CN114657199A - 一种重组工程菌及其在制备d-泛酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组工程菌及其在制备D‑泛酸中的应用，将重组工程菌经过诱导表达后与缬氨酸、甲醛、甲酸铵、β‑丙氨酸，在30‑40℃、pH为4‑7条件下，反应10‑60h，制得D‑泛酸。本发明以缬氨酸甲醛和β‑丙氨酸为底物发酵转化生成D‑泛酸，原料价廉易得，反应成本低。

Description

一种重组工程菌及其在制备D-泛酸中的应用
技术领域
本发明涉及生物合成领域，具体涉及一种重组工程菌及其在制备D-泛酸中的应用。
背景技术
泛酸又称维生素B5，为包括人和家畜在内的哺乳动物的必须营养元素，并在机体细胞中用于生物合成辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)，进而参与一百多种细胞代谢反应。现有技术一般用缬氨酸作为底物生产D-泛酸，但存在反应步骤繁琐、反应时间长、转化过程中的辅酶NADPH消耗带来的成本高等缺陷，限制了其产业化应用前景。需要研究更为高效的D-泛酸制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组质粒，包括：
含有L-氨基酸脱氨酶编码基因的第一重组质粒；
和/或，含有醛缩酶编码基因的第二重组质粒；
和/或，含有甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因的第三重组质粒；
和/或，含有泛酸合成酶编码基因的第四重组质粒。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因来源于奇异变形杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因经过密码子优化得到L-氨基酸脱氨酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因1。
本发明优选的技术方案，所述第一重组质粒所采用质粒为pET-28a质粒。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶编码基因来源于大肠杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶编码基因经过密码子优化得到醛缩酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因2。
本发明优选的技术方案，所述第二重组质粒所采用质粒为pET-28a质粒。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶编码基因来源于伯克霍尔德氏菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶编码基因经过密码子优化得到甲酸脱氢酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因3。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶编码基因来源于嗜麦芽窄食单胞菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶编码基因经过密码子优化得到酮泛解酸还原酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因4。
本发明优选的技术方案，所述第三重组质粒所采用质粒为pRSFDUet-I质粒。
本发明优选的技术方案，所述泛酸合成酶编码基因来源于谷氨酸棒杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明优选的技术方案，所述泛酸合成酶编码基因经过密码子优化得到泛酸合成酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述泛酸合成酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。
本发明优选的技术方案，所述泛酸合成酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因5。
本发明优选的技术方案，所述第四重组质粒所采用质粒为pET-28a质粒。
本发明的目的在于提供一种重组工程菌，包括：
含有第一重组质粒的第一重组工程菌，所述第一重组工程菌包括L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
和/或，含有第二重组质粒的第二重组工程菌，所述第二重组工程菌包括醛缩酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
和/或，含有第三重组质粒的第三重组工程菌，所述第三重组工程菌包括甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因，或目的基因3和目的基因4，或如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
和/或，含有第四重组质粒的第四重组工程菌，所述第四重组工程菌包括泛酸合成酶编码基因或目的基因5或如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
本发明优选的技术方案，所述第一重组工程菌的获得方法为：将L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第一重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述第一重组工程菌的获得方法为：将L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到载体pET-28a上，再将所得第一重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到第一重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述第二重组工程菌的获得方法为：将醛缩酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第二重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述第二重组工程菌的获得方法为：将醛缩酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到重组质粒pET-28a上，再将所得第二重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到第二重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述第三重组工程菌的获得方法为：将甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因、或目的基因3和目的基因4、或如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第三重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述第三重组工程菌的获得方法为：
(a)将甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到载体pRSFDUet-I上，获得重组质粒pRSF-fdh；
(b)将酮泛解酸还原酶编码基因或目的基因4或如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列克隆到重组质粒pRSF-fdh上，获得第三重组质粒pRSF-fdh-kur；
(c)将第三重组质粒pRSF-fdh-kur导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到第三重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述第四重组工程菌的获得方法为：将泛酸合成酶编码基因或目的基因5或如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第四重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述第四重组工程菌的获得方法为：将泛酸合成酶编码基因或目的基因5或如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列克隆到重组质粒pET-28a上，再将所得第四重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到第四重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因来源于奇异变形杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶编码基因来源于大肠杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶编码基因来源于伯克霍尔德氏菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶编码基因来源于嗜麦芽窄食单胞菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明优选的技术方案，所述泛酸合成酶编码基因来源于谷氨酸棒杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌在制备D-泛酸中的应用，具体为：本发明所述的第一重组工程菌经过诱导表达后得到菌体一，第二重组工程菌经过诱导表达后得到菌体二，第三重组工程菌经过诱导表达后得到菌体三，第四重组工程菌经过诱导表达后得到菌体四，将菌体一、菌体二、菌体三和菌体四用于制备D-泛酸。
本发明优选的技术方案，所述诱导表达包括下述步骤：
S-1，将重组工程菌按照1-5％接种量接种于LB培养基中，于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-12h，获得种子液；
S-2；将种子液按照1-10％的接种量接种于发酵培养基中，30-40℃、pH 6.0-8.0下培养至发酵液OD值为0.5-2，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其终浓度为0.5-1mM/L，30℃下培养12-24h，收集湿菌体，于-20℃下保存。
本发明优选的技术方案，所述LB培养基的组成包括卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
本发明优选的技术方案，所述发酵培养基的组成包括七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
本发明优选的技术方案，培养温度为30-37℃。
本发明优选的技术方案，转速为100-400rpm，优选为200-300rpm。
本发明优选的技术方案，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6-1。
本发明优选的技术方案，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.6-0.8mM/L。
本发明的另一目的在于提供一种D-泛酸的制备方法，包括下述步骤：加入本发明所述的菌体一、菌体二、菌体三、菌体四，以及缬氨酸、甲醛、甲酸铵、β-丙氨酸为底物，在30-40℃、pH为4-7条件下，反应10-60h，制得D-泛酸。
本发明优选的技术方案，所述菌体一为含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的菌体。
本发明优选的技术方案，所述菌体一为含有L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1的菌体，其中，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明优选的技术方案，反应体系菌体一的OD值为1-15，优选为5-15，更优选为8-12。
本发明优选的技术方案，所述菌体二为含有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的菌体。
本发明优选的技术方案，所述菌体二为含有醛缩酶编码基因，或目的基因2的菌体，其中，所述醛缩酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明优选的技术方案，反应体系菌体二的OD值为1-15，优选为5-15，更优选为8-12。
本发明优选的技术方案，所述菌体三为含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的菌体，其中，所述甲酸脱氢酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述酮泛解酸还原酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
本发明优选的技术方案，所述菌体三为含有甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因，或目的基因3和目的基因4的菌体。
本发明优选的技术方案，反应体系菌体三的OD值为1-15，优选为5-15，更优选为8-12。
本发明优选的技术方案，所述菌体四为含有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的菌体。
本发明优选的技术方案，所述菌体四为含有泛酸合成酶编码基因，或目的基因5的菌体，其中，所述泛酸合成酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明优选的技术方案，反应体系菌体四的OD值为1-15，优选为8-15，更优选为10-14。
本发明优选的技术方案，所述缬氨酸:甲醛:β-丙氨酸的摩尔比为(0.9-1.3):(0.9-1.2):1，优选为(1.0-1.2):(1.0-1.1):1。
本发明优选的技术方案，甲酸铵以流加方式进行添加。
本发明优选的技术方案，甲酸铵的浓度为1.5g/L-2.5g/L，优选为1.8g/L-2.2g/L。
本发明的优选技术方案中，反应体系中还可加入金属盐或磷酸盐溶液。
本发明的优选技术方案中，所述金属盐或磷酸盐选自锌盐、钙盐、铜盐中的任一种或其组合，优选为氯化锌、氯化钙、氯化铜、硫酸锌、硫酸钙、硫酸铜、磷酸镁、磷酸锌、磷酸钙、磷酸铜、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述金属盐或磷酸盐溶液浓度为0-50mmol/L，优选为1～40mol/L，更优选为5～30mol/L。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Zn2+浓度为0～15mM，优选为5～10mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Cu2+浓度为0～15mM，优选为5～10mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Ca2+浓度为0-9mM，优选为2-7mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Mg2+浓度为0-9mM，优选为2-7mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Na+浓度为0-9mM，优选为2-7mM。
本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液的PO4 3-浓度为0-21mM，优选浓度为0-15mM，优选为2-10mM。
本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液中的H PO4 2-浓度为0～15mM，优选为2～10mM。
本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液中的H2PO4 -浓度为0～15mM，优选为2～10mM。本发明优选的技术方案，反应温度为35～38℃。
本发明优选的技术方案，反应时间为20-40h。
本发明优选的技术方案，反应体系pH 5-7。
本发明的优选方案中，用于调节反应体系pH的pH调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙胺、氢氧化钾、磷酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硫酸的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种如上所述的方法制备得到的D-泛酸在制备D-泛酸钙中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明按照下述方法检测转化率和收率。
1.酶活
酶活为酶活力的度量单位，单位为U。在本申请中，定义1个酶活单位表示1ml底物溶液在1分钟内转化生成1umolD-泛酸的酶量。
2.转化率
分别在转化时间T＝0和T＝m(m为大于0的任一数值)时，取反应液稀释100倍，过滤后HPLC检测，分别记录缬氨酸浓度为S0和Sm，以及在T＝m时D-泛酸浓度为Nm。
转化率(m时刻)＝(Nm*0.534)/(S0-SM)
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、首次成功构建生物合成D-泛酸的基因工程菌，以缬氨酸为底物，加入丙氨酸，发酵转化生成D-泛酸，原料价廉易得，反应成本低。
2、本发明通过增加辅酶循环达到辅酶NADPH再生，降低生产成本。
3、本发明催化甲酸生成二氧化碳，直接从反应体系中出去，促使反应正向进行，减化提取过程。
附图说明
图1为本发明实施例的技术原理示意图
图2试验例1-6和对比例1的D-泛酸转化率
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用的目的基因和引物序列如下表所示(下划线部位为酶切位点)。
实施例1构建表达L-氨基酸脱氨酶的第一重组工程菌
步骤一，将来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶编码基因(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到L-氨基酸脱氨酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；
将所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列送至人工合成，并加上XhoI与NdeI酶切位点，得到目的基因1。
步骤二，以目的基因1的DNA分子为模板，采用引物对LA-for和LA-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因1的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
LA-for：GGAATTCCATATGATGGCTATAAGTAGGAGAAAATTTATTC；
LA-rev：CCGCTCGAGAAAGCGGTACAAGCTGAACGG。
PCR体系如下：
Figure BDA0003288740220000141
过程如下：
95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤三，用限制性内切酶XhoI与NdeI双酶切pET-28a质粒和目的基因1的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物(命名为pET-28a-LA)转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-28a-LA。
实施例2构建表达醛缩酶的第二重组工程菌
步骤一，将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的醛缩酶编码基因序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到醛缩酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
将所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列送至人工合成，并加上XhoI与NdeI酶切位点，得到目的基因2。
步骤二，以目的基因2的DNA分子为模板，采用引物对ald-for和ald-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因2的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
ald-for：
GGAATTCCATATGATGAAAAACTGGAAAACAAGTGCAGAATCAATC
ald-rev：CCGCTCGAGCAGCTTAGCGCCTTCTACAGCTTCAC。
PCR体系如下：
Figure BDA0003288740220000151
PCR过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤三，用限制性内切酶双酶切质粒pET-28a和目的基因2的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物pET-28a-ald转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-28a-ald。
实施例3构建共表达甲酸脱氢酶和酮泛解酸还原酶的第三重组工程菌
步骤一，将来源于伯克霍尔德氏菌(burkholderia stabilis)的甲酸脱氢酶编码基因序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到甲酸脱氢酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；
将来源于嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的酮泛解酸还原酶编码基因序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到酮泛解酸还原酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
将所述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列送至人工合成，分别加上BamHI与NotI酶切位点，XhoI与NdeI酶切位点，得到目的基因3和目的基因4。
步骤二，以目的基因3的DNA分子为模板，采用引物对fdh-for和fdh-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因3的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
fdh-for：CGGGATCCATGGCTACCGTTCTGTGCGTTC
fdh-rev：ATAAGAATGCGGCCGCGGTCAGACGGTAAGACTG
PCR体系如下：
Figure BDA0003288740220000171
PCR过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min10s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
以目的基因4的DNA分子为模板，采用引物对kur-for和kur-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因4的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
kur-for：GGAATTCCATATGATGACCCAGCAACGGTGGCGCC
kur-rev：CCGCTCGAGTCAGAACCCGTAGCGCAGG
PCR体系如下：
Figure BDA0003288740220000172
Figure BDA0003288740220000181
PCR过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸50s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤三，用限制性内切酶双酶切pRSFDUet-I质粒和目的基因3的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物pRSF-fdh转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-pRSF-fdh。
用限制性内切酶双酶切重组质粒pRSF-fdh和目的基因4的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物pRSF-fdh-kur转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-pRSF-fdh-kur。
实施例4构建表达泛酸合成酶的第四重组工程菌
步骤一，将来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)编码基因(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到泛酸合成酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；
将所述SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列送至人工合成，并加上XhoI与NdeI酶切位点，得到目的基因5。
步骤二，以目的基因5的DNA分子为模板，采用引物对panc-for和panc-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因5的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
panc-for：GGAATTCCATATG ATGCAGGTTGCAACCACC
panc-rev：CCGCTCGAGTTACAGTTCAATATTATCAATCAGGCGAACC
PCR体系如下：
Figure BDA0003288740220000191
PCR过程如下：
95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤三，用限制性内切酶双酶切pET-28a质粒和目的基因5的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物(命名为pET-28a-panc)转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-28a-panc。
实施例5第一重组工程菌E-28a-LA的诱导表达
将实施例1制备的第一重组工程菌E-28a-LA按2％的接种量接种于LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床培养8h；获得种子液。LB培养基的组成如下：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
按照2％的接种量将种子接种于10L发酵罐中，发酵罐中含6L发酵培养基，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其终浓度为0.5mM/L，30℃下培养18h；收集湿菌体，为菌体一，于-20℃下保存。发酵培养基的组成如下：七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
实施例6第二重组工程菌E-28a-ald的诱导表达
将实施例2中的第二重组工程菌E-28a-ald按2％的接种量接种于LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床培养8h；LB培养基的组成如下：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
按照2％的接种量将种子接种于10L发酵罐中，发酵罐中含6L发酵培养基，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6，加入IPTG至其终浓度为0.5mM/L，30℃下培养18h；收集湿菌体，为菌体二，于-20℃下保存。发酵培养基的组成如下：七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
实施例7第三重组工程菌E-pRSF-fdh-kur的诱导表达
将实施例3中的第三重组工程菌E-pRSF-fdh-kur按2％的接种量接种于LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床培养8h；LB培养基的组成如下：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
按照2％的接种量将种子接种于10L发酵罐中，发酵罐中含6L发酵培养基，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6，加入IPTG至其终浓度为0.5mM/L，30℃下培养18h；收集湿菌体，为菌体三，于-20℃下保存。发酵培养基的组成如下：七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
实施例8第四重组工程菌E-28a-panc的诱导表达
将实施例4中的第四重组工程菌E-28a-panc按2％的接种量接种于LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床培养8h；LB培养基的组成如下：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
按照2％的接种量将种子接种于10L发酵罐中，发酵罐中含6L发酵培养基，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6，加入IPTG至其终浓度为0.5mM/L，30℃下培养18h；收集湿菌体，为菌体四，于-20℃下保存。发酵培养基的组成如下：七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
将实施例5得到的菌体一、实施例6得到的菌体二、实施例7得到的菌体三、实施例8得到的菌体四用于试验例1-6制备D-泛酸。
试验例1
向反应容器中加入缬氨酸300g，甲醛69.07g，β-丙氨酸196.89g，菌体一、菌体二、菌体三、菌体四，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，菌体四的OD值为10，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应24h，得到D-泛酸溶液，经检测，D-泛酸转化率见图2。
试验例2
对菌体一、菌体二、菌体三、菌体四进行破碎处理，分别获得L-氨基酸脱氨酶、醛缩酶、甲酸脱氢酶、酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶。向反应容器中加入缬氨酸300g，甲醛69.07g，β-丙氨酸196.89g，L-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶、醛缩酶、酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶。加水至总体积为5L，搅拌溶解，使得溶液中L-氨基酸脱氨酶的酶活为12U/L、醛缩酶的酶活为10U/L、甲酸脱氢酶的酶活为10U/L，酮泛解酸还原酶的酶活为10U/L，泛酸合成酶的酶活为12U/L。维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到D-泛酸溶液，经检测，D-泛酸转化率见图2。
试验例3
向反应容器中加入缬氨酸300g，甲醛69.07g，β-丙氨酸196.89g，菌体一、菌体二、菌体三、菌体四，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，菌体四的OD值为12，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应24h，得到D-泛酸溶液，经检测，D-泛酸转化率见图2。
试验例4
向反应容器中加入缬氨酸300g，甲醛69.07g，β-丙氨酸196.89g，菌体一、菌体二、菌体三、菌体四，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，菌体四的OD值为14，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应24h，得到D-泛酸溶液，经检测，D-泛酸转化率见图2。
试验例5
向反应容器中加入缬氨酸300g，甲醛69.07g，β-丙氨酸196.89g，氯化锌4g，菌体一、菌体二、菌体三、菌体四，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，菌体四的OD值为14，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应24h，得到D-泛酸溶液，经检测，D-泛酸转化率见图2。
试验例6
向反应容器中加入缬氨酸300g，甲醛69.07g，β-丙氨酸196.89g，磷酸氢二钠7g，菌体一、菌体二、菌体三、菌体四，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，菌体四的OD值为12，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应24h，得到D-泛酸溶液，经检测，D-泛酸转化率见图2。
对比例1
向反应容器中加入缬氨酸300g、甲醛69.07g、复合酶、β-丙氨酸196.89g，加水至总体积为5L，搅拌溶解，使得反应体系中：过氧化氢酶10U/L，酮异戊酸还原酶10U/L，羟甲基转移酶12U/L，甲酸脱氢酶12U/L，泛酸合成酶12U/L，流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应30h，得到D-泛酸溶液，经检测，D-泛酸转化率见图2。
序列表
<110> 安徽华恒生物科技股份有限公司
合肥华恒生物工程有限公司
<120> 一种重组工程菌及其在制备D-泛酸中的应用
<150> 2020115243834
<151> 2020-12-22
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctatat caagaaggaa atttattcta ggtggcacgg tggtggccgt tgctgcgggc 60
gcgggcgttt tgaccccgat gctgacccgt gaaggtcgtt tcgtgccggg tactccgcgc 120
cacggctttg tggagggtac tggtggtcca ctgccaaaac aagatgatgt tgtggtcatt 180
ggcgcgggca tcctcgggat catgactgcg attaacctgg cggaacgtgg cctgagcgtt 240
acgattgttg aaaaaggtaa tattgcaggc gaacaatcca gccgcttcta tggtcaggcg 300
atcagctaca aaatgccgga cgaaacgttt ctgctgcatc acctgggtaa gcaccgttgg 360
cgtgagatga acgcgaaagt tggcatcgac accacgtacc gcacccaggg acgtgttgag 420
gttccgcttg acgaggagga tctggagaat gttcgtaaat ggattgacgc caaatccaaa 480
gatgtgggtt ctgacatccc gttccgcact aaaatgattg aaggtgctga gctgaagcaa 540
cgtctgagag gcgccaccac cgattggaaa attgcaggct tcgaagagga cagcggttcg 600
ttcgatccgg aggtggctac gttcgtgatg gcagaatacg ccaaaaagat gggcatcaag 660
atctttacca actgcgcagc gcgtggcctg gaaacccaag cgggggtgat cagcgacgtg 720
gtgaccgaaa agggtccgat taaaaccagc cgtgttgttg tcgcgggcgg tgtcggttct 780
cgcctgttta tgcagaattt gaatgtcgat gttccgaccc taccggcgta tcagtcgcaa 840
caactgatca gcgccgctcc gaatgcgcct ggtggcaacg tggcgttgcc gggcggtatc 900
ttttttcgtg atcaggcgga cggcacctat gcaacgagcc cgcgcgttat cgtcgctccg 960
gttgtaaagg agtctttcac ctacggctat aaatacctgc cgctcctggc attgccggac 1020
tttccggtcc acatttcctt gaatgaacag ctgatcaaca gcttcatgca gtccacccat 1080
tgggatttga acgaagaaag tccgttcgag aagtaccgtg atatgaccgc cctgccagat 1140
ctgccggaac tgaacgcgag cctggagaag ttgaagaagg agttcccggc atttaaagag 1200
tcaacgttaa ttgaccagtg gagcggtgct atggcgattg cgccagacga gaacccgatc 1260
atctccgacg ttaaggagta cccgggtctg gtgatcaaca ccgcgaccgg ttggggtatg 1320
accgaatctc cggtgagcgc agaaattacc gcggatttgc tgcttggtaa gaagccggta 1380
ctcgacgcaa agccgttttc gctgtatcgc ttc 1413
<210> 2
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaaatt ggaagacatc agctgaaagt atcctgacga ccggtccggt cgttccggtt 60
attgtggtga agaagttgga gcacgctgtg ccgatggcca aggctctggt ggccggtggt 120
gttcgtgttc tggaggtgac gctgcgtacc gagtgcgcag tcgatgccat ccgcgcaatt 180
gctaaggagg tgccggaagc gatcgttggt gctggcaccg ttctcaaccc gcagcaactg 240
gcagaagtaa ctgaggcggg cgcgcagttt gcaatctctc cgggtttgac cgagccgttg 300
ctcaaggccg caaccgaggg caccattccg ctgattccgg ggatctcgac cgtgagcgaa 360
ctgatgctgg gtatggacta cggcctgaaa gaatttaaat tcttcccggc ggaagcgaat 420
ggtggcgtga aagcgctgca agcgatcgcg ggccctttta gccaggttcg cttctgcccg 480
acgggcggca tctccccggc gaactataga gactacctgg cgttaaaaag cgtcctgtgt 540
attggtggta gctggctggt tccagcggat gcgttggagg ctggcgacta tgatcgtatt 600
accaaacttg cgcgtgaagc ggtggaaggt gccaagttg 639
<210> 3
<211> 1152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctacag tactatgtgt tttatatccc gacccggttg acggctaccc gcctcactac 60
gtgcgcgaca ccataccggt catcacccgt tacgcggacg gccagaccgc gccgacccca 120
gccggcccac cgggttttcg tccgggtgag ttggtgggca gcgtttccgg gcttggtctg 180
cgtggctatt tggaggccca cggtcacacc ctgatcgtta ccagcgacaa ggacggtccg 240
gacagcgaat ttgaacgtcg tctgccggat gctgatgtgg tgatttccca gcctttctgg 300
cctgcctact tgactgccga gcgcattgca cgcgcgccaa agctgcgctt ggcgctgacc 360
gcaggtattg gtagcgatca tgttgatctg gacgctgccg cgcgcgcgca catcaccgtg 420
gcggaggtga cgggtagcaa tagcattagt gttgctgagc acgttgttat gaccactctg 480
gcgttggttc gcaactattt accgtcccat gccatcgccc aacagggtgg catgaatatt 540
gcggattgcg tttctagatc ctacgacgtg gaaggtatgc attttggtac ggtcggggca 600
ggccgtatcg gccttgcggt actgcgtcgt ttaccgttcg gtctgcactt gcactatacc 660
caacgtcatc gtcttgatgc ggcgattgaa caagagctgg gtctgacgta tcatgcagat 720
ccggctagcc tggctgcggc ggtagacatc gtgaacctgc agattccgct gtatccgtcg 780
accgaacacc tattcgacgc ggcaatgatt gcccgtatga aacgtggtgc gtacctgatc 840
aacaccgctc gcgcgaaact ggtggatcgt gatgcggtcg tgagagcggt cacgtcaggt 900
catctcgctg gttacggcgg tgatgtttgg ttcccgcagc cggctccggc ggaccacccg 960
tggcgtgcga tgccgttcaa cggtatgacc ccgcatatct ctggcacttc tctgagcgca 1020
caggcacgct acgcagctgg caccctggag atcctgcaat gttggtttga tggccgtccg 1080
attcgtaatg aatatctgat cgtggacggc ggaacattgg cgggcacggg tgcacaaagc 1140
tatcgtttga cc 1152
<210> 4
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgacacagc aaagatggag gctagatgga caaaccgcgc tgatcaccgg tgcctccgct 60
ggcatcggcc tggcgattgc ccacgaatta gcaggtttcg gtgctgatct gatgatcgtt 120
ggtcgtgaca tcgatatgct ggaaaccgct agagacgagc tcttggacgt gtacccgcag 180
atgcaggttc atgcgctggc tgcggatgtt tccgacgacg aggatcgtcg ccaaattctg 240
gactgggtcg aggaccactc cgacggcctg cacatcttgg tcaacaacgc tggcggtaat 300
gttaccaaag cagccaccga atatagcgaa gatgagtggc gtaaaatctt tgagacaaat 360
ttgtttagcg cgtttgagtt gtctcgttac gcgcacccgc tgctggcgcg ccacgcgagc 420
agcagcattg tgaacgtagg tagcgtttct ggtttgaccc atgttcgttc tggcgttgtt 480
tatggcatga gcaaggcggc tatgcatcag atgacccgta atctggcggt ggagtgggca 540
gaagacggta ttcgtgttaa cgcagtggca ccgtggtata tccgcacgcg tcgcacgagc 600
ggcccactga gcgatccgga ttactacgag gaagtgatca accgcacccc gatgcgtcgt 660
attggtgaac cggaagaggt cgcggcggcg gtgggcttcc tttgcctgcc ggcagcgagc 720
tatgtgactg gtgaatgtat tgcggtggat ggtggtttcc tgcgttacgg cttctaa 777
<210> 5
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcaggttg caaccaccaa acaggcactg attgatgccc tgctgcatca taaaagcgtt 60
ggcctggttc cgaccatggg tgccctgcat agcggtcatg ccagtctggt taaagcagca 120
cgtgcagaaa atgataccgt tgttgcaagc atttttgtta atccgctgca gtttgaagcc 180
ctgggcgatt gcgatgatta tcgcaattat ccgcgccagc tggatgccga tctggcactg 240
ctggaagaag ccggcgtgga tattgtgttt gcaccggatg tggaagaaat gtatccgggc 300
ggcctgccgc tggtgtgggc acgtacaggt agtattggta ccaaactgga aggcgccagt 360
cgtccgggcc attttgatgg cgtggcaacc gttgtggcaa aactgtttaa tctggtgcgc 420
ccggatcgtg cctattttgg ccagaaagat gcccagcagg tggccgtgat tcgtcgcctg 480
gtggcagatc tggatattcc ggtggaaatt cgtccggttc cgattattcg tggcgcagat 540
ggcctggccg aaagtagtcg taatcagcgt ctgagcgcag atcagcgcgc ccaggcactg 600
gttctgccgc aggtgctgag cggtctgcag cgtcgcaaag cagcaggcga agcactggat 660
attcagggcg cccgcgatac cctggcaagt gccgatggtg tgcgcctgga tcatctggaa 720
attgtggatc cggccaccct ggaaccgctg gaaattgatg gtctgctgac ccagccggca 780
ctggtggtgg gcgcaatttt tgttggtccg gttcgcctga ttgataatat tgaactgtaa 840
<210> 6
<211> 471
<212> PRT
<213> Proteus mirabilis
<400> 6
Met Ala Ile Ser Arg Arg Lys Phe Ile Leu Gly Gly Thr Val Val Ala
1 5 10 15
Val Ala Ala Gly Ala Gly Val Leu Thr Pro Met Leu Thr Arg Glu Gly
20 25 30
Arg Phe Val Pro Gly Thr Pro Arg His Gly Phe Val Glu Gly Thr Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Lys Gln Asp Asp Val Val Val Ile Gly Ala Gly Ile
50 55 60
Leu Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Leu Ser Val
65 70 75 80
Thr Ile Val Glu Lys Gly Asn Ile Ala Gly Glu Gln Ser Ser Arg Phe
85 90 95
Tyr Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Lys Met Pro Asp Glu Thr Phe Leu Leu
100 105 110
His His Leu Gly Lys His Arg Trp Arg Glu Met Asn Ala Lys Val Gly
115 120 125
Ile Asp Thr Thr Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Val Pro Leu Asp
130 135 140
Glu Glu Asp Leu Glu Asn Val Arg Lys Trp Ile Asp Ala Lys Ser Lys
145 150 155 160
Asp Val Gly Ser Asp Ile Pro Phe Arg Thr Lys Met Ile Glu Gly Ala
165 170 175
Glu Leu Lys Gln Arg Leu Arg Gly Ala Thr Thr Asp Trp Lys Ile Ala
180 185 190
Gly Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Phe Asp Pro Glu Val Ala Thr Phe
195 200 205
Val Met Ala Glu Tyr Ala Lys Lys Met Gly Ile Lys Ile Phe Thr Asn
210 215 220
Cys Ala Ala Arg Gly Leu Glu Thr Gln Ala Gly Val Ile Ser Asp Val
225 230 235 240
Val Thr Glu Lys Gly Pro Ile Lys Thr Ser Arg Val Val Val Ala Gly
245 250 255
Gly Val Gly Ser Arg Leu Phe Met Gln Asn Leu Asn Val Asp Val Pro
260 265 270
Thr Leu Pro Ala Tyr Gln Ser Gln Gln Leu Ile Ser Ala Ala Pro Asn
275 280 285
Ala Pro Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Gly Gly Ile Phe Phe Arg Asp
290 295 300
Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Thr Ser Pro Arg Val Ile Val Ala Pro
305 310 315 320
Val Val Lys Glu Ser Phe Thr Tyr Gly Tyr Lys Tyr Leu Pro Leu Leu
325 330 335
Ala Leu Pro Asp Phe Pro Val His Ile Ser Leu Asn Glu Gln Leu Ile
340 345 350
Asn Ser Phe Met Gln Ser Thr His Trp Asp Leu Asn Glu Glu Ser Pro
355 360 365
Phe Glu Lys Tyr Arg Asp Met Thr Ala Leu Pro Asp Leu Pro Glu Leu
370 375 380
Asn Ala Ser Leu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Phe Pro Ala Phe Lys Glu
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Ser Thr Leu Ile Asp Gln Trp Ser Gly Ala Met Ala Ile Ala Pro Asp
405 410 415
Glu Asn Pro Ile Ile Ser Asp Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile
420 425 430
Asn Thr Ala Thr Gly Trp Gly Met Thr Glu Ser Pro Val Ser Ala Glu
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Ile Thr Ala Asp Leu Leu Leu Gly Lys Lys Pro Val Leu Asp Ala Lys
450 455 460
Pro Phe Ser Leu Tyr Arg Phe
465 470
<210> 7
<211> 213
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 7
Met Lys Asn Trp Lys Thr Ser Ala Glu Ser Ile Leu Thr Thr Gly Pro
1 5 10 15
Val Val Pro Val Ile Val Val Lys Lys Leu Glu His Ala Val Pro Met
20 25 30
Ala Lys Ala Leu Val Ala Gly Gly Val Arg Val Leu Glu Val Thr Leu
35 40 45
Arg Thr Glu Cys Ala Val Asp Ala Ile Arg Ala Ile Ala Lys Glu Val
50 55 60
Pro Glu Ala Ile Val Gly Ala Gly Thr Val Leu Asn Pro Gln Gln Leu
65 70 75 80
Ala Glu Val Thr Glu Ala Gly Ala Gln Phe Ala Ile Ser Pro Gly Leu
85 90 95
Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Ala Thr Glu Gly Thr Ile Pro Leu Ile
100 105 110
Pro Gly Ile Ser Thr Val Ser Glu Leu Met Leu Gly Met Asp Tyr Gly
115 120 125
Leu Lys Glu Phe Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Asn Gly Gly Val Lys
130 135 140
Ala Leu Gln Ala Ile Ala Gly Pro Phe Ser Gln Val Arg Phe Cys Pro
145 150 155 160
Thr Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asn Tyr Arg Asp Tyr Leu Ala Leu Lys
165 170 175
Ser Val Leu Cys Ile Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Ala Asp Ala Leu
180 185 190
Glu Ala Gly Asp Tyr Asp Arg Ile Thr Lys Leu Ala Arg Glu Ala Val
195 200 205
Glu Gly Ala Lys Leu
210
<210> 8
<211> 384
<212> PRT
<213> burkholderia stabilis
<400> 8
Met Ala Thr Val Leu Cys Val Leu Tyr Pro Asp Pro Val Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Pro Pro His Tyr Val Arg Asp Thr Ile Pro Val Ile Thr Arg Tyr Ala
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Ala Pro Thr Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Arg Pro
35 40 45
Gly Glu Leu Val Gly Ser Val Ser Gly Leu Gly Leu Arg Gly Tyr Leu
50 55 60
Glu Ala His Gly His Thr Leu Ile Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro
65 70 75 80
Asp Ser Glu Phe Glu Arg Arg Leu Pro Asp Ala Asp Val Val Ile Ser
85 90 95
Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Arg Ile Ala Arg Ala
100 105 110
Pro Lys Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val
115 120 125
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala His Ile Thr Val Ala Glu Val Thr
130 135 140
Gly Ser Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Thr Leu
145 150 155 160
Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Ala Ile Ala Gln Gln Gly
165 170 175
Gly Met Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser Arg Ser Tyr Asp Val Glu Gly
180 185 190
Met His Phe Gly Thr Val Gly Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu
195 200 205
Arg Arg Leu Pro Phe Gly Leu His Leu His Tyr Thr Gln Arg His Arg
210 215 220
Leu Asp Ala Ala Ile Glu Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr His Ala Asp
225 230 235 240
Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ala Val Asp Ile Val Asn Leu Gln Ile Pro
245 250 255
Leu Tyr Pro Ser Thr Glu His Leu Phe Asp Ala Ala Met Ile Ala Arg
260 265 270
Met Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Ala Lys Leu Val
275 280 285
Asp Arg Asp Ala Val Val Arg Ala Val Thr Ser Gly His Leu Ala Gly
290 295 300
Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp His Pro
305 310 315 320
Trp Arg Ala Met Pro Phe Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly Thr
325 330 335
Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Leu Glu Ile Leu
340 345 350
Gln Cys Trp Phe Asp Gly Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile Val
355 360 365
Asp Gly Gly Thr Leu Ala Gly Thr Gly Ala Gln Ser Tyr Arg Leu Thr
370 375 380
<210> 9
<211> 258
<212> PRT
<213> Stenotrophomonas
<400> 9
Met Thr Gln Gln Arg Trp Arg Leu Asp Gly Gln Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala His Glu Leu Ala Gly
20 25 30
Phe Gly Ala Asp Leu Met Ile Val Gly Arg Asp Ile Asp Met Leu Glu
35 40 45
Thr Ala Arg Asp Glu Leu Leu Asp Val Tyr Pro Gln Met Gln Val His
50 55 60
Ala Leu Ala Ala Asp Val Ser Asp Asp Glu Asp Arg Arg Gln Ile Leu
65 70 75 80
Asp Trp Val Glu Asp His Ser Asp Gly Leu His Ile Leu Val Asn Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Asn Val Thr Lys Ala Ala Thr Glu Tyr Ser Glu Asp Glu
100 105 110
Trp Arg Lys Ile Phe Glu Thr Asn Leu Phe Ser Ala Phe Glu Leu Ser
115 120 125
Arg Tyr Ala His Pro Leu Leu Ala Arg His Ala Ser Ser Ser Ile Val
130 135 140
Asn Val Gly Ser Val Ser Gly Leu Thr His Val Arg Ser Gly Val Val
145 150 155 160
Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala Met His Gln Met Thr Arg Asn Leu Ala
165 170 175
Val Glu Trp Ala Glu Asp Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Ala Pro Trp
180 185 190
Tyr Ile Arg Thr Arg Arg Thr Ser Gly Pro Leu Ser Asp Pro Asp Tyr
195 200 205
Tyr Glu Glu Val Ile Asn Arg Thr Pro Met Arg Arg Ile Gly Glu Pro
210 215 220
Glu Glu Val Ala Ala Ala Val Gly Phe Leu Cys Leu Pro Ala Ala Ser
225 230 235 240
Tyr Val Thr Gly Glu Cys Ile Ala Val Asp Gly Gly Phe Leu Arg Tyr
245 250 255
Gly Phe
<210> 10
<211> 279
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
<400> 10
Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His
1 5 10 15
His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly
20 25 30
His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val
35 40 45
Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys
50 55 60
Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu
65 70 75 80
Leu Glu Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu
85 90 95
Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile
100 105 110
Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val
115 120 125
Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala
130 135 140
Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu
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Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile
165 170 175
Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser
180 185 190
Ala Asp Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly
195 200 205
Leu Gln Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala
210 215 220
Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu
225 230 235 240
Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu
245 250 255
Thr Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg
260 265 270
Leu Ile Asp Asn Ile Glu Leu
275

Claims (10)

1.一种重组质粒，包括：
含有L-氨基酸脱氨酶编码基因的第一重组质粒；
和/或，含有醛缩酶编码基因的第二重组质粒；
和/或，含有甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因的第三重组质粒；
和/或，含有泛酸合成酶编码基因的第四重组质粒。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其中，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因来源于奇异变形杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，优选的，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因经过密码子优化得到L-氨基酸脱氨酶优化基因序列，所述L-氨基酸脱氨酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，更优选的，所述L-氨基酸脱氨酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因1；
和/或，
所述醛缩酶编码基因来源于大肠杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；优选的，所述醛缩酶编码基因经过密码子优化得到醛缩酶优化基因序列，所述醛缩酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，更优选的，所述醛缩酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因2；
和/或，
所述甲酸脱氢酶编码基因来源于伯克霍尔德氏菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；优选的，所述甲酸脱氢酶编码基因经过密码子优化得到甲酸脱氢酶优化基因序列，所述甲酸脱氢酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；更优选的，所述甲酸脱氢酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因3；
和/或，所述酮泛解酸还原酶编码基因来源于嗜麦芽窄食单胞菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；优选的，所述酮泛解酸还原酶编码基因经过密码子优化得到酮泛解酸还原酶优化基因序列，所述酮泛解酸还原酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；更优选的，所述酮泛解酸还原酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因4；
和/或，所述泛酸合成酶编码基因来源于谷氨酸棒杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示；优选的，所述泛酸合成酶编码基因经过密码子优化得到泛酸合成酶优化基因序列，所述泛酸合成酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；更优选的，所述泛酸合成酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因5。
3.一种重组工程菌，包括：
含有第一重组质粒的第一重组工程菌，所述第一重组工程菌包括L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
和/或，含有第二重组质粒的第二重组工程菌，所述第二重组工程菌包括醛缩酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
和/或，含有第三重组质粒的第三重组工程菌，所述第三重组工程菌包括甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因，或目的基因3和目的基因4，或如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列；
和/或，含有第四重组质粒的第四重组工程菌，所述第四重组工程菌包括泛酸合成酶编码基因或目的基因5或如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其中，所述第一重组工程菌的获得方法为：将L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第一重组工程菌；
和/或，所述第二重组工程菌的获得方法为：将醛缩酶编码基因或目的基因2或如SEQID NO：2所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第二重组工程菌；
和/或，所述第三重组工程菌的获得方法为：将甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因、或目的基因3和目的基因4、或如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第三重组工程菌；
和/或，所述第四重组工程菌的获得方法为：将泛酸合成酶编码基因或目的基因5或如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第四重组工程菌。
5.一种重组工程菌在制备D-泛酸中的应用，具体为：将权利要求3-4任一项所述的第一重组工程菌经过诱导表达后得到菌体一，第二重组工程菌经过诱导表达后得到菌体二，第三重组工程菌经过诱导表达后得到菌体三，第四重组工程菌经过诱导表达后得到菌体四，将菌体一、菌体二、菌体三和菌体四用于制备D-泛酸。
6.一种D-泛酸的制备方法，包括下述步骤：加入本发明所述的菌体一、菌体二、菌体三、菌体四，以及缬氨酸、甲醛、甲酸铵、β-丙氨酸为底物，在30-40℃、pH为4-7条件下，反应10-60h，制得D-泛酸。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，反应体系菌体一的OD值为1-15，优选为5-15，更优选为8-12；
反应体系菌体二的OD值为1-15，优选为5-15，更优选为8-12；
反应体系菌体三的OD值为1-15，优选为5-15，更优选为8-12；
反应体系菌体四的OD值为1-15，优选为8-15，更优选为10-14。
8.根据权利要求6-7任一项所述的制备方法，其中，所述缬氨酸:甲醛:β-丙氨酸的摩尔比为(0.9-1.3):(0.9-1.2):1，优选为(1.0-1.2):(1.0-1.1):1。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，甲酸铵以流加方式进行添加，优选的，甲酸铵的浓度为1.5g/L-2.5g/L，更优选为1.8g/L-2.2g/L。
10.一种根据权利要求6-9任一项所述的制备方法制得的D-泛酸在制备D-泛酸钙中的应用。
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