CN114774398B

CN114774398B - 一种重组ek酶工程菌的高密度发酵方法

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Publication number: CN114774398B
Application number: CN202210698517.7A
Authority: CN
Inventors: 曹海燕; 林兆生; 连婕妮; 王惠; 朱志伟; 辛瑞
Original assignee: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd; Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd; Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2042-06-20
Also published as: CN114774398A

Abstract

本发明涉及生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，具体包括：合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，表达框序列如SEQ ID No.4所示，构建重组EK酶工程菌，菌种活化，高密度发酵培养，诱导表达EK酶。本发明的重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，表达量可提高至19g/L以上，同时可显著降低包涵体蛋白的色素含量。

Description

一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法

技术领域

本发明涉及生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法。

背景技术

丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识底物别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。

对于外源基因的表达可以采用原核表达和真核表达系统进行，但真核表达系统在表达目的蛋白时存在一些缺陷。原核表达系统方面，大肠杆菌表达系统是研究最为深入，发展最迅速的表达系统，其遗传学背景、基因表达调控机理清晰，表达载体及宿主菌种类繁多，常被用于多肽和蛋白质的表达，是目前首选的外源表达系统。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要有使用工具酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的工具酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有上述高度的特异性，使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。

高密度培养一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术在用基因工程菌（尤其是大肠埃希氏菌）生产多肽类药物的实践中逐步发展。大肠埃希氏菌在生产各种多肽类药物中具有极其重要的地位。若能提高菌体培养密度，提高产物的比生产速率（单位体积单位时间内产物的产量），不仅可减少培养容器的体积、培养基的消耗和提高下游工程中分离、提取的效率，而且还可缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本。

但由于肠激酶自身氨基酸序列和结构特点，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的重组工程菌，其包涵体存在着蛋白表达量低、包涵体产物复性困难等的问题。因此，仍需要奖励能够更优的适应大肠杆菌的EK酶表达系统，构建具备更高的分泌表达和活性收率的重组肠激酶工程菌。

而且，在发酵方面，受制于现有发酵体系构建工程菌的表达效率低，材料损耗大，使产品的产量难以提升，同时伴随着产酶的成本居高不下。因此，开发一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法具有重大意义，以便于工业化生产EK酶。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法。

为了获得改善的EK蛋白的体外复性效率，提高EK蛋白的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，本发明提出了一种突变的牛肠激酶，其相比现有商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白的收率可提高4倍以上。在此基础上，进一步获得了可以高效表达该牛肠激酶的重组EK酶工程菌。为了进一步提高产酶量，本发明进一步提出了该重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，至少包括以下步骤：

S1、构建重组EK酶工程菌，包括：

合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，表达框序列如SEQ ID No.4所示，将表达框序列插入到表达载体上，构建得到重组表达载体，并将重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到重组EK酶工程菌，冻存备用；

S2、菌种活化，得活化种子培养液；

S3、发酵培养：将活化种子培养液接种至发酵培养基，发酵过程中，流加补料培养基；

补料培养基的组成为：质量体积百分比为40%~ 70%的葡萄糖水溶液和质量体积百分比15% ~ 35%的酵母浸粉水溶液，按照1：3 ~ 6的体积比混合；

S4、诱导表达：当OD 600值为145 ~160时，添加IPTG诱导EK酶的表达，至OD600值出现平台期发酵结束。

在本发明中，质量体积百分比（w/v）为1%的溶液是指1g溶质溶解于100 mL溶剂中。

具体的构建方式包括：设计牛肠激酶轻链蛋白突变体：在野生型牛肠激酶轻链基础上，在101、112、177位氨基酸发生突变，具体的突变为：K101P、C112T和A177K。上述突变体可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升。

野生型牛肠激酶轻链（即EK酶）在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化。而EK_Lm1是一种已商业化EK酶（雅心），其相对于野生型牛肠激酶轻链第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，该突变使得EK_Lm1相较于野生型具备更好的复性率，该EK酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

虽然上述EK_Lm1相较于野生型具备更优的复性率，但碍于EK酶特点，其复性收率仍相对较低。为了获得改善的蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，本发明设计了一种突变EK酶EKLm3，其相比现有商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白收率提高4倍以上。

本发明结合序列的保守性及三维空间结构分析，在野生型牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，可以减少变性过程中聚集体的产生。在突变体EKLm1的氨基酸序列基础上将第101位赖氨酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸，得到突变体EKLm3，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明具体的EK酶的氨基酸序列如下：

(1)突变体EK_Lm1氨基酸序列SEQ ID No:1：

IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；

（2）突变体EK_Lm3氨基酸序列SEQ ID No:2：

IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMPVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEKGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；

本发明步骤S1中，合成表达框序列编码包含本发明牛肠激酶轻链的重组融合蛋白，重组融合蛋白为牛肠激酶突变体的N端依次连接肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白所得。其中，优选的，表达EKLm1的表达框序列如SEQ ID No.3所示，表达EKLm3的表达框序列如SEQ ID No.4所示。

将合成的表达框序列克隆到pET-30a(+)的酶切位点之间，获得重组pET-30a(+)表达载体。例如，可采用NdeI和XhoI酶切位点等。

将重组表达载体转化到宿主细胞中，筛选得到重组基因工程菌；将步骤S2中构建的重组pET-30a(+)表达载体转化导入到宿主菌中，具体可采用原核表达体系，并优选大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）。转化的方式可采用热击法。并经过抗性筛选单克隆得到基因工程菌，将获得的基因工程菌于-80℃低温保存。经发酵培养、纯化和活性检测，本发明突变EK酶的收率和野生型及当前商业化EK酶相比，可显著提高牛肠激酶轻链蛋白的收率，并可同时保证蛋白的活性。

作为本发明的一种优选的技术方案，在S2中，菌种活化为多级活化得到活化种子液，至少包括以下步骤：

一级活化：取冻存重组EK酶工程菌，按照1：800 ~ 1200的体积比，接种至活化培养基，35 ~ 38℃，200 ~ 240 rpm，培养12~16小时，至菌种OD600值为4.0~8.0，得一级活化种子液；

二级活化：将培养好的一级活化种子液按照1：4 ~ 6的体积比接种至活化培养基，35 ~ 38℃，200 ~ 240rpm，培养2~5小时，至菌种OD600值为3.0~4.0，得二级活化种子培养液。

作为本发明的一种优选的实施方式，菌种活化包括以下步骤：

一级活化：取冻存重组EK酶工程菌，按照1：1000的体积比，接种至活化培养基，37℃，220 rpm，培养12~16小时，至菌种OD600值为4.0~8.0，得一级活化种子液；

二级活化：将培养好的一级活化种子液按照1：5的体积比接种至活化培养基，37℃，220rpm，培养2~5小时，至菌种OD600值为3.0~4.0，得二级活化种子培养液。

作为本发明的一种优选的技术方案，在S3中，作为高密度发酵，将S2中活化后的种子培养液以体积比为1：5~ 15接种于发酵培养基中，并优选为1：10。优选的，发酵培养基的pH值为6.6 ~ 7.0。

作为本发明的一种优选的技术方案，在S3中，在高密度发酵过程中，发酵条件为：温度36 ~ 38℃，空气的通气量450 ~ 550 mL/min，氧气的通气量0~300mL/min，转速400 ~1400rpm；并通过对空气通气量、氧气通气量和转速调整，将溶氧控制在15%~30%；发酵开始后，pH伴随溶氧同时开始上升时开始流加补料培养基，流加补料培养基的时间为10~ 12小时。

作为本发明的一种优选的实施方式，按照前述发酵控制要求确定起始发酵条件，优选地，起始发酵条件为温度36 ~ 38℃，空气的通气量450 ~ 550 mL/min，氧气的通气量0mL/min，转速300 ~ 600rpm；更优选地，起始发酵条件为温度37℃，空气的通气量500 mL/min，氧气的通气量0mL/min，转速400rpm。在发酵前期通过调节搅拌转速，例如每次增加50~100 rpm，从而控制溶氧值在15% ~ 30%范围内，当搅拌转速达到1400 rpm仍无法满足溶氧时开始通纯氧控制。

作为本发明的一种优选的技术方案，在S3中所流加的补料培养基的组成为：质量体积百分比为40%~ 70%的葡萄糖水溶液和质量体积百分比15% ~ 35%的酵母浸粉水溶液，按照1：3 ~ 6的体积比混合；

补料培养基的组成优选为：质量体积百分比含量分别为50~65%的葡萄糖水溶液和15 ~25%的酵母浸粉水溶液，按照体积比1：3 ~ 4混合；

补料培养基的组成更优选为：质量体积百分比为50%的葡萄糖水溶液和质量体积百分比25%的酵母浸粉水溶液，按照1：3的体积比混合。

本发明通过研究发现，降低补料培养基中酵母抽提粉的浓度，控制菌体的生长速度，使其稳定生长，同时可显著降低包涵体色素含量，且不会影响EK酶的整体表达量，从而可降低分离纯化的成本。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S3中，使用紫外分光光度计检测发酵液OD600值，通过调整补料培养基的流加速度控制发酵液的OD600值每小时增加7~12，使菌体平稳生长。

作为本发明的一种优选的实施方式，在S3中，在高密度发酵的条件控制为：初始培养体积0.8 L，接种比例1：10，初始温度37℃，pH为6.8，空气设置500 mL/min，氧气设置0~200mL/min，转速设置300~ 1400rpm，溶氧控制15%~30%。当溶氧开始上升时开始流加补料培养基（同时伴随pH回升）。

作为本发明的一种优选的技术方案，在S4中，当OD 600值为145 ~ 150时，优选148~ 150，添加IPTG诱导EK酶的表达。当降低诱导时的OD600值，可使整个发酵周期菌体平稳生长，进一步提高菌体密度。

作为本发明的一种优选的技术方案，在S4中，诱导的温度为27~ 33℃，优选30℃；IPTG终浓度为0.9 ~ 1.1mmol，优选为1 mmol。

作为本发明的一种优选的实施方式，当流加补料10~ 12小时后，OD600值达到148~150时，开始诱导，IPTG终浓度1.0mM，逐步降低温度至30 ℃，此过程持续时间20 ~ 40 min，同时调整补料速度、调整氧气通气量等以维持溶氧在15%~30%。在发酵过程中，采用氨水调控pH值。

作为本发明的一种优选的实施方式，在S2中，所使用的活化培养基的组成为：胰蛋白胨16~ 22 g/L、酵母浸粉8~14g/L、氯化钠8~12 g/L，余量为水。优选为：胰蛋白胨18g/L、酵母浸粉12g/L、氯化钠10 g/L，余量为水。

作为本发明的一种优选的实施方式，发酵培养基的组成为：

酵母浸粉 8~12 g/L；

一水合柠檬酸 0.8 ~ 1.2 g/L；

硫酸铵 4 ~ 6 g/L；

磷酸二氢钾 5 ~ 7g/L；

七水合硫酸亚铁 0.04 ~ 0.05 g/L

无水氯化钙 0.001 ~ 0.003 g/L

葡萄糖 9.5 ~ 11.5 g/L；

硫酸镁 11 ~ 13 g/L；

溶液D 900 ~ 1100 μL/L；

消泡剂 50~ 150μL/L；

溶液D的组成为：

七水合硫酸亚铁 3.3 ~ 3.4 g/L；

七水合硫酸锌 0.8 ~ 0.9g/L；

一水合硫酸锰 0.5 ~ 0.55 g/L；

四水合钼酸铵 0.16 ~ 0.2 g/L；

五水合硫酸铜(II) 0.1 ~ 0.15g/L；

磷酸 45 ~ 50 mL/L；

发酵培养基使用氢氧化钠溶液调节pH至6.7 ~ 7.0，优选5 M的氢氧化钠溶液。本发明的消泡剂可以使用常规的适于大肠杆菌发酵的消泡剂，如有机非硅聚丙烯基聚醚类消泡剂；本发明使用的是Sigma-Aldrich公司的204消泡剂。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明的牛肠激酶轻链蛋白突变体可显著提高牛肠激酶轻链蛋白的收率，并可同时保证蛋白的活性。而本发明基于该突变体构建的高表达重组工程菌及其高密度发酵方法，更是能够显著增强包涵体表达量，提高EK酶发酵量更有利于进行商业化生产，具备更好的商业应用价值。

本发明的重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，表达量可提高至19g/L以上，同时可显著降低包涵体蛋白的色素含量，减少了下游分离纯化工艺的成本。

附图说明

图1为本发明实施例1获得的酶活检测结果；

图2为本发明实施例2获得的生长曲线图；

图3为本发明实施例3获得的生长曲线图；

图4为本发明实施例2和3所表达的包涵体色素对比照片。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

以下实施例所用到原料均为市售。

以下实施例所用到溶液的配制方法为：

（1）氨水配制：取250 mL纯化水于补料瓶中经121 ℃灭菌30 min降温至室温后在超净工作台中将等体积氨水加入该补料瓶中混匀待用。

（2）5 M氢氧化钠配制：将称量好的20 g氢氧化钠粉末加纯化水充分溶解后定容至100 mL待用。

（3）活化培养基配制如表1所示：

表1

（4）溶液D配制如表2所示：

表2

（5）发酵培养基配制表3所示：

表3

发酵培养基使用5 M氢氧化钠溶液调节pH至6.7 ~ 7.0。

（6）补料培养基配制：

配方1：质量百分比含量分别为55%的葡萄糖和45%的酵母浸粉按照体积比1：3混合；

配方2：质量百分比含量分别为55%的葡萄糖和25%的酵母浸粉按照体积比1：3混合。

实施例1

本实施例用于说明重组EK酶工程菌的构建过程：

一、重组牛肠激酶轻链表达框合成

合成表达本发明重组融合蛋白的表达框，表达框分别表达包含本发明EK_Lm1和EK_Lm3的重组融合蛋白，表达EK_Lm1的表达框序列如SEQ ID No.3所示，表达EK_Lm3的表达框序列如SEQ ID No.4所示。

二、重组蛋白的表达载体的构建及工程菌的构建

将上述步骤1中构建的表达EK_Lm1和EK_Lm3的表达框序列插入到表达载体pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体，测序验证后，并将上述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）中，经过抗性筛选单克隆，挑取该阳性克隆接种到含有相关抗性的液体培养基中，37℃、220 rpm振荡培养至OD600值为1~ 1.5，菌液在生物安全柜内加入50%甘油（菌液：50%甘油=2：1），即每个2 mL的无菌冻存管中加菌液600μL和50%甘油300μL，在离心管内混合均匀（每个克隆至少保存10管），-80℃保存。

经测序验证，得到的工程菌中的序列与所设计的序列一致。

基因合成及测序服务业务均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

三、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测

（1）LB培养基配制，按照表4所示配置：

表4：

（2）工程菌复苏

取前述得到甘油菌各一支，分别按照千分之一接种量接入到装有20 mL灭菌后培养基的三角瓶中，于37℃、200rpm的条件下过夜培养，得相应重组工程菌的复苏菌液。

（3）工程菌的诱导表达

取上述复苏菌液分别按照百分之一接种量接入到装有50 mL灭菌后培养基的三角瓶中于37℃，220rpm的条件下培养至OD600值为0.6 ~ 0.8时加入终浓度为0.5 mM的IPTG，并于30℃、220rpm条件下进行过夜诱导表达。

（4）菌体收集及SDS-PAGE表达检测

菌液于8000 rpm，4℃离心30min，弃上清收获菌体。菌体经超声破碎后获得包涵体，并进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。

（5）重组蛋白菌体制备

将SDS-PAGE检测并确定有目的蛋白的表达的工程菌进行5L摇瓶发酵制备菌体，方法同上述步骤（1）和步骤（2），菌液于8000 rpm，4℃离心30min，弃上清收获菌体。

（6）菌体破碎及包涵体制备

Buffer1配方：50mMTris+ 0.5mol/L NaCl，pH=8.5；

Buffer2配方：50mMTris+ 2M尿素 + 0.5mol/L NaCl + 1.5%Triton，pH=8.5；

按照W/V=1：10的比例用Buffer1重悬菌体，高压匀质机进行破碎处理（800 Bar 3次），离心（10000g，30min，4℃）处理留沉淀；按照W/V=1：10的比例用Buffer2重悬洗涤，20min后离心处理，同上；最后用UP水按照w/v=1：10重悬洗涤包涵体，离心（10000g，30min，4℃），留沉淀。

（7）包涵体变性和复性

变性液配方：6M尿素+ 50mMTris + 20mMDTT；

复性液配方：2M尿素+ 1%PEG1000 + 2mM还原型半胱氨酸 + 1mM氧化型半胱氨酸+ 50mMTris，pH=8.0；

包涵体变性：按照w/v=1：10比例，用变性液重悬包涵体，室温搅拌2 ~ 3小时；离心（13000g，30min，4℃）留上清；

包涵体复性：按照v/v=1：20比例将变性液稀释缓慢添加至复性液，室温搅拌过夜进行复性。

（8）目的蛋白纯化和检测

层析柱：QHP柱；

缓冲液：缓冲液A：50mMTris，pH=8.0；

缓冲液B：1mol/LNaCl + 50mMTris，pH=8.0；

程序：流速5mL/min；

5CV 100%缓冲液A；

20CV 0%~100%缓冲液B。

纯化蛋白经测序验证，为本发明实施例设计的重组融合蛋白，即EK酶。

（9）活性检测

直接使用荧光底物DDDDK-肽底物测量酶活性，在含有100μL反应缓冲液的Fluorescent 96孔板的每个孔内加入1μL样品开始反应，混合10秒后，测量荧光（在380nm激发并在500nm发射），计算酶活性；酶活检测结果如图1所示。

由图1可知，相比于突变体EK_Lm1，本发明的突变的EK酶活性提高接近10%。

（10）纯化结果

根据纯化结果得到每克包涵体的目的蛋白收率情况，纯化结果见表5。

表5

野生型由于二硫键和溶解性等因素造成得率极低，其复性获得的正确折叠的活性蛋白浓度低于0.01mg/mL。EK_Lm1虽然相较于也野生型经过改造后提高了数倍的蛋白回收率，但仍远低于本发明实施例的突变EK酶。突变体EK_Lm3复性获得的正确折叠的活性蛋白浓度甚至达到0.18mg/mL，相比商业化EK_Lm1提高了4倍以上。

由表5中结果可知，突变体EK_Lm3的蛋白收率更是远远高于EK_Lm1。

因此，相比于已商业化EK酶，本发明的提供的突变EK酶，其具备比其更高的EK酶活性，且具备远高于其的蛋白收率，能够有效避免生产上使用巨大的储液罐生产大量EK酶，更有利于进行商业化生产，具备更好的商业应用价值。

实施例2

采用实施例1构建得到的重组EK酶工程菌，进行高密度培养：

1.菌种活化：

一级活化：在超净工作台中，取冻存甘油菌50 μL接入到装有50mL活化培养基的250mL三角瓶中于恒温振荡器中培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间12 ~ 16小时。

二级活化：在超净工作台中，取上述一级活化种子培养液40 mL接入到装有200mL活化培养基1000mL三角瓶中于恒温振荡器中培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间3小时。

2.发酵调控：

（1）发酵罐初始参数设定

温度：37.0±1.0℃，空气流量：500mL/min，氧气流量：0mL/min，初始搅拌：400rpm，溶氧电极校正为100%。

（2）接种

二级活化菌种合格后，用氨水调节pH至6.8后将合格的80mL二级种子液接入800mL发酵培养基，于2L发酵罐内开始发酵培养。

（3）发酵和诱导：

pH伴随溶氧同时开始上升时开始流加配方1的补料培养基，当OD600达到160时开始诱导（30℃，IPTG终浓度1.0 mmol），至OD600值出现平台期发酵结束，同时控制补料使得菌体在诱导前流加10~12小时后OD600值达到160。发酵前期通过调节搅拌转速（每次增加50~ 100 rpm）控制溶氧范围在15% ~ 30%，当搅拌转速达到1400 rpm仍无法满足溶氧时开始通纯氧控制。降温时：降温过程持续时间在20min左右，同时通过调整补料速度及氧气通气量以维持溶氧在15% ~ 30%。参数控制如表6所示：

表6

3、实验结果：

所获得的生长曲线如图2所示，收菌数据及HPLC表达量检测结果如表7所示：

表7

实施例3：

基于实施例2的方法，区别在于：

（1）降低补料培养基中酵母抽提粉的浓度；

（2）诱导OD600值由160调整为150，同时降低诱导前菌体生长速度（流加12 ~ 14小时后OD600值达到150）；

（3）补料培养基采用配方2；其余条件同实施例2。

发酵结果：生长曲线如图3所示，收菌数据及HPLC表达量检测结果如表8所示：

表8

实施例2和实施例3所表达的包涵体色素对比照片如图4所示。其中A为实施例2的表达产物溶解后的色泽，B为实施例3的表达产物溶解后的色泽。

通过实施例2和实施例3的实验数据可知，补料培养基中酵母抽提粉浓度降低后，虽然会降低OD600值及菌体生物量（OD600值降低了5.62%，菌体生物量降低了7.20%），但单菌表达量提高了30.30%，表达量提高了24.69%，同时如图4所示，实施例3所表达的包涵体色素明显减少。

上述实验结果说明：在降低诱导前菌体生长速度并适当降低诱导OD600值，从而使整个发酵周期菌体平稳生长，最终实现高密度发酵，菌体密度OD600值高达为300。同时在降低补料培养基中酵母抽提粉浓度后，单菌表达量及总产量（达到19.12g/L）显著提高的同时包涵体蛋白色素显著减少，减少了下游分离纯化工艺的成本。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 北京惠之衡生物科技有限公司

吉林惠升生物制药有限公司

<120> 一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser

20 25 30

Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met

35 40 45

Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn

50 55 60

Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile

65 70 75 80

Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met

85 90 95

His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr

100 105 110

Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile

115 120 125

Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln

145 150 155 160

Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu

165 170 175

Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met

180 185 190

Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly

195 200 205

Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro

210 215 220

Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His

225 230 235

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser

20 25 30

Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met

35 40 45

Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn

50 55 60

Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile

65 70 75 80

Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met

85 90 95

His Leu Glu Met Pro Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr

100 105 110

Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile

115 120 125

Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln

145 150 155 160

Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu

165 170 175

Lys Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met

180 185 190

Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly

195 200 205

Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro

210 215 220

Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His

225 230 235

<210> 3

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480

ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540

cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600

gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcacatggcg 660

agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720

cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgaaagtg 780

aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840

ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900

gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960

gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aagcgggcgg cgtggatagc 1020

tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080

ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140

gtgccgcgct ttaccgaatg gattcagagc tttctgcat 1179

<210> 4

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480

ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540

cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600

gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcatatggcg 660

agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720

cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgccggtg 780

aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840

ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900

gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960

gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aaaaaggcgg cgtggatagc 1020

tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080

ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140

gtgccgcgct ttaccgaatg gattcagagc tttctgcat 1179

Claims

1.一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述高密度发酵方法至少包括以下步骤：

S1、构建重组EK酶工程菌，包括：

合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，所述表达框序列如SEQ ID No.4所示，将所述表达框序列插入到表达载体上，构建得到重组表达载体，并将所述重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到所述重组EK酶工程菌，冻存备用；

S2、菌种活化，得活化种子培养液；

S3、发酵培养：将所述活化种子培养液接种至发酵培养基，发酵过程中，流加补料培养基；

所述补料培养基的组成为：质量体积百分比含量分别为50% ~ 65%的葡萄糖水溶液和15% ~ 25%的酵母浸粉水溶液，按照体积比1：3 ~ 4混合；

S4、诱导表达：当OD 600值为145 ~ 150时，添加IPTG诱导EK酶的表达，至OD600值出现平台期发酵结束。

2.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在步骤S1中，所述表达框序列插入到pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间。

3.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S2中，所述菌种活化包括以下步骤：

一级活化：取冻存的所述重组EK酶工程菌，按照1：800 ~ 1200的体积比，接种至活化培养基，35 ~ 38℃，200 ~ 240 rpm，培养12 ~ 16小时，至菌种OD600值为4.0 ~ 8.0，得一级活化种子液；

二级活化：将所述一级活化种子液按照1：4 ~ 6的体积比接种至活化培养基，35 ~ 38℃，200 ~ 240 rpm，培养2 ~ 5小时，至菌种OD600值为3.0 ~ 4.0，得二级活化种子培养液。

4.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S3中，将所述S2中活化种子培养液按照1：5 ~ 15的体积比接种至发酵培养基；发酵条件为：温度36 ~ 38℃，空气的通气量450 ~ 550 mL/min，氧气的通气量0 ~ 300 mL/min，转速300 ~ 1400 rpm；并通过对空气通气量、氧气通气量和转速调整，将溶氧控制在15% ~ 30%；发酵开始后，pH伴随溶氧同时开始上升时开始流加补料培养基，所述流加补料培养基的时间为10 ~ 12小时。

5.根据权利要求4所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S3中，通过流加补料培养基控制发酵液的OD600值每小时增加7 ~ 12。

6.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，所述诱导的温度为27 ~ 33℃，IPTG终浓度为0.9 ~ 1.1 mmol。

7.根据权利要求3所述的高密度发酵方法，其特征在于，所述活化培养基的组成为：胰蛋白胨16 ~ 22 g/L、酵母浸粉8 ~ 14 g/L、氯化钠8 ~ 12 g/L，余量为水。

8.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：

酵母浸粉 8 ~ 12 g/L；

一水合柠檬酸 0.8 ~ 1.2 g/L；

硫酸铵 4 ~ 6 g/L；

磷酸二氢钾 5 ~ 7 g/L；

七水合硫酸亚铁0.04 ~ 0.05 g/L

无水氯化钙 0.001 ~ 0.003 g/L

葡萄糖 9.5 ~ 11.5 g/L；

硫酸镁 11 ~ 13 g/L；

溶液D 900 ~ 1100 μL/L；

消泡剂 50 ~ 150 μL/L；

溶液D的组成为：

七水合硫酸亚铁 3.3 ~ 3.4 g/L；

七水合硫酸锌 0.8 ~ 0.9g/L；

一水合硫酸锰 0.5 ~ 0.55 g/L；

四水合钼酸铵 0.16 ~ 0.2 g/L；

五水合硫酸铜（II） 0.1 ~ 0.15 g/L；

磷酸 45 ~ 50 mL/L；

所述发酵培养基使用氢氧化钠溶液调节pH至6.7 ~ 7.0。