴＡＲＳＲ高速液
体クロマトグラフィー（日本分光社製）を使用し、２１
０ｎｍの吸光度で溶出液をモニターした。溶出は３０℃
で０．１％トリフルオロ酢酸から７０％アセトニトリル
を含む０．１％トリフルオロ酢酸までの勾配により１．
０ｍｌ／分の流速で行った。

該因子はアセトニトリル濃度約４５％で溶出された。活
性画分を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析することにより、該両分は分子量的１６．１０
０の単一蛋白質を含むことを確認した。この工程の活性
回収率は約６１％であり、精製度は約２５倍であった。

なお全工程を通じての活性回収率は約８％であり、精製
度は約８．５Ｘ１０’倍であった。また該因子の生物活
性は、約Ｉ　Ｘ　１０’単位／ｍｇ蛋白であった。

なお精製結果のまとめを第２表に示した。

発明の効果本発明によれば、免疫担当細胞の機能を活性化し、癌そ
の他の疾患に対する治療に用いることができる新規なＴ
細胞活性化因子が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明因子のＴ細胞活性化作用によるＣ３Ｈ
／Ｈｅマウス胸腺細胞への〔３日〕−チミジンの取り込
み活性を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１）下記の理化学的性質を有する新規Ｔ細胞活性化因子
。ａ）分子量：約１６，１００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）ｂ）等電点：９．３±０．３（クロマトフォーカシング
法）ｃ）アミノ酸組成比：６Ｎ塩酸で１１０℃、２０時間減圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザーに
より分析したアミノ酸組成比（モル比）はアラニン（Ａ
ｌａ）を１．００として以下の通りである。アラニン（Ａｌａ）　１．００アルギニン（Ａｒｇ）　０．７４アスパラギン酸／アスパラギン　０．３２（Ａｓｐ／Ａｓｎ）システイン（Ｃｙｓ）　測定せずグルタミン酸／グルタミン　０．７１（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）グリシン（Ｇｌｙ）　１．１１ヒスチジン（Ｈｉｓ）　０．２２イソロイシン（Ｉｌｅ）　０．３５ロイシン（Ｌｅｕ）　０．９７リジン（Ｌｙｓ）　０．７９メチオニン（Ｍｅｔ）　０．１４フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　０．１１プロリン（Ｐｒｏ）　０．３４セリン（Ｓｅｒ）　０．４７トリプトファン（Ｔｒｐ）　測定せずトレオニン（Ｔｈｒ）　０．３３チロシン（Ｔｙｒ）　０．１９バリン（Ｖａｌ）　０．５２