CN114134166A - 用于合成咖啡酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法 - Google Patents

用于合成咖啡酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于合成咖啡酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的苯丙氨酸酶基因、肉桂酸‑4‑羟化酶基因和对香豆酸‑3‑羟化酶基因三个基因，其中苯丙氨酸酶基因序列如SEQ ID NO.5所示，肉桂酸‑4‑羟化酶基因序列如SEQ ID NO.6所示，对香豆酸‑3‑羟化酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法。本发明还涉及包含有所述构建体的载体和包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法。一种用于合成咖啡酸的构建体，应用了该构建体的底盘生物能够催化CO2直接合成咖啡酸，无需外界碳源对香豆酸的支持，成本低，适于进行大规模生产。

Description

用于合成咖啡酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生 产咖啡酸的方法
技术领域
本发明涉及咖啡酸的合成技术领域，具体而言，涉及一种用于合成咖啡酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法。
背景技术
蓝藻(Cyanobacteria)作为一种原核生物，其可以同高等植物一样进行光合作用，许多科学家将蓝藻看作一种“光合反应器”，蓝藻仅仅通过固定CO2即可生物合成大量的人类所需的化工产品和天然植物产物。对蓝藻进行基因改造以进行生物合成具有许多优势：(1)常见蓝藻如鱼腥藻、集胞藻等的基因组都已经完成了测序，由于蓝藻的结构简单，科学家们已经制定出了一套有关蓝藻的基因编辑体系；(2)蓝藻生长繁殖快，适合进行大规模生产；(3)蓝藻的适应能力很强，可以在许多恶劣的环境中生存，只需要给予光照和水即可存活；(4)蓝藻通过固定空气中的CO2进行生物合成对温室效应的减轻具有一定的缓解作用。因此，使用蓝藻作为合成生物学的底盘生物，具有美好的前景和广泛的应用价值。
咖啡酸(caffeic acid)，又称为“3,4-二羟基肉桂酸”，分子式C9H8O4，分子量180.15。咖啡酸一般存在于植物体内，在常用饮品中亦有存在。咖啡酸作为一种重要的多酚类物质，是非常重要的微量营养素且具有非常高的生物活性，还具有抗氧化、预防心脑血管疾病等药理功能。
咖啡酸目前的主要合成方法是化学合成，具体操作例如：用甲醇将咖啡酸粗提后，经过减压浓缩的方式，将咖啡酸粗品进行第一步提纯；再用热水溶解第一步粗提的产物，以将杂质溶解去除，待冷却后用苯萃取；最后用1％碳酸氢钠溶液洗涤一次，加盐酸中和，经减压浓缩最终产物即为咖啡酸。化学合成咖啡酸不仅需要用到酸、碱、苯等化合物，成本高，而且步骤繁琐不易提纯，在其化学生产过程还会产生大量副产物。这不仅会污染环境，而且副产物的大量产生对经济效益也有严重的影响。
咖啡酸在蓝藻中的生物合成目前也有研究：Xue等在Synechocystis sp.PCC6803的代谢途径引入REF8代谢途径，再加入外界碳源对香豆酸的条件下，将对香豆酸转化为7.2mg/L的咖啡酸。但是需要外界碳源对香豆酸的支持，成本较高，因而无法进行大规模生产。
发明内容
针对现有技术，本发明要解决的技术问题是一种用于合成咖啡酸的构建体，应用了该构建体的底盘生物能够催化CO2直接合成咖啡酸，无需外界碳源对香豆酸的支持，成本低，适于进行大规模生产。
为解决上述问题，本发明提供一种用于合成咖啡酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的苯丙氨酸酶基因(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶基因(C4H)和对香豆酸-3-羟化酶基因(REF8)三个基因，其中苯丙氨酸酶基因序列如SEQID NO.5所示，肉桂酸-4-羟化酶基因序列如SEQ ID NO.6所示，对香豆酸-3-羟化酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。
可选地，其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。
可选地，所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。
可选地，其在两端具有集胞藻PCC6803的slr2081基因的N-末端序列和C-末端序列，以用于同源重组。
可选地，在所述蓝细菌中具有活性的所述启动子为Pcpc560。
可选地，所述蓝细菌为集胞藻PCC6803。
一种载体，其包含上述任一所述的用于合成咖啡酸的构建体。
一种蓝细菌，用上述所述的载体转化得到。
用上述载体转化的蓝细菌。
一种蓝细菌，其包含上述任一所述的用于合成咖啡酸的构建体。
一种在蓝细菌中生产咖啡酸的方法，所述方法包括：在合适于合成咖啡酸的条件下培养上述任一的蓝细菌；以及从所获得的培养物中提取所述的咖啡酸。
本发明与现有技术的不同之处在于：
(1)以蓝藻为底盘生物进行改造合成咖啡酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于化学生产方法，生产成本大幅度降低；相对于外加对香豆酸合成咖啡酸的生物合成方法，成本也大幅降低。
(2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制。
(4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高。
(5)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本发明工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产路线。
附图说明
图1为本发明实施例1中外源基因整合示意图；
图2为本发明实施例1中pJS410质粒图谱；
图3为本发明实施例1中重组载体pJS410-PAL-C4H-REF8质粒图谱；
图4为本发明实施例4中咖啡酸生物合成路线图；
图5为本发明实施例4中咖啡酸生物合成的产量图；
图6为本发明实施例4对照组中野生型集胞藻PCC6803的液相结果图；
图7为本发明中实施例4中转基因蓝藻Syn6803的液相结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本发明披露了一种生产咖啡酸的工程蓝藻的制备方法、咖啡酸的合成方法及应用，方法包括在蓝藻细胞里外源表达苯丙氨酸酶(PAL)，肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和对香豆酸-3-羟化酶(REF8)这三个咖啡酸合成关键酶，催化CO2直接生成咖啡酸。主要包括构建集胞藻PCC6803基因表达平台pJS410、重组载体、同源重组、筛选确认以及检测产物五个步骤。利用该合成方式，以蓝藻为底盘生物进行改造合成咖啡酸，生产原料仅需光照和水分等，符合当今绿色生产的方向，且利用该生物手段，与化学提纯方式相比，本发明的生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，生产成本大幅度降低的同时，有效保护了环境，实现了绿色化生产。具体如下各实施例所示。
实施例1
本实施例提供载体质粒的构建过程：根据本发明提供的Synechocystissp.PCC6803(简称Syn6803)的slr2081上、下游，Ome和PrbcL基因序列，slr2081上游基因序列见SEQ ID NO.1，slr2081下游基因序列见SEQ ID NO.2，壮观霉素基因序列见SEQ IDNO.3，强启动子PrbcL序列见SEQ ID NO.4，壮观霉素抗性基因和强启动子序列PrbcL链接后插入到slr2081上游基因序列和slr2081下游基因序列之间，载体基本结构如图2所示。按照图2中的质粒图谱构建集胞藻PCC6803基因表达平台pJS410。
根据PAL，C4H和REF8基因序列，按照Synechocystis sp.PCC6803细胞密码子偏好性设计相应基因的核酸序列。苯丙氨酸酶基因序列(PAL)见SEQ ID NO.5，肉桂酸-4-羟化酶基因序列(C4H)见SEQ ID NO.6，对香豆酸-3-羟化酶基因序列(REF8)见SEQ ID NO.7。将PAL，C4H和REF8送市面上具有基因合成能力的公司合成，三个基因PAL、C4H、REF8的序列片段插入到表达载体pJS410中，设计具有600bp左右大小的同源臂序列，按照图3中的质粒图谱，利用分子生物学技术将这三个基因整合到pJS410载体上，得到带有壮观霉素抗性基因的重组载体pJS410-PAL-C4H-REF8。本实施例中PAL基因根据红酵母中基因的氨基酸序列进行优化合成；C4H基因根据酵母中基因的氨基酸序列进行优化合成；REF8基因根据拟南芥中基因的氨基酸序列进行优化合成。
Slr2081是本发明提供的Synechocystis sp.PCC6803基因组上的一段同源序列，slr2081的作用是，我们可以通过同源重组技术将外源基因插入到slr2081上下游片段之间，这样即把外源基因整合到了Synechocystis sp.PCC6803的基因组中，同时不会影响原来基因组的功能。
外源基因整合原理是基因的同源重组，如图1所示，本发明将集胞藻PCC6803的slr2081同源臂上下游片段分别连在需要插入的外源基因两端，通过slr2081上下游片段的基因重组，将外源基因重组到Synechocystis sp.PCC6803的slr2081位点，其中PrbcL为启动子元件控制基因表达，Ome是壮观霉素基因，用来筛选含有外源基因的蓝藻。
实施例2
本实施例提供重组转化过程：
1)将野生型Synechocystis sp.PCC6803在恒温光照培养箱培养至生长旺盛阶段(OD730＝0.6-0.8或者OD600＝1.1-1.2)。取出30mL Syn6803藻液，4500rpm离心15min，去除上清液；
2)用等体积新鲜无抗的BG11培养基将藻体洗涤2次，4500rpm离心15min，去除上清液；
3)加入1mL BG11将离心后的藻体吸打重悬，并转移至1.5mL灭菌EP管中，向其中小心加入约10μg质粒pJS410-PAL-C4H-REF8，震荡混匀；
4)在光照培养箱至少光照培养4h；
5)约4h后，在BG11固体平板铺上事先灭好菌的0.45μm纤维素滤膜，并排出滤膜和固体培养基之间的气泡。将1mL光照转化后的蓝藻藻液均匀分为5等分(每等分200μL)，用玻棒均匀涂在5个平板的滤膜上，在超净台正置20min后，在恒温光照培养箱倒置光照培养24h；
6)24h后，将滤膜转移到10ng/μL壮观霉素抗性的BG11固体平板上；
7)将BG11固体平板倒置放在30℃恒温光照培养箱光照培养至少1个月，待转化子长出(若培养期间固体BG11平板出现干涸，则将膜转移至新的有抗培养基)；
8)蓝藻转化子长出后，用无菌牙签挑取转化子于10ng/μL壮观霉素抗性平板划线纯化，待转化子长出后进行PCR验证。
需要注意的是，除离心外以上操作均需在超净台进行。
实施例3
本实施例提供转基因蓝藻的筛选确认和产物的检测过程：挑取10个左右含有10μg/mL壮观霉素BG11固体培养基上长出来的单克隆蓝藻菌斑，接入5mL 20μg/mL壮观霉素BG11液体培养基中培养，待蓝藻培养好后，提取基因组，以设计好的引物PCR验证PAL，C4H和REF8三个目的基因，并PCR将产物送测序，确定基因序列是否正确；将验证正确的转PAL，C4H和REF8基因的转基因蓝藻Syn6803接入100mL BG11液体培养基中光照培养，待OD730为1时，用细胞破碎仪破碎蓝藻细胞，分离提纯后用高效液相色谱仪检测。
实施例4
本实施例提供咖啡酸的合成：如图4所示，在转基因蓝藻Syn6803细胞里外源表达PAL，C4H和REF8这三个咖啡酸合成关键酶，直接催化CO2生成咖啡酸，PAL催化一分子苯丙氨酸生成一分子肉桂酸，然后C4H催化肉桂酸生成对香豆酸，最后REF8催化对香豆酸生成最终产物咖啡酸。
以上实验均用野生型PCC6803做阴性对照，其中对照组的咖啡酸液相图如图5所示，实施例的液相结果如图6所示。根据图5可以得出，野生型PCC6803做咖啡酸产物分析，没有峰图出现，说明其不产出咖啡酸，而根据图6所示，本实施例中的转基因蓝藻Syn6803有咖啡酸峰图出现，说明其可以产出咖啡酸。由此证明本实施例中公开的转基因蓝藻Syn6803具有生产咖啡酸的效果，且该过程绿色环保低成本。
本发明人分别在蓝细菌PCC6803和转基因蓝藻Syn6803中检测了咖啡酸产量，野生型蓝细菌PCC6803中未检测到咖啡酸的产生，转基因蓝藻Syn6803检测到了咖啡酸的产生，蓝藻细胞OD730达到1.028时，其生产咖啡酸的能力为8.603mg/L,产量如图5所示。
图6和图7分别展示了野生型蓝细菌PCC6803和转基因蓝藻Syn6803的生长以及咖啡酸的生产情况。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波市妇女儿童医院
<120> 用于合成咖啡酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法
<130> 2021/11/1
<141> 2021-11-15
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 610
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcaatgcta gcagcccaag atgccaatca gtgaagatct caaacaagct attcggcaac 60
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ggcatggctt tctgttaaaa ataaacaagc actgcccttt cccgctcaga gcgcatgact 180
aaccagccca ccgcatcggt tccctttcaa cgcccctggc acgactatct caaattcagc 240
accgatcaca aagtcattgg cattcaatat ttactgatgt ccttctgctt cttcttagtg 300
gcgggattat tggccatgat tatccgggca gaattactca ccccccaatt ggacgtggtg 360
gaccgtagcc tctacaacgg tctatttacc ctccacggca ccatcatgat tttcctctgg 420
atttttccag ccaatgtggg gttagccaat tacttaattc ccctgatgat tggtgccagg 480
gacgtagcct ttccggtatt gaatgcgatc gccttttggc taatgccagt ggtgggagtg 540
ttattgattg gtagcttttt tctacccaca gggacggccc aggcgggctg gtggtcctat 600
cctccagt 608
<210> 3
<211> 1079
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 3
gctcacgcaa ctggtccaga accttgaccg aacgcagcgg tggtaacggc gcagtggcgg 60
ttttcatggc ttgttatgac tgtttttttg gggtacagtc tatgcctcgg gcatccaagc 120
agcaagcgcg ttacgccgtg ggtcgatgtt tgatgttatg gagcagcaac gatgttacgc 180
agcagggcag tcgccctaaa acaaagttaa acatcatgag ggaagcggtg atcgccgaag 240
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 300
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 360
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 420
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 480
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 540
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 600
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 660
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 720
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 780
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 840
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aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat 960
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<210> 4
<211> 277
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 4
tcaccatttg gacaaaacat caggaattct aattagaaag tccaaaaatt gtaatttaaa 60
aaacagtcaa tggagagcat tgccataagt aaaggcatcc cctgcgtgat aagattacct 120
tcagaaaaca gatagttgct gggttatcgc agatttttct cgcaaccaaa taactgtaaa 180
taataactgt ctctggggcg acggtaggct ttatattgcc aaatttcgcc cgtgggagaa 240
agctaggcta ttcaatgttt atggaggact gacctag 277
<210> 5
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 5
atggccccct ccgtggattc cattgccacc agtgtggcca attccttgag taatggcttg 60
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ggctttggcg gttccgccga tacccggacc gaagatgcca ttagtttgca aaaagcctta 420
ttagaacatc aattgtgtgg tgtgttaccc accagtatgg atggctttgc cttagggcgc 480
ggcttggaaa attccttgcc cttagaagtg gtgcgcggcg ccatgaccat tcgggtgaat 540
agcttaaccc gtggtcatag tgccgtgcgg attgtggtgt tagaagcctt gaccaacttt 600
ttgaatcatg gcattacccc cattgttccc ttacggggca ccatttccgc ctccggcgat 660
ttgtccccct tgagttatat tgccgcctcc attaccgggc atcccgatag taaagtgcat 720
gtggatggca aaattatgtc cgcccaagaa gccattgcct tgaaaggttt acaacccgtg 780
gtgttaggcc ccaaagaagg cttaggcttg gtgaatggta ccgccgtgag tgccagtatg 840
gccaccttag ccttaaccga tgcccatgtt ttaagtttgt tagcccaagc cttaactgcc 900
ctgaccgtgg aagccatggt gggccatgcc ggcagttttc atcccttttt acatgacgtg 960
acccggcccc atcccactca aattgaagtg gcccgtaata ttcggacctt attagaaggt 1020
agtaaatatg ccgtgcacca tgaaaccgaa gtgaaagtga aagatgatga aggcattttg 1080
cggcaagatc gctatccctt acggtgtagt ccccagtggt taggcccctt agtgagtgat 1140
atgattcatg cccatgccgt gttgagttta gaagccggcc aatccaccac cgataatccc 1200
ttaattgatt tggaaaataa aatgacccat catggcggcg cctttatggc ctctagtgtg 1260
gggaatacca tggaaaaaac ccgtttggcc gtggccttga tgggcaaagt gagttttacc 1320
caattaactg aaatgttaaa tgccgggatg aatcgtgccc tgccctcctg tttagccgct 1380
gaagatccct ccctaagtta tcattgtaaa ggcttggata ttgcggccgc cgcctatact 1440
agtgaattag gccatttagc caatcccgtg agcacccatg tgcaacccgc cgaaatgggt 1500
aatcaagcca ttaatagttt agccttgatt agtgcccggc ggaccgccga agctaatgat 1560
gtgttaagtt tattattagc cacccatttg tattgtgtgt tgcaagccgt ggatttacgg 1620
gccatggaat ttgaacatac caaagccttt gaacccatgg tgactgaatt attaaaacaa 1680
cattttggcg ccttagccac cgccgaagtg gaagataaag tgcgtaaaag tatttataaa 1740
cggttacaac aaaataatag ttatgattta gaacaacgtt ggcatgatac ctttagtgtg 1800
gccaccgggg ccgtggtgga agccttagcc ggtcaagaag tgagtttagc ctccttgaat 1860
gcctggaaag tggcctgtgc tgaaaaagcc attgccttga cccggtccgt gcgggatagt 1920
ttttgggccg cccccagtag tagtagtccc gccttgaaat atctgagtcc ccggacccgt 1980
gtgttgtata gttttgtgcg ggaagaagtg ggcgtgaaag cccgccgggg cgatgtgtat 2040
ttaggtaaac aagaagtgac cattggtacc aatgtgagtc ggatttatga agccattaaa 2100
tccggtcgga ttgcccccgt gttggtgaaa atgatggcct aa 2142
<210> 6
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 6
atggatttgt tgctgttgga aaaatccttg attgccgtgt ttgtggccgt gattttagcc 60
accgtgatta gtaaattgcg tggtaaaaaa ttaaaattgc cccccggtcc cattcccatt 120
cccatttttg gcaattggct gcaagtgggg gatgatctga atcatcggaa tttagtggat 180
tatgccaaaa aatttggtga tttgtttttg ttgcggatgg gtcaacgcaa tttagtggtg 240
gtgtcctccc ccgatttaac taaagaagtg ttattaaccc agggtgttga atttggaagc 300
cgtacccgca atgttgtgtt tgatattttt accgggaaag gtcaagatat ggtgtttacc 360
gtgtatggtg aacattggcg caaaatgcgt cggattatga ccgttccctt tttcaccaat 420
aaagtggtgc agcaaaatcg tgaaggttgg gaatttgaag ccgccagtgt ggtggaagat 480
gtgaagaaaa atcccgattc cgccaccaaa ggcatcgtgt tgcggaaacg gttgcaatta 540
atgatgtata ataacatgtt tcggattatg tttgatcgtc gctttgaaag tgaagatgat 600
cccttatttc tgcggctgaa agccctgaat ggcgaacgca gtcgcttagc ccaatccttt 660
gaatataatt atggggattt tattccaatt ttacgtccgt ttctgcgtgg gtacttgaaa 720
atttgtcaag atgtcaaaga tcggcggatt gccttattta aaaaatattt tgtggacgaa 780
cggaaacaaa ttgcctcctc caaacccacc gggagtgaag ggttgaaatg tgccattgat 840
catattttag aagctgaaca aaaaggtgaa attaatgaag ataatgtgtt atatattgtg 900
gaaaatatta atgtggccgc cattgaaacc accttgtggt ccattgaatg gggcattgct 960
gaattggtga atcaccctga aattcaatcc aaattacgga atgaattaga tacggtttta 1020
ggtcctggcg tgcaagtgac tgaacccgat ctgcataaac tgccctattt gcaagccgtt 1080
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acctccgaaa aaggcgggca attttccttg catattttga atcattccat tattgtgatg 1500
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<210> 7
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 7
atgagttggt ttttaattgc cgtggccacc attgccgccg tggtgtccta taaattaatt 60
caacggttgc ggtataaatt tccgcccggc cccagtccca aacccattgt gggtaatttg 120
tatgatatta aacccgtgcg ctttcgctgt tattatgaat gggcccaatc ctatggtccc 180
attattagtg tgtggattgg gagtattttg aatgtggtgg tgtccagtgc cgaactggcc 240
aaagaagtgt tgaaagaaca tgatcaaaaa ttggccgatc gtcatcggaa tcgttccacc 300
gaagcctttt cccggaatgg ccaagatttg atttgggccg attacggtcc ccattatgtg 360
aaagtgcgta aagtgtgcac cttagaatta tttaccccca aacggttgga aagtttacgg 420
cccattcgtg aagatgaagt gaccgccatg gtggaaagtg tgtttcggga ttgcaatttg 480
cccgaaaatc gcgccaaagg gttacaactg cgcaaatatt tgggtgccgt ggcctttaat 540
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cagggcttgg aatttaaagc cattgtttcc aatggtttga aattaggtgc ctccctgtcc 660
attgccgaac atattccctg gttgcgctgg atgtttcccg ccgatgaaaa agcctttgcc 720
gaacatgggg ctcggcgtga tcgcttgacc cgcgccatta tggaagaaca taccttggcc 780
cggcaaaaat cctccggcgc caaacaacac tttgtggatg ccttgttgac cttgaaagat 840
caatatgatc tgagtgaaga taccattatt ggtttgttgt gggatatgat taccgccggt 900
atggatacca ccgccattac cgccgaatgg gccatggccg aaatgattaa aaatcctcgg 960
gtgcaacaaa aagtgcaaga agaatttgat cgggtggtgg gcttagatcg cattttaacc 1020
gaagccgatt ttagtcgctt gccctattta caatgcgtgg tgaaagaaag ttttcgtttg 1080
catcccccca cccccttgat gttgccccat cggtccaatg ccgatgtgaa aattggcggc 1140
tatgatattc ccaaaggcag taatgtgcat gtgaatgtgt gggccgtggc ccgcgatccc 1200
gccgtgtgga aaaatccctt tgaatttcgg cccgaacgct ttctggaaga agatgtggat 1260
atgaaagggc atgattttcg gttgctaccc tttggcgccg gccggcgcgt gtgtcccggc 1320
gcccaattgg gcattaattt ggtgacctcc atgatgagtc atttattgca tcattttgtg 1380
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gtgacctata tgcgcacccc cgtgcaagcc gtggccaccc cccggttgcc cagtgattta 1500
tataaacggg tgccctatga tatgtaa 1527

Claims (10)

1.一种用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于，包含有：
在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的苯丙氨酸酶基因、肉桂酸-4-羟化酶基因和对香豆酸-3-羟化酶基因三个基因，其中苯丙氨酸酶基因序列如SEQ IDNO.5所示，肉桂酸-4-羟化酶基因序列如SEQ ID NO.6所示，对香豆酸-3-羟化酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。
3.根据权利要求2所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：其在两端具有集胞藻PCC6803的slr2081基因的N-末端序列和C-末端序列，以用于同源重组。
5.根据权利要求1所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：在所述蓝细菌中具有活性的所述启动子为Pcpc560。
6.根据权利要求1-5任一所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：所述蓝细菌为集胞藻PCC6803。
7.一种载体，其特征在于：其包含权利要求1-6任一所述的用于合成咖啡酸的构建体。
8.一种蓝细菌，其特征在于，用权利要求7所述的载体转化得到。
9.一种蓝细菌，其特征在于：其包含权利要求1-6任一所述的用于合成咖啡酸的构建体。
10.一种在蓝细菌中生产咖啡酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
在合适于合成咖啡酸的条件下培养权利要求8或9中的蓝细菌；以及
从所获得的培养物中提取所述的咖啡酸。
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