CN103382482A

CN103382482A - 一种食用安全性整合型螺旋藻高效表达载体及其应用技术

Info

Publication number: CN103382482A
Application number: CN2012101329638A
Authority: CN
Inventors: 李明刚; 李宠; 乔坤艳; 张耀方; 马百成; 马志华; 马超; 董震; 郝军凤; 姬艳丽
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2013-11-06

Abstract

本发明描述了一种食用安全性整合型螺旋藻高效表达载体p21GZ-GAG的构建方法及应用技术。该载体含有GFP标签、螺旋藻特异性启动子和10拷贝促胰岛素GLP-1基因。通过去除自杀质粒pSZ21中Tn5转座单元的抗生素基因构建载体p21GZ；分别克隆GFP、螺旋藻特异启动子AP以及10拷贝促胰岛素GLP-1基因，并串联连接成表达单元GAG，将其插入p21GZ获得p21GZ-GAG。该载体保留了其自杀型质粒和Tn5介导的转座整合能力，可将表达单元GAG整合进螺旋藻基因组，通过螺旋藻特异启动子AP启动GLP-1的表达；剔除抗性标记而通过GFP进行筛选，保证其食用安全性，可研发防治糖尿病的保健品。

Description

一种食用安全性整合型螺旋藻高效表达载体及其应用技术

技术领域

本发明涉及一种食用安全性整合型螺旋藻高效表达载体及其应用技术，属生物技术领域。

背景技术

钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)又称蓝细菌，属于蓝藻纲，藻殖段目，颤藻科，是一种低等单细胞原核植物(如无特别说明本专利所指螺旋藻均为钝顶螺旋藻)。螺旋藻富含蛋白质、矿物质、B族维生素、β-胡萝卜素、必需脂肪酸等营养成分，螺旋藻对多种疾病有预防及辅助治疗的作用，是一种天然的营养保健食品(Mar.Biotechnol.，2004，6：355-363；Bioresource Technology，1999，70：89-93)。

整合型表达载体是指能够将外源目的基因插入宿主细胞基因组中稳定遗传的表达载体，相对于附加型质粒表达载体，整合型表达载体具有更高的遗传稳定性。

自杀性质粒载体是指由于其所含的复制起点，在转化进入目标宿主细胞后不能被其识别起始该质粒复制，最终自动消失的质粒载体。

自杀性质粒pSZ21(如图1)，由质粒pACYC184衍生而来，大小为11.4kb，包含Tn5转座子序列、来源于Tn9的氯霉素抗性基因和pACYC184的复制起点。由于其骨架质粒pACYC184的复制起点不能在大肠杆菌以外的宿主细胞中进行复制，当pSZ21转入其他受体如螺旋藻时，质粒最终将被降解而消除，除非在此之前质粒上的Tn5转座子发生了转座而整合进宿主细胞基因组中，整合单元才会对宿主细胞产生影响(科学通报，1990，4：302-305；Mol.Gen.Genet.，1984，196：413-420)。

Tn5转座子最早是在Escherichia coli中被发现的，序列全长5818bp，包括含有卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、链霉素抗性基因的中央序列和两个1534bp的末端反向重复序列(IS50)，其结构如图2所示。Tn5转座子属于非复制型转座子，可以在转座酶Tnp的作用下，从供体DNA跳跃到受体DNA。Tn5转座子属于IS4家族，左末端(IS50L)和右末端(IS50R)高度同源，唯一不同的是IS50L的第1442碱基处有一个赭石突变，该突变使得IS50L不能像IS50R一样编码有功能的转座酶。IS50R除了编码转座酶(Tnp)外，还编码一个阻遏蛋白(Inh)。IS50的19bp的倒置末端是Tnp的作用位点。包含3个抗生素抗性基因的中央序列对转座并不起任何作用。IS50L的右端1413bp-1462bp处为抗生素抗性基因的启动子，启动三个串联抗性基因的转录(Mol. Cell Biol，2001，21：459-466；J. Biol. Chem，1999，274：86-92；广西农业生物科学，2003，22：316-320)。

绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)是从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，在蓝色波长范围的光线激发下，该蛋白会发出绿色荧光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是分子生物学中常用的报道基因。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)又称促胰岛素，是一种由远端回肠及结肠的L细胞分泌的促胰岛素。GLP-1具有影响胃肠动力、抑制胃酸分泌、抑制胰高糖素分泌、引起饱食感、减少摄食活动、增加依赖于葡萄糖的胰岛素分泌以及胰岛β-细胞增生等作用。天然GLP-1在体内很快被DPP-IV(二肽酶IV)在N端第二位脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)之间特异性切割而失活，其体内半衰期仅2-5分钟(Lancet，2006，368：1696-1705)。

发明内容

本发明的目的是：

1)以质粒pSZ21为基础，在保留其Tn5转座(重组)功能的情况下去除转座子中卡那霉素、新霉素、链霉素抗性基因，构建转座单元不含抗生素基因的载体p21GZ。

2)克隆螺旋藻特异性启动子AP，构建包含GFP、AP、10GLP-1串联结构的表达单元GAG。

3)构建含有GAG表达单元的表达载体p21GZ-GAG和携带该载体的大肠杆菌株系。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

首先，本发明提供了一个去除pSZ21重组部分中的卡那霉素、新霉素、链霉素抗性基因的表达载体p21GZ。

本发明以自杀型质粒pSZ21为基础，设计一对引物对Tn5三个抗性基因以外部分进行长片段PCR扩增，得到线性载体，然后使其自连，在保证质粒其他功能不受影响的情况下去除了抗性基因标记。

载体p21GZ的构建过程(图3)如下：

设计并合成一对引物并对其进行磷酸化处理，以质粒pSZ21为模版，PCR克隆得到大约9.5kb的不含三个抗性基因的线性载体，通过载体自连转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选得到转座单元无抗生素标记的载体，将其命名为p21GZ。

其次，本发明提供了一个表达单元GAG，该表达单元由绿色荧光蛋白GFP基因、螺旋藻特异性启动子AP(GenBank注册号：AB102782.1)以及10拷贝促胰岛素编码基因10GLP-1串联而成。

通过Tn5IS50L右端启动子(原卡那霉素抗性基因启动子)启动GFP基因表达，通过螺旋藻特异启动子AP启动10GLP-1的高效表达。其中10GLP-1由本实验室前期克隆，其特征在于消除了DPP IV和胰蛋白酶识别位点，该基因保存于大肠杆菌表达载体pET-22b(+)上(Biosci.Biotechnol. Biochem，2007，71：1462-1469)。

表达单元GAG的构建过程(图4)如下：

运用PCR的方法分别克隆得到GFP序列、AP启动子、10GLP-1序列(包括其下游T7终止子)并分别插入到克隆载体pMD19-Tsimple中，获得pMD19-T simple-GFP、pMD19-Tsimple-AP和pMD19-T simple-10GLP-1。然后以pMD19-Tsimple-10GLP-1为基本载体，通过酶切连接将AP启动子插入到pMD19-T simple-10GLP-1载体10GLP-1基因的上游得到pMD19-T simple-AP-10GLP-1，然后将GFP插入到AP基因的上游，得到含GFP-AP-10GLP-1(GAG)表达单元的pMD19-T simple-GAG质粒。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体是通过将GAG表达单元插入p21GZ载体中得到的载体p21GZ-GAG。该载体利用IS50L右端的原抗生素基因启动子启动GFP的组成型表达，用螺旋藻特异性启动子AP起始10GLP-1的表达。载体p21GZ中的Tn5抗性基因被去除但仍保留其转座功能，保证其携带GAG单元转座从而整合进宿主基因组。其构建过程(图5)如下：

将克隆载体pMD19-T simple-GAG和p21GZ分别用SalI酶切，回收GAG表达单元和线性p21GZ，将二者用T4连接酶连接，从而获得p21GZ-GAG表达载体。

本发明的有益效果：

构建的整合型螺旋藻特异表达载体p21GZ-GAG，利用Tn5转座子的转座特性能将GAG表达单元整合进目标宿主基因组中稳定遗传。因该载体无抗生素选择标记基因，食用安全，用其转化螺旋藻，构建能够稳定高效表达促胰岛素的螺旋藻，可用于开发防治糖尿病的保健食品。

附图说明

图1pSZ21载体结构图谱。

图2Tn5的结构图谱。

图3p21GZ的构建过程图。

图4GAG表达单元的构建过程图。

图5p21GZ-GAG的构建过程图。

图6AP、10GLP、GFP三个基因PCR克隆电泳检测结果。(A)AP启动子PCR克隆电泳检测结果，泳道1-3，PCR产物，泳道4，50bp DNALadder；(B)10GLP-1PCR克隆电泳检测结果，泳道1，200bp DNA Ladder；泳道2-3PCR产物。(C)GFP PCR克隆电泳结果，泳道1，200bp DNA Ladder；泳道2和3PCR产物。

图7pMD19-T simple-AP-10GLP-1转化子的鉴定结果。(A)pMD19-Tsimple-AP-10GLP转化子菌液PCR检测结果，泳道1，200bp DNA Ladder，泳道2-4阳性转化子；泳道5，阴性转化子；泳道6，阳性对照。(B)pMD19-T simple-AP-10GLP质粒PstI、SalI双酶切结果，泳道1，200bp DNA Ladder，泳道2-5阳性转化子。

图8GAG表达单元的鉴定结果。(A)菌液PCR电泳检测结果，泳道1，200bp DNALadder；泳道3阳性转化子；泳道2、4、5，阴性转化子；(B)酶切鉴定电泳检测结果。泳道1，200bp DNA Ladder；泳道2pMD19-T simple-GAG PstI酶切结果。

图9p21GZ-GAG转化子的PCR及酶切鉴定结果。泳道1，200bp DNA Ladder；泳道2，300bp DNALadder；泳道3-4，SalI酶切结果；泳道5，GAG表达单元PCR结果；泳道6，用引物P3、P7PCR鉴定插入方向结果。

图10，p21GZ构建过程中长片段PCR及自连载体酶切鉴定结果。(A)以pSZ21为模版进行长片段PCR电泳结果。泳道1，1kb DNALadder；泳道2PCR产物。(B)自连载体酶切结果。泳道1和12为1kb DNALadder，泳道2-3，样品A酶切产物及载体对照；泳道4-5，样品B酶切产物及载体对照；泳道6-7，样品C酶切产物及载体对照；泳道8-9，样品D酶切产物及载体对照；泳道10-11，样品E酶切产物及载体对照。结果显示样品B被切开。

图11螺旋藻特异启动子AP碱基序列。

图12GFP基因的核苷酸序列。

图1310GLP-1基因核苷酸序列。

图14GAG表达单元核苷酸序列。

图15Tn5核苷酸序列。

具体实施方式

实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆手册中所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。

实施例1

载体p21GZ的构建过程，包括如下步骤：

(1)根据pSZ21载体中Tn5转座子的序列(图15)设计合成一对引物，对引物进行5′磷酸化处理后，以pSZ21为模板对Tn5上三个串联抗性基因以外的部分进行PCR扩增，扩增得到不含三个抗性基因的线性载体。设计的引物序列如下：

P1：5′-GTCGACTGGAGGCTCGACTCAGCATTG-3′

P2：5′-AATCATGCGAAACGATCCTCATCC-3′

P1的上游引入SalI位点，用下划线表示。

(2)用引物P1、P2以pSZ21为模版进行PCR扩增，使用的DNA聚合酶为Stratagene公司生产的PfuUltra II Fusion HS DNAPolymerase，条件为其说明书推荐条件。得到大约9.5kb的PCR产物，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图10A)。对扩增产物进行回收，自连，并转化DH5a，挑取转化子提取质粒，进行SalI酶切鉴定(图10B)，并对酶切鉴定阳性的质粒的自连部分进行测序，最终得到载体p21GZ。测序引物P9根据Tn5上原抗性基因下游序列进行设计，其序列为：

P9：5′-GACCTAGCTCGACGACCAGG-3′。

实施例2

表达单元GAG的构建过程。包括如下步骤：

(1)PCR克隆GFP基因，电泳检测(图6C)回收，TA克隆到pMD-19T simple载体，构建得到pMD-19T simple-GFP。根据GFP序列设计PCR引物序列如下：

P3：5′-CTGCAGGTCGACAAGGGCGAGGAGCTG-3′

P4：5′-CTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTC-3′

P3的上游引入PstI和Sal I位点，P4上游引入PstI位点，均用下划线表示。

(2)对位于大肠杆菌表达载体pET-22b(+)上的10GLP-1连同其下游T7终止子进行PCR克隆，电泳检测(图6B)，TA克隆到pMD19-Tsimple中，得到pMD19-Tsimple-10GLP-1。PCR引物序列如下：

P5：5′-CTGCAGCGGGATCCAA GGA CAGCCGGCGATGGCC-3′

P6：5′-GTCGACATCCGGATATAGTTCCTC-3′

P5的上游引入PstI和BamHI位点，P6的上游引入SalI位点，均用下划线表示，P5上游还加入促进mRNA翻译的SD序列，用斜体表示。

(3)CTAB法提取螺旋藻基因组。根据AP启动子(GenBank注册号：AB102782.1)序列设计一对引物，PCR克隆得到AP序列，电泳检测(图6A)，回收TA克隆到pMD19-Tsimple载体。PCR引物序列如下：

P7：5′-CTGCAGGATCGCATTTCCGACCCG-3′

P8：5′-GGATCCGATCATAACCCACATCAGCCACAT-3′

P7上游添加PstI位点，P8上游添加BamHI位点，均用下划线表示。

(4)以pMD19-T simple-10GLP-1为基本载体，通过PstI和BamHI双酶切，然后连接将AP启动子插入到pMD19-T simple-10GLP-1载体中10GLP-1基因的上游得到pMD19-Tsimple-AP-10GLP-1，然后通过PstI酶切、连接将GFP插入到AP基因的上游，得到pMD19-Tsimple-GFP-AP-10GLP-1，通过引物P3、P6进行PCR鉴定GFP的插入方向，筛选正向插入转化子，最终将GFP(729bp)、螺旋藻特异性启动子AP(192bp)及10GLP-1连同终止子序列(1192bp)三个片段顺序连接(图5)，构成长2.1kb的GFP-AP-10GLP表达单元(简称GAG)。

实施例3

一种含有GAG表达单元的表达载体p21GZ-GAG的构建。包括如下步骤：运用SalI对p21GZ和pMD19-T simple-GAG进行酶切，电泳回收线性化的p21GZ片段和GAG表达单元，将二者进行连接。通过PCR鉴定GAG表达单元的插入方向(图9)。PCR鉴定所用引物为P3、P9。

所得到载体即为本发明所述的食用安全性整合型螺旋藻高效表达载体，即含有以GFP为安全选择标记的GAG表达单元的螺旋藻特异表达载体p21GZ-GAG。

Claims

1.一种表达载体p21GZ，其特征在于该载体源于自杀型质粒pSZ21，在保留其中Tn5转座功能的基础上去除了Tn5中的抗性基因。

2.一种表达单元GAG，该表达单元包含串联的绿色荧光蛋白GFP基因、螺旋藻特异性启动子AP以及10拷贝促胰岛素编码基因10GLP-1。其特征在于，该表达单元以GFP作为报告基因，通过螺旋藻特异性启动子AP启动10拷贝促胰岛素的高效表达。

3.一种表达载体p21GZ-GAG，该表达载体通过将权利要求2所述表达单元GAG插入权利要求1所述载体p21GZ中获得。其特征在于该表达载体能够通过Tn5介导的转座整合进宿主基因组，可以GFP进行荧光筛选，特异性高效表达多拷贝促胰岛素GLP-1。

4.一种大肠杆菌菌株NK-Ec007，其特征在于，含有权利要求3所述的表达载体p21GZ-GAG。

5.一种含有如权利要求3所述表达载体p21GZ-GAG的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，通过PCR扩增和酶切连接的方法获得权利要求1所述载体p21GZ和权利要求2所述的GAG表达单元，将GAG表达单元插入p21GZ中得到权利要求3所述的表达载体p21GZ-GAG，并将该表达载体转化大肠杆菌得到权利要求4所述菌种。

6.一种权利要求3所述方法获得表达载体的用途，其特征在于，用其转化螺旋藻可获得稳定高效表达多拷贝促胰岛素的螺旋藻藻(菌)株，不含抗生素筛选标记，该藻(菌)株可用于开发功能性保健品。