JPH0568583A

JPH0568583A - 組換えヒトβ−インターフエロンの精製方法

Info

Publication number: JPH0568583A
Application number: JP3074344A
Authority: JP
Inventors: Otello Protasi; プロタスイオテツロ; Paolo Rappuoli; ラツプオーリパオロ
Original assignee: Sclavo SpA
Current assignee: Sclavo SpA
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1991-03-15
Publication date: 1993-03-23
Also published as: DE69116582D1; IT9019699A1; IT9019699A0; ATE133421T1; EP0446850B1; KR910016928A; EP0446850A3; IT1240612B; EP0446850A2

Abstract

(57)【要約】【構成】ａ）未精製状態の組換えヒトβ−インターフ
ェロンの水溶液を脱イオン水で平衡にしたシリカ含有固
体マトリックスと接触させてその上に組換えヒトβ−イ
ンターフェロンを吸着させ、その後組換えヒトβ−イン
ターフェロンを２〜10ミリモル／ｌ酢酸水溶液で溶出
し、その後一層高純度の組換えヒトβ−インターフェロ
ンを含む溶出画分を回収し；ついでｂ）高純度溶出画分を、pH3.0 以上のアセテート緩衝液
で平衡にした陽イオン交換マトリックスに 0.1cm／分を
超えない流速で充填し、前記のマトリックスに吸着され
た rhu−β−インターフェロンを、0.15〜0.18モル／ｌ
のNaClを含むpH6.2 〜6.8 の0.07〜0.15モル／ｌホスフ
ェート緩衝液で溶出させることによる組換えヒトβ−イ
ンターフェロンの精製方法。【効果】タンパク質１mg当り１×10⁸〜４×10⁸単位
の比活性を示す高純度の rhu−β−インターフェロンを
高収率で得ることを可能にした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シリカ含有マトリック
スによるクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグ
ラフィーとの組合せた使用による組換えヒトβ−インタ
ーフェロン（ｒｈｕ−β−ＩＦＮと称する）の精製方法
に関する。更に、本発明は活性薬剤として組換えヒトβ
−インターフェロンを含むウィルス感染及び腫瘍の治療
のため、且つ免疫調節剤としての製薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】インタ
ーフェロン（簡単にＩＦＮと称される）は、感染の第一
段階中にウィルス剤及び非ウィルス剤に対する応答とし
て種々のヒト及び動物の細胞により生産される糖タンパ
ク質物質である。インターフェロンは、種々の活性、例
えば抗ウィルス活性、抗増殖活性、抗細胞（ａｎｔｉｃ
ｅｌｌｕｌａｒ）活性及び免疫調節活性を示す。それら
の生物活性に基いて、少なくとも三つの型のインターフ
ェロン、即ちアルファ、ベータ及びガンマ（以下、α、
β及びγとして表される）が同定され、性質を調べられ
た。これらは白血球、繊維芽細胞、リンパ球により、及
び免疫系により生産される。特に、ヒトβ−インターフ
ェロン（ｈｕ−β−ＩＦＮ）が繊維芽細胞により生産、
分泌され、それはウィルス感染及び腫瘍学領域に於ける
二次免疫不全のコアジュバントとして適用される。ポリ
−ＩＣ（ポリリボシン酸及びポリリボシチジル酸）によ
る超誘導の条件下のヒト繊維芽細胞の試験管内培養、続
いてクロマトグラフィー技術及び電気泳動技術による精
製によるβ−インターフェロンの生産方法が従来技術で
知られている。しかしながら、前記の方法は低い生産収
率及び、特別には、出発物質（繊維芽細胞）の不充分な
有用性のために欠点を示す。遺伝子工学の技術分野に於
ける現在の開発は、関係する生産物を暗号化する遺伝子
を含むベクターを宿す形質転換された宿主生物を使用す
る発酵方法によりタンパク質及びポリペプチドの高収率
の生産を可能にした。種々の操作された宿主生物の使用
に基く組換えヒトβ−インターフェロンの多くの生産方
法が技術文献及び特許文献に記載されている（デリンク
（Ｄｅｒｙｎｃｋ）、Ｒ．ら著、Ｎａｔｕｒｅ２８５
巻、５４２〜５４７頁（１９８０年）；デリンク、Ｒ．
ら著、Ｎａｔｕｒｅ２８７巻、１９３〜１９７頁（１９
８０年）；タニグチ、Ｔ．ら著、Ｇｅｎｅ１０巻、１１
〜１５頁（１９８０年）；タニグチ、Ｔら著、ＰＮＡＳ
７７巻、４００３〜４００６頁（１９８０年）；欧州特
許出願第０４１３１３号を参照のこと）。前記の既知の
方法は、得られた組換え生産物の精製に関する多くの問
題を生じる。ヒトの治療に於けるタンパク質の適用は、
毒性の細胞混在物質及び／または生産物の抽出及び精製
の工程に使用される外来の化学物質を含まない、高水準
の純度及び比活性を有する生産物の有用性を必要とする
ことが実際に知られている。沈澱、電気泳動、アフィニ
ティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグ
ラフィーのような精製方法が技術的な従来の文献で公知
であり、細胞抽出物及び分泌物からタンパク質を精製す
るのに適用されていた。特に、天然及び組換えβ−イン
ターフェロンの多くの精製方法が技術文献及び特許文献
に記載されている。これに関して、欧州特許出願第０６
３４８２号、英国特許第１，５３４，８１２号及びビリ
アウ（Ｂｉｌｌｉａｕ）らの論文、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ．ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｅｒａｐｙ，
１６巻，４９〜５５頁（１９７９年）が参照される。詳
細には、欧州特許出願第０６３４８２号は以下の技術：
１）ＣＰＧ、２）コンカナバリン−Ａ−セファロース
（商標）、３）ヘパリン−セファロース（商標）または
プロシオン・レッド−Ａ−アガロース及び４）ゲル濾過
の逐次使用を含むβ−インターフェロンの精製方法を開
示している。英国特許第１，５４３，８１２号は、主な
特徴として、ＣＰＧの使用及び強酸溶離剤（ｐＨ２．
０）の使用を含むβ−インターフェロンの精製方法を開
示している。この方法によれば、粗β−インターフェロ
ンの４０〜９０倍の精製及び６０％の収率が得られる。
ビリアウらの方法（上記の文献を参照のこと）は、タン
パク質１ｍｇ当り１×１０⁶単位の比活性を有するイン
ターフェロンを５０％の全収率で得ることを可能にす
る。結論として、前記の従来方法は低い生産収率及び精
製収率のため、及び多くの必要な工程のため全く不充分
である。それ故、これらの方法は工業規模の適用には不
適である。今般、従来技術の方法の欠点が簡単且つ経済
的に有利な組換えヒトβ−インターフェロンの方法によ
り解消し得ることが発見された。

【０００３】

【課題を解決するための手段】４かくして、本発明の目
的は、シリカ含有マトリックスによるクロマトグラフィ
ーと陽イオン交換クロマトグラフィーを組合せることに
よる未精製状態の組換えヒトβ−インターフェロンを含
む溶液からの組換えヒトβ−インターフェロンの精製方
法である。本発明の別の目的は、ウィルス感染及び腫瘍
の治療のため、及び免疫調節剤としての製薬組成物を製
造するための活性成分として、上記の方法により精製さ
れた組換えヒトβ−インターフェロンの使用である。本
発明の更に別の目的は、治療有効量の、本法により精製
された組換えヒトβ−インターフェロンを含む製薬組成
物である。

【０００４】詳細には、本発明のクロマトグラフィー精
製方法は、ａ）未精製状態の組換えヒトβ−インターフェロンの水
溶液を脱イオン水で平衡にしてシリカ含有固体マトリッ
クスと接触させてその上に組換えヒトβ−インターフェ
ロンを吸着させ、その後、前記のインターフェロンを２
〜１０ミリモル／ｌの範囲のモル濃度の酢酸の水溶液を
使用して溶出し、その後、一層高水準の純度の組換えヒ
トβ−インターフェロンを含む溶出画分を回収し；つい
でｂ）段階ａ）により精製された組換えヒトβ−インター
フェロンを含む溶出画分を、３．０以上のｐＨのアセテ
ート緩衝液で平衡にした陽イオン交換樹脂に０．１ｃｍ
／分を超えない流速で装填し、前記のマトリックスに吸
着されたｒｈｕ−β−インターフェロンを０．１５〜
０．１８モル／ｌのＮａＣｌを含む６．２〜６．８の範
囲のｐＨの０．０７〜０．１５モル／ｌの範囲の濃度の
ホスフェート緩衝液で０．１ｃｍ／分以下の流速で溶出
させることにある。この様にして、組換えヒトβ−イン
ターフェロンは所定の溶出画分中の特異な明瞭なピーク
として得られる。精製される組換えヒトβ−インターフ
ェロンに関する限り、これはヒトβ−インターフェロン
を暗号化する遺伝子を含む形質発現ベクターで形質転換
された細菌、酵母または哺乳類の細胞の群から選ばれた
宿主生物を培養し、ついで細胞溶解産物または培地から
組換え生成物を分離することにより得ることができる。
本発明の方法の実施態様によれば、ｒｈｕ−β−ＩＦＮ
はバイオリアクター中のミクロキャリヤー上のＣＨＯ細
胞（チャイニーズハムスターの卵巣腫瘍細胞、即ちチロ
ン（ＣＨＩＲＯＮ）からのプラスミドｐＳＡＤ β−Ｉ
ＦＮｇ１による系ＣＨＯＤ×Ｂ１１のトランスフェク
ションから誘導されたクローンＣＨＯβ−ＩＦＮｇ４５
４）により生産される。形質転換された細胞は、タンパ
ク質１ｍｇ当り約１０⁴Ｕ．Ｉの比活性を有する不純な
状態の組換えヒトβ−インターフェロンを形質発現し培
地中に分泌する。ｒｈｕ−β−ＩＦＮ溶液の成分の明瞭
な分離のためのクロマトグラフィーカラムの最適なサイ
ズ（断面の直径及び直さ）は、流速並びに組換えヒトβ
−インターフェロンと固体担体との間の結合比に関する
操作条件を一旦規定した場合、精製しようとする生産物
の量に依存する。

【０００５】段階ａ）本発明の方法の段階ａ）に於いて、シリカ含有材料は組
換えヒトβ−インターフェロンを結合し得る材料の中か
ら選ばれ、これらは市販されている。本発明の目的に好
ましい材料は、調節された多孔度のガラス材料（ＣＰ
Ｇ）であり、これらの中でも、エレクトロ・ヌクレオニ
ウス（ＥｌｅｃｔｒｏＮｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）からの
ＣＰＧ５００が特に好ましい。カラムを調製するのに使
用されるシリカ含有材料、特にＣＰＧの量は、以下の利
点：─装填されたインターフェロンの充分な吸着；精製
された組換えヒトβ−インターフェロンに相当するピー
クの鋭さ；─高タイトル（ｔｉｔｌｅ）の純粋なβ−Ｉ
ＦＮを含む画分を得ること、を得るために出来るだけ高
い結合比Ｕ．Ｉ．（吸着剤材料１ｍｌ当りの装填された
β−インターフェロンの結合比Ｕ．Ｉ．）を有するよう
に決められる。カラムが一旦調製されると、カラムはそ
れを１０％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒド水溶液と約４
時間にわたって静的に接触させることにより滅菌され
る。その後、カラムはクリチフィールド（Ｃｒｉｔｃｈ
ｆｉｅｌｄ），Ｆ．Ｅ．らの方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２９巻、７９７頁を参照のこと）に従って測定され
るホルムアルデヒドの完全な除去まで脱イオンされた無
菌の発熱物質を含まない水で洗浄され、それは４℃に冷
却される。その後、粗組換えｈｕ−β−ＩＦＮの溶液
は、シリカ含有材料への粗インターフェロンの吸着を得
るために、１〜２ｃｍ／分の線形速度（流量／吸着剤材
料の容積）で供給される。アリメンテーション（ａｌｉ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は大気圧で４℃付近の温度で行な
われる。装填段階中に、インターフェロンはシリカ含有
材料に結合され、一方、殆どの外来タンパク質は溶液中
に残り、カラムから浸透して出ていく。ｒｈｕ−β−Ｉ
ＦＮとシリカ含有材料との間の接触段階中のｐＨ値は、
装填された溶液のｐＨである。アリメンテーション段階
の終了時に、カラムは２８０ｎｍに於ける吸収の消失ま
で脱イオンされた無菌の発熱物質を含まない水で洗浄さ
れ、残存する外来タンパク質は１．４ＭのＮａＣｌ水溶
液、ついで脱イオンされた無菌の発熱物質を含まない水
でカラムを連続的に溶離することにより除去される。ア
ームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）Ｊ．Ａ．（１９
８１年の方法（Ｅｎｚｙｍｏｌ．７８巻、３８１〜３８
７頁を参照のこと）を従ってＩＦＮ生物活性を測定する
ことにより行なわれる単一の溶出された画分の分析は、
インターフェロンの存在を明らかにせず、この様にして
装填されたインターフェロンと吸着剤材料との間の連結
（ｌｉｎｋ）の安定性を確かめる。カラムを平衡にし、
洗浄するための脱イオン水の使用は本発明の精製方法の
目的に特に有利であることがわかった。従来技術に一般
に使用される緩衝液は、低モル濃度の溶離酸溶液が使用
される場合にインターフェロンの溶出を遅延させること
が実際に認められた。これは、カラムが緩衝されたまま
であり、それ故、かなり低い重量モル濃度を有する溶離
溶液により吸着材料からｒｈｕ−β−ＩＦＮを放出する
のに必要なｐＨ値が一層遅く得られるという事実による
ようである。その後、ｒｈｕ−β−インターフェロンは
２〜１０ｍＭ／ｌ、好ましくは４〜７ｍＭ／ｌの範囲の
モル濃度の酢酸の水溶液で溶離することにより吸着剤材
料から放出される。５ｍＭ／ｌの酢酸濃度が特に好まし
い。何となれば、１×１０⁷Ｕ．Ｉ．／ｍｇより高い活
性を有する画分について考慮すると、それはｒｈｕ−β
−ＩＦＮが８０％付近の収率で得られることを可能にす
るからである。ｒｈｕ−β−ＩＦＮを溶離するのに適用
される低い酢酸重量モル濃度は、連続陽イオン交換クロ
マトグラフィーの展開に特に好ましい。工程ａ）から来
る部分精製されたβ−インターフェロンを含む画分は実
際に３．５〜４．０の範囲のｐＨ値を示し、これはイン
ターフェロンが使用された陽イオン交換マトリックスに
結合されることを保証するのに充分低いが、同時に、極
限の酸性度（３．０より低いｐＨ）によりマトリックス
が有効でなくなるという問題を生じる程には低くない。
好ましい条件で操作すると、ＣＰＧ１ｍｌ当りに結合さ
れるｒｈｕ−β−ＩＦＮの単位を３．５×１０⁶Ｕ．
Ｉ．から約５．６×１０⁶Ｕ．Ｉ．に増加することによ
り、ＣＰＧに結合されたインターフェロンを完全に溶離
するのに必要な酢酸重量モル濃度が比例して減少するこ
とが観察された。溶離段階の終了時に、流出液が適当な
容積の画分中に回収され、それらの含量が通常の技術に
より分析される。所望により、カラムは５Ｍの酢酸の水
溶液による処理及び脱イオンされた無菌の発熱物質を含
まない水による連続洗浄により再生し得る。

【０００６】段階ｂ）本発明の方法による陽イオン交換クロマトグラフィー
は、１）段階ａ）により部分精製された組換えヒトβ−
インターフェロンを含む溶出画分を、３．０以上のｐＨ
のアセテート緩衝液で平衡にされた陽イオン交換マトリ
ックスに０．１ｃｍ／分を越えない流速で装填し、２）
カラムを０．５ＭのＮａＣｌを含む同アセテート緩衝液
で処理し、３）カラムを３．０以上のｐＨのアセテート
緩衝液でＣｌ^-イオンの完全除去まで洗浄し、ついで
４）前記のマトリックスに吸着された組換えヒトβ−イ
ンターフェロンを、０．１５〜０．１８モル／ｌのＮａ
Ｃｌを含むｐＨ６．２〜６．８の０．０７〜０．１５モ
ル／ｌの濃度のホスフェート緩衝液で０．１ｃｍ／分を
越えない流量で溶出させることを含む。陽イオン交換ク
ロマトグラフィーを行なうためには、ＣＭ−セファロー
ス（商標）、ＣＭ−セファデックス（商標）、ＳＰ−セ
ファロース（商標）、ＳＰ−セファデックス（商標）ま
たはＣＭ−アクセル（商標）の中から選ばれた樹脂（こ
れらは市販されている）が使用し得る。ＣＭ−セファロ
ース−ＣＬ−６Ｂが使用されることが好ましい。ｒｈｕ
−β−ＩＦＮと選ばれたマトリックスとの間の最良の結
合比は、０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌであることがわかっ
た。更に、組換えヒトβ−ＩＦＮの装填量及び溶出流量
が本発明の目的に特に重要である。０．１ｃｍ／分より
高い流速で供給すると、一層高い重量モル濃度のＮａＣ
ｌが組換えヒトβ−ＩＦＮをカラムから溶離するのに必
要であり、その結果純度が低下することが実際に観察さ
れた。同様に、０．１ｃｍ／分より高い流速で溶出する
と、２×１０⁶Ｕ．Ｉ．／ｍｇを越える比活性を有する
ｒｈｕ−β−ＩＦＮの極めて低い収率が得られる。それ
故、装填及び溶出の流速は０．１ｃｍ／分以下であるこ
とが好ましく、それらは０．０５〜０．１ｃｍ／分の範
囲であることが更に好ましい。本発明によれば、アセテ
ート緩衝液は３．０〜４．５、好ましくは３．５〜４．
０の範囲のｐＨを有する。溶離ホスフェート緩衝液のモ
ル濃度は０．０９〜０．１１モル／ｌの範囲であること
が好ましい。

【０００７】本発明の方法により得られた組換えヒトβ
−インターフェロンは、単一ピークとして単離され、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で単一の狭い帯を与える。ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で測定された精製組換えヒ
トβ−インターフェロンの分子量は約２４，０００ダル
トンであることがわかった。これは天然のヒトβ−イン
ターフェロンの分子量に相当する。更に、レーザースキ
ャナー分析は純度最小値９９．５８％を明らかにする。

【０００８】本発明の方法により得られた組換えヒトβ
−インターフェロンは、かくして、ヒトへ投与するのに
特に適する。本発明の方法により精製されたｒｈｕ−β
−ＩＦＮは抗ウィルス剤、抗腫瘍剤及び免疫調節剤とし
て使用するために経口投与、非経口投与または静脈内投
与されることが都合がよい。

【０００９】こうして精製されたｒｈｕ−β−ＩＦＮを
含む組成物は、通常の技術により、活性薬剤を不活性賦
形剤及び必要により安定剤及び適当に選ばれた通常の添
加剤と組合せて調製し得る。経口適用に関して、本発明
の方法により精製されたｒｈｕ−β−ＩＦＮは、澱粉、
糖、水、アルコール等のような通常のキャリヤー／賦形
剤を用いて製造され、必要により着香剤、安定剤、防腐
剤及び滑剤を含む錠剤、カプセル、ドロップ及びエリキ
シル剤の形態で投与し得る。非経口適用または静脈内適
用に関して、最も好ましいキャリヤーは注射用の無菌の
水である。既知の技術により添加剤が含まれてもよい。
治療に有効な毎日の投薬量は治療される患者（体重、年
令及び症状）及び投与方法に応じて変化する。それ故、
本発明の製薬組成物は有効な毎日の投薬量を保証するの
に適した量で精製組換えヒトβ−インターフェロンを含
む。

【００１０】

【実施例】以下の実施例は本発明を説明することを目的
とするものであり、本発明を限定するものではない。

【００１１】実施例１ＣＰＧによるｈｕ−β−ＩＦＮ
組換え体の精製この目的のため、バイオリアクター中でミクロキャリヤ
ーでＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣腫瘍細
胞、即ちチロンからのプラスミドｐＳＡＤβ−ＩＦＮｇ
１により系ＣＨＯＤ×Ｂ１１のトランスフェクション
から誘導されたクローンＣＨＯ β−ＩＦＮｇ４５４）
の培養から得られた粗ｈｕ−β−ＩＦＮの溶液（６００
ｍｌ）を使用した。組換えｈｕ−β−ＩＦＮ溶液は、下
記の組成を有していた。 ─ｈｕ−β−ＩＦＮタイトル８６８４０Ｕ．Ｉ．／ｍｌ ─全ｈｕ−β−ＩＦＮ５２．１×１０⁶Ｕ．Ｉ． ─全タンパク質１．５０２ｍｇ／ｍｌ ─比活性５．８×１０⁴ Ｕ．Ｉ．／ｍｌ直径１．６ｃｍ、高さ０．５ｃｍのガラスカラム（ファ
ーマシア、型式Ｃ１６）に、ａ）ｎ−プロパノール４０
％、β−メルカプトエタノール０．０７％及び飽和量の
尿素からなる混合物、ｐＨ１．５；ｂ）−ＮＨ₄ＯＨ５
％；ｃ）ＣＨ₃ＣＯＯＨ０．１Ｍ；ｄ）ＨＮＯ₃６５
％で沸点で前もって精製されたＣＰＧ（商標）−５００
（エレクトロ・ヌクレオニクス）１ｍｌで充填する。続
いて、カラムをホルムアルデヒド（１０％ｗ／ｖ）の水
溶液で室温（２０〜２５℃）で４時間滅菌する。その
後、クリチフィールド、Ｆ．Ｅ．らの方法（Ａｎａｌ
Ｃｈｅｍ，２９巻，７９７頁を参照のこと）に従って測
定してホルムアルデヒドの完全除去まで、カラムを脱イ
オンされた無菌の発熱物質を含まない水で洗浄し、それ
を４℃に冷却する。その後、上記の組成を有する粗ヒト
β−ＩＦＮを含む上澄液６００ｍｌを、５２×１０
⁶Ｕ．Ｉ．／ｍｌＣＰＧのβ−ＩＦＮ／ＣＰＧの比を得
る１ｍｌ／分×ｃｍ²（ｃｍ／分）の流速でカラムに供
給する。アリメンテーション段階の終了時に、２８０ｎ
ｍに於ける吸収が消失するまでカラムを脱イオンされた
無菌の発熱物質を含まない水で洗浄し、それを１．４Ｍ
のＮａＣｌ溶液で溶離し、その終了時に、塩化物イオン
が消失するまでカラムを脱イオンされた無菌の発熱物質
を含まない水で洗浄する。流速は１ｃｍ／分である。更
に、その方法を、０．２５ｃｍ／分の流速で供給される
酢酸溶液５ｍＭ（ｐＨ３．８）によるｒｈｕ−β−ＩＦ
Ｎの溶出により行なう。下記の画分が得られる。 β−ＩＦＮ全容積タンパク質タンパク質１ｍｇ当りＵ．Ｉ．ｍｇ／ｍｌのβ−ＩＦＮＵ．Ｉ ──────────────────────────────── 3 757 000 3.2 0.12 3.1×10⁷ 2 004 000 7.2 0.063 3.2×10⁷ 317 300 12.0 0.025 1.3×10⁷ 176 000 16.0 0.013 1.3×10⁷ 85 500 12.0 n.d. n.d. 50 100 13.5 n.d. n.d. 50 100 12.0 n.d. n.d. 部分精製された組換えヒトβ−ＩＦＮの全収率は８５％
である。ｎ．ｄ．は、測定されなかったことを意味す
る。

【００１２】実施例２ＣＰＧ（商標−５００による工
業規模の組換えヒトβ−ＩＦＮの精製１．２ｌのＣＰＧ（商標）−５００を含む、２５．２ｃ
ｍ×２．４ｃｍのカラム（ファーマシア、型式ＢＰ２５
２）を使用して実施例１に上記したようにして精製を行
なう。その後、下記の特性を有する粗組換えｈｕ−β−
ＩＦＮの溶液４８６ｌを装填する。 ─ｈｕ−β−ＩＦＮタイトル１００６００Ｕ．Ｉ．／ｍｇ ─全ｈｕ−β−ＩＦＮ３９．６×１０⁶Ｕ．Ｉ． ─タンパク質１．４ｍｇ／ｍｌ ─比活性５．８×１０⁴ Ｕ．Ｉ．５ｍＭの酢酸溶液を用いて溶離を行ない、下記の画分を
得る。タイトル β−ＩＦＮタンパク質比活性全容積Ｕ．Ｉ．／ｍｌｍｇ／ｍｌＵ．Ｉ．／ｍｇｍｌ ──────────────────────────────── 861 000 0.065 1.3×10⁷ 400 4 223 000 0.177 2.4×10⁷ 200 12 100 000 0.478 2.5×10⁷ 1000 6 560 000 0.302 2.2×10⁷ 2500 1 558 000 0.102 1.5×10⁷ 6000 451 000 0.041 1.1×10⁷ 7000 部分精製されたｒｈｕ−β−ＩＦＮの全収率は８６％で
ある。

【００１３】実施例３ＣＰＧ（商標）−５００で部分
精製されたｒｈｕ−β−ＩＦＮの陽イオン交換クロマト
グラフィーによる精製直径１．６ｃｍ、高さ０．５ｃｍのガラスカラム（ファ
ーマシア、型式Ｃ１６）を使用する。カラム、フローセ
ル、弁及び出口を、それらを２５％のエタノールに一夜
接触させることにより滅菌し、一方、全ての入口及びカ
ラムの上流の取付具をオートクレーブ中で滅菌する。そ
の後、エチルアルコールが消失するまで（光度計試験に
より測定）、カラムを０．２Ｍのアセテート緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）で洗浄し、同アセテート緩衝液を用いて０．
０８ｃｍ／分の流速で平衡にし、１７．６ｍｌのＣＭ−
セファロース（商標）ＣＬ−６Ｂ（ファーマシア）（カ
ラム中のゲルの高さ８．８ｃｍ）を充填し、水を０．１
７８ｃｍ／分の流速で装填する。その後、実施例１によ
りＣＰＧ（商標）−５００によるクロマトグラフィーに
より部分精製された組換えヒトβ−ＩＦＮの溶液（５
６．５ｍｌ）を装填する。その溶液は下記の組成を有す
る。 ─ｈｕ−β−ＩＦＮタイトル１１１５０００Ｕ．Ｉ．／ｍｌ ─タンパク質タイトル０．０７６ｍｇ／ｍｌ ─比活性１．４６×１０⁷ Ｕ．Ｉ．／ｍｇ ─全ｈｕ−β−ＩＦＮ６３×１０⁶ Ｕ．Ｉ． ─全タンパク質４．３ｍｇその溶液を０．０８ｃｍ／分の流速でカラムに供給し、
タンパク質（ｍｇ）／ゲル（ｍ１）の比約０．２を得
る。アリメンテーションの終了時に、カラムを２倍容の
０．２Ｍのアセテート緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄し、
５倍容の０．２Ｍのアセテート緩衝液中の０．５ＭのＮ
ａＣｌで溶離し、塩化物イオンが消失するまで０．２Ｍ
のアセテート緩衝液（ｐＨ４．０）でもう１回洗浄す
る。全溶液を０．０８ｃｍ／分の流速で供給する。その
後、カラムに吸着された組換えヒトβ−ＩＦＮを、０．
１Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ６．５）中の０．１５
のＮａＣｌの溶液を用いて０．０７５ｃｍ／分の流速で
溶出させて、下記の画分を回収する。タイトル β−ＩＦＮタンパク質比活性全容積全β−ＩＦＮＵ．Ｉ．／ｍｌ μｇ／ｍｌＵ．Ｉ．／ｍｇｍｌＵ．Ｉ． ─────────────────────────────────── 111 600 29.2 3.8×10⁶ 1.5 0.17×10⁶ 325 500 37.2 8.7×10⁶ 3.0 0.97×10⁶ 423 150 1.8 2.3×10⁸ 9.0 3.80×10⁶ 255 750 1.4 1.8×10⁸ 4.5 1.10×10⁶ 190 650 0.4 4.8×10⁸ 6.0 1.10×10⁶ 162 750 2.1 7.7×10⁷ 6.0 1.06×10⁶ 176 700 0.7 2.5×10⁸ 6.0 1.10×10⁶ 111 600 0.3 3.7×10⁸ 6.0 0.67×10⁶ 74 000 0.3 2.5×10⁸ 6.0 0.44×10⁶ 111 600 0.3 3.7×10⁸ 6.0 0.67×10⁶ 376 650 3.2 1.2×10⁸ 6.0 2.26×10⁶ 762 600 1.1 6.9×10⁸ 6.0 4.58×10⁶ 251 100 3.0 8.4×10⁷ 6.0 1.50×10⁶ 232 500 0.3 7.7×10⁸ 6.0 1.39×10⁶ 139 500 3.9 3.6×10⁷ 6.0 0.83×10⁶ 120 900 3.5 5.0×10⁷ 6.0 0.72×10⁶ 111 600 5.5 2.0×10⁷ 6.0 0.67×10⁶ 93 000 3.9 2.4×10⁷ 6.0 0.56×10⁶ 46 500 2.8 1.7×10⁷ 6.0 0.28×10⁶ 37 200 - - - - 27 900 - - - - ｒｈｕ−β−ＩＦＮの全収率は約７８％であり、そのう
ち約４５％が１×１０⁸ Ｕ．Ｉ．／ｍｇ〜７．７×１０
⁸ Ｕ．Ｉ．／ｍｇの範囲の比活性を有する画分に関係
し、粗ｒｈｕ−β−ＩＦＮに対する最終収率は３８％で
あると云える。タンパク質タイトルはＢＩＯ−ＲＡＤ
ミクロ−ＢＣＡキットで測定した。組換えヒトβ−ＩＦ
Ｎの試験体の純度は、１２．５％及び１５％のＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で測定した。コマシー・
ブルーで染色した後、単一の帯が得られた（第１図、ラ
イン２及び３を参照のこと）。

【００１４】実施例４ＣＰＧ（商標）−５００で部分
精製されたｒｈｕ−β−ＩＦＮの陽イオン交換のクロマ
トグラフィーによる精製直径１１．３ｃｍ、高さ３０ｃｍのカラム（ファーマシ
ア、型式ＢＰ１１３／３０）に約１０００ｍｌのＣＭセ
ファロース（商標）ＣＬ−６８（カラム中のゲルの高さ
約１０ｃｍ）を充填し、０．１８ｃｍ／分の流速で水を
装填した。その後、実施例２により得られたｒｈｕ−β
−ＩＦＮ６５０ｍｌを０．１ｃｍ／分の流速でカラム
に供給する。その溶液は下記の特性を有する。 ─β−ＩＦＮタイトル６５６００００Ｕ．Ｉ．／ｍｌ ─タンパク質タイトル０．３２ｍｇ／ｍｌ ─比活性２．２０×１０⁷ Ｕ．Ｉ．／ｍｇ ─全β−ＩＦＮ４．２６×１０⁹ Ｕ．Ｉ． ─全タンパク質２０８ｍｇタンパク質／ゲルの比０．２１ｍｇ／ｍｌを得た。カラ
ムに吸着されたβ−ＩＦＮの溶離を、０．１Ｍのホスフ
ェート緩衝液（ｐＨ６．５）中の０．１５ＭのＮａＣｌ
を用いて０．０７５ｃｍ／分の流速で行なう。溶離の終
了時は、下記の画分を得る。タイトル β−ＩＦＮタンパク質比活性容積全β−ＩＦＮＵ．Ｉ． μｇ／ｍｌＵ．Ｉ．／ｍｇｍｌＵ．Ｉ． ───────────────────────────────── 1 904 000 33.3 5.7×10⁷ 240 4.56×10⁸ 5 236 000 116.3 4.5×10⁷ 30 1.57×10⁸ 6 528 000 121.6 5.1×10⁷ 50 3.26×10⁸ 5 780 000 100.6 5.7×10⁷ 60 3.46×10⁸ 4 216 000 58.5 7.2×10⁷ 50 2.10×10⁸ 3 196 000 44.7 7.1×10⁷ 50 1.59×10⁸ 2 992 000 28.9 1.0×10⁸ 85 2.54×10⁸ 2 516 000 16.1 1.6×10⁸ 150 3.77×10⁸ 2 312 000 9.7 2.4×10⁸ 430 9.90×10⁸ 816 000 7.7 1.1×10⁸ 170 1.38×10⁸ 476 000 6.2 7.7×10⁸ 140 0.66×10⁸ 340 000 5.1 6.7×10⁸ 275 0.93×10⁸ 340 000 4.8 7.1×10⁸ 275 0.93×10⁸ 272 000 4.3 6.3×10⁸ 275 0.75×10⁸ 335 000 4.5 7.4×10⁸ 275 0.92×10⁸ 176 000 3.0 5.9×10⁸ 275 0.48×10⁸ 122 000 2.2 5.6×10⁸ 275 0.33×10⁸ ｒｈｕ−β−ＩＦＮの全収率は８２％であり、そのうち
３５．６％は１×１０⁸Ｕ．Ｉ．／ｍｇ〜２．４×１０
⁸Ｕ．Ｉ．／ｍｇの範囲の比活性を有する画分に関す
る。

【００１５】実施例５ＣＰＧ（商標）−５００で部分
精製された陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製実験の目的は、組換えｈｕ−β−ＩＦＮ精製に関する溶
出速度の効果を確かめることである。直径２５．２ｃ
ｍ、高さ９．６ｃｍのカラム（ファーマシア、型式ＢＰ
２５２）に４７８０ｍｌのＣＭセファロース（商標）Ｃ
Ｌ−６８を充填した。その後、ＣＰＧ（商標）−５００
により部分精製されたｒｈｕ−β−ＩＦＮ溶液６０００
ｍｌを０．１ｃｍ／分の流速でカラムに供給する。その
溶液は下記の特性を有する。 ─β−ＩＦＮタイトル４４２５０００Ｕ．Ｉ．／ｍｌ ─タンパク質タイトル０．２４３ｍｇ／ｍｌ ─比活性１．８０×１０⁷ Ｕ．Ｉ．／ｍｇタンパク質／マトリックスの比０．３１ｍｇ／ｍｌに得
られる。アリメンテーションの終了時に、実施例４に記
載したような種々の洗浄工程後に、組換えヒトβ−ＩＦ
Ｎを０．１Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ６．５）中の
０．１５ＭのＮａＣｌの溶液を用いて０．１８ｃｍ／分
の流速で溶離し、ｒｈｕ−β−ＩＦＮを含む画分を回収
する。ｒｈｕ−β−ＩＦＮの全収率は６５％であり、そ
のうちのわずかに２．６％が１０．０×１０⁷Ｕ．Ｉ．
より高い比活性を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例３に従って精製された組換えヒ
トβ−インターフェロンの電気泳動の結果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）未精製状態の組換えヒトβ−インタ
ーフェロンの水溶液を脱イオン水で平衡にしたシリカ含
有固体マトリックスと接触させてその上に組換えヒトβ
−インターフェロンを吸着させ、その後、組換えヒトβ
−インターフェロンを２〜１０ミリモル／ｌの範囲のモ
ル濃度の酢酸の水溶液で溶出し、その後、一層高水準の
純度の組換えヒトβ−インターフェロンを含む溶出画分
を回収し；ついでｂ）段階ａ）により精製された組換えヒトβ−インター
フェロンを含む溶出画分を、３．０以上のｐＨのアセテ
ート緩衝液で平衡にした陽イオン交換マトリっクスに
０．１ｃｍ／分を超えない流速で装填し、前記のマトリ
ックスに吸着されたｒｈｕ−β−インターフェロンを、
組換えヒトβ−インターフェロンを所定の溶出画分中で
特異な明瞭なピークとして得るような方法で、０．１５
〜０．１８モル／ｌのＮａＣl を含む６．２〜６．８の
範囲のｐＨの０．０７〜０．１５モル／ｌの範囲の濃度
のホスフェート緩衝液で溶出させることを特徴とする組
換えヒトβ−インターフェロンのクロマトグラフィー精
製方法。
【請求項２】段階ａ）のシリカ含有マトリックスが調
節された多孔度のガラス材料（ＣＰＧ（商標））の群か
ら選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】ＣＰＧがＣＰＧ（商標）５００である請
求項２記載の方法。
【請求項４】段階ａ）の酢酸濃度が４〜７ミリモル／
ｌの範囲である請求項１記載の方法。
【請求項５】酢酸濃度が５ミリモル／ｌである請求項
４記載の方法。
【請求項６】段階ｂ）の陽イオン交換マトリックスが
ＣＭ−セファロース（商標）、ＣＭ−セファデックス
（商標）、ＳＰ−セファロース（商標）、ＳＰ−セファ
デックス（商標）またはＣＭ−アクセル（商標）の中か
ら選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項７】陽イオン交換マトリックスがＣＭ−セフ
ァロース（商標）−ＣＬ−６Ｂである請求項６記載の方
法。
【請求項８】段階ｂ）の組換えヒトβ−インターフェ
ロンの装填及び溶出の流速が０．０５〜０．１ｃｍ／分
の範囲である請求項１記載の方法。
【請求項９】段階ｂ）のアセテート緩衝液が３．５〜
４．５の範囲内のｐＨを有する請求項１記載の方法。
【請求項１０】アセテート緩衝液がｐＨ４．０を有す
る請求項９記載の方法。
【請求項１１】ホスフェート緩衝液が０．０９〜０．
１１モル／ｌの範囲の濃度である請求項１記載の方法。
【請求項１２】治療有効量の、請求項１記載の方法に
従って得られた組換えヒトβ−インターフェロンを活性
剤として含むことを特徴とするウィルス感染及び腫瘍を
治療するため、且つヒトの免疫調節剤としての製薬組成
物。