CN101182527A - 一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性内切葡聚糖酶的基因，该酶基因序列为一个完整的开放阅读框，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括2502个核苷酸。本发明还公开了上述重组碱性内切葡聚糖酶及在洗涤剂等工业中的应用。该重组碱性内切葡聚糖酶对SDS具有非常良好的耐受性，并且重组碱性内切葡聚糖酶在终浓度为0.2％的洗涤剂中保存10min后其残余酶活力无显著损失。该重组碱性内切葡聚糖酶适用于洗涤剂、纺织等工业。

Description

一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用。

背景技术

内切葡聚糖酶(β-1，4-内切葡聚糖酶，Endoglucanase/Endo-1，4-β-Glucanase，EC3.2.1.4)是纤维素酶酶系的重要组分，可将纤维素分子从内部即在β-1，4糖苷键将其切断。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它往往不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系，它除了内切葡聚糖酶外，还包括外切葡聚糖酶(β-1，4-外切葡聚糖酶，Cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(BG，β-Glucosidase，EC3.2.1.21)。按催化反应的最适pH值，内切葡聚糖酶可以分为酸性内切葡聚糖酶(最适pH3～5)、中性内切葡聚糖酶(最适pH6～8)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH8～10)。酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究最早，然而，随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性内切葡聚糖酶也显现出诸多不足，如碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性较差、pH值适应范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生退色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。

碱性内切葡聚糖酶(又名碱性纤维素酶)主要由细菌产生。与由真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，由细菌产生的碱性内切葡聚糖酶具有其独特的优越性：(1)pH值适应范围广，一般在pH值6～10之间均具有较高的活性；(2)热稳定性好，可以耐受60℃的高温；(3)酶成分单一，主要酶活性成分为内切葡聚糖酶，便于工业应用；(4)可用细菌发酵生产，发酵周期短；(5)可以承受很高的pH值，作为洗涤用酶可使衣物经多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳；(6)可以在中性环境中处理纺织品，不会造成纺织品退色等。因此，就洗涤剂、纺织等工业而言，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶有着传统酸性内切葡聚糖酶无可比拟的优越性。

内切葡聚糖酶基因的克隆是深入研究酶作用机制及高产工程菌株构建的基础。1986年，Fukumori等首次报道了芽孢杆菌Bacillus sp.Strain 1139的碱性内切葡聚糖酶基因的克隆和测序(Fukumori F，Kudo T， Narahashi Y，et al.JGen Microbiol，1986，132：2329～2335)。目前，国外共有近20个左右碱性内切葡聚糖酶基因被克隆和测序，其中大部分来源于芽孢杆菌。国内对细菌内切葡聚糖酶基因的研究相对滞后，尚未能达到产业化水平。就目前国内有关碱性内切葡聚糖酶的研究水平来看，主要问题在于：(1)酶活性还比较低，在国内还不能达到工业化生产水平的要求；(2)对酶的纯化、酶学性质研究还很少，特别是对酶在洗涤剂中的性质研究很少，缺乏具有实际应用价值的酶；(3)对酶基因的研究不够深入。这些都阻碍了碱性内切葡聚糖酶的工业化生产应用。因此，当前迫切需要解决的问题主要有两个：首先是提高产酶水平，可通过现代基因工程的方法构建基因工程菌株，以提高酶产量；其次，通过基因工程寻找酶学性质更优并可在洗涤剂及纺织等领域能实际应用的重组酶。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a的基因序列及其氨基酸序列。本发明根据酶蛋白质谱分析所得的肽段及其同源序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出碱性内切葡聚糖酶的酶基因III-3-a。

本发明的另一目的在于提供一种重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1。该重组酶III-3-A1比天然酶在洗涤剂中的稳定性更强。

本发明的再一目的在于提供上述重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a，所述酶基因序列如表1所示(也即序列表SEQUENCE LISTING NO.1所示的基因序列)：

表1碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a酶基因序列

GAAGGAAACACTCGTGAAGACAATTTT AATCATTTATTAGGTAATGACAATGTTAAGCGCCCTTCCGAGGCTGGCGCATTACAATT ACAAGAAGTCGATGGACAAATGACATTAGTAGATCAAGATGGAGAAAAAATTCAATT ACGTGGAATGAGTACACACGGATTACAATGGTTTCCTGAGATTTTAAATGATAACGCAT ACAAAGCTCTTACTAACGATTGGGAATCAAATATGATTCGTCTAGCTATGTATGTCGGT GAAAATGGCTATGCTTCAAATCCAGATTTAATTAAAAGCAGAGTCATTAAAGGAATAG ATCTTGCTATTGAAAATGACATGTATGTCATTGTTGACTGGCATGTACATGCACCTGGT GATCCTAGAGATCCGGTTTAYGCWGGTGCAGAAGATTTCTTTAGAGAAATTGCAGCAT TATATCCTAACAATCCACACATTATTTATGAGTTAGCGAATGAACCAAGTAGTAATAATA ATGGTGGAGCAGGGATTCCGAATAATGAAGAAGGTTGGAATGCAGTAAAAGAATACG CTGATCCAATTGTAGAAATGTTACGTGAAAGTGGTAACGCAGATGACAATATCATCATT GTGGGGAGTCCTAACTGGAGTCAGCGTCCTGACTTAGCAGCTGATAATCCAATTGATG ACCACCATACAATGTACACAGTTCATTTCTATACAGGTTCACATGCAGCTTCAACGGA GAGTTATCCGCCTGAAACTCCTAACTCTGAAAGAGGAAACGTAATGAGTAACACTCG TTATGCGTTAGAGAACGGAGTAGCGGTATTTGCAACAGAATGGGGAACAAGTCAAGC AAGTGGAGACGGTGGTCCTTACTTTGACGAAGCAGATGTATGGATTGAATTTTTAAAT GAAAACAACATTAGCTGGGCTAACTGGTCTTTAACGAATAAAAATGAAGTGTCTGGTG CATTTACACCATTCGAGTTAGGAAAATCTAACGCAACTAATCTTGACCCAGGTCCAGA CCATGTTTGGGCACCTGAAGAGTTAAGTCTTTCTGGAGAATATGTACGTGCTCGTATTA AAGGTGTGAACTATGAGCCAATCGACCGTACTAAATACACGAAAGTACTTTGGGACTT TAATGATGGAACGAAGCAAGGATTTGGAGTGAATGGAGATTCTCCAAATAAAGAGCTT ATTGCAGTTGATAATGAAAACAACACTTTGAAAATTTCGGGGTTAGATGTAAGTAACG ATGTTTCTGATGGCAACTACTGGGCTAATGCTCGTCTTTCAGCCAACGGTTGGGGGAA AAGTGTTGATATATTAGGTGCTGAAAAACTAACTATGGATGTTATTGTTGATGAGCCGA CGACGGTAGCGATTGCTGCAATTCCACAAGGTCCATCAGCAAATTGGATTAATCCAAT TTGCGCAGTTAAGGTTGAGCCAACTGATTTCGTGCCGTTTGGAGATAAGTTTAAAGCA GAATTAACTATAACTACAGCGGACTCTCCAGCGATAGAAGCGATTGCGATGCATGCTG AAAATAACAATATGAACAACATCATTCTGTTCGTAGGAACTGATGCAGCTGACGTTATT TATTTAGATAACATTAAAGTAATTGGAACAGAAGTTGAAATTCCAGTTGTTCATAATCC AAAAGGAGAAGCTGTCCTTCCGTCTAATTTTGAAGACGGCACACGTCAAGGTTGGGA CTGGGCTGGAGAGTCTGGTGTGAAAACAGCTTTAACCATTGAAGAAGCAAACGGTTC TAACGCGCTATCATGGGAATTTGGATACCCAGAAGTAAAACCTAGTGATAACTGGGCG ACAGCTCCACGTTTAGATTTCTGGAAATCTGACTTGGTTCGCGGTGAGAATGATTATGT AGCTTTTGACTTCTATCTAGATCCAGTTCGTGCAACAGAAGGCGCGATGAATATCAATT TAGTATTTCAGCCACCTACTAATGGATATTGGGTTCAAGCACCACAAACTTTTACGGTT GACTTTGAAGAGTTAGATCAAGCAAATCAAGTAGACGGTCTATACCATTATGAAGTAA AAATTAATGTAAGAGATATTACAAACGTTCAAGATGACACTTTACTACGTAATATGATG ATTATTTTTGCTGATGTACAAAGTGATTTTGCAGGAAGAGTATTCGTAGATAATGTTCG TTTTGAGGTTGCTGCTACTGGGCCGATTGAGCCTGAACCAGTTGATCCTGGCGAAGAG GCGCCTCCTGTAGATGAGAAGGAAGCAGCAAAAGAAGAAAGAGAAGCAGCTAGAGG AGCGGAGAAAGAGGAAAGAGAAGCCGTGAAAGCTGAAAGAGAAGTAGCTAGAGAA GCAGCGAAAGAGGAAAGAGAAACCGCAAAAGAAGAAAAGAAAGAGGCTACGAAAA

所述碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括2502个核苷酸。其中，前90个核苷酸为信号肽编码序列(ATGATGTTGCGCAAAAAGACAAAACAGTTGATTTCTTCCACTCTTATTTTAGTTTTACTTCTATCTTTATTTCCAACAGCTCTAGCAGCA)。

上述碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a编码的氨基酸序列如表2所示(即序列表SEQUENCE LISTING  NO.2所示的氨基酸序列)：

表2碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a编码的氨基酸序列

EGNTREDNFNHLLGNDNVKRPSEAGALQLQ EVDGQMTLVDQDGEKIQLRGMSTHGLQWFPEILNDNAYKALTNDWESNMIRLAMYVG ENGYASNPDLIKSRVIKGIDLAIENDMYVIVDWHVHAPGDPRDPVYAGAEDFFREIAALY PNNPHIIYELANEPSSNNNGGAGIPNNEEGWNAVKEYADPIVEMLRESGNADDNIIIVGSP NWSQRPDLAADNPIDDHHTMYTVHFYTGSHAASTESYPPETPNSERGNVMSNTRYALEN GVAVFATEWGTSQASGDGGPYFDEADVWIEFLNENNISWANWSLTNKNEVSGAFTPFEL GKSNATNLDPGPDHVWAPEELSLSGEYVRARIKGVNYEPIDRTKYTKVLWDFNDGTKQG FGVNGDSPNKELIAVDNENNTLKISGLDVSNDVSDGNYWANARLSANGWGKSVDILGA EKLTMDVIVDEPTTVAIAAIPQGPSANWINPICAVKVEPTDFVPFGDKFKAELTITTADSPAI EAIAMHAENNNMNNIILFVGTDAADVIYLDNIKVIGTEVEIPVVHNPKGEAVLPSNFEDG TRQGWDWAGESGVKTALTIEEANGSNALSWEFGYPEVKPSDNWATAPRLDFWKSDLVR GENDYVAFDFYLDPVRATEGAMNINLVFQPPTNGYWVQAPQTFTVDFEELDQANQVDG LYHYEVKINVRDITNVQDDTLLRNMMIIFADVQSDFAGRVFVDNVRFEVAATGPIEPEPV DPGEEAPPVDEKEAAKEEREAARGAEKEEREAVKAEREVAREAAKEERETAKEEKKEAT

碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a开放阅读框编码833个氨基酸，其中，MMLRKKTKQLISSTLILVLLLSLFPTALAA序列(前30个氨基酸)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala³⁰位点被切除。因此，成熟的酶蛋白从Glu³¹开始(用下划线表示)，共计803个氨基酸，其理论分子量(MWt)为89kD，酶蛋白的等电点(pI)为4.30。

上述重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1的制备方法，包括如下步骤：

(1)重组菌株构建：

用PCR方法从Bacillus sp.III-3(CGMCC No.2138)的基因组DNA中克隆出不含信号肽编码序列的III-3-a酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-III-3-a，并转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到高效表达的重组大肠杆菌菌株E.coli III-3-A1；

(2)诱导表达：

将筛选得到的重组大肠杆菌E.coli III-3-A1接种到50ml LB液体培养基中，待OD值达到0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，于23℃条件下进行诱导培养，并于诱导培养12h加入0.5％(质量百分比)的EDTA，诱导培养23h终止发酵；将发酵液用液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min后去沉淀即得粗酶液。

(3)重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1的分离纯化

将粗酶液离心收集上清液后直接上用pH 8.0 Tris-HCl预平衡的DEAESepharose CL-6B离子交换柱，用含浓度0.4～1M NaCl的pH 8.0 Tris-HCl以180ml·h-1的流速进行梯度洗脱，收集重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1。

所述重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1具有序列表SEQUENCE LISTINGNO.1所示的基因序列，具有序列表SEQUENCE LISTING NO.2所示的氨基酸序列。

所述重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1的最适作用pH为8～10，最适作用温度为40～50℃，III-3-A1酶蛋白具有耐Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺等金属离子的良好特性，并对SDS、EDTA或EGTA等表面活性剂具有良好的耐受性。

所述重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1在洗涤剂和纺织等工业中的应用。该重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1在终浓度为0.2％(质量百分比)的洗涤剂(市售立白洗衣粉)中保存10min后其残余酶活力无显著损失，显示重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1在洗涤剂和纺织等工业中的良好应用潜力。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面与已知蛋白的差异判断，碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a为一新发现的β-1，4-内切葡聚糖酶基因。

(2)重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1对SDS具有非常良好的耐受性，与天然碱性内切葡聚糖酶的酶活性受到SDS抑制有明显不同。并且该重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1在终浓度为0.2％的洗涤剂(市售立白洗衣粉)中保存10min后其残余酶活力无显著损失。该重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1非常适用于洗涤剂和纺织等工业。

附图说明

图1为基因组DNA的凝胶电泳图。

其中：Marker 1为BBI公司的100bp+1.5kb DNA Ladder的Marker；2为基因组DNA。

图2为pET-28a(+)表达载体图谱。

图3为pET-28a(+)表达载体多克隆位点图。

图4为由PCR方法从Bacillus sp.III-3基因组DNA中扩增III-3-a基因图。

图5为重组质粒pET-28a-III-3-a的酶切检验图。

其中，1：重组质粒pET-28a-III-3-a经Hind III和EcoR I双酶切的产物；

2：重组质粒pET-28a-III-3-a；3：III-3-a基因；M：DNA分子量标记。

图6为不同时期加入EDTA对胞外酶活的影响图。

图7为EDTA添加量对胞外酶活的影响图。

图8为诱导培养不同时间的生物量及胞外酶活力图。

图9为III-3-A1分离纯化的SDS-PAGE电泳图谱。

其中，1：粗酶液；2：DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析酶活峰。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(一)材料

1.菌株

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3(CGMCC No.2138)。大肠杆菌E.coli Top10购自Invitrogen公司。

2.仪器

MyCycler^TM thermal cycler PCR仪、DNA及蛋白电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为Pharmacia Biotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品；匀浆机、低温高速离心机为BECKMAN和Sigma公司产品；Dolphin-DOC成像系统为美国WEALTEC公司产品。

(二)实验方法和结果

1.基因组DNA的提取

利用EZ-10 spin column Genomic DNA Minipreps Kit(For Beteria)试剂盒提取Bacillus sp.III-3基因组DNA，通过1％琼脂糖凝胶电泳看到一条较明显的条带(如图1)，符合基因组DNA提取的要求。

2.基因克隆

(1)PCR引物设计和扩增

从质谱分析所得到的肽段的保守氨基酸序列(第160-171位氨基酸：DPVYAGAEDFFR，第438-465位氨基酸：LSGLDASNDVSEGNYWANARLSADGWGK)入手，设计本发明上游895bp片断的特异性上下游简并引物(如表4-1)。再根据已克隆的上游895bp片断并结合质谱分析所得的相似保守氨基酸序列(第751-757位氨基酸：VFVDNVR)分别设计基因下游928bp片断的上下游引物。最后，根据已经克隆的中间片断序列，结合KSM-S237酶基因5′-端的氨基酸序列和KSM-64酶蛋白C端氨基酸序列，分别设计扩增酶基因5′-端序列和3′-端序列的PCR引物，引物设计见表4-1。

表4-1 PCR引物设计

克隆片断	引物名称	引物	设计引物的依据
				上游895bp	上游引物A1下游引物B2	5′-GAYCCNGTNTAYGCNGGNGC-3′5′-GCRTTNGCCCARTARTTNCC-3′	160：DPVYAGAEDFFR438：LSGLDASNDVSEGNY

片断下游928bp片断酶基因5′-端序列酶基因3′-端序列

上游引物AS2下游引物N1上游引物T1下游引物T2上游引物CS2下游引物KSM64

5′-AACGATGTTTCTGATGGCAACTACTGGG-3′5′-CKNACRTTRTCNACRAANAC-3′5′-GYTNMGNAARAARACNAARC-3′5′-CTACTTGGTTCATTCGCTAA-3′5′-GCAGGAAGAGTATTCGTAGA-3′5′-TTATTTTTTCGTAGCCTC-3′

WANARLSADGWGK已克隆的上游895bp片断751：VFVDNVRKSM-S237的酶基因5′-端的氨基酸序列已克隆的上游895 bp片断已克隆的下游928 bp片断KSM-64酶蛋白C端序列

(2)完整的酶基因序列

通过将PCR得到的各基因片段测序，得到碱性内切葡聚糖酶III-3-a完整的酶基因序列如表1所示(也即序列表SEQUENCE LISTING NO.1所示的基因序列)。

碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a的基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括2502个核苷酸。其中，前90个核苷酸为信号肽编码序列(用阴影标出)。

3.碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a编码的氨基酸序列

碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a的酶基因所编码的氨基酸序列如表2(即序列表SEQUENCE LISTING NO.2所示的氨基酸序列)。

经DNAssist Version 2.0软件分析得到，碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a开放阅读框编码833个氨基酸，其中，MMLRKKTKQLISSTLILVLLLSLFPTALAA序列(前30个氨基酸)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala³⁰位点被切除。因此，成熟的酶蛋白从Glu³¹开始(用下划线表示)，共计803个氨基酸。其理论分子量(MWt)为89 kD，与分离到的天然酶蛋白分子量一致，而与KSM-S237、KSM-64、Bacillus sp.1139菌株的碱性内切葡聚糖酶蛋白分子量(分别为91.5、91.0、88.5)不尽一致。III-3-A酶蛋白的等电点(pI)为4.30，不同于KSM-S237、KSM-64、Bacillus sp.1139菌株的碱性内切葡聚糖酶的等电点(分别为4.55、4.4、3.35)。

通过DNAssist Version 2.0软件比对III-3-A酶蛋白氨基酸序列与Bacillussp.1139、KSM-64、KSM-S237和NW-2004a的氨基酸序列。根据比对结果，把碱性内切葡聚糖酶蛋白序列分为5个区。将III-3-A酶蛋白氨基酸序列分别命名为：(1)Signal区：1～30位氨基酸(用着重号标明)，富含极性氨基酸，为酶蛋白分泌所需的信号肽；(2)N端保守结构域区：31～419位氨基酸(用下划线标明)，成熟酶蛋白从31位氨基酸开始，其序列高度保守；(3)结构域连接区Linkage：420～470位氨基酸，为两个保守结构域的连接区，但此连接区的相似性较低；(4)近C-端保守结构域：471～701位氨基酸(用下划线标明)，靠近C-末端约74个氨基酸，其序列保守性相对较高；(5)C-端氨基酸序列：702～833位氨基酸，该端长度随酶蛋白来源的不同而存在较大差异，且相似性较低。

根据DNA序列及氨基酸序列比对结果，发现不同来源的酶基因及其氨基酸序列之间存在一定的进化关系。来源于Bacillus sp.III-3的酶基因III-3-a与KSM-S237及KSM-64、Bacillus sp.1139的酶基因亲缘关系最近，而与Bacillussp.NW-2004a及Bacillus sp.22-28的酶基因亲缘关系相对较远。

III-3-A成熟酶蛋白分子量为89 kD，与KSM-S237、KSM-64、Bacillussp.1139菌株的碱性内切葡聚糖酶蛋白分子量(分别为91.5、91.0、88.5)不尽一致。等电点(pI)为4.30，不同于KSM-S237、KSM-64、Bacillus sp.1139菌株的碱性内切葡聚糖酶的等电点(分别为4.55、4.4、3.35)。根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断，III-3-a酶基因为一新发现的β-1，4-内切葡聚糖酶基因。

实施例2

一、材料和方法

(一)材料

1.菌株

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3菌株(CGMCC No.2138)；宿主菌E.coli BL21Star(DE3)、E.coli Top10F’均购自Invitrogen公司。

2.载体

大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen)含有Kan⁺抗性标记，载体图谱和多克隆位点分别见图2和图3。

3.试剂及试剂盒

限制性内切酶、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、DNA分子量标记、T4连接酶为宝生物公司产品；一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品；蛋白分子量标记为Fermentas(MBI)公司产品；其余试剂均为国产分析纯。PCR引物合成和DNA序列测定由Takara公司完成。

4.培养基及缓冲液

(1)嗜碱芽孢杆菌III-3菌株培养基(质量百分比)：1％复合蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，0.1％KH₂PO₄，0.25％Na₂HPO₄·12H₂O，2％CMC-Na，0.5％Na₂CO₃(分开灭菌)。

(2)LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂糖(固体培养基)15g，溶质溶于950ml蒸馏水中，用1M的NaOH调pH至7.0后加水至1L。121℃高压灭菌20min。

(3)LB(含抗生素卡那霉素Kan，Kanamycin)：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，琼脂糖(固体培养基)15g，溶质溶于950ml蒸馏水中，用1M的NaOH调pH至7.5后加水至1L。121℃高压灭菌20min，待温度降至55℃后加入Kan至终浓度50ug/ml。

(4)TE缓冲液：10mmol/l Tris-Hcl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0。

(5)碱裂解液I、II、III(质粒提取)：碱裂解液I：葡萄糖50mmol/l，Tris-Hcl(pH8.0)25mmol/L，EDTA 10mmol/L。每瓶约100ml，灭菌后4℃贮存。碱裂解液II：NaOH 0.2mmol/L，SDS 1％。溶液不可贮存，现用现配。碱裂解液III：乙酸钾5mmol/L，冰乙酸11.5％。

(二)方法

1.目的基因III-3-a的分离

采用PCR的方法从Bacillus sp.III-3菌中分离III-3-a基因。在37℃、220r/min摇瓶培养Bacillus sp.III-3菌，84h后离心收集菌体，然后利用EZ-10spin columnGenomic DNA Minipreps Kit(For Beteria)试剂盒提取基因组总DNA。根据不含信号肽编码序列的III-3-a基因，设计引入HindIII和EcoR I酶切位点(斜体)的PCR引物：

上游引物EcoR I：5’-GATgaattcGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3’：

下游引物Hind III：5’-GTTaagcttTTATTTTTTCGTAGCCTCTTTC-3’；

按照如下条件进行PCR：

PCR反应组分：

ddH₂O    33.75μl

10×PCR Buffer      5μl

dNTP                5μl

5’Primer           1μl

3’Primer           1μl

模板DNA             4μl

Ex Taq DNA聚合酶    0.25μl

                                            

Totol               50μl

PCR反应参数如下：

反应完成后，取8μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物与pUCm-T连接后送Takara公司进行测序鉴定。

2.重组质粒pET-28a-III-3-a的构建

不含信号肽编码序列的III-3-a基因经Hind III和EcoR I双酶切后与采用同样酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接，得到重组质粒pET-28a-III-3-a。

连接反应体系如下：

T4连接酶    1μl

T4Buffer    1μl

DNA         6μl(2μg)

质粒        2μl(200ng)

                                   

Totol       10μl

16℃水浴中连接过夜后转化感受态细胞(连接反应中基因和质粒的摩尔比为9∶1)。

3.TOP10F′E.coli和BL21 Star(DE3)E.coli感受态细胞的制备

用上海生工生物工程公司生产的一步法快速制备感受态细胞试剂盒制成感受态细胞。可立即转化或于-70℃冻存。

4.转化TOP10F’E.coli感受态细胞

(1)10μl连接产物与100μl感受态细胞混匀，冰浴30min。(2)42℃水浴90秒，冰浴2min。(3)加入1ml LB培养基，混匀，37℃180r/min温浴1h。(4)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μL至LB(含选择抗生素Kan)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。

5.重组质粒的中量制备

(1)挑取抗性平板上的重组菌落至50ml LB(含选择抗生素Kan)液体培养基中，200r/min、37℃培养过夜。(2)将培养液12000r/min离心3min，弃上清，收集菌体。(3)将菌体加入200μl冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡后，将悬浮液转移至1.5ml小离心管中。(4)加入400μl新配制的裂解液II，反复颠倒数次(切勿涡旋振荡)后，置于冰上。(5)加入300μl冰预冷的碱裂解液III，盖紧管口，颠倒数次，将离心管置于冰上5min。(6)微量离心机12000r/min、4℃冷冻高速离心5min，上清液移至另一离心管中。(7)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混匀，12000r/min、4℃离心5min，上清转入一支新管中。(8)加入2倍体积无水乙醇，室温放置2min沉淀核酸。(9)微量离心机12000r/min、4℃离心5min，弃上清。(10)加入1ml 70％乙醇洗涤核酸沉淀，微量离心机12000r/min、4℃离心2min，弃上清。(11)干燥核酸沉淀，加入100μl无菌水溶解核酸。(12)取5μl进行琼脂糖电泳检验，剩余核酸-20℃贮存备用。

6.E.coli BL21 Star(DE3)的转化

(1)将从重组TOP10F’E.coli中提取的质粒100μg与100μl感受态细胞混匀，冰浴30min。42℃水浴90秒，冰浴2min。(2)加入1ml LB培养基，混匀，37℃、180r/min温浴1h。(3)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μl至LB(含选择抗生素Kan)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。

7.酶活性(CMC酶)测定

取1％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液1mL作为底物，加入0.1mL适当稀释的酶溶液，在40℃下反应30min，中性内切葡聚糖酶活力测定控制反应pH值为7.0，碱性内切葡聚糖酶活力测定控制反应pH值为9.0。终止反应后，用DNS法于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每小时由底物产生1.0mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U/mL表示。菌体浓度采用比色法进行测定。将适当稀释的菌液于600nm波长下测定吸光值，对照采用同样稀释度的培养基。

8.加入表面活性剂对胞外产酶的促进作用

(1)不同时期加入EDTA对胞外酶活的影响

取过夜培养菌液0.5mL接种到装有50ml LB培养基的250ml摇瓶中培养，待OD₆₀₀值达到0.6时加入终浓度为0.2mM的IPTG，将其等量分装并置于23℃摇瓶培养。分别在诱导后不同时间(0.5、3、6、9、12和21h)加入0.5％的EDTA，并分别测定诱导培养23h的胞外酶活力。

(2)EDTA添加量对胞外酶活的影响

取过夜培养菌液0.5mL接种到装有70ml LB培养基的250ml摇瓶中培养，待OD₆₀₀值达到0.6时加入终浓度为0.2mM的IPTG，将其等量分装并置于23℃摇瓶培养。于诱导培养12h时分别加入不同量的EDTA(0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、1.5％和3％)，并分别测定其诱导培养14 h和22 h的胞外酶活力。

(3)添加EDTA对产酶的促进作用

取过夜培养菌液0.5ml接种到2个装有50ml LB培养基的250ml摇瓶中培养，待OD₆₀₀值达到0.6时分别加入终浓度为0.2mM的IPTG，并置于23℃摇瓶培养。其中一个摇瓶于加入IPTG后12h加入0.5％的EDTA，而另一摇瓶不加EDTA作对照。分别于预定时间测定生物量和胞外酶活力。通过离心收集菌体并用液氮反复冻融法破碎细胞后测其胞内酶活力。

9.重组大肠杆菌E.coli III-3-A1的诱导表达

将筛选得到的重组大肠杆菌E.coli III-3-A1接种到50ml LB液体培养基中，待OD值达到0.6时加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，于23℃条件下进行诱导培养，并于诱导培养12h加入0.5％的EDTA，诱导培养23h终止发酵。将发酵液用液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min后去沉淀即得粗酶液。

10.重组碱性内切葡聚糖酶的分离纯化

采用一步离子交换层析法分离重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1(离子交换层析介质为DEAE Sepharose CL-6B，层析柱Φ2.6cm×30cm)。平衡液为pH 8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl pH 8.0 Tris-HCl缓冲液。将粗酶液离心收集上清液后直接上用pH 8.0 Tris-HCl预平衡的DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱，用含不同浓度NaCl(i.e.0.4，0.45and 1M)的pH 8.0 Tris-HCl以180ml·h^-1的流速进行梯度洗脱，收集酶活峰。

二、实验结果

(一)重组大肠杆菌的构建

1.目的基因III-3-a的获取

从Bacillus sp.III-3菌84 h培养液中，利用EZ-10 spin column Genomic DNAMinipreps Kit(For Beteria)试剂盒提取基因组总DNA，并用PCR方法扩增得到III-3-a基因，结果如图4所示。由于大肠杆菌表达载体pET-28a(+)可使目的蛋白实现细胞周质表达，因此在设计PCR引物时按照III-3-a成熟酶蛋白的编码序列进行设计。由图4可见，PCR扩增产物的大小为2.4kb，与不含信号肽编码序列的III-3-a基因大小相符。

2.pET-28a-III-3-a重组表达载体的构建

将不含信号肽编码序列的III-3-a基因用Hind III和EcoR I进行双酶切，并连接到采用同样酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中，连接物转化E.coliTOP10F’，在含25μg/mL卡那霉素(Kan)抗性平板上筛选转化菌落。从这些菌落中提取质粒进行酶切鉴定，结果如图5所示。重组质粒经HindIII和EcoR I双酶切得到大小为5.37kb和2.4kb的片段，分别对应于pET-28a(+)和不含信号肽编码序列的III-3-a基因的大小。同时，将重组质粒送Takara公司进行测序，测序结果显示重组质粒所携带的基因为目的基因。

3.E.coli BL21 Star(DE3)的转化

采用一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)制备E.coli BL21 Star(DE3)的感受态细胞，并将重组质粒pET-28a-III-3-a转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)，并利用含25μg/mL卡那霉素(Kan)抗性平板筛选转化菌落。经过大量筛选后得到可以高效表达的重组大肠杆菌菌株E.coli III-3-A1，其在含有CMC的LB平板上培养3天可形成相对较大的透明圈。从E.coli III-3-A1菌株中提取基因组DNA后，以III-3-a基因的5’和3’引物进行PCR扩增，结果表明该转化菌株含有III-3-a基因。将重组菌株接种到LB液体培养基中摇瓶培养，待OD值达到0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG过夜培养15h后取样，并用液氮反复冻融法破碎细胞后测其酶活性，结果可以检测到内切酶活性。同时，将重组菌株送至Takara公司进行测序，测序结果显示重组质粒所携带的基因为目的基因。可见，pET-28a-III-3-a重组质粒已经成功转入E.coli BL21 Star(DE3)。

(二)加入表面活性剂对胞外产酶的促进作用

(1)不同时期加入EDTA对胞外酶活的影响

研究表明，重组大肠杆菌E.coli III-3-A1的细胞外酶活力极微，这与Sanchez-Torres等的研究结果一致。为了提高重组内切葡聚糖酶III-3-A1的细胞外表达水平，本发明通过加入表面活性剂增加细胞膜的通透性以使表达的酶蛋白渗透到胞外。结果发现，加入表面活性剂EDTA可显著提高胞外酶活力。

为了确定在菌体诱导培养的不同时期加入EDTA对胞外酶活的影响，在6个OD₆₀₀为0.6左右的摇瓶培养液中，分别加入终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，于23℃条件下进行诱导培养，分别在诱导后不同时间(0.5、3、6、9、12和21h)加入0.5％的EDTA，并分别测定诱导培养23h的胞外酶活力(结果见图7)。图6表明，在诱导培养6h后加入表面活性剂EDTA均可使胞外酶活力显著增加，其中，以诱导培养12h时添加EDTA对胞外产酶的促进作用最大。

(2)EDTA添加量对胞外酶活的影响

在7个经IPTG诱导的摇瓶培养液中，于诱导培养12h时分别加入不同量的EDTA(0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、1.5％和3％)，并分别测定其诱导培养14h和22h的胞外酶活力，结果如图7所示。由图7可以看出，加入适量的EDTA对胞外产酶有显著的促进作用，但EDTA添加量过多反而使胞外酶活力下降。这是由于过量的EDTA对菌体生长的抑制作用之故。当添加0.5％的EDTA时，诱导培养14h和22h的胞外酶活力均较高，因此，选择EDTA的添加量以0.5％左右为宜。

(3)添加EDTA对产酶的促进作用

为了深入研究添加表面活性剂对重组大肠杆菌胞内外产酶的影响，本实验在上述优化培养条件下，分别测定在IPTG诱导后不同时间的生物量并检测加入表面活性剂EDTA后胞外酶活力的变化，结果如图8。由图8可见，在诱导培养12h时加入EDTA的时间约为菌体对数生长后期，此时加入EDTA后胞外酶活力迅速增加，至诱导培养22h左右达到高峰，胞外酶活力达18.5 U/mL。同时，通过对比诱导培养22h时不加EDTA和添加0.5％EDTA两种条件下胞内外酶活力的变化(如表5-1)，发现添加EDTA不仅可显著增加胞外酶活力，而且使胞内外酶活总量增加26.3％，达到31.2U/mL。可见，添加EDTA可通过增加细胞膜的通透性而达到促进碱性内切葡聚糖酶胞外分泌的目的。

表5-1  不加EDTA和添加EDTA两种条件下胞内外酶活力的对比

酶活力(U/mL)	诱导培养	诱导培养22h
				12h	不加EDTA	添加EDTA
	胞外酶活力胞内酶活力总酶活力	0.719.320	5.319.424.7				18.512.731.2

(三)重组碱性内切葡聚糖酶蛋白的分离纯化

将50mL上述重组大肠杆菌粗酶液经离心后加到预先用pH8.0 Tris-HCl缓冲液充分平衡的DEAE-Sepharose CL-6B层析柱，先后用含0.4M、0.45M和1MNaCl的pH8.0 Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，并收集各峰进行酶活性检测，酶活性集中于用0.4～0.45M NaCl的pH8.0 Tris-HCl缓冲液的洗脱峰，其它峰无酶活。将此酶活峰收集、透析，并经过浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图9。由图9电泳图的第2泳道可见，电泳检测到分子量约为90 kD的单一蛋白条带，达到分离纯化的预期效果。同时，发现粗酶液的电泳条带中(图9电泳图的第1泳道)可见一明显的相应目的蛋白条带，这也证明重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1已经成功分泌到细胞外。

(四)重组碱性内切葡聚糖酶的酶学性质

1.最适pH和pH稳定性

分离纯化的重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1酶的最适作用pH为8～10左右，且在pH6～11的范围内可保持80％以上酶活性。

2.最适温度和热稳定性

重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1的最适作用温度为40～50℃左右，其在55℃以下具有良好的热稳定性。

3.对金属离子和表面活性剂的耐受性

将纯化的重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1酶蛋白分别置于终浓度为1mM的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺等金属离子以及0.05％EDTA、0.05％EGTA、0.01％SDS中，30℃保存10min后按照常规方法测定其酶活力。结果表明，在上述各种金属离子和表面活性剂中，残余酶活力可保持99％以上，说明III-3-A1酶蛋白具有耐Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺和Ca²⁺等金属离子的良好特性，并对SDS、EDTA、EGTA等表面活性剂均具有良好的耐受性。同时，III-3-A1在终浓度为0.2％的洗涤剂(市售立白洗衣粉)中保存10min后按常规方法测定其酶活力，发现其残余酶活力无显著损失。可见，重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1在洗涤剂等工业中的良好应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>邢苗  刘森林  陈伟钊

<120>一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用

<130>30

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2502

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a的基因序列

<400>1

atgatgttgc gcaaaaagac aaaacagttg atttcttcca ctcttatttt agttttactt    60

ctatctttat ttccaacagc tctagcagca gaaggaaaca ctcgtgaaga caattttaat    120

catttattag gtaatgacaa tgttaagcgc ccttccgagg ctggcgcatt acaattacaa    180

gaagtcgatg gacaaatgac attagtagat caagatggag aaaaaattca attacgtgga    240

atgagtacac acggattaca atggtttcct gagattttaa atgataacgc atacaaagct    300

cttactaacg attgggaatc aaatatgatt cgtctagcta tgtatgtcgg tgaaaatggc    360

tatgcttcaa atccagattt aattaaaagc agagtcatta aaggaataga tcttgctatt    420

gaaaatgaca tgtatgtcat tgttgactgg catgtacatg cacctggtga tcctagagat    480

ccggtttayg cwggtgcaga agatttcttt agagaaattg cagcattata tcctaacaat    540

ccacacatta tttatgagtt agcgaatgaa ccaagtagta ataataatgg tggagcaggg    600

attccgaata atgaagaagg ttggaatgca gtaaaagaat acgctgatcc aattgtagaa    660

atgttacgtg aaagtggtaa cgcagatgac aatatcatca ttgtggggag tcctaactgg    720

agtcagcgtc ctgacttagc agctgataat ccaattgatg accaccatac aatgtacaca    780

gttcatttct atacaggttc acatgcagct tcaacggaga gttatccgcc tgaaactcct    840

aactctgaaa gaggaaacgt aatgagtaac actcgttatg cgttagagaa cggagtagcg    900

gtatttgcaa cagaatgggg aacaagtcaa gcaagtggag acggtggtcc ttactttgac    960

gaagcagatg tatggattga atttttaaat gaaaacaaca ttagctgggc taactggtct    1020

ttaacgaata aaaatgaagt gtctggtgca tttacaccat tcgagttagg aaaatctaac    1080

gcaactaatc ttgacccagg tccagaccat gtttgggcac ctgaagagtt aagtctttct   1140

ggagaatatg tacgtgctcg tattaaaggt gtgaactatg agccaatcga ccgtactaaa   1200

tacacgaaag tactttggga ctttaatgat ggaacgaagc aaggatttgg agtgaatgga   1260

gattctccaa ataaagagct tattgcagtt gataatgaaa acaacacttt gaaaatttcg   1320

gggttagatg taagtaacga tgtttctgat ggcaactact gggctaatgc tcgtctttca   1380

gccaacggtt gggggaaaag tgttgatata ttaggtgctg aaaaactaac tatggatgtt   1440

attgttgatg agccgacgac ggtagcgatt gctgcaattc cacaaggtcc atcagcaaat   1500

tggattaatc caatttgcgc agttaaggtt gagccaactg atttcgtgcc gtttggagat   1560

aagtttaaag cagaattaac tataactaca gcggactctc cagcgataga agcgattgcg   1620

atgcatgctg aaaataacaa tatgaacaac atcattctgt tcgtaggaac tgatgcagct   1680

gacgttattt atttagataa cattaaagta attggaacag aagttgaaat tccagttgtt   1740

cataatccaa aaggagaagc tgtccttccg tctaattttg aagacggcac acgtcaaggt   1800

tgggactggg ctggagagtc tggtgtgaaa acagctttaa ccattgaaga agcaaacggt   1860

tctaacgcgc tatcatggga atttggatac ccagaagtaa aacctagtga taactgggcg   1920

acagctccac gtttagattt ctggaaatct gacttggttc gcggtgagaa tgattatgta   1980

gcttttgact tctatctaga tccagttcgt gcaacagaag gcgcgatgaa tatcaattta   2040

gtatttcagc cacctactaa tggatattgg gttcaagcac cacaaacttt tacggttgac   2100

tttgaagagt tagatcaagc aaatcaagta gacggtctat accattatga agtaaaaatt   2160

aatgtaagag atattacaaa cgttcaagat gacactttac tacgtaatat gatgattatt   2220

tttgctgatg tacaaagtga ttttgcagga agagtattcg tagataatgt tcgttttgag   2280

gttgctgcta ctgggccgat tgagcctgaa ccagttgatc ctggcgaaga ggcgcctcct   2340

gtagatgaga aggaagcagc aaaagaagaa agagaagcag ctagaggagc ggagaaagag   2400

gaaagagaag ccgtgaaagc tgaaagagaa gtagctagag aagcagcgaa agaggaaaga   2460

gaaaccgcaa aagaagaaaa gaaagaggct acgaaaaaat aa                      2502

<210>2

<211>833

<212>PRT

<213>Artifcial sequence

<220>

<223>碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a编码的氨基酸序列

<400>2

Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ile

1                5                  10                  15

Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Asn His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val

         35                  40                  45

Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly

     50                  55                  60

Gln Met Thr Leu Val Asp Gln Asp Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly

 65                  70                  75                  80

Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn

                 85                  90                  95

Ala Tyr Lys Ala Leu Thr Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile Arg Leu

            100                 105                 110

Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Asp Leu Ile

        115                 120                 125

Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met

    130                 135                 140

Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp

145                 150                 155                 160

Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu

                165                 170                 175

Tyr Pro Ash Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp

        195                 200                 205

Ash Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Glu

    210                 215                 220

Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp

225                 230                 235                 240

Ser Gin Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His

               245               250                255

Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr

           260                  265                270

Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met

        275                 280                 285

Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr

    290                 295                 300

Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp

305                 310                 315                 320

Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp

                325                 330                 335

Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr

            340                 345                 350

Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro

        355                 360                 365

Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val

    370                 375                 380

Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys

385                 390                 395                 400

Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe

                405                 410                 415

Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn

            420                 425                 430

Glu Asn Asn Thr Leu Lys Ile Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val

        435                 440                 445

Ser Asp Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp

    450                 455                 460

Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val

465                 470                 475                 480

Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly

            485                490                  495

Pro Ser Ala Asn Trp Ile Asn Pro Ile Cys Ala Val Lys Val Glu Pro

            500                 505                 510

Thr Asp Phe Val Pro Phe Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr Ile

        515                 520                 525

Thr Thr Ala Asp Ser Pro Ala Ile Glu Ala Ile Ala Met His Ala Glu

    530                 535                 540

Asn Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala

545                 550                 555                 560

Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu

                565                 570                 575

Ile Pro Val Val His Asn Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Asn

            580                 585                 590

Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly

        595                 600                 605

Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu

    610                 615                 620

Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala

625                 630                 635                 640

Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu

                645                 650                 655

Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr

            660                 665                 670

Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly

        675                 680                 685

Tyr Trp Val Gln Ala Pro Gln Thr Phe Thr Val Asp Phe Glu Glu Leu

    690                 695                 700

Asp Gln Ala Asn Gln Val Asp Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile

705                 710                 715                 720

Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Val Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn

                725                 730                 735

Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Gln Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val

            740                 745                 750

Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Val Ala Ala Thr Gly Pro Ile Glu

        755                 760                 765

Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Ala Pro Pro Val Asp Glu Lys

    770                 775                 780

Glu Ala Ala Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Arg Gly Ala Glu Lys Glu

785                 790                 795                 800

Glu Arg Glu Ala Val Lys Ala Glu Arg Glu Val Ala Arg Glu Ala Ala

                805                 810                 815

Lys Glu Glu Arg Glu Thr Ala Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Thr Lys

            820                 825                 830

Lys

Claims (5)

1.一种碱性内切葡聚糖酶基因，其特征在于：所述的酶基因序列如下：ATGATGTTGCGCAAAAAGACAAAACAGTTGATTTCTTCCACTCTTATTTTAGTTTTACTTCTATCTTTATTTCCAACAGCTCTAGCAGCAGAAGGAAACACTCGTGAAGACAATTTTAATCATTTATTAGGTAATGACAATGTTAAGCGCCCTTCCGAGGCTGGCGCATTACAATTACAAGAAGTCGATGGACAAATGACATTAGTAGATCAAGATGGAGAAAAAATTCAATTACGTGGAATGAGTACACACGGATTACAATGGTTTCCTGAGATTTTAAATGATAACGCATACAAAGCTCTTACTAACGATTGGGAATCAAATATGATTCGTCTAGCTATGTATGTCGGTGAAAATGGCTATGCTTCAAATCCAGATTTAATTAAAAGCAGAGTCATTAAAGGAATAGATCTTGCTATTGAAAATGACATGTATGTCATTGTTGACTGGCATGTACATGCACCTGGTGATCCTAGAGATCCGGTTTAYGCWGGTGCAGAAGATTTCTTTAGAGAAATTGCAGCATTATATCCTAACAATCCACACATTATTTATGAGTTAGCGAATGAACCAAGTAGTAATAATAATGGTGGAGCAGGGATTCCGAATAATGAAGAAGGTTGGAATGCAGTAAAAGAATACGCTGATCCAATTGTAGAAATGTTACGTGAAAGTGGTAACGCAGATGACAATATCATCATTGTGGGGAGTCCTAACTGGAGTCAGCGTCCTGACTTAGCAGCTGATAATCCAATTGATGACCACCATACAATGTACACAGTTCATTTCTATACAGGTTCACATGCAGCTTCAACGGAGAGTTATCCGCCTGAAACTCCTAACTCTGAAAGAGGAAACGTAATGAGTAACACTCGTTATGCGTTAGAGAACGGAGTAGCGGTATTTGCAACAGAATGGGGAACAAGTCAAGCAAGTGGAGACGGTGGTCCTTACTTTGACGAAGCAGATGTATGGATTGAATTTTTAAATGAAAACAACATTAGCTGGGCTAACTGGTCTTTAACGAATAAAAATGAAGTGTCTGGTGCATTTACACCATTCGAGTTAGGAAAATCTAACGCAACTAATCTTGACCCAGGTCCAGACCATGTTTGGGCACCTGAAGAGTTAAGTCTTTCTGGAGAATATGTACGTGCTCGTATTAAAGGTGTGAACTATGAGCCAATCGACCGTACTAAATACACGAAAGTACTTTGGGACTTTAATGATGGAACGAAGCAAGGATTTGGAGTGAATGGAGATTCTCCAAATAAAGAGCTTATTGCAGTTGATAATGAAAACAACACTTTGAAAATTTCGGGGTTAGATGTAAGTAACGATGTTTCTGATGGCAACTACTGGGCTAATGCTCGTCTTTCAGCCAACGGTTGGGGGAAAAGTGTTGATATATTAGGTGCTGAAAAACTAACTATGGATGTTATTGTTGATGAGCCGACGACGGTAGCGATTGCTGCAATTCCACAAGGTCCATCAGCAAATTGGATTAATCCAATTTGCGCAGTTAAGGTTGAGCCAACTGATTTCGTGCCGTTTGGAGATAAGTTTAAAGCAGAATTAACTATAACTACAGCGGACTCTCCAGCGATAGAAGCGATTGCGATGCATGCTGAAAATAACAATATGAACAACATCATTCTGTTCGTAGGAACTGATGCAGCTGACGTTATTTATTTAGATAACATTAAAGTAATTGGAACAGAAGTTGAAATTCCAGTTGTTCATAATCCAAAAGGAGAAGCTGTCCTTCCGTCTAATTTTGAAGACGGCACACGTCAAGGTTGGGACTGGGCTGGAGAGTCTGGTGTGAAAACAGCTTTAACCATTGAAGAAGCAAACGGTTCTAACGCGCTATCATGGGAATTTGGATACCCAGAAGTAAAACCTAGTGATAACTGGGCGACAGCTCCACGTTTAGATTTCTGGAAATCTGACTTGGTTCGCGGTGAGAATGATTATGTAGCTTTTGACTTCTATCTAGATCCAGTTCGTGCAACAGAAGGCGCGATGAATATCAATTTAGTATTTCAGCCACCTACTAATGGATATTGGGTTCAAGCACCACAAACTTTTACGGTTGACTTTGAAGAGTTAGATCAAGCAAATCAAGTAGACGGTCTATACCATTATGAAGTAAAAATTAATGTAAGAGATATTACAAACGTTCAAGATGACACTTTACTACGTAATATGATGATTATTTTTGCTGATGTACAAAGTGATTTTGCAGGAAGAGTATTCGTAGATAATGTTCGTTTTGAGGTTGCTGCTACTGGGCCGATTGAGCCTGAACCAGTTGATCCTGGCGAAGAGGCGCCTCCTGTAGATGAGAAGGAAGCAGCAAAAGAAGAAAGAGAAGCAGCTAGAGGAGCGGAGAAAGAGGAAAGAGAAGCCGTGAAAGCTGAAAGAGAAGTAGCTAGAGAAGCAGCGAAAGAGGAAAGAGAAACCGCAAAAGAAGAAAAGAAAGAGGCTACGAAAAAATAA 。

2.根据权利要求1所述的一种碱性内切葡聚糖酶基因，其特征在于：所述碱性内切葡聚糖酶基因编码的氨基酸序列如下：MMLRKKTKQLISSTLILVLLLSLFPTALAAEGNTREDNFNHLLGNDNVKRPSEAGALQLQEVDGQMTLVDQDGEKIQLRGMSTHGLQWFPEILNDNAYKALTNDWESNMIRLAMYVGENGYASNPDLIKSRVIKGIDLAIENDMYVIVDWHVHAPGDPRDPVYAGAEDFFREIAALYPNNPHIIYELANEPSSNNNGGAGIPNNEEGWNAVKEYADPIVEMLRESGNADDNIIIVGSPNWSQRPDLAADNPIDDHHTMYTVHFYTGSHAASTESYPPETPNSERGNVMSNTRYALENGVAVFATEWGTSQASGDGGPYFDEADVWIEFLNENNISWANWSLTNKNEVSGAFTPFELGKSNATNLDPGPDHVWAPEELSLSGEYVRARIKGVNYEPIDRTKYTKVLWDFNDGTKQGFGVNGDSPNKELIAVDNENNTLKISGLDVSNDVSDGNYWANARLSANGWGKSVDILGAEKLTMDVIVDEPTTVAIAAIPQGPSANWINPICAVKVEPTDFVPFGDKFKAELTITTADSPAIEAIAMHAENNNMNNIILFVGTDAADVIYLDNIKVIGTEVEIPVVHNPKGEAVLPSNFEDGTRQGWDWAGESGVKTALTIEEANGSNALSWEFGYPEVKPSDNWATAPRLDFWKSDLVRGENDYVAFDFYLDPVRATEGAMNINLVFQPPTNGYWVQAPQTFTVDFEELDQANQVDGLYHYEVKINVRDITNVQDDTLLRNMMIIFADVQSDFAGRVFVDNVRFEVAATGPIEPEPVDPGEEAPPVDEKEAAKEEREAARGAEKEEREAVKAEREVAREAAKEERETAKEEKKEATKK-。

3.一种重组碱性内切葡聚糖酶，其特征在于：所述重组碱性内切葡聚糖酶是按下述方法制备而成：

(1)重组菌株的构建：

用PCR方法从Bacillus sp.III-3(CGMCC No.2138)的基因组DNA中克隆出不含信号肽编码序列的III-3-a酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-III-3-a，并转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到高效表达的重组大肠杆菌菌株E.coli III-3-A1；

(2)重组菌株的培养：

将筛选得到的重组大肠杆菌E.coli III-3-A1接种到50ml LB液体培养基中，待OD值达到0.6时加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于23℃条件下进行诱导培养，并于诱导培养12h加入0.5％的EDTA，诱导培养23h终止发酵；将发酵液用液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min后去沉淀即得粗酶液；

(3)重组碱性内切葡聚糖酶的分离纯化

将粗酶液离心收集上清液后直接上用pH 8.0 Tris-HCl预平衡的DEAESepharose CL-6B离子交换柱，用含浓度0.4～1M NaCl的pH8.0 Tris-HCl以180ml·h^-1的流速进行梯度洗脱，收集重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1；

所述重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1具有序列表SEQUENCE LISTINGNO.1所示的基因序列，具有序列表SEQUENCE LISTING NO.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组碱性内切葡聚糖酶，其特征在于：所述重组碱性内切葡聚糖酶的最适作用pH为8～10，最适作用温度为40～50℃，酶蛋白具有耐Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺金属离子，对SDS、EDTA或EGTA具有耐受性。

5.权利要求3所述的重组碱性内切葡聚糖酶在洗涤剂或纺织工业中的应用。

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