CN115044594A - 一种重组工程菌及其用于高效转化l-泛解酸内酯的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组工程菌及其用于高效转化L‑泛解酸内酯的应用，所述重组工程菌经诱导后高效表达L‑泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶，高效转化L‑泛解酸内酯生成DL‑泛解酸内酯。本发明的重组工程菌显著提高DL‑泛解酸内酯的纯度和质量、反应效率和资源利用率，降低生产成本，具有操作简便、绿色环保等优点。

Description

一种重组工程菌及其用于高效转化L-泛解酸内酯的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组工程菌及其用于高效转化L-泛解酸内酯的应用。
背景技术
D-泛解酸内酯为用于合成维生素类药D-泛醇及神经营养药D-高泛酸钙的医药中间体，并用作饲料添加剂和日化产品的合成前体，年产量超过上万吨。工业制备D-泛解酸内酯常采用化学法和拆分法相结合的方法，包括下述步骤：异丁醛和甲醛发生羟醛缩合生成羟基特戊醛，再和氰基反应生成氰醛，水解生成DL-泛解酸内酯外消旋体，采用化学拆分和酶拆分，制得D-泛解酸内酯。但拆分产生大量L-泛解酸内酯，如不合理利用将造成资源浪费，增加生产成本。
《化学酶法合成D-泛解酸内酯的研究进展》(汪钊等，发酵科技通讯，第45卷第4期)公开了DL-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯脱氢酶生成酮泛解酸内酯，再经酮泛解酸内酯还原酶还原得到D-泛解酸内酯，该方法中L-泛解酸内酯脱氢酶的脱氢效率低。还公开了L-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯脱氢酶反应得到酮泛解酸内酯，自发水解生成酮泛解酸，再经酮泛解酸还原酶还原得到D-泛解酸，酸性闭环，制得D-泛解酸内酯。该方法因L-泛解酸内酯脱氢酶的反应效率低下，且自发水解在实际实验中较难控制，基本未得到D-泛解酸内酯，实验难以重现。
CN110423717A公开了一种多酶重组细胞及多酶级联催化合成D-泛解酸内酯的方法，该方法使用L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶组成的三元复合酶转化生产D-泛解酸内酯。但葡萄糖脱氢酶易诱导生成反应副产物葡萄糖酸，导致D-泛解酸内酯的分离困难，且产生大量废料，增加处理困难。为此，需要开发高转化率的D-泛解酸内酯制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组载体，所述重组载体选自含有L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组载体。
本发明的优选技术方案中，L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示分别在第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体和第四重组载体上。
本发明的优选技术方案中，所述重组载体任选地包括第四重组载体或第五重组载体的任一种，其中，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第五重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的优选技术方案中，所述重组载体选自第一重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明优选的技术方案中，所述重组载体用于L-泛解酸内酯制备DL-泛解酸内酯。
本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体包括L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因，优选所述L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因源自红串红球菌、红球菌、分支杆菌、诺卡氏菌、链霉菌、放线菌中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到L-泛解酸内酯脱氢酶基因序列。
本发明优选的技术方案中，酶切位点选自XhoI、NdeI的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因1，所述目的基因1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因源自木兰假丝酵母、小单孢菌、链霉菌中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到酮泛解酸内酯还原酶基因序列。
本发明优选的技术方案中，酶切位点选自SacI、NotI的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶基因序列经人工合成制得目的基因2，所述目的基因2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶编码基因源自伯克霍尔德菌、大肠杆菌、气单胞菌中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶编码基因经密码子优化并加上酶切位点得到甲酸脱氢酶基因序列。
本发明优选的技术方案中，酶切位点选自EcoRI、NotI的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因3，所述目的基因3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的优选技术方案中，所述密码子优化根据大肠杆菌的密码子偏好性进行。
本发明优选的技术方案中，用于重组的载体选自pET-21a质粒、pET-28a质粒、pRSFDuet-I质粒的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体的获得方法包括下述步骤：将L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到第一载体中，得到第一重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第二重组载体的获得方法包括下述步骤：将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到第二载体中，得到第二重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第三重组载体的获得方法包括下述步骤：将甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第三载体中，得到第三重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：先将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，再将甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：先将甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，然后再将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第五重组载体的获得方法包括下述步骤：将L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列、甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第五载体中，得到第五重组载体，其中，3种基因或核苷酸序列的克隆顺序并无先后之分。
本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包括能够表达L-泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、表达酮泛解酸内酯还原酶的第二重组载体和表达甲酸脱氢酶的第三重组载体的任一种或其组合；
和/或，所述重组工程菌包括能够共表达酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第四重组载体；
和/或，所述重组工程菌包括能够共表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第五重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌包含能够表达L-泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、共表达酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第四重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌用于L-泛解酸内酯制备DL-泛解酸内酯。
本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体包括L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因，优选所述L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因源自红串红球菌、红球菌、分支杆菌、诺卡氏菌、链霉菌中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到L-泛解酸内酯脱氢酶基因序列。
本发明优选的技术方案中，酶切位点选自XhoI、NdeI的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因1，所述目的基因1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的技术方案中，所述第二重组载体包括酮泛解酸内酯还原酶编码基因，优选的，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因源自木兰假丝酵母、小单孢菌、链霉菌中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到酮泛解酸内酯还原酶基因序列。
本发明优选的技术方案中，酶切位点选自SacI、NotI的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶基因序列经人工合成制得目的基因2，所述目的基因2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明优选的技术方案中，所述第三重组载体包括甲酸脱氢酶编码基因，优选的，所述甲酸脱氢酶编码基因源自伯克霍尔德菌、大肠杆菌、气单胞菌中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到甲酸脱氢酶基因序列。
本发明优选的技术方案中，酶切位点选自EcoRI、NdeI的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因3，所述目的基因3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的优选技术方案中，所述密码子优化根据大肠杆菌的密码子偏好性进行。
本发明优选的技术方案中，用于重组的载体选自pET-21a质粒、pET-28a质粒、pRSFDuet-I质粒的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体的获得方法包括下述步骤：将L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到第一载体中，得到第一重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体包括酮泛解酸内酯还原酶编码基因和甲酸脱氢酶编码基因。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：先将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，再将甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：先将甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，再将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体。
本发明优选的技术方案中，将第一重组载体和第四重组载体顺序或同步导入到宿主细胞中，得到重组工程菌。
本发明优选的技术方案中，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌的诱导方法包括下述步骤：
S-1，将重组工程菌按照1-5％接种量接种于LB培养基中，将其置于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-12h，获得一级种子液；
S-2，将一级种子液按照1-5％接种量接种于LB培养基中，将其置于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-10h，获得二级种子液；
S-3，将二级种子液按照0.1-0.5％接种量接种于发酵培养基中，流加葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度不高于5g/L，在pH7、37℃、好氧条件下发酵培养12-20h后，收集湿菌体，-20℃冷冻储存。
本发明优选的技术方案中，S-1和S-2步骤的发酵温度为35-38℃。
本发明优选的技术方案中，S-1和S-2步骤的转速为100-400rpm，优选为200-300rpm。
本发明优选的技术方案中，所述LB培养基的组成包括抗生素、酵母粉、胰蛋白胨和氯化钠。
本发明优选的技术方案中，所述LB培养基的组成包括抗生素50-200mg/L、酵母粉4-6g/L，胰蛋白胨8-12g/L和氯化钠8-12g/L。
本发明优选的技术方案中，所述抗生素选自青霉素、两性霉素B、制霉素、多粘菌素B、链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、氨苄霉素、卡那霉素的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述LB培养基的组成包括抗生素50-200mg/L、酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L和氯化钠10g/L。
本发明优选的技术方案中，所述发酵培养基的组成包括七水硫酸镁、磷酸二氢钾、一水柠檬酸、硫酸铵、酵母粉、葡萄糖。
本发明优选的技术方案中，所述发酵培养基的组成包括七水硫酸镁1-3g/L、磷酸二氢钾6-8g/L、一水柠檬酸1-3g/L、硫酸铵2-4g/L、酵母粉0.5-2g/L、葡萄糖5-7g/L。
本发明优选的技术方案中，所述发酵培养基的组成包括七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌的构建方法，包括下述步骤：
(1)将L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因、酮泛解酸内酯还原酶编码基因、甲酸脱氢酶编码基因的任一种或其组合顺序或同步导入载体，得到重组载体；
(2)将所得重组载体导入宿主细胞，得到重组工程菌。
本发明的优选技术方案中，所述重组载体选自第一重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第四重组载体酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体的获得方法包括下述步骤：将L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到第一载体中，得到第一重组载体。
本发明优选的技术方案中，所述第四重组载体的获得方法包括下述步骤：将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和甲酸脱氢酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到第四载体中，得到第四重组载体，其中2种基因或核酸序列的克隆顺序并无先后之分。
本发明优选的技术方案中，用于重组的载体选自pET-21a质粒、pET-28a质粒、pRSFDuet-I质粒的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，将第一重组载体、第四重组载体依次或同步导入到宿主细胞中，得到重组工程菌。
本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌能够共表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶。
本发明优选的技术方案中，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种DL-泛解酸内酯的制备方法，包括如下步骤：将浓度为10-300g/L的L-泛解酸内酯置于浓度为1-100g/L的甲酸铵、菌体OD值为1-5的重组工程菌的发酵体系中，将其置于30-40℃、pH4-7条件下培养发酵20-40h，制得DL-泛解酸内酯。
本发明优选的技术方案中，所述重组工程菌的OD值为2-3。
本发明的优选方案中，L-泛解酸内酯的浓度为100-250g/L，优选为150-200g/L。
本发明的优选方案中，甲酸铵的浓度为20-80g/L，优选为30-50g/L。
本发明的优选方案中，反应体系中还可加入金属盐或磷酸盐溶液。
本发明优选的技术方案中，所述金属盐或磷酸盐选自锌盐、钙盐、铜盐、镁盐、钠盐、钾盐中的任一种或其组合，优选为氯化镁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸钙、硫酸铜、磷酸镁、磷酸锌、磷酸钙、磷酸铜、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述金属盐或磷酸盐溶液浓度为0-50mmol/L，优选为1-40mmol/L，更优选为5-30mmol/L。
本发明优选的技术方案中，金属盐溶液中的Zn2+浓度为0-15mM，优选为5-10mM。
本发明优选的技术方案中，金属盐溶液中的Cu2+浓度为0-15mM，优选为5-10mM。
本发明优选的技术方案中，金属盐溶液中的Ca2+浓度为0-9mM，优选为2-7mM。
本发明优选的技术方案中，无机盐溶液中的PO42-浓度为1-50mM，优选为5-40mM。
本发明优选的技术方案中，发酵体系温度为35-37℃。
本发明优选的技术方案中，发酵体系pH4.5-6.5，优选为pH5-6。
本发明优选的技术方案中，发酵体系培养时间为25-35h。
本发明的优选方案中，pH调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙胺、氢氧化钾、磷酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硫酸、盐酸的任一种。
本发明的另一目的在于提供本发明的重组工程菌在L-泛解酸内酯制备DL-泛解酸内酯中的应用。
本发明优选的技术方案中，所得的DL-泛解酸内酯用于制备泛化合物中的应用，优选所述泛化合物选自D-泛解酸内酯、D-泛酸、D-泛酸钙、D-泛醇、泛硫乙胺中的任一种。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明按照下述方法检测。
1.转化率
仪器及工作条件：岛津LC-16液相色谱仪，色谱柱
Figure BDA0003215500740000131
μm，4.6*250mm，柱温30℃，采集时间30min，波长210nm，流速1.0ml/min，流动相为0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液∶甲醇＝60∶40。
实验步骤：分别在转化时间T＝0和T＝M(M为大于0的任一数值)时，取反应液稀释100倍，过滤后进样，进样量10ul，分别记录L-泛解酸内酯峰面积S0和SM。
转化率(M时刻)＝(S0-SM)/S0。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1.本发明的重组工程菌经诱导表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶，高效转化L-泛解酸内酯生成DL-泛解酸内酯，提高了反应效率，降低了生产成本。
2.本发明的DL-泛解酸内酯制备方法具有反应效率高、操作简便，适合大规模工业化生产等优点。
3.本发明使用甲酸脱氢酶将甲酸转化为易挥发的二氧化碳，提高反应效率，又避免了分离除去葡萄糖酸钠所致的繁琐步骤，缩短生产周期，避免产生大量葡萄糖酸钠，减低三废生成及其回收处理成本，适合工业化生产。
附图说明
图1 L-泛解酸内酯制备DL-泛解酸内酯流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
如无特殊说明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法，所用的材料、试剂等均从商业途径获得。
实施例1重组工程菌的构建
1、目的基因1-3的设计与合成
步骤一，将来源于Humibacter sp.BT305(放线菌)的L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上XhoI与NdeI酶切位点，得到L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二，将来源于木兰假丝酵母的酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上XhoI与NdeI酶切位点，得到D-酮泛解酸内酯改造基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤三，将来源于伯克霍尔德菌的甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上EcoRI与NotI酶切位点，得到甲酸脱氢酶改造基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤四，合成SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，制得目的基因1、目的基因2和目的基因3。
2、重组工程菌的构建
步骤一，以目的基因1的DNA分子为模板，采用引物对lpldh-for和lpldh-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因1的基因片段。
引物序列：(下划线为酶切位点)
lpldh-for：GGAATTCCATATGATGAACCCGTGGTTTGAAAC
lpldh-rev：CCGCTCGAGTGCGCTTTCTGCTTCTGC
PCR体系：
Figure BDA0003215500740000161
PCR过程：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，循化28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤二，用限制性内切酶XhoI与NdeI双酶切pET-21a质粒和基因组1的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物(命名为pET-21a-LPLDH)化学法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-21a-lpldh。
步骤三，以目的基因2的DNA分子为模板，采用引物对KPR-for与KPR-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因2的基因片段。
引物序列：(下划线为酶切位点)
KPR-for：
GGAATTCCATATGATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTGAATACC
KPR-rev：CCGCTCGAGCGGCAGGGTGTAACCACCGTCAAC
PCR体系：
Figure BDA0003215500740000171
PCR过程：95℃预变性5min，95℃变性30s,55℃退火30s，72℃延伸1min，循化28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤四，用限制性内切酶XhoI与NdeI双酶切pRSFDuet-I质粒和基因2的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物(命名为pRSFDuet-kpr)用化学转化至E-21a-lpldh感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-lpldh-kpr。
步骤五，以目的基因3的DNA分子为模板，采用引物对FDH-for和FDH-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因3的基因片段。
引物序列如下：(下划线为酶切位点)
FDH-for：CGGAATTCATGGCTACCGTTCTGTGCG
FDH-rev：ATAAGAATGCGGCCGCGGTCAGACGGTAAGACTGAGC
PCR体系如下：
Figure BDA0003215500740000181
PCR过程：
95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循化28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤六，用限制性内切酶EcoRI与NotI双酶切pRSFDuet-kpr质粒和基因组3的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物(命名为pRSFDuet-kpr-FDH)用化学转化至E-lpldh-kpr感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-lpldh-kpr-FDH，制得共表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的重组工程菌。
化学转化至感受态细胞的制备采用常规方法，包括下述步骤：
挑单菌落接种到含有50ug/mL氨苄霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm恒温摇床培养8h，制得种子液；
取所得种子液接种到50mL含有50ug/mL氨苄霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm条件下恒温摇床培养至菌液OD600为0.2～0.4；
取50ml摇床培养液分装到4个10ml的离心管中，冰浴10min，4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清；
每管用2ml预冷的0.1mol/l CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴10min，4℃条件下，4000r/min离心10min，弃上清；
用1.6ml预冷的含有15％甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮菌体，得到感受态细胞，-70℃保存备用；
将感受态细胞冰上放置，加入1uL重组质粒，混匀，冰上放置30min，42℃热激90s，取出冰上放置2min，加800uL LB培养基，在37℃，200rpm条件下培养2h后取出，吸取300uL，涂布于含有抗生素的平板，过夜培养。
实施例2重组工程菌的诱导表达
将实施例1制得的重组工程菌按照2％的接种量接种于5mL LB培养基中，将其置于37℃、200rpm条件下培养10-15h，获得一级种子液；
将一级种子液按照2％接种量接种于100mL LB培养基中，将其置于37℃、200rpm条件下培养8h，制得二级种子液；
将二级种子液按照0.2％接种量接种于含6L发酵培养基的发酵罐中，所述发酵培养基包括七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L和葡萄糖6g/L。流加葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度小于5g/L，在pH7、37℃、好氧条件下发酵培养18h，将制得的重组工程菌置于-20℃冷冻储存，备用。
实施例3 L-泛解酸内酯的转化
将L-泛解酸内酯130g和甲酸铵31.5g加入到反应容器中，加水至总体积为1L，搅拌溶解后，用20-25％氨水调节溶液pH6.2，加入实施例2收集的重组工程菌体(OD＝2)后，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应32h，得到反应液，其中，D-泛解酸内酯终浓度为91g/L，L-泛解酸内酯终浓度为39g/L，L-泛解酸内酯的转化率为70％。
实施例4 L-泛解酸内酯的转化
L-泛解酸内酯130g和甲酸铵63.06g加入到反应容器中，加水至总体积为1L，搅拌溶解，用20-25％氨水调节溶液pH6.2，再加入实施例2收集的重组工程菌体(OD＝2)，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应32h，得到反应液，其中，D-泛解酸内酯终浓度84.63g/L，L-泛解酸内酯终浓度为45.37g/L，L-泛解酸内酯的转化率为65.1％。
实施例5 L-泛解酸内酯的转化
L-泛解酸内酯130g和甲酸铵31.5g，氯化铜2g加入到反应容器中，加水至总体积为1L，搅拌溶解后，用20-25％氨水调节溶液pH6.2，再加入实施例2收集的重组工程菌体(OD＝2)，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应32h，得到反应液，其中，D-泛解酸内酯终浓度为96.85g/L，L-泛解酸内脂终浓度为33.15g/L，L-泛解酸内酯的转化率为74.5％。
实施例6 L-泛解酸内酯的转化
将L-泛解酸内酯130g、甲酸铵31.5g和氯化锌2g加入到反应容器中，加水至总体积为1L，搅拌溶解后，用20-25％氨水调节溶液pH6.2后，加入实施例2收集的重组工程菌体(OD＝2)，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应32h，得到反应液，其中，D-泛解酸内酯终浓度为93.73g/L，L-泛解酸内酯终浓度为36.27g/L，L-泛解酸内酯的转化率为72.1％。
实施例7 L-泛解酸内酯的转化
L-泛解酸内酯130g、甲酸铵31.5g和磷酸氢二钠5g加入到反应容器中加入，加水至总体积为1L，搅拌溶解，然后用20-25％氨水调节溶液pH6.2，然后加入实施例2收集的重组工程菌体(OD＝2)，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应32h，得到反应液，其中，D-泛解酸内酯终浓度为95.42g/L，L-泛解酸内酯终浓度为34.58g/L，L-泛解酸内酯的转化率为73.4％。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。
序列表
<110> 安徽华恒生物科技股份有限公司
巴彦淖尔华恒生物科技有限公司
秦皇岛华恒生物工程有限公司
合肥华恒生物工程有限公司
<120> 一种重组工程菌及其用于高效转化L-泛解酸内酯的应用
<150> 2020110463081
<151> 2020-09-29
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctaaaa acgctttctt cgaaaccgtt gctgaagctc agcgtcgtgc taaaaaacgt 60
ctgccgaaat ctgtttacgc tgctctggtt gctggttctg aaaaaggtct gaccgttgac 120
gacaacgttg ctgctttctc tgaactgggt ttcgctccgc acgctgctgg tctgtctgac 180
aaacgtgaaa tgtctaccac catcatgggt caggacatct ctctgccggt tatgatctct 240
ccgaccggtg ttcaggctgt tcacccggac ggtgaagttg ctgttgctcg tgctgctgct 300
gctcgtggta ccgctatcgg tctgtcttct ttcgcttcta aatctatcga agaagttgct 360
gctgctaacc cgcaggtttt cttccagatg tactgggttg gttctcgtga cgttctgctg 420
cagcgtatgg aacgtgctcg tgctgctggt gctaaaggtc tgatcatcac caccgactgg 480
tctttctctt acggtcgtga ctggggttct ccgtctatcc cggaaaaaat ggacctgaaa 540
gctatgttcc agttcgctcc ggaaggtatc atgcgtccga aatggctgct ggaattcgct 600
aaaaccggta aaatcccgga cctgaccacc ccgaacctgg ctgctccggg tcagccggct 660
ccgaccttct tcggtgctta cggtgaatgg atgcagaccc cgctgccgac ctgggaagac 720
atcgcttggc tgcgtgaaca gtggggtggt ccgttcatgc tgaaaggtat catgcgtatc 780
gacgacgcta aacgtgctgt tgacgctggt gtttctgcta tctctgtttc taaccacggt 840
ggtaacaacc tggacggtac cccggctccg atccgtgttc tgccgggtat cgctgaagct 900
gttggtgacc aggttgaagt tgttctggac ggtggtatcc gtcgtggtgg tgacgttgtt 960
aaagctctgg ctctgggtgc taaagctgtt atgctgggtc gtgcttacct gtggggtctg 1020
tctgctaacg gtcaggctgg tgttgaaaac gttctggacc tgatgcgtat gggtatcgac 1080
tctggtctga tgggtctggg tcactcttct atcaccgaac tgtctccggc tgacctggtt 1140
atcccggaag gtttcacccg taccctgggt gcttct 1176
<210> 2
<211> 849
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctaaaa acttctctaa cgttgaatac ccggctccgc cgccggctca caccaaaaac 60
gaatctctgc aggttctgga cctgttcaaa ctgaacggta aagttgcttc tatcaccggt 120
tcttcttctg gtatcggtta cgctctggct gaagctttcg ctcaggttgg tgctgacgtt 180
gctatctggt acaactctca cgacgctacc ggtaaagctg aagctctggc taaaaaatac 240
ggtgttaaag ttaaagctta caaagctaac gtttcttctt ctgacgctgt taaacagacc 300
atcgaacagc agatcaaaga cttcggtcac ctggacatcg ttgttgctaa cgctggtatc 360
ccgtggacca aaggtgctta catcgaccag gacgacgaca aacacttcga ccaggttgtt 420
gacgttgacc tgaaaggtgt tggttacgtt gctaaacacg ctggtcgtca cttccgtgaa 480
cgtttcgaaa aagaaggtaa aaaaggtgct ctggttttca ccgcttctat gtctggtcac 540
atcgttaacg ttccgcagtt ccaggctacc tacaacgctg ctaaagctgg tgttcgtcac 600
ttcgctaaat ctctggctgt tgaattcgct ccgttcgctc gtgttaactc tgtttctccg 660
ggttacatca acaccgaaat ctctgacttc gttccgcagg aaacccagaa caaatggtgg 720
tctctggttc cgctgggtcg tggtggtgaa accgctgaac tggttggtgc ttacctgttc 780
ctggcttctg acgctggttc ttacgctacc ggtaccgaca tcatcgttga cggtggttac 840
accctgccg 849
<210> 3
<211> 1152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctaccg ttctgtgcgt tctgtacccg gacccggttg acggttaccc gccgcactac 60
gttcgtgaca ccatcccggt tatcacccgt tacgctgacg gtcagaccgc tccgaccccg 120
gctggtccgc cgggtttccg tccgggtgaa ctggttggtt ctgtttctgg tctgggtctg 180
cgtggttacc tggaagctca cggtcacacc ctgatcgtta cctctgacaa agacggtccg 240
gactctgaat tcgaacgtcg tctgccggac gctgacgttg ttatctctca gccgttctgg 300
ccggcttacc tgaccgctga acgtatcgct cgtgctccga aactgcgtct ggctctgacc 360
gctggtatcg gttctgacca cgttgacctg gacgctgctg ctcgtgctca catcaccgtt 420
gctgaagtta ccggttctaa ctctatctct gttgctgaac acgttgttat gaccaccctg 480
gctctggttc gtaactacct gccgtctcac gctatcgctc agcagggtgg tatgaacatc 540
gctgactgcg tttctcgttc ttacgacgtt gaaggtatgc acttcggtac cgttggtgct 600
ggtcgtatcg gtctggctgt tctgcgtcgt ctgccgttcg gtctgcacct gcactacacc 660
cagcgtcacc gtctggacgc tgctatcgaa caggaactgg gtctgaccta ccacgctgac 720
ccggcttctc tggctgctgc tgttgacatc gttaacctgc agatcccgct gtacccgtct 780
accgaacacc tgttcgacgc tgctatgatc gctcgtatga aacgtggtgc ttacctgatc 840
aacaccgctc gtgctaaact ggttgaccgt gacgctgttg ttcgtgctgt tacctctggt 900
cacctggctg gttacggtgg tgacgtttgg ttcccgcagc cggctccggc tgaccacccg 960
tggcgtgcta tgccgttcaa cggtatgacc ccgcacatct ctggtacctc tctgtctgct 1020
caggctcgtt acgctgctgg taccctggaa atcctgcagt gctggttcga cggtcgtccg 1080
atccgtaacg aatacctgat cgttgacggt ggtaccctgg ctggtaccgg tgctcagtct 1140
taccgtctga cc 1152

Claims (10)

1.一种重组载体，所述重组载体选自含有L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组载体。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体任选地包括第四重组载体、第五重组载体的任一种，其中，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第五重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种重组工程菌，所述重组工程菌包括能够表达L-泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、表达酮泛解酸内酯还原酶的第二重组载体和表达甲酸脱氢酶的第三重组载体的任一种或其组合；
和/或，所述重组工程菌包括能够共表达酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第四重组载体；
和/或，所述重组工程菌包括能够共表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第五重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其中，所述重组工程菌包含能够表达L-泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、共表达酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第四重组载体。
5.一种重组工程菌的构建方法，包括下述步骤：
(1)将L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因、酮泛解酸内酯还原酶编码基因、甲酸脱氢酶编码基因的任一种或其组合顺序或同步导入载体，得到重组载体；
(2)将所得重组载体导入宿主细胞，得到重组工程菌。
6.一种DL-泛解酸内酯的制备方法，包括如下步骤：将浓度为10-300g/L的L-泛解酸内酯置于浓度为1-100g/L的甲酸铵、菌体OD值为1-5的重组工程菌的发酵体系中，将其置于30-40℃、pH4-7条件下培养发酵20-40h，制得DL-泛解酸内酯。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，L-泛解酸内酯的浓度为100-250g/L，优选为150-200g/L。
8.根据权利要求6-7任一项所述的制备方法，其中，甲酸铵的浓度为20-80g/L，优选为30-50g/L。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其中，反应体系中还可加入金属盐或磷酸盐溶液；优选的，所述金属盐或磷酸盐选自锌盐、钙盐、铜盐、镁盐、钠盐、钾盐中的任一种或其组合，优选为氯化镁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸钙、硫酸铜、磷酸镁、磷酸锌、磷酸钙、磷酸铜、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种或其组合。
10.根据权利要求3-4任一项所述的重组工程菌在L-泛解酸内酯制备DL-泛解酸内酯中的应用。
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