CN107881159B

CN107881159B - 一种提高d-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法

Info

Publication number: CN107881159B
Application number: CN201711352455.XA
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 郑俊贤; 杨套伟; 周俊平; 张显; 徐美娟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN107881159A

Abstract

本发明公开了一种提高D‑氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，在甲硫氨酸后面添加三个额外的组氨酸和一个甘氨酸。本发明得到的突变体获得的体积酶活比野生型提高3.4倍。同时突变体经5L发酵罐发酵最终获得体积酶活为86.8U/mL，体积产率为4.52kU·L^‑1·h^‑1，为圆冬红酵母在大肠杆菌中表达获得的最高酶活，加强了该酶的工业应用潜力。

Description

一种提高D-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法

技术领域

本发明涉及一种提高D-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(DAAO,EC 1.4.3.3)具有高效立体选择性催化D-氨基酸生成相应的α-酮酸的生物催化剂，该过程同时伴随着还原态的黄素腺嘌呤二核苷酸被分子氧重新氧化生成副产物过氧化氢。D-氨基酸氧化酶前期主要作为关键酶被用于抗生素中间体7-氨基头孢烷酸的合成，由于D-氨基酸氧化酶具有底物的光谱性，D-氨基酸氧化酶也被开发用于食品、药品中D-氨基酸的检测，及应用于手性纯L-氨基酸和α-酮酸的生成。

目前，研究比较透彻且报道具有较好应用潜力的D-氨基酸氧化酶主要来源于圆红冬孢酵母菌和三角酵母。大肠杆菌作为高效异源表达蛋白的首选宿主具有培养简单、遗传信息透彻和分子操作方便等优势，但是D-氨基酸氧化酶在大肠杆菌中异源表达主要存在于包涵体中酶活很低，且活性的D-氨基酸氧化酶对大肠杆菌细胞壁D-丙氨酸又降解作用阻碍了其高效表达。针对异源表达外源基因时出现包涵体现象，目前主要的解决办法有：密码子偏好性优化、低温诱导或者降低诱导剂浓度、目的蛋白N-端添加分子伴侣或者是融合血红蛋白等大标签可溶性蛋白等等。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过对来源于圆红冬孢酵母菌D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列进行改造来提高其大肠杆菌中的可溶性表达，同时保证大肠杆菌的细胞生长，从而获得最大效益和最大产量的D-氨基酸氧化酶。

本发明的第一个目的是提供一种高效异源表达的D-氨基酸氧化酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，在第二位氨基酸组氨酸后面添加两个额外的组氨酸和一个甘氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，在其甲硫氨酸后面添加三个额外的组氨酸和一个甘氨酸密码子而得到的。

本发明的第三个目的是提供含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pXMJ19。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为E.coli BL21。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的基础上，在其第二位氨基酸组氨酸后面添加两个额外的组氨酸和一个甘氨酸密码子而得到的，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌BL21宿主菌中即得到重组基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：

(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因H(3)G。

(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pXMJ19表达载体中，得到重组质粒ppXMJ19-H(3)G，重组质粒化转化E.coli BL21，获得重组工程菌株，命名为pXMJ19-H(3)G/E.coli BL21。

本发明的第六个目的是提供所述突变体、编码所述突变体的核苷酸序列、含有编码所述突变体的核苷酸序列的载体、表达所述突变体的基因工程菌的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，包括与过氧化氢酶组合用于α-酮酸和手性纯L-氨基酸的合成。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，包括与戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶组合用于7-氨基头孢烷酸的合成。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，作为D-氨基酸检测传感器中的关键酶。

本发明的有益效果：

本发明在圆红冬孢酵母菌来源的天然D-氨基酸氧化酶的基础上，通过利用基因工程技术D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列进行改造，获得的突变体在大肠杆菌中的表达获得的体积酶活是野生型的3.4倍且几乎不影响大肠杆菌的生长，同时突变体经5L发酵罐发酵最终获得体积酶活为86.8U/mL，体积产率为4.52kU·L^-1·h^-1。本发明所得的突变体酶与过氧化氢酶组合用于α-酮酸和手性纯L-氨基酸的合成，与戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶组合用于7-氨基头孢烷酸的合成，同时可作为D-氨基酸检测传感器中的关键酶。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

TY发酵培养基：酵母粉8g/L，蛋白胨12g/L，K₃PO₄4.02g/L，NaCl 3g/L，柠檬酸2g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，甘油10g/L，(NH)₄SO₄2.5g/L，MgSO₄·7H₂O₂。调节pH 7.2。

酶活定义：定义每分钟lμmol D-丙酮酸氧化脱氨为丙酮酸所需的酶量为一个酶活单位U。酶比活力定义为单位蛋白的酶活U/mg。

D-氨基酸氧化酶酶活测定方法：反应体系为0.1mL 0.1mol/L的D-丙氨酸，0.1mL400U的过氧化氢酶于总体积为1.2mL的0.1mol/LpH 8.0的磷酸钾缓冲液中。加入适量的酶液启动反应，37℃反应15分钟，加入0.48mL 10mmol/L的2,4-二硝基苯肼终止反应，并于37℃下孵育10min，最后加入1.7mL 3mol/L的NaOH显色。根据反应液在550nm吸光值和丙酮酸在该吸光值条件下的标准曲线来计算酶活。

实施例1：含D-氨基酸氧化酶突变体的重组载体的构建

(1)H(3)G突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)和Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ IDNO.3所示的重组基因。

(2)将重组基因与pXMJ19分别用BamHI、HindIII双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化E.coli BL21感受态细胞。转化液涂布含氯霉素(15mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pXMJ19-H(3)G。测序工作由上海生工完成。

实施例2：产D-氨基酸氧化酶突变体重组大肠杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pXMJ19-H(3)G化转至E.coli BL21感受态细胞，聚体方法如下：

(1)转化实验所需试剂如下：

LB培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶解,加入去离子水至总体积为1L，分装，高压灭菌20min。

LB琼脂培养基：先按上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入琼脂1％-2％。

100mmol/L CaCl₂(灭菌)、50％甘油(灭菌)、50EP管，1.5mL EP管

(2)挑取大肠杆菌单菌落接种于10mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

(3)按1％接种量接种至50mL LB培养基中，37℃180r/min振荡培养1.5-2h至有些微菌丝体生成。

(4)将100mmol/LCaCl₂、50％甘油、50EP管，1.5mL EP管事先放冰上冷却并置于超净台中灭菌。

(5)于超净台中分装菌液至2个50EP管中，配平，于5000r/min 5min.。

(6)在超净台中去上清，用0.1M CaCl₂悬浮细胞，放置冰上15min，离心(5000r/min5min)，再同样操作1-2次。最后一次0.1M CaCl₂和50％甘油按照2:1的比例去悬浮细胞，最后分装至1.5mL EP管，每管150-200μL。加入5μL重组质粒L484M-pET28a-M至一管感受态中，轻轻混匀，经过冰上放置45min，42℃水浴90s，冰上放置5min，加入800μL LB，37℃、180r/min培养1.5-2h，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌pXMJ19-H(3)G/E.coli BL21。

实施例3：重组菌pXMJ19-H(3)G/E.coli BL21表达D-氨基酸氧化酶及酶活测定

将实施例2构建的重组菌pXMJ19-H(3)G/E.coli BL21与表达未突变的野生酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的对照菌株pXMJ19-DAAO/E.coli BL21分别接种于l0mL含氯霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于TY发酵培养基中，37℃培养4h后加入0.5mM的IPTG于24度诱导16小时。离心收集细胞并破碎，细胞破碎上清液(粗酶液)用于酶活力的测定。突变体H(3)G大肠杆菌中的表达获得的酶活是野生型的3.4倍且几乎不影响大肠杆菌的生长。

实施例4：重组菌pXMJ19-H(3)G/E.coli BL215L发酵罐放大实验

将实施例2构建的重组菌pXMJ19-H(3)G/E.coli BL21接种于l0mL含氯霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于TY发酵培养基中，37℃培养6h后接种到5L发酵罐TY发酵培养基中培养，培养6h时加入0.2mM的IPTG进行诱导，并同时补料(补料培养基为200g/L甘油，20g/L蛋白胨和40g/L酵母粉)流速为0.3mL/min。诱导24h截止。突变体H(3)G经5L发酵罐发酵最终获得体积酶活为86.8U/mL，体积产率为4.52kU·L^-1·h^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种提高D-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met His His His Gly Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly

1 5 10 15

Val Ile Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser

20 25 30

Val His Ile Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr

35 40 45

Phe Ala Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu

50 55 60

Thr Asp Gly Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys

65 70 75 80

Trp Val Glu Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr

85 90 95

Arg Arg Phe Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys

100 105 110

Asp Ile Thr Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro

115 120 125

Gly Ala Ile Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys

130 135 140

Tyr Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe

145 150 155 160

Glu Arg Arg Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp

165 170 175

Leu Val Val Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile

180 185 190

Asp Asp Gln Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys

195 200 205

Ser Pro Cys Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro

210 215 220

Ala Tyr Ile Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr

225 230 235 240

Tyr Gly Val Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln

245 250 255

Arg Ile Leu Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp

260 265 270

Gly Thr Ile Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg

275 280 285

Pro Ala Arg Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu

290 295 300

Pro Leu Asp Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala

305 310 315 320

Arg Ala Ala Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe

325 330 335

Ser Ser Ala Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala

340 345 350

Gln Leu Val Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu

355 360 365

Ser Lys Leu

370

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile Leu

20 25 30

Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser Pro

35 40 45

Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly Pro

50 55 60

Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu Leu

65 70 75 80

Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe Ala

85 90 95

Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr Pro

100 105 110

Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile Gly

115 120 125

Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln Tyr

130 135 140

Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg Thr

145 150 155 160

Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val Asn

165 170 175

Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln Ala

180 185 190

Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys Lys

195 200 205

Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile Ile

210 215 220

Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val Gly

225 230 235 240

Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu Lys

245 250 255

His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile Glu

260 265 270

Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg Arg

275 280 285

Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp Arg

290 295 300

Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala Lys

305 310 315 320

Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala Gly

325 330 335

Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val Asp

340 345 350

Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365

<210> 3

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcatcatc atggttccca aaagagggtt gtggtgctgg gttccggcgt gataggactc 60

agctccgcgc ttatacttgc ccggaagggg tactccgtcc acatcctggc ccgggacctc 120

ccagaggatg ttagctcaca gaccttcgcg tccccttggg ctggagccaa ctggacccct 180

tttatgaccc tcactgacgg cccgaggcag gcaaagtggg aggagtctac attcaagaag 240

tgggtggaac ttgtgccaac ggggcatgcc atgtggttga agggaaccag gcgtttcgcc 300

caaaatgagg acggactgct cggtcactgg tacaaagata tcacccccaa ttatagaccc 360

ttgccctctt ccgaatgtcc accaggcgct attggcgtga cttatgacac attgtcagtg 420

cacgctccaa agtactgcca atacctcgca agggagctcc agaagctggg ggcgacattc 480

gagcgccgca ccgttacttc cctcgagcaa gcttttgatg gggctgacct cgtcgttaac 540

gcgacggggc tgggtgccaa gtccatcgct ggcatcgatg accaggcggc cgagcctatt 600

cgcggtcaaa cggtgctcgt caagtcgccc tgcaaaaggt gtactatgga cagctcggac 660

ccggcatcac cggcgtacat catcccgcgg ccaggaggcg aagtgatttg cggcggtacg 720

tacggggtcg gagactggga tctctcggtc aacccagaga ccgtccagcg catcctcaaa 780

cactgcctgc gcctggatcc gactatttct tcggacggca caatcgaagg catcgaggtg 840

ctgcggcata acgtcggact cagaccggcg aggaggggag gccctcgcgt tgaagccgag 900

aggattgttc ttccacttga cagaacgaag agccccctct cactgggccg tgggagcgct 960

cgtgcggcca aggagaagga ggtgactttg gtgcatgcct acggtttctc cagcgctggc 1020

tatcaacagt cttggggcgc agccgaagac gtcgcacaat tggtcgatga ggcgtttcag 1080

aggtatcatg gggccgcccg cgagtctaag ctctga 1116

<210> 4

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtcccaaa agagggttgt ggtgctgggt tccggcgtga taggactcag ctccgcgctt 60

atacttgccc ggaaggggta ctccgtccac atcctggccc gggacctccc agaggatgtt 120

agctcacaga ccttcgcgtc cccttgggct ggagccaact ggaccccttt tatgaccctc 180

actgacggcc cgaggcaggc aaagtgggag gagtctacat tcaagaagtg ggtggaactt 240

gtgccaacgg ggcatgccat gtggttgaag ggaaccaggc gtttcgccca aaatgaggac 300

ggactgctcg gtcactggta caaagatatc acccccaatt atagaccctt gccctcttcc 360

gaatgtccac caggcgctat tggcgtgact tatgacacat tgtcagtgca cgctccaaag 420

tactgccaat acctcgcaag ggagctccag aagctggggg cgacattcga gcgccgcacc 480

gttacttccc tcgagcaagc ttttgatggg gctgacctcg tcgttaacgc gacggggctg 540

ggtgccaagt ccatcgctgg catcgatgac caggcggccg agcctattcg cggtcaaacg 600

gtgctcgtca agtcgccctg caaaaggtgt actatggaca gctcggaccc ggcatcaccg 660

gcgtacatca tcccgcggcc aggaggcgaa gtgatttgcg gcggtacgta cggggtcgga 720

gactgggatc tctcggtcaa cccagagacc gtccagcgca tcctcaaaca ctgcctgcgc 780

ctggatccga ctatttcttc ggacggcaca atcgaaggca tcgaggtgct gcggcataac 840

gtcggactca gaccggcgag gaggggaggc cctcgcgttg aagccgagag gattgttctt 900

ccacttgaca gaacgaagag ccccctctca ctgggccgtg ggagcgctcg tgcggccaag 960

gagaaggagg tgactttggt gcatgcctac ggtttctcca gcgctggcta tcaacagtct 1020

tggggcgcag ccgaagacgt cgcacaattg gtcgatgagg cgtttcagag gtatcatggg 1080

gccgcccgcg agtctaagct ctga 1104

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccaagctta aaggagggaa atcatgcatc atcatggttc tcaaaagagg gtt 53

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgggatcctt agagcttaga ctcgcgggc 29

Claims

1.一种D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.一种表达权利要求1所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。

5.一种权利要求4所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法是将核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的基因连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。

7.权利要求1所述的突变体、编码权利要求1所述突变体的基因、含有编码权利要求1所述突变体的基因的载体或者表达权利要求1所述突变体的基因工程菌在与过氧化氢酶组合用于α-酮酸和手性纯L-氨基酸的合成中的应用。

8.权利要求1所述的突变体、编码权利要求1所述突变体的基因、含有编码权利要求1所述突变体的基因的载体或者表达权利要求1所述突变体的基因工程菌在与戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶组合用于7-氨基头孢烷酸的合成中的应用。

9.权利要求1所述的突变体、编码权利要求1所述突变体的基因、含有编码权利要求1所述突变体的基因的载体或者表达权利要求1所述突变体的基因工程菌在制备D-氨基酸检测传感器中的关键酶中的应用。