CN116789800A

CN116789800A - 一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药

Info

Publication number: CN116789800A
Application number: CN202310852126.0A
Authority: CN
Inventors: 徐亮; 孙彩云; 孙大志; 安孟缘; 徐春雷; 夏宇
Original assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Current assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Priority date: 2023-07-12
Filing date: 2023-07-12
Publication date: 2023-09-22

Abstract

本发明涉及利拉鲁肽原料药制备领域，特别涉及一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药，利拉鲁肽原料药的蛋白序列经过密码子偏好修正后不包括起始密码子和终止密码子的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，本发明公开了一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，实现了生物质资源的回用，提供了电转操作的具体参数，促进小球藻的生长，并公开了一种蛋白质的纯化处理方法，实现蛋白质的纯化。

Description

一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药

技术领域

本发明涉及利拉鲁肽原料药制备领域，特别涉及一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药。

背景技术

浓醪废水资源化处理是发酵行业产业优化的关键问题之一；微藻对浓醪废水资源转化中的多肽原料药开发潜力巨大；本研究以同步处理浓醪废水和废水生物质资源回用为研究目标，实现转基因工程绿藻制备利拉鲁肽原料药；绿藻表观调控是污水生物质资源化和高附加值产品开发的前沿技术；项目为浓醪废水的高附加值资源化处理提供新思路，是蛋白原料药的规模化低成本制备和浓醪废水的资源化处理的交叉领域，具有良好的应用前景和研发价值；

2013年，Nature报道了3个实验室利用基因编辑系统对单子叶植物小麦、水稻和对双子叶植物烟草、拟南芥的基因组进行定点编辑的研究并实现对它们的基因组定点编辑的操作，表明了基因编辑技术可编辑植物基因组DNA；但目前为止，尚未见到有关基因编辑在转基因工程绿藻制备外源多肽药蛋白的报道，以及CAS9蛋白是否对绿藻细胞有免疫原性和毒副作用，并进而影响细胞代谢和光合效率的报道，这些问题都是浓醪液(包括糖浆、废醪等)高效处理和生物高附加值产品资源化制备领域迫切需要研究及解决的；因此寻找到合适的表达载体,建立高效的转化方法，利用新型的基因编辑工具对基因进行定点编辑，是基因工程在小球藻研究及应用中急需实现的技术；本研究将得到高效的小球藻基因编辑体系，并培育制备多肽药的转基因藻；该技术是严防出现多肽药技术鸿沟的必要保障；

长链多肽药物尤其是原料药的制备体系研发对于多肽药领域具有重要意义，对于推动新型国产多肽药占领国际多肽药市场具有决定性作用，是严防出现多肽药技术鸿沟的必要保障；《产业结构调整指导目录》中鼓励类医药模块指出，鼓励具有自主知识产权的新药开发及生产，鼓励大规模药用多肽和核酸合成、纯化技术开发和应用；中国多肽药物发展特别是长链多肽药物研发亟待技术瓶颈的突破；长链多肽原料药的蛋白表达系统的效率和稳定性是技术的核心突破口；作为全球糖尿病的首推药物，仅美国市场利拉鲁肽原料药年需求量就达到约536kg；多肽药物年均复合增长率保持在10％左右，可见其全球市场发展潜力巨大；

因此，如何有效利用小球藻制备利拉鲁肽原料药，实现生物质资源的回用，成为了待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药，以解决以上的问题。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种由小球藻制备的利拉鲁肽原料药，所述利拉鲁肽原料药的蛋白序列经过密码子偏好修正后不包括起始密码子和终止密码子的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：

CAC GCC GAG GGC ACC TTC ACC AGC GAC GTC AGC AGC TAT CTG GAG GGC CAGGCC GCC AAA GAG TTC ATC GCC TGG CTG GTC AGG GGC AGG GGC

其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2：

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVRGR G。

一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，具体包括以下步骤：

S1：取用带有Hygromycin抗性基因的植物双元表达载体pCAMBIA 1302，确定Hygromycin基因的最终DNA序列；

S2：取100-200mg的植物双元表达载体的植物组织放入液氮中，在液氮环境中将植物组织碾碎；

S3：向所述S2中的混合物加入1mL的裂解液，加入10mg/mL的蛋白酶抑制剂和10mg/mL PMSF并于4℃下裂解20min，期间每隔5min震荡1次，处理完毕后在4℃，14000转条件下离心30min；

S4：吸取所述S2中的上清至新管中，得到植物组织蛋白，并保存于-80℃下，即用即取；

S5：采用电转化法将所述步骤S4中获得的植物组织蛋白引入小球藻中，并采用所述权利要求1中的mCHERRY荧光蛋白建立小球藻中引入的蛋白表达筛选，电转操作的具体参数为电压230V、电容50uF、电阻200ohms；电压400V、电容25uF、电阻200ohms；电压800V、电容10uF、电阻400ohms；

mCHERRY荧光蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：

用于建立绿藻蛋白表达筛选的标签蛋白mCHERRY荧光蛋白序列来源于质粒载体(cloning vector N-term 8xHis mcherry pCellFree_G05)的全序列，mCHERRY荧光蛋白对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4：

KGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK；

S6：将小球藻中的蛋白质做纯化处理；

S7：将小球藻置于存在N、P元素的环境中，对小球藻进行培养，得到如权利要求1所述的利拉鲁肽原料药。

优选地，所述利拉鲁肽原料药的化学名称为：Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1。

优选地，所述步骤S6具体为：

将所述步骤S5的小球藻置于HEPES缓冲液中，在4℃和12000r/min下超声热解后，离心30s后清洗三分钟，直到绝大多数细菌沉淀，并采用0.22μm孔径过滤。

优选地，所述HEPES缓冲液包括：20mmol的NaCl和200mmol的HEPES，其pH值为7.5。

本发明的有益效果为：

1、本发明公开了一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，实现了生物质资源的回用；

2、本发明提供了电转操作的具体参数，促进小球藻的生长；

3、本发明公开了一种蛋白质的纯化处理方法，实现蛋白质的纯化。

附图说明

图1为本发明荧光蛋白标记后的小球藻形态图；

图2为本发明不同电转条件下的mCherry蛋白荧光标的强度的WERTERN结果；

图3为本发明小球藻的湿重与对N、P去除效率的关系图；

图4为本发明不同光照强度下小球藻对N、P去除的影响图一；

图5为本发明不同光照强度下小球藻对N、P去除的影响图二；

图6为本发明光照效率和蛋白多肽药产率的关系图；

图7为蛋白多肽药的鉴定图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种由小球藻制备的利拉鲁肽原料药，利拉鲁肽原料药的蛋白序列经过密码子偏好修正后不包括起始密码子和终止密码子的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

S1：购买带有Hygromycin抗性基因的植物双元表达载体pCAMBIA 1302，并获取该质粒的序列信息，提取Hygromycin基因的DNA序列，通过NCBI(National Center forBiotechnology Information)blast比对，确定Hygromycin基因的最终DNA序列；

S2：取100-200mg的植物双元表达载体的植物组织放入液氮中，过夜处理，在液氮环境中将植物组织碾碎；

S3：向S2中的混合物加入1mL的裂解液，加入10mg/mL的蛋白酶抑制剂和10mg/mLPMSF并于4℃下裂解20min，期间每隔5min震荡1次，处理完毕后在4℃，14000转条件下离心30min；

S4：吸取S2中的上清至新管中，得到植物组织蛋白，并保存于-80℃下，即用即取；采用转录因子识别序列筛选；EMSA实验验证；启动子序列替换的表达载体改造工程；启动子活性报告基于检测分析实验；

S5：采用电转化法将步骤S4中获得的植物组织蛋白引入小球藻中，并采用权利要求1中的mCHERRY荧光蛋白建立小球藻中引入的蛋白表达筛选，电转操作的具体参数为电压230V、电容50uF、电阻200ohms；电压400V、电容25uF、电阻200ohms；电压800V、电容10uF、电阻400ohms；

依据不同的细胞密度，不同培养时期进行对比试验，检测不同电击条件下的细胞成活率、细胞转染效率、目的基因正确表达比率、稳定转染细胞株系的蛋白表达遗传稳定性；藻细胞均等分裂条件和孢子生殖条件下的稳转基因稳定遗传模式或丧失机制，主要研究同源重组和连锁互换作用；小球藻电击转化法外源基因转化为优选技术，相关研究主要探索了小球藻藻细胞转化浓度、质粒转化的量、高渗处理条件及电转参数方面的影响；小球藻生长藻细胞浓度为10⁷/mL时，即OD₆₅₀＝0.5，小球藻正处于对数生长期的中前期，此时的小球藻生长旺盛且次级代谢产物积累极少，是制备成感受态进行电转的最佳状态；研究中使用0.2mm的电击杯进行电击转化试验，转化体系为400μL，藻细胞浓度为10⁸/mL，优选单个质粒的量为2μg；高渗处理小球藻有助于提高小球藻在电击过程中的转化效率，高渗处理50min具有更高的转化效率；在电转参数的选取方面：过高的电压如1800V和2000V对小球藻的生长状态造成一定的不利影响，经测试，小球藻电击转化最佳的电击参数有：电压230V、电容50uF、电阻200ohms；电压400V、电容25uF、电阻200ohms；电压800V、电容10uF、电阻400ohms；

S6：将小球藻中的蛋白质做纯化处理；

S7：将小球藻置于存在N、P元素的环境中，对小球藻进行培养，得到如权利要求1的利拉鲁肽原料药；

在一些实施例中，利拉鲁肽原料药的化学名称为：Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1；

在一些实施例中，步骤S6具体为：

将步骤S5的小球藻置于HEPES缓冲液中，在4℃和12000r/min下超声热解后，离心30s后清洗三分钟，直到绝大多数细菌沉淀，并采用0.22μm孔径过滤；

由于所选择的预测目标蛋白质等电点(PI)与pH 7.5不同，HEPES缓冲液(20mmNaCl200mm HEPES pH7.5)在4℃和12000r/min下超声热解后，离心30s后清洗三分钟，直到绝大多数细菌沉淀，过滤0.22μm孔径，然后储存用于蛋白质纯化；

由于蛋白质可以携带在N6 x His标签的末端，因此使用镍螯合色谱柱用500mM咪唑梯度洗脱进行纯化；然后通过sds-page确定目标蛋白的洗脱侦查根据目标蛋白的纯化效果，测量进一步的纯化措施，例如离子交换色谱法(Hitrap S/Q)、分子筛等；HiloadSuperdex 75(16/60)用于分离和纯化；快速高效液相色谱纯化工艺系统(FPLC)在预加载的柱使用了镍亲和层析和凝胶过滤的纯化策略；

在一些实施例中，HEPES缓冲液包括：20mmol的NaCl和200mmol的HEPES，其pH值为7.5；

如图1-7所示，本实施例采用将小球藻置于浓醪废水中，去除其中的N、P并制备利拉鲁肽原料药，如图2所示，图2中横坐标中为6组不同的电压、电容和电阻，具体分组情况按下表1分组：

表1：不同的电压、电容和电阻分组

分组	电压、电容、电阻
		1	230V、50μF、200ohms
2	300V、50μF、200ohms
		3	400V、25μF、200ohms
4	500V、25μF、200ohms
		5	600V、10μF、400ohms
6	800V、10μF、400ohms

如图3所示，实验刚开始阶段，小球藻可摄取的营养物质足量，小球藻的繁殖速度较快，N、P的去除效率上升幅度也随之较大，随着实验的进行，营养物质的含量减少，小球藻的生长繁殖速度也就下降，随之N、P的去除效率也就趋于稳定；最后在80％左右；

如图4-5所示，在同一时间段，光强在实验所定范围内，随光强的增大而增大，当时间到第10天时，二者的去除效率都开始趋于平缓；第12天时，测得光强为1600lx、1900lx、2300lx、2500lx时，N的去除效率分别为74％、84％、87％、90％；P的去除效率分别为65％、79％、85％、88％；

如图6所示，光合作用主要包括光反应、暗反应两个阶段，光反应阶段可以为暗反应提供其用来固定二氧化碳(CO₂)的ATP和NADPH(还原型辅酶II)，而光反应阶段的光化学反应是由两个含有光合色素在内的光系统完成的，即光系统I(简称PSI)和光系统II(简称PSII)；两个光系统通过电子传递链连接，高度有序地排列在类囊体膜上，承担着电子传递和质子传递任务；因此光合作用效率可以用PSII活性来体现，而PSII活性用Fv/Fm表示，本实施例中，光照效率和蛋白多肽药产率成正相关。

Claims

1.一种由小球藻制备的利拉鲁肽原料药，其特征在于：所述利拉鲁肽原料药的蛋白序列经过密码子偏好修正后不包括起始密码子和终止密码子的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

S3：向所述S2中的混合物加入1mL的裂解液，加入10mg/mL的蛋白酶抑制剂和10mg/mLPMSF并于4℃下裂解20min，期间每隔5min震荡1次，处理完毕后在4℃，14000转条件下离心30min；

S5：采用电转化法将所述步骤S4中获得的植物组织蛋白引入小球藻中，并采用mCHERRY荧光蛋白建立小球藻中引入的蛋白表达筛选，电转操作的具体参数为电压230V、电容50uF、电阻200ohms；电压400V、电容25uF、电阻200ohms；电压800V、电容10uF、电阻400ohms；

S6：将小球藻中的蛋白质做纯化处理；

3.根据权利要求2所述的基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，其特征在于：所述利拉鲁肽原料药的化学名称为：Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1。

4.根据权利要求2所述的基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，其特征在于：所述步骤S6具体为：

5.根据权利要求3所述的基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，其特征在于：所述HEPES缓冲液包括：20mmol的NaCl和200mmol的HEPES，其pH值为7.5。