IT9019699A1 - Procedimento di purificazione del b-interferone umano ricombinante - Google Patents
Procedimento di purificazione del b-interferone umano ricombinanteInfo
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Description
scambio cationico equilibrata con tampone acetato con un pH non inferiore a 3,0 e si eluisce ad una velocità di flusso non superiore a 0,1 cm/minuto l'rhu-p-IFN adsorbito su detta matrice mediante tampone fosfato con una concentrazione compresa tra 0,07 e 0,15 moli/litro ed un pH compreso tra 6,2 e 6,8 contenente NaCl in concentrazione da 0,15 a 0,18 moli/litro in modo da ottenere il |3-interferone umano ricombinante sotto forma di un unico picco netto in determinate frazioni dell’eluato.
Il procedimento consente di ottenere hu-piFN ricombinante con un grado di purezza ed una resa elevati e con una attività specifica compresa tra 1x108 e 4x108 Unità/mg di proteina.
Il β-interferone umano ricombinante così purificato è particolarmente utile come principio attivo per la preparazione di composizioni farmaceutiche adatte al trattamento di infezioni virali e di tumori e come immunomodulatori.
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un procedimento di purificazione del β-interferone umano ricombinante (rhu-p-IFN) mediante una combinazione di cromatografia su una matrice silicea e cromatografia a scambio cationico.
' La presente invenzione riguarda inoltre composizioni farmaceutiche per il trattamento di infezioni virali e di tumori e come immunomodulatori contenenti il β-interferone umano ricombinante così purificato come principo attivo.
Gli interferoni, indicati brevemente IFN, sono sostanze glicoproteiche che vengono prodotte da differenti cellule umane o animali in risposta ad agenti virali e non virali durante le prime fasi di una infezione.
Gli interferoni svolgono molteplici attività biologiche quali, ad esempio, una attività antivirale, antiproliferativa, anticellulare e immunomodulatrice .
Sulla base delle loro attività biologiche sono stati identificati e caratterizzati almeno tre tipi di IFN: alfa, beta e gamma (qui di seguito indicati CL, (5 e y) che vengono prodotti dai leucociti, fibroblasti, linfociti e dal sistema immunitario.
In particolare, il β-interferone umano (ϊηι-β-ΐΓΝ) è prodotto e secreto dai fibroblasti e trova una applicazione come coadiuvante delle immunodeficienze secondarie ad infezioni virali e nel settore oncologico.
' Sono noti nella tecnica procedimenti per la produzione di β-interferone mediante coltura in vitro di fibroblasti umani in condizioni di superinduzione con poli-IC (acido poliribosinico e acido poliribocitidilico) e successiva purificazione mediante tecniche cromatografiche ed elettroferotiche.
Detti procedimenti presentano tuttavia gli inconvenienti derivanti dalle basse rese di produzione e, soprattutto, dalla scarsa disponibilità del materiale di partenza (fibroblasti).
I recenti sviluppi nel campo dell'ingegneria genetica hanno reso possibile l'ottenimento di proteine o polipeptidi in rese elevate mediante procedimenti di fermentazione che utilizzano organismi ospiti trasformati con un vettore contenente il gene codificante il prodotto di interesse .
Sono stati descritti in letteratura tecnica e brevettuale numerosi procedimenti per la preparazione di β-IFN umano ricombinante che impiegano differenti organismi ospiti ingegnerizzati (si veda a tale proposito Derynck, R.et al.,(1980), Nature 285,542-547; Derynck, R.et al., (1980), Nature 287,193-197; Taniguchi, T. et al., (1980), Gene, ]J),11-15; Taniguchi, T. et al., (1980), PNAS 77 4003-4006; EP-041313).
Detti procedimenti noti presentano notevoli problemi relativamente alla purificazione dei prodotti ricombinanti ottenuti.
E' noto infatti che l'impiego di proteine in terapia umana richiede la disponibilità di prodotti con un elevato grado di purezza e di attività specifica, privi di contaminanti cellulari tossici e/o di sostanze chimiche estranee utilizzate nella fase di estrazione e purificazione del prodotto.
Procedimenti di purificazione come precipitazione, elettroforesi, cromatografia di affinità o a scambio ionico sono ben noti nella tecnica e sono stati utilizzati per la purificazione di proteine da estratti o secreti cellulari.
In particolare sono stati descritti in letteratura tecnica e brevettuale numerosi procedimenti per la purificazione di β-IFN naturale o ricombinante .
A tale proposito vengono citate le domande di brevetto EP-063482, GB 1.534.812 e l'articolo di Billiau et al., Antimicrob.Agents and Chemoterapy, 16, 49-55 (1979).
In particolare, la domanda europea EP-063482 descrive un metodo per la purificazione di β-IFN che utilizza in successione le seguenti tecniche cromatografiche: 1) CPG; 2) Concanavalina-A Sepharose; 3) Eparina-Sepharose o Procion Red-A-garosio e 4) gel filtrazione.
GB 1.534.812 riporta un procedimento di purificazione di β-IFN la cui caratteristica fondamentale consiste nell'uso di CPG e di un eluente fortemente acido (pH 2,0). Operando secondo detto procedimento si ottiene una purificazione di β-IFN grezzo da 40 a 90 volte ed una resa totale di circa il 60%.
Infine il procedimento descritto da Billiau et al. (Antimicrob. Agents and Chemoterapy, 16, 49-55 (1979)) consente l'ottenimento di interferone con una resa totale del 50% e con una attività specifica di 1x10 Unità/mg di proteina.
In conclusione detti procedimenti noti non sono completamente soddisfacenti in vista delle basse rese di produzione e di purificazione e per i numerosi stadi richiesti. Ne consegue che detti procedimenti sono poco adatti per una loro applicazione a livello industriale.
E' stato ora trovato che è possibile superare gli inconvenienti della tecnica nota mediante un procedimento di purificazione del β-interferone umano ricombinante semplice ed economicamente vantaggioso.
Pertanto costituisce uno scopo della presente invenzione un procedimento di purificazione del β-interferone umano ricombinante da soluzioni che lo contengono in uno stato non puro mediante la combinazione di una cromatografia su matrice silicea e cromatografia a scambio cationico.
Costituisce inoltre uno SCOPO della presente invenzione l’uso del β-interferone umano ricombinante così purificato come principo attivo nella preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di infezioni virali e tumori e come immunomodulatore .
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione una composizione farmaceutica contenente una quantità terapeuticamente efficace di β-interferone umano ricombinante purificato in accordo al suddetto procedimento.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla lettura della descrizione e dagli esempi che seguono.
In particolare, il procedimento di purificazione cromatografica secondo la presente invenzione consiste nel:
a) porre a contatto una soluzione acquosa di 3-interferone umano ricombinante in uno stato non puro con una matrice solida silicea equilibrata con acqua deionizzata sulla quale il β-interferone umano ricombinante viene adsorbito, eluire detto interferone impiegando una soluzione acquosa di acido Acetico con una concentrazione molare compresa tra 2 e 10 mmoli/litro e recuperare le frazioni dell'eluato contenenti β-interferone umano ricombinante con un grado di purezza più elevato; e
b) seminare con una velocità di flusso non superiore a 0,1 cm/minuto le frazioni di eluato contenenti il β-interf erone umano ricombinante purificato come nello stadio a) su una matrice a scambio cationico equilibrata con tampone acetato con un pH non inferiore a 3,0 ed eluire ad una velocità di flusso non superiore a 0,1 cm/minuto l'rhu^ -IFN adsorbito su detta matrice con tampone fosfato con una concentrazione compresa tra 0,07 e 0,15 moli/litro ed un pH compreso tra 6,2 e 6,8 contenente NaCl in concentrazione da 0,15 a 0,18 moli/litro in modo da ottenere il β-interferone umano ricombinante sotto forma di un unico picco netto in determinate frazioni dell'eluato.
Per quanto riguarda il β-interferone umano ricombinante da purificare questo può essere ottenuto mediante coltura di organismi ospiti scelti nel gruppo di batteri, lieviti o cellule di mammifero trasformati con un vettore ad espressione contenente il gene che codifica per il βinterferone umano e separazione del prodotto ricombinante dalle cellule U sate o dal mezzo di coltura.
Secondo una forma di realizzazione del procedimento della presente invenzione rhu-p-IFN è prodotto da cellule CHO (cellule tumorali di ovaia di hamster cinese, clone CHO β-IFNg 454 derivato dalla trasfezione della linea CHO DXB11 con il plasmide pSAD β-IFNgl della CHIRON) su microcarriers in un bioreattore.
Le cellule trasformate esprimono e secernono nel mezzo di coltura il β-interferone umano ricombinante allo stato non puro con una attività specifica di circa 10 U.I./mg di proteina.
Le dimensioni (sezione e lunghezza) ottimali delle colonne cromatografiche per una separazione netta dei componenti la soluzione di rhu-p-IFN dipenderà, una volta fissate le condizioni operative di flusso e di rapporto di legame tra il β-interferone umano ricombinante e supporto solido, dalla quantità del prodotto che si intende purificare.
Stadio a).
Nello stadio a) del procedimento della presente invenzione i materiali silicei vengono scelti tra quelli capaci di legare il β-interferone umano ricombinante e disponibili commercialmente.
Preferiti per gli scopi della presente invenzione sono i materiali di vetro a porosità controllata (CPG) e tra questi, particolarmente preferito, è il CPG 500 della Electro Nucleonics.
La quantità di materiale siliceo e, in particolare di CPG, impiegata per preparare la colonna è determinata in modo tale da avere un rapporto di legame U.I. di β-interferone caricato/ml di materiale adsorbente più elevato possibile e ciò allo scopo di ottenere i seguenti vantaggi:
- completo adsorbimento dell’interferone seminato; - compattezza del picco corrispondente a β-IFN umano ricombinante purificato e
- ottenimento di frazioni con un elevato titolo in J3-IFN puro.
Una volta preparata la colonna, si sterilizza ponendola in contatto statico con una soluzione acquosa al 10% (p/v) in formaldeide, a temperatura ambiente (20°-25°) per circa 4 ore.
Successivamente si lava la colonna con acqua deionizzata sterile apirogena sino a completa rimozione della formaldeide, determinata secondo il metodo di Critchfield, F.E. et al., (1957), Anal.Chem., 2j), 797, e la si porta a 4°C.
La soluzione di hu-p-IFN ricombinante grezzo viene quindi alimentata ad una velocità lineare (portata/volume del materiale adsorbente) da 1 a 2 cm/minuto in modo da ottenere l’adsorbimento dell'interferone grezzo sul materiale siliceo. L'alimentazione viene condotta operando a pressione atmosferica e ad una temperatura pari o circa pari a 4°C.
Durante la fase di alimentazione, l'interferone si lega al materiale siliceo, mentre la maggior parte delle proteine estranee rimane in soluzione e fuoriesce dalla colonna
Il pH durante la fase di contatto tra hu-β-ΙΡΝ ricombinante e il materiale siliceo è quello della soluzione alimentata.
Al termine della fase di alimentazione, si lava la colonna con acqua deionizzata sterile apirogena sino ad azzeramento dell'effluente a 280 nm e si rimuovono le proteine estranee residue eluendo la colonna, in successione, con una soluzione acquosa di NaCl 1,4 M e con acqua deionizzata sterile apirogena.
L'analisi dei singoli eluati, effettuata mediante determinazione dell'attività biologica di IFN secondo Armstrong J.A. (1981), Methods Enzymol. 78,381-387 non rivela la presenza di interferone confermando così una stabilità di legame fra interferone caricato e materiale adsorbente.
L'impiego di acqua deionizzata per equilibrare e lavare la colonna è stato trovato particolarmente vantaggioso ai fini del procedimento di purificazione in accordo con la presente invenzione.
Si è infatti constatato che le soluzioni tampone, generalmente utilizzate nella tecnica nota, causano un rallentamento dell’eluizione di interferone quando si impiegano soluzioni eluenti acide a bassa concentrazione molare.
Ciò è dovuto, probabilmente, al fatto che la colonna rimane tamponata e quindi le condizioni di pH necessarie per rimuovere rhu-fì-IFN dal materiale adsorbente con una soluzione eluente a molarità piuttosto bassa vengono raggiunte più lentamente .
Si procede quindi alla rimozione del rhu-p-interferone dal materiale absorbente mediante eluizione con una soluzione acquosa di acido Acetico in concentrazione molare compresa tra 2 e 10 mmoli/litro, preferibilmente tra 4 e 7 mmoli/litro. Particolarmente preferita è una concentrazione di acido Acetico di 5 mmoli/litro in quanto consente di ottenere rhu-β-ΙΡΝ con una resa pari o circa pari all'80% relativamente alle frazioni con una attività superiore a 1x10 U.I./mg.
La bassa molarità dell'acido Acetico utilizzata per l'eluizione di rhu-p-lFN è particolarmente vantaggiosa per la successiva conduzione della cromatografia a scambio cationico.
Il pH delle frazioni contenenti β-interferone parzialmente purificato provenienti dallo stadio a) hanno infatti un pH compreso tra 3,5 e 4,0 che è sufficientemente basso per garantire l'attacco dell'interferone alla matrice a scambio cationico utilizzata e, nello stesso tempo, non troppo basso da provocare problemi di inefficienza della matrice indotti da eccessiva acidità (pH inferiori a 3,0).
Operando nelle condizioni preferite è stato trovato che aumentando le unità di rhu-β-ΙΡΝ legate/ml di CPG da 3,5x10® U.I. a circa 50x10® U.I., la molarità di acido Acetico necessaria per eluire completamente l'interferone legato al CPG diminuisce in modo proporzionale.
Al termine della fase di eluizione, l'effluente viene raccolto in frazioni di volume opportuno il cui contenuto è analizzato mediante tecniche convenzionali. Se si desidera la colonna può essere rigenerata mediante trattamento con una soluzione acquosa di acido Acetico 5 M e successivi lavaggi con acqua deionizzata sterile apirogena.
Stadio b).
La cromatografia a scambio cationico in accordo con il procedimento della presente invenzione comprende :
1) il seminare con una velocità di flusso non superiore a 0,1 cm/mìnuto le frazioni dell'eluato contenenti il β-interferone umano ricombinante parzialmente purificato come riportato nello stadio a) su una matrice a scambio cationico equilibrata con tampone acetato con un pH non inferiore a 3,0;
2) il trattare la colonna con lo stesso tampone acetato contenente NaCl 0,5 M;
4) il lavare la colonna con tampone acetato con un pH non inferiore a 3,0 fino a completa rimozione degli ioni CL ; e infine
5) l'eluire con una velocità di flusso non superiore a 0,1 cm/minuto il β-interferone umano ricombinante adsorbito su detta matrice con tampone fosfato con una concentrazione da 0,07 a 0,15 moli/litro e un pH da 6,2 a 6,8 contenente NaCl in concentrazione da 0,15 a 0,18 moli/litro.
Per la realizzazione della cromatografia a scambio cationico possono essere utilizzate matrici scelte tra CM-SepharoseR , CM-SephadexR, SP-SepharoseR, SP-SephadexR o CM-ACCELR disponibili commercialmente.
Preferibilmente viene impiegata CM-Sepharose -CL-6B
In accordo con la presente invenzione è stato trovato che il rapporto ottimale di legame tra rhu-p-IFN e la matrice selezionata è pari a 0,2-0,3 mg/ml.
Inoltre, particolarmente critici per gli scopi della presente invenzione sono risultati i flussi di semina e di eluizione del β-IFN umano ricombinante.
Infatti è stato osservato che seminando a velocità superiori a 0,1 cm/minuto sono necessarie molarità di NaCl più elevate per eluire il β-interefrone umano ricombinante dalla colonna con conseguente diminuzione del grado di purezza.
Analogamente, eluendo a velocità superiori a 0,1 cm/minuto si ottiene una resa in rhu-β-ΙΡΝ con una attività specifica superiore a 2x10 U.I./mg di proteina estremamente bassa. Pertanto preferibilmente le velocità del flusso di semina e di eluizione non devono essere superiori a 0,1 cm/minuto, preferibilmente esse sono comprese tra 0,05 e 0,1 cm/minuto.
In accordo con la presente invenzione il tampone acetato ha un pH compreso tra 3,0 e 4,5, preferibilmente tra 3,5 e 4,0.
La concentrazione molare del tampone fosfato di eluizione è compresa, preferibilmente, tra 0,09 a 0,11 moli/litro.
Il (3-interferone umano ricombinante ottenuto secondo il procedimento della presente invenzione è isolato sotto forma di un singolo picco e produce una sola banda ristretta nella elettroforesi su SDS-PAGE.
Il peso molecolare del β-interferone umano ricombinante così purificato, determinato mediante elettroforesi di gel di poliacrilammide, è risultata di circa 24.000 daltons corrispondente a quello del β-interferone naturale.
La lettura su scanner a raggio laser ha rivelato inoltre un valore minimo di purezza del 99,58%.
Il β-interferone umano ricombinante ottenuto secondo il procedimento della presente invenzione è quindi particolarmente adatto per la sua somministrazione nell'uomo.
Per l'uso come antivirale, antitumorale e immunomodulatore il β-interferone umano ricombinante purificato secondo il procedimento della presente invenzione può essere convenientemente somministrato per via orale, parenterale o endovenosa.
Le composizioni che contengono l'rhu-p-IFN così purificato possono essere preparate, secondo le tecniche convenzionali, combinando il principio attivo con un veicolo inerte ed eventualmente con degli stabilizzanti e additivi convenzionali opportunamente scelti.
Per l'uso orale il β-interferone umano ricombinante purificato con il procedimento della presente invenzione può essere somministrato sotto forma di compresse, capsule, gocce o elisir, preparate impiegando i convenzionali veicolanti/eccipienti quali amido, zuccheri, acqua, alcool etc. e contenenti, eventualmente, agenti aromatizzanti, stabilizzanti, conservanti o lubrificanti.
Per l'uso parenterale o endovenoso, il veicolo d'elezione è l'acqua sterile per iniezioni. Additivi possono essere aggiunti secondo l'arte nota. Il dosaggio giornaliero terapeuticamente efficace varierà a seconda del soggetto da trattare (peso, età e condizioni) e della via di somministrazione.
Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione conterranno pertanto il β-interferone umano ricombinante purificato in quantità idonea a garantire un corretto dosaggio giornaliero.
Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione stessa.
Esempio 1
Purificazione di hu-β-ΙΡΝ ricombinante mediante CPG.
A tale scopo è stata impiegata una soluzione di hu-β-ΙΡΝ grezzo (600 mi) ottenuta mediante coltura di cellule CHO (cellule tumorali di ovaia di hamster cinese, clone CHO β-IFNg 454 derivato dalla trasfezione della linea CHO DXB11 con il plasmide pSAD β-IFNg della CHIRON) su microcarriers in un bìoreattore.
La soluzione di hu^ -IFN ricombinante ha la seguente composizione:
- titolo hu-β-ΙΡΝ 86.840 U.I./ml
- totale hu-β-ΙΡΝ 52,1x10® U.I.
- proteine totali 1,502 mg/ml
- attività specifica 5,8xl0<4 >U.I./mg
Una colonna in vetro di 1,6 cm di diametro e 0,5 cm di altezza (Pharmacia, modello C16) viene impaccata con 1 mi di CPG -500 (Electro Nucleonics) previamente purificati con:
una miscela costituita da n-propanolo 40%, beta-mercaptoetanolo 0,07% e urea fino a saturazione, pH 1,5;
- NH4OH 5%;
- CH3COOH 0,1 M;
- HNO^ 65%, all'ebollizione.
Successivamente la colonna è sterilizzata con una soluzione acquosa di formaldeide (10%, peso/volume) a temperatura ambiente (20-25°C) per 4 ore.
Quindi, la colonna è lavata con acqua deionizzata sterile apirogena sino a completa rimozione della formaldeide, determinata secondo il metodo di Critchfield, F.E. et al., (1957), Anal.Chem., 29, 797, e portata a 4°C.
Successivamente 600 mi di supernatante contenente β-IFN umano ricombinante grezzo avente la composizione prima riportata sono caricati in colonna con una velocità di flusso di 1 ml/minuto x cm (cm/minuto) ottenendo un rapporto β-IFN/CPG di 52xl0<6 >U.I./ml di CPG.
Terminata la carica, si lava la colonna con acqua deionizzata sterile apirogena fino ad azzeramento della assorbanza misurata a 280 nm, si eluisce con una soluzione acquosa di NaCl 1,4 M e infine si lava nuovamente con acqua deionizzata sterile apirogena sino a scomparsa degli ioni cloruro. La velocità di flusso è di 1 cm/minuto.
Si procede quindi all’eluizione dell'rhu-p-IFN con una soluzione di acido Acetico 5 mM (pH 3,8) alimentata ad un flusso di 0,25 cm/minuto.
Si ottengono le seguenti frazioni:
β-IFN volume totale proteine β-IFN U.I./ml mi mg/ml U.I./mg proteina
3.757.000 3,2 0,12 3,lxlO7 2.004.000 7,2 0.063 3,2xl07 317.300 12,0 0,025 l,3xl07 176.000 16,0 0,013 1,3xl07 85.500 12,0 n.d. n.d.
50.100 13,5 n.d. n.d.
50.100 12,0 n.d. n.d.
La resa totale in β-IFN umana ricombinante parzialmente purificato risulta pari all' 85,5% Con n.d. si intende non determinabile.
Esempio 2
Purificazione di β-!FN umano ricombinante su scala industriale mediante CPG 500.
Si opera come descritto nell'esempio 1 che precede utilizzando una colonna 25,2 cm x 2,4 cm (Pharmacia, modello BP 252) contenente 1,2 1 di CPG<R >500.
Si caricano 486 litri di soluzione di hu-p-interferone ricombinante grezzo avente le seguenti caratteristiche:
- titolo hu-|3-IFN 100.600 U.I./ml
- totale hu-^-IFN 39,6xl0<9 >U.I.
- proteine 1,4 mg/ml
- attività specifica 5,8x10 A<* >U.I.
L'eluizione è condotta utilizzando una soluzione di acido Acetico 5 mM e si ottengono le seguenti frazioni :
Titolo Proteine Attività Volume
β-IFN specifica totale
U.I./ml mg/ml U.I./mg mi
861.000 0,065 l,3xl0<7 >400
4.223.000 0.177 2,4xl0<7 >200
12.100.000 0,478 2,5xl0<7 >1000
6.560.000 0,302 _2,2xl0<7 >2500
1.558.000 0,102 l,5xl0<7 >6000
451.000 0,041 1,lxlO<7 >7000
La resa totale in J3-IFN umana ricombinante parzialmente purificato risulta pari all' 86%.
Esempio 3
Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico di rhu-3-IFN parzialmente purificato su CPGR 500.
Si impiega una colonna in vetro di 1,6 cm di diametro e 0,5 cm di altezza (Pharmacia, modello C16).
La colonna, la cella di flusso, le valvole e le uscite sono sterilizzate lasciandole a contatto con alcool etilico al 25% per una notte, mentre tutte le vie a monte della colonna vengono sterilizzate in autoclave.
Quindi la colonna è lavata con tampone acetato 0,2 M (pH 4,0) fino a scomparsa dell'alcool etilico (dosato con test fotometrico), equilibrata utilizzando lo stesso tampone acetato ad una velocità di flusso di 0,08 cm/minuto ed impaccata con 17,6 mi di CM-Sepharose CL-6B (Pharmacia) (altezza del gel in colonna di 8,8 cm) alimentati ad una velocità di flusso di 0,178 cm/minuto in acqua. Si carica quindi la soluzione di β-interferone umano ricombinante (56,5 mi) parzialmente purificato mediante cromatografia su CPG 500 operando come riportato nell'esempio 1, avente la seguente composizione: .
- titolo hu-p-IFN 1.115.000 U.I./ml
- titolo proteine 0,076 mg/ml
- attività specifica l,46xl07 U.I./mg
- totale hu-3-IFN 63xl06 U.I.
- totale proteine 4,3 mg
La soluzione è caricata in colonna ad una velocità di flusso di 0,08 cm/minuto e si ottiene un rapporto mg di proteine/ml di gel pari a circa 0,2.
Terminata la carica, la colonna è lavata con 2 volumi di tampone acetato 0,2 M (pH 4,0), eluita con 5 volumi di NaCl 0,5 M in tampone acetato 0,2 M e nuovamente lavata con tampone acetato 0,2 M (pH 4,0) fino a scomparsa degli ioni Cl . Le soluzioni sono alimentate tutte con una velocità di flusso di 0,08 cm/minuto.
Quindi il β-IFN umano ricombinante adsorbito su colonna è eluito utilizzando una soluzione di NaCl 0,15 M in tampone fosfato 0,1 M (pH 6,5) alimentata ad un flusso di 0,075 cm/minuto e si raccolgono le seguenti frazioni:
Titolo Proteine Attività Volume Totale β-IFN specifica β-IFN
U.I./mi yug/ml_ U.I. /mq mi_ U.I.
111.600 29,2 3,8xl06 1,5 0,17xl06 325.500 37,2 8,7xl06 3,0 0,97xl06 423.150 1,8 2,3xl0<8 >9,0 3,80xl0<6 >255.750 1,4 1,8x10® 4,5 Ι,ΙΟχΙΟ<6 >150.650 0,4 4,8xl0<8 >6,0 Ι,ΙΟχΙΟ<6 >162.750 2,1 7,7xl0<7 >6,0 1,06χ10<6 >176.700 0,7 2,5xl0<8 >6,0 Ι,ΙΟχΙΟ<6 >111.600 0,3 3,7xl0<8 >6,0 0,67χ10<6 >74.000 0,3 2,5xl0<8 >6,0 0,44χ10<6 >111.600 0,3 3,7xl0<8 >6,0 0,67χ10<6 >376.650 3,2 1,2xl0<8 >6,0 2,26χ10<6 >762.600 1,1 6,9xl0<8 >6,0 4,58χ10<6 >251.100 3,0 8,4xl0<7 >6,0 1,50χ10<6 >232.500 0,3 7,7xl0<8 >6,0 1,39χ10<6 >139.500 3,9 3,6xl0<7 >6,0 0,83χ10<6 >120.900 3,5 5,OxlO<7 >6,0 0,72χ10<6 >111.600 5,5 2,OxlO<7 >6,0 0,67χ10<6 >93.000 3,9 2,4xl0<7 >6,0 0,56χ10<6 >46.500 2,8 1,7xl0<7 >6,0 0,28χ10<6 >37.200
27.900
La resa totale di rhup-IFN è circa il 78%, di cui il 45% è relativo alle frazioni con una attività specifica compresa tra 1x108° U.I./mg e 7,7x108 U.I./mg, con una resa finale rispetto al β-IFN umano ricombinante grezzo del 38%.
Il titolo proteico è stato determinato con il Kit BIO-RAD micro-BCA.
La purezza dei campioni di β-IFN umano ricombinante è stata verificata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide sodiododecilsolf ato al 12,5% o al 15%. Dopo colorazione con Comassie Blue si è ottenuta una singola banda (figura 1 corsie 2 e 3).
Il peso molecolare determinato utilizzando come markers di pesi molecolari gli standards del Kit LMW della Pharmaciache è di circa 24.000 daltons (figura 1, corsie 1 e 4).
Esempio 4
Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico di hu-3-IFN ricombinante parzialmente purificato su GPG 500.
Una colonna con un diametro di 11,3 cm ed una altezza di 30 cm (Pharmacia, modello BP113/30) è impaccata con circa 1.000 mi di CM Sepharos-D
e CL-68 (altezza del gel in colonna di circa 10 cm) alimentata con una., velocità di flusso di 0,18 cm/minuto in acqua.
Si caricano quindi in colonna, con una velocità di flusso di 0,1 cm/minuto, 650 mi di una soluzione di rhu-^-IFN ottenuta come riportato nell'esempio 2 avente le seguenti caratteristiche:
titolo β-IFN 6. 560.000 U. I . /ml titolo proteine 0,32 mg/ml attività specifica 2,20xl0<7 >U.I./mg totale β-IFN 4,26xl0<9 >U.I totale proteine 208 mg ottenendo un rapporto proteine/gel di 0,21 mg/ml. L'eluizione del β-IFN adsorbito su colonna è condotta utilizzando una soluzione di NaCl 0,15 M in tampone fosfato 0,1 M (pH 6,5) alimentata ad un flusso di 0,075 cm/minuto.
Al termine dell'eluizione si raccolgono le seguenti frazioni:
Titolo Proteine Attività Volume Totale β-IFN specifica β-IFN U.I./ml MQ/rnl_ U.I. /mg mi_ U.I.
1.904.000 33,3 5,7xl0<7 >240 4,56xl0<8 >5.236.000 116,3 4,5xl0<7 >30 l,57xl0<8 >6.528.000 121,6 5,lxlO<7 >50 3,26xl0<8 >5.780.000 100,6 5,7xl0<7 >60 3,46xl0<8 >4.216.000 58,5 7 ,2xlQ<7 >50 2,10xl0<8 >3.196.000 44,7 7<~>lxÌ0<7 >50 1,59x10® 2.992.000 28,9 Ι,ΟχΙΟ<8 >85 2,54xl0<8 >2.516.000 16,1 1, 6xl0<8 >150 3,77xl0<8 >2.312.000 9,7 2 ,4xl0<8 >430 9,90x10® 816.000 7,7 Ι,ΙχΙΟ<8 >170 1,38x10® 476.000 6,2 7,7x10® 140 0,66xl0<8 >340.000 5,1 6,7x10® 275 0,93xl0<8 >340.000 4,8 7,lxlO<8 >275 0,93xl0<8 >272.000 4,3 6,3xl0<8 >275 0,75x10<® >335.000 4,5 7,4xl0<8 >275 0,92x10® 176.800 3,0 5,9xl0<8 >275 0,48x10® 122.000 2,2 5,6xl0<8 >275 0,33x10® La resa totale di rhup-IFN è dell' 82%, di cui il 35,6% è relativo alle frazioni con una attività specifica compresa tra 1x10 U.I./mg e 2,4x10 U.I./mg.
Esempio 5
Prurificazione mediante cromatografia a scambio cationico di rhu-3~IFN parzialmente purificato su CPG<R >500.
Scopo dell'esperimento è quello di verificare l'effetto della velocità di eluizione sulla purificazione di hu-β-ΙΡΝ ricombinante.
Una colonna con un diametro di 25,2 cm ed una altezza di 9,6 cm (Pharmacia, modello BP252) viene impaccata con 4780 mi di CM-Sepharose CL-6B.
Quindi si caricano, con una velocità di flusso di 0,1 cm/minuto, 6000 mi di una soluzione di rhu-p-IFN parzialmente purificata su CPG 500 avente le seguenti caratteristiche:
- titolo p-IFN 4.425.000 U.I./ml
- titolo proteine 0,243 mg/ml
'
- attività specifica 1,80x10 U.I./mg
ottenendo un rapporto proteine/matrice di
a 0,31 mg/ml.
Terminata la carica ed effettuati i diversi lavaggi come riportato nell’esempio 4, si eluisce il p-IFN umano ricombinante con NaCl 0,15 M in tampone fosfato 0,1 M (pH 6,5) con una velocità di flusso di 0,18 cm/minuto e si raccolgono le frazioni di p-IFN umano ricombinante.
La resa totale di rhup-IFN è del 65%, di cui solo il 2,6% mostra un'attività specifica superiore a ΙΟ,ΟχΙΟ7 U.I./mg.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI Procedimento per la purificazione cromatografica di p-interferone umano ricombinante caratterizzato dal fatto che: a) si pone a contatto, una soluzione acquosa di p-interferone umano ricombinante in uno stato non puro con una matrice solida silicea equilibrata con acqua deionizzata sulla quale il p-interferone umano ricombinante viene adsorbito, si eluisce il p-interferone umano ricombinante mediante una soluzione acquosa di acido Acetico con una concentrazione molare compresa tra 2 e 10 mmoli/litro e si recuperano le frazioni dell'eluato contenenti β-interferone umano ricombinante con un grado di purezza più elevato; e b) si seminano con una velocità di flusso non superiore a 0,1 cm/minuto le frazioni di eluato contenenti il β-interferone umano ricombinante purificato come nello stadio a) su una matrice a scambio cationico equilibrata con tampone acetato con un pH non inferiore a 3,0 e si eluisce l'rhu-piFN adsorbito su detta matrice mediante tampone fosfato con una concentrazione compresa tra 0,07 e 0,15 moli/litro ed un pH compreso tra 6,2 e 6,8 contenente NaCl in concentrazione compresa tra 0,15 e 0,18 moli/litro in modo da ottenere il β-interferone umano ricombinante sotto forma di un unico picco netto in determinate frazioni dell'eluato. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui nello stadio a) la matrice silicea è scelta nel gruppo del materiale di vetro a porosità controllata (CPG ). Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui CPG è CPGR 500. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui nello stadio a) la concentrazione di acido Acetico è compresa tra 4 e 7 mmoli/ litro. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui la concentrazione di acido Acetico è 5 mmoli/litro. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui nello stadio b) le matrici a scambio cationico sono scelte tra CM-Sepharose , CM-SephadexR , SP-SepharoseR, SP-SephadexR o CM-ACCELR. Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui la matrice a scambio cationico è CM-Sepharose -CL-6B. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui nello stadio b) le velocità del flusso di semina e di eluizione del β-interferone umano ricombinante sono comprese tra 0,05 e 0,1 cm/minuto. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui nello stadio b) il tampone acetato ha un pH compreso tra 3,5 e 4,5. Procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui il tampone acetato ha un pH 4,0. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il tampone fosfato ha una concentrazione compresa tra 0,09 e 0,11 moli/litro. 12.1 Composizione farmacologica per il trattamento di infezioni virali e di tumori e come immunomodulatore nell'uomo, caratterizzata dal fatto di contenere come principio attivo una quantità terapeuticamente efficace di ^-interferone umano ricombinante ottenuto mediante il procedimento secondo la rivendicazione 1.
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