CN106801048A

CN106801048A - 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法

Info

Publication number: CN106801048A
Application number: CN201710117439.6A
Authority: CN
Inventors: 赵磊; 涂然; 王钦宏; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2017-03-01
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2037-03-01
Also published as: CN106801048B

Abstract

本发明公开了一种低温碱性蛋白酶及其制备方法，其在低温条件下尤其4‑15摄氏度条件下，在平板酶解圈法和荧光显色法测试中均比野生株的碱性蛋白酶具有更好的酶活，具备应用于洗涤产品的前景，且在制备过程中利用了不同的枯草芽孢杆菌的转化方法，提高了转化的效率，较现有的制备方法具有时间短效率高的优点。

Description

一种低温碱性蛋白酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及基因的定点突变和重组技术，尤其是一种低温碱性蛋白酶及其制备方法。

背景技术

蛋白酶是具有水解蛋白质肽键的一类酶的总称，可用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学、工业、废物处理等方面。尤其是碱性蛋白酶因其具有外源表达技术成熟、相对较高的酶活性，在洗涤剂工业领域中有重要应用价值。目前全世界工业用酶制剂中洗涤剂酶约占1/3。近年来国内外洗涤剂工业较具变革性的成果就是使用酶制剂，使洗涤剂朝低磷或无磷化的方向发展，减少环境污染，加酶洗涤剂在洗涤剂中所占的比重越来越大。目前，作为洗涤剂添加剂的碱性蛋白酶多为中温蛋白酶，最适反应温度通常在50～70℃。但洗涤剂在日常生活中，通常在室温28℃甚至更低温度中使用，因此添加到洗涤剂中的碱性蛋白酶的催化效率并不高。蛋白酶制剂在低温条件下更高的酶活性质对于其在节能洗涤行业中的应用有着重要意义。

近年来随着世界洗涤领域发生的根本性改变，全球洗衣正向着低温、节水型发展，以便节约能源，所以要求洗涤剂用酶(主要是碱性蛋白酶)在低温条件下仍然维持相对高的酶活性。温度是影响生化反应的重要因素，温度每下降10℃，生化反应速度将降低2-3倍。中温酶和高温酶的最适反应温度都较高，在低温下反应活性很低。由于低温碱性蛋白酶在低温下具有较高的活性，因此越来越受到关注。传统的作为洗涤剂添加剂的碱性蛋白酶的最适反应温度通常在50～70℃，在低温下的酶活性很低，所表现出的清洁能力已难以满足消费者的需求。如：Savinase 4.0T低温碱性蛋白酶在pH 10条件下，最适反应温度55℃、20℃时相对活性约为15％。Properase CT低温碱性蛋白酶在pH 10条件下，最适反应温度50℃-55℃，20℃时相对活性约为42％。所以，传统的洗涤剂用酶在低温条件下的酶活性已不适应新一代加酶洗涤剂的发展。低温碱性蛋白酶其最适反应温度通常在40℃以下，应用在食品、洗涤剂、化妆品、水产饲料等工业上，有着中温蛋白酶无法取代的优越性，因此对中温蛋白酶低温进化是非常必要的。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提供了一种在低温条件下酶活高的碱性蛋白酶及其制备方法。

本发明实现目的技术路线如下：

一种低温碱性蛋白酶，具有如下氨基酸序列：

将SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列中的(a)93位、(b)151、(c)217、(d)223位替换为如下氨基酸残基：

在位置(a)：精氨酸，

在位置(b)：精氨酸，

在位置(c)：色氨酸，

在位置(d)：天冬酰胺。

而且，所述的一种低温碱性蛋白酶，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，优选B.subtilisWB800作为表达宿主，或B.subtilis SCK6作为表达宿主，以pBCS为质粒。

而且，所述的一种低温碱性蛋白酶相比于SEQ ID NO.1编码的碱性蛋白酶，在4摄氏度-15摄氏度条件下具有更高的酶活力。

一种低温碱性蛋白酶的制备方法：按照下列步骤进行：

(1)将野生碱性蛋白酶基因与载体相连，得到携带野生碱性蛋白酶基因的重组表达载体；

(2)对携带野生碱性蛋白酶基因的重组表达载体进行定点突变，得到携带低温碱性蛋白酶基因的重组表达载体；

(2)将重组载体转化入宿主菌株中，得到重组细胞；

(4)将重组细胞进行发酵制备低温碱性蛋白酶；

(5)提取低温碱性蛋白酶。

而且，所述的重组载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBCS，pBCS是一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，含有一个强启动子P43启动蛋白酶基因的转录，一个芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽用于指导菌体中合成的蛋白酶分泌到胞外。

而且，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌为B.subtilis SCK6。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明使用重叠PCR技术，对野生型碱性蛋白酶进行定点突变，利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，转化枯草芽孢杆菌，得到一种具有适冷性的低温碱性蛋白酶，并且这一种低温碱性蛋白酶在4摄氏度和15摄氏度条件下比野生型蛋白酶酶活力提高了20％，在低温条件下有较高的酶活，可以节省能源，符合低碳发展理念，应用在食品、洗涤剂、化妆品、水产饲料等工业上，有着中温蛋白酶无法取代的优越性，具有明显的经济效益及社会效益。

附图说明

图1为平板酶解圈法测定点突变碱性蛋白酶酶活的示意图。

图2为平板酶解圈法测定点突变碱性蛋白酶酶活的示意图。

图3为荧光法测定点突变碱性蛋白酶酶活的结果示意图。

在上述图中，SC为野生株碱性蛋白酶，M2为93位替换为精氨酸的突变子，M4为151位替换为精氨酸的突变子，M2-6为93位替换为精氨酸、217位替换为色氨酸的突变子，M2-7为93位替换为精氨酸、223位替换为天冬酰胺的突变子。

具体实施方式

下面结合附图与具体的实施方式对本发明作进一步详细描述：

实施例中野生碱性蛋白酶基因为subtilisin Carlsberg，具有序列表中的序列1的氨基酸序列。

实施例中所用的仪器信息如下：

所用菌株信息如下：

所用培养基信息如下：

1)普通培养基

LB培养基：1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母膏，1％(w/v)氯化钠

LB固体培养基：在LB液体培养基中添加1.5％(w/v)的琼脂

LBM培养基：在LB液体培养基中添加1％(w/v)的脱脂牛奶

LBM固体培养基：在LBM液体培养基中添加1.5％(w/v)的琼脂

2)枯草芽孢杆菌感受态细胞制备培养基

枯草电转Growth Medium：LB，0.5M山梨醇

枯草电转Electroporation Medium：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油

枯草电转Recovery Medium：LB，0.5M山梨醇，0.38甘露醇

一、定点突变

1.点突变基因的扩增

1)以携带SC蛋白基因的pBCS-SC质粒为模板，在两个EP管中分别以正向和反向的引物扩增目标基因，以防止易形成引物二聚体的情况。反应体系如下：

EP管1:

EP管2:

PCR循环条件为：95℃预变性30s，循环一次；95℃变性30s，55℃退火1min，68℃延伸3min，共3个循环。

2)将上述两个EP管中的体系混匀，每50μl体系中加入1U Pfu DNApolymerase。再次进行PCR，循环条件为：95℃预变性30s，循环一次；95℃变性30s，55℃延伸1min，68℃退火3min，共15个循环；4℃保存。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.模板的消化

在PCR验证后，在50μl的PCR产物中加入10U的DpnI酶，混匀在37℃温浴过夜，进行模板的消化。

3.产物的纯化与回收

1)将消化的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳；

2)切下琼脂糖凝胶至1.5ml的离心管中；

3)加入6倍体积(如凝胶重为0.1g，则体积可视为100μl，以此类推)Buffer QX1；

4)将QIAEX II溶液重悬30s，取30μl加入到上述样品中；

5)将含有凝胶的离心管置于50℃水浴，溶胶10min，其中每隔2min，涡旋一次，是QIAEX II悬浮，更好的结合DNA，此时溶液正常颜色应为黄色，如果溶液显示橙色，则加入10μl 3M的乙酸钠，颜色即可变成黄色，溶胶时间相应延长5min；

6)12000rpm转速离心30s，小心移走上清；

7)用500μl Buffer QX1洗沉淀，去除残留的琼脂糖凝胶，重悬，12000rpm转速离心30s，小心移走上清；

8)用500μl Buffer PE洗2次，去除残余的盐，重悬，12000rpm离心30s，小心移走上清；

9)晾干10-15min，直至沉淀变白(透明，看不见为止)；

10)加入20μl dd H2O，重悬，12000rpm离心30s，上清即为纯化的DNA。

4.大肠杆菌的转化

1)取上述纯化的DNA进行Nanodrop检测浓度，取50ng-100ng的DNA质粒加入装有50μl大肠杆菌DH5α的EP管中，冰上放置30min；

2)将EP管放入42℃水浴锅中热激90s；

3)加入500μlLB培养基在200rpm，37℃的摇床中培养1h；

4)将菌液离心，弃去上清剩余200μl左右的菌液，涂板，隔夜培养。

5.质粒的提取

在培养过夜的平板上挑取单菌落，放入3ml带氯霉素抗性的液体LB中培养，12h-16h使用质粒提取试剂盒提取质粒。

6.验证与测序

对提取的质粒使用KpnI-HF和NotI-HF酶切位点，进行双酶切，并使用凝胶电泳进行验证，验证正确后送去测序。测序的结果使用VectorNTI软件进行查看，相对于野生型质粒序列，验证目标位点突变正确。

二、质粒的线性化

1.准备Buffer D1和Buffer N1；

2.加入2.5μl或5μl体积的DNA模板；

3.加入2.5μl或5μl体积的Buffer D1。震荡混匀并短暂离心；

室温下(15-25℃)静置3分钟；

4.加入5μl或10μl体积的Buffer N1。震荡混匀并短暂离心；

5.准备master mix；

6.加入40μl或30μl的master mix到步骤5中的10μl或20μl体积的变性DNA；

7.30℃反应10-16h；

8.将REPLI-g Mini DNA Polymerase变性，65℃保温3min；

9.将样品1:20在TE中稀释进行PCR分析，每次PCR反应用3μl体积的稀释DNA；4℃保存，-20℃长期保存。

三、枯草芽孢杆菌的转化-传统电转

1.感受态的制备

1)新鲜平板挑单菌落(小一点为好)接种于3mlLB培养基中，过夜培养；

2)测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.1-0.2之间。(2.5ml菌液加到45mlGM中)。37℃，200rpm培养至OD600＝0.85-0.95(大约3-4小时)左右；

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体；

4)用45ml预冷的电转缓冲液EM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次；

5)将洗涤后的菌体重悬于1.2ml的EM中，每管分装120μl。

2.电击转化

1)将60μl(根据感受态细胞效率可以适量增加用量)感受态细胞中加入1-6μl质粒，冰浴孵育1min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次。电转仪设置：2.5kv，2mm，电击1次(持续时间4.5ms-5ms之间)；

2)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，10000rpm，1min离心，弃700μl上清，将剩余300μl重悬涂板。37℃，过夜培养。

四、枯草芽孢杆菌的转化-基于SCK6的枯草芽孢杆菌的转化

1.SCK6感受态的制备

1)接种新鲜的B.subtilis SCK6菌株的单菌落到3ml带有1μg/ml新霉素的LB培养基中；

2)菌株在37℃，200rpm的条件下培养过夜；

3)将隔夜培养的培养液使用新鲜的混有浓度为1％(w/v)木糖的LB培养基稀释，至浓度A600＝1，再次培养2小时；

4)此时的SCK6细胞已处于感受态，使用10％的甘油分装储存至-80℃以备用。

2.转化

1)在EP管中将1μl经过线性化的质粒与100μl的超级感受态细胞SCK6混匀，在37℃，200rpm的摇床中培养90min；

2)由于SCK6具有很高的转化效率，通常需要稀释103-104倍。并在具有适当抗生素的培养基上涂板过夜。

五、蛋白表达分泌和分析

1.蛋白的表达分泌

将表达的菌株SCK6-SCWT和突变体划线到LB平板，37℃恒温培养箱16h；挑取单克隆至3ml LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养；将培养液12000rpm离心取上清即得蛋白酶的粗酶液。

2.TCA沉淀

取250μl枯草芽孢杆菌的培养液(隔夜培养)；

10000g，4-8℃离心5min；取上清，在冰上孵育5min；

加入100μl冷100％TCA(1:2.5/TCA:sample)，涡旋5秒混匀；

20000g，4-8℃离心10min，弃去上清；

使用100μl冷98％丙酮冲洗试管，4-8℃，20000g离心10min；

弃去上清，开瓶盖风干。使用4*SDS溶解跑胶备用。

3.SDS-PAGE分析

六、蛋白纯化

1.粗酶液纯化：

1)超滤：粗酶液上清使用Stirred Cell超滤装置超滤，将200ml酶液上清放入超滤装置中，通氮气泵(加压超滤装置所能承受75psi压力上限(1psi＝0.006895MPA)约为0.52MPA)加压，放置在磁力搅拌器上，保持转速，并全程保持冰袋孵育；

2)硫酸铵沉淀：取粗酶液放置于冰上并搅拌，分别缓慢加入研磨后的硫酸铵，使体系中的硫酸铵终浓度达到10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％，梯度取样，4℃静置过夜，12000rpm离心10分钟。使用脱脂牛奶法测定上清酶活，确定硫酸铵沉淀梯度。将沉淀的蛋白用pH8.6Tris-HCl缓冲液复溶，装入透析袋。

2.透析

4L Tris/HCl buffer pH9.0透析过夜

3.阳离子交换层析

1)从透析袋中移出经透析的蛋白质溶液，4℃、10000rpm/min离心20min，取上清；

用缓冲液A(buffer)平衡柱约5个柱体积，待电导值稳定；

将上清加载于阴离子交换柱，上样流速1mL/min，收集穿透液

上样完成后，用缓冲液A平衡2个柱体积，待280nm的吸收峰稳定；

用缓冲液B洗脱，待280nm下吸收峰稳定后，用缓冲液A平衡2个柱体积，用超纯水洗脱3-5个柱体积，待电导趋近于零之后，用20％脱气的乙醇溶液平衡2个柱体积，将柱子放入4℃存放；

将收集到的穿透液在4℃、缓冲液中透析过夜

4.阴离子交换层析

用缓冲液A(buffer)平衡柱约5个柱体积，待电导值稳定；

3)将上清加载于阴离子交换柱，上样流速1mL/min，收集穿透液

4)用缓冲液B洗脱，待280nm下吸收峰稳定后，用缓冲液A平衡2个柱体积，用超纯水洗脱3-5个柱体积，待电导趋近于零之后，用20％脱气的乙醇溶液平衡2个柱体积，将柱子放入4℃存放；

将收集到的穿透液在4℃、缓冲液中透析过夜

七、蛋白酶活测定

1.平板圈法：使用含有1％(m/v)脱脂牛奶的平板，利用单菌落周围的水解圈来测定酶活，测定条件为4摄氏度和15摄氏度，如图1中和图2中所示，M2，M4，M2-6和M2-7对于野生型具有更大的酶解圈。

2.荧光法：在96微孔板中，buffer使用Tris-HCl(0.1M，pH8.6)，荧光底物为100μM的Suc-AAPF-pNA，酶液使用2μl的粗酶液上清，在100μl的反应体系中进行，酶活在4℃和15℃的条件下由Tecan SAFIRE酶标仪检测，如图3所示，M2，M4，M2-6和M2-7在4摄氏度条件下相对于野生型具有更高的酶活。

以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 274

<212> PRT

<213> 野生碱性蛋白酶

<400> 1

Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Gln Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ser

35 40 45

Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val leu Asn

85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

100 105 110

Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala

115 120 125

Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg

130 135 140

Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser GLy Ser Ser Gly Asn

145 150 155 160

Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175

Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val GLy

180 185 190

Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205

Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220

His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

245 250 255

Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270

Ala Gln

275

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> M2突变子碱性蛋白酶

<400> 2

Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Gln Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ser

35 40 45

Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Arg Val leu Asn

85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

100 105 110

Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala

115 120 125

Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg

130 135 140

Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser GLy Ser Ser Gly Asn

145 150 155 160

Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175

Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val GLy

180 185 190

Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205

Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220

His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

245 250 255

Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270

Ala Gln

275

<210> 3

<211> 274

<212> PRT

<213> M4突变子碱性蛋白酶

<400> 3

Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

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35 40 45

Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

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85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

100 105 110

Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala

115 120 125

Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg

130 135 140

Gly Val Val Val Val Ala Gln Ala Gly Asn Ser GLy Ser Ser Gly Asn

145 150 155 160

Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175

Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val GLy

180 185 190

Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205

Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220

His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

245 250 255

Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270

Ala Gln

275

<210> 4

<211> 274

<212> PRT

<213> M2-6突变子碱性蛋白酶

<400> 4

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1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

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35 40 45

Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

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Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala

115 120 125

Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg

130 135 140

Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser GLy Ser Ser Gly Asn

145 150 155 160

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165 170 175

Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val GLy

180 185 190

Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205

Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Trp Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220

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225 230 235 240

Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

245 250 255

Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270

Ala Gln

275

<210> 5

<211> 274

<212> PRT

<213> M2-7突变子碱性蛋白酶

<400> 5

Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Gln Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ser

35 40 45

Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Arg Val leu Asn

85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

100 105 110

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115 120 125

Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg

130 135 140

Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser GLy Ser Ser Gly Asn

145 150 155 160

Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175

Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val GLy

180 185 190

Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205

Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Asn Pro

210 215 220

His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

245 250 255

Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270

Ala Gln

275

Claims

1.一种低温碱性蛋白酶，其特征在于：具有如下氨基酸序列：

在位置(a)：精氨酸，

在位置(b)：精氨酸，

在位置(c)：色氨酸，

在位置(d)：天冬酰胺。

2.如权利要求1所述的一种低温碱性蛋白酶，其特征在于：以枯草芽孢杆菌为表达宿主，优选B.subtilis WB800作为表达宿主，或B.subtilis SCK6作为表达宿主，以pBCS为质粒。

3.如权利要求1所述的一种低温碱性蛋白酶，其特征在于：所述的一种低温碱性蛋白酶相比于SEQ ID NO.1编码的碱性蛋白酶，在4摄氏度-15摄氏度条件下具有更高的酶活力。

4.一种低温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于，按照下列步骤进行：

(3)将重组载体转化入宿主菌株中，得到重组细胞；

(4)将重组细胞进行发酵制备低温碱性蛋白酶；

(5)提取低温碱性蛋白酶。

5.如权利要求4所述的一种低温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述的重组载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBCS，pBCS是一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，含有一个强启动子P43启动蛋白酶基因的转录，一个芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽用于指导菌体中合成的蛋白酶分泌到胞外。

6.如权利要求4所述的一种低温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌为B.subtilis SCK6。