CN102002510A - 一种新型链霉菌分泌表达质粒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的链霉菌分泌表达质粒及其应用。具体地，本发明提供的质粒以球孢链霉菌C-1027中天然存在的pSGL1质粒最小复制子为骨架，克隆有大肠杆菌复制起始区ori、链霉菌接合转移的必需区oriT、氨苄青霉素抗性基因bla、阿普霉素抗性基因aac(3)IV、启动子ermE＊p、力达霉素辅基蛋白基因启动子cagAp、力达霉素辅基蛋白基因突变型信号肽SP_cagA(CTG)和多克隆位点。该质粒可应用于在链霉菌中高效分泌表达各种异源蛋白。

Description

一种新型链霉菌分泌表达质粒及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体而言，涉及一种链霉菌分泌表达质粒，以及其在链霉菌中分泌表达外源蛋白的应用。

背景技术

链霉菌是一种丝状革兰氏阳性细菌，能产生大量的次级代谢产物，如抗生素、免疫抑制剂等，在医药和农业生产中具有重要的价值。链霉菌表达体系是从20世纪中后期发展起来的一种新的原核表达体系，具有高效的蛋白分泌机制，并且表达的蛋白通常是可溶性、具有生物活性的，这些优点使其成为一种非常有前景的表达体系。

模式菌天蓝色链霉菌的基因组测序已经完成，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)也已成为一个高效分泌异源蛋白的表达宿主，许多真核蛋白在该系统中获得了成功的分泌表达，如TNFα、鲑鱼降钙素(Vrancken K，Ann éJ，Secretory production of recombinantproteins by Streptomyces，Future Microbiology，2009，4(2)：181-188)等。

到目前为止根据不同的需要已经在链霉菌中构建了大量的质粒载体(Kieser T，Bibb MJ，Buttner MJ，Chater KF，Hopwood DA：PracticalStreptomyces Genitics，2000)，其中大部分是从变铅青链霉菌ISP5434质粒pIJ101衍生而来。虽然链霉菌的克隆表达体系已逐渐完善，但是向链霉菌中直接引入外源基因仍然比大肠杆菌复杂，并且能达到大肠杆菌表达水平的载体还很少。

研究人员在1992年从力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)中分离出一种新质粒pSGL1(李晓平，李元，中国抗生素杂志，1992，17(5)：326～332)，该质粒具有易于分离，分子量小(7.4kb)和带有多个限制性酶切位点的特点。进一步的研究表明，pSGL1为高拷贝质粒，其最小复制子位于Sau3AI酶切的2.0kb片段上(洪斌，李元，球孢链霉菌质粒pSGL1的性质研究，微生物学报，1998，38(4)：256-260；张华，洪斌，李元，链霉菌质粒pSGL1最小复制子序列测定及分析，微生物学报，1999，39(4)：327-332)，而且该质粒与常用的pIJ101衍生质粒相容，可用于异源基因的克隆和表达。但是该质粒现在还没有充分优化，不含大肠杆菌质粒复制子和接合转移元件oriT，只能采用原生质体转化的方式来进行链霉菌中外源基因的克隆，操作比较繁琐；没有方便实用的多克隆位点来克隆需要表达的外源基因；没有外源基因表达必需的启动子；没有外源基因分泌表达必需的信号肽。因此尚需要进一步开发简便易用、表达效率高的链霉菌表达载体。

发明内容

基于此需要，发明人进行了多方面的研究，选择了力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027中的表达元件，由此构建了能在链霉菌中进行重组蛋白表达的新型载体。

本发明的一个方面涉及一种表达载体，其为环状，且可操作地连接有：

源于pSGL1的复制子序列：其由SEQ ID NO：1中第5086-7372位所示序列的互补序列构成；

大肠杆菌复制起始区ori序列：其由SEQ ID NO：1中第2497-3164位所示序列构成；

氨苄青霉素抗性基因bla序列：其由SEQ ID NO：1中第3315-4172位所示序列的互补序列构成；

多克隆酶切位点序列：其由SEQ ID NO：1中第1452-1481位所示序列构成；

阿普霉素抗性基因aac(3)IV序列：其由SEQ ID NO：1中第204-980位所示序列的构成；

源于链霉菌接合转移的必需区oriT序列：其由SEQ ID NO：1中第8602-8713位所示序列构成；

cagAp和ermE*p串联的强启动子序列：其由SEQ ID NO：1中第1581-2057位所示序列的互补序列构成；和

信号肽序列：其由SEQ ID NO：1中第1482-第1580位所示序列的互补序列构成或者由SEQ ID NO：1中第1482-第1580位所示序列中第1572位至第1574位的CTG替换为TTA的互补序列构成。

本发明另一方面涉及一种表达载体，其为环状，且由SEQ ID NO：1所示序列构成。

上述两个方面的表达载体中还可操作地插入有表达外源蛋白的基因。所述外源蛋白包括：细胞因子、肽类生物药物、功能蛋白等，例如集落刺激因子、表皮生长因子、白介素、胰岛素等；在本发明的一个实施方案中，所述外源蛋白是IL6。

本发明还涉及含有上述两个方面的表达载体的宿主细胞，在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞为链霉菌。

本发明还涉及上述两个方面的表达载体在链霉菌中表达外源蛋白的用途，其中的表达为分泌型表达，蛋白直接分泌到培养基中。所述外源蛋白包括：细胞因子、肽类生物药物、功能蛋白等，例如集落刺激因子、表皮生长因子、白介素、胰岛素等；在本发明的一个实施方案中，所述外源蛋白是IL6。

在本发明中，术语“可操作地连接”是指将核酸与另外的核酸序列置于在功能上具有关系的状态。这可以是相互连接的基因和控制序列以这样的方式连接，使得当适当的分子被结合到控制序列时，该基因的表达变得可行。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么该启动子将可操作性地与该序列结合。通常，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是相邻的，并且在分泌性前导序列的情况中，是相邻的且在阅读框内。所述序列的连接是通过在适当的限制酶位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。

具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型的表达载体：

从pSGL1质粒得到pSGL1的最小复制子(所述复制子是DNA分子中能独立进行复制的最小功能单位)。

从pBluescript II KS+质粒获得大肠杆菌复制起始区ori和氨苄青霉素抗性基因bla。

从质粒pOJ446中酶切得到源于链霉菌接合转移的必需区oriT和阿普霉素抗性基因aac(3)IV。

从质粒pL646中获得启动子ermE*p片段。

从力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027的基因组中得到包含力达霉素辅基蛋白基因cagA启动子cagAp和信号肽的序列cagA^TTA，并采用突变的方法获得包含cagA启动子cagAp和突变型信号肽SP_cagA(CTG)的序列cagA^CTG。

以pSGL1的最小复制子为骨架，将上述各片段连接，具体连接方式为：沿着pSGL1复制子转录的方向依次连接bla、ori、ermE*p、cagAp、SP_cagA(CTG)、多克隆位点(MCS)、aac(3)IV和oriT，其中aac(3)IV的连接方向与转录方向相反。

链霉菌基因表达调控是一个非常复杂的过程，选择合适的启动子和信号肽对外源蛋白的表达量至关重要。在链霉菌中表达真核基因时必须使用原核的启动子，不同的外源基因通常需要尝试不同的启动子信号肽才能确定最佳的选择，表达载体的构建尽可能的选用高效转录的基因启动子、高效切割的信号肽。

研究发现串联的启动子能增强蛋白的表达量，因此本实验中采用强启动子ermE*p和力达霉素辅基蛋白基因cagA的启动子串联。信号肽采用突变后的cagA信号肽，cagA是球孢链霉菌中力达霉素辅基蛋白的编码基因，其信号肽也被用于外源蛋白的分泌。cagA的信号肽中第三位密码子为链霉菌稀有密码子TTA，其在链霉菌次级代谢中起调控作用。为了研究其对外源蛋白分泌表达的影响，我们通过定点突变，用CTG取代TTA，不改变其编码的氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，链霉菌分泌表达质粒pIMB4和pIMB3的构建包括以下步骤：

1)复制区的选择

根据已知的pSGL1质粒的酶切图谱，通过实验证实pSGL1的最小复制子存在于Sal I和Sac I两单酶切位点之间。将pSGL1上包含最小复制子的小片段克隆入pUC19-E载体上，得到包含最小复制子的质粒pUC19-E/SG。

2)大肠杆菌复制起始区ori、链霉菌接合转移的必需区oriT、抗性基因的获得及质粒pIMB1的构建

将pUC19-E/SG双酶切，回收含pSGL1最小复制子的大片段，与pOJ446酶切获得的包含oriT和aac(3)IV的约2.2kb的片段，再与pBluescriptII KS+载体双酶切获得的包含ori和bla的片段进行三片段连接，得到质粒pIMB1。

3)启动子，信号肽，多克隆位点的获得

本发明以含有ermE*p片段的质粒pL646为模板，设计引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-ermE*p。

为了获得cagA的启动子及其突变的信号肽，本发明提取力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027的基因组为模板，通过设计引物，利用重叠PCR的方法获得包含cagA启动子cagAp及其突变型信号肽SP_cagA(CTG)的序列cagA^CTG，并克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-cagA^CTG。采用一步PCR法，获得野生型cagA^TTA的序列，克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-cagA^TTA。

4)pIMB4的构建

将质粒pGEM-ermE*p双酶切，回收ermE*p片段，再将质粒pGEM-cagA^CTG双酶切，回收cagA^CTG片段，一起连接到经酶切的pIMB1质粒上，得到表达载体pIMB4(SEQ ID NO：1)。同样构建了表达载体pIMB3，与pIMB4的差别仅在于cagA的信号肽编码序列中的TTA未被CTG所取代。

以在S.lividans TK24中表达人白细胞介素6(Interleukin-6，IL6)为例，说明本发明质粒pIMB4的应用效果：

IL6作为一种多效性细胞因子，在大肠杆菌、酵母以及哺乳动物细胞中都获得了表达(董宇清，李荣贵，吴光耀，重组人白细胞介素6工程菌的表达和功能初探，北京大学学报(自然科学版)，2000，36(4)：468-471；Guisez Y，Tison B，Contreras R，production andpurification of recombinant human interleukin-6 secreted by theyeast Saccharomyces cerevisiae，Eur J Biochem，1991，198(1)：217-222)，但迄今还没有在链霉菌中表达的报道。本发明以人外周血单核细胞总RNA逆转录而成的cDNA为模板，扩增获得人的IL6基因并克隆到pGEM-T载体上。，得到质粒pGEM-IL6。将酶切回收的IL6片段与载体pIMB4进行连接，构建链霉菌表达质粒pIMB4-IL6。将pIMB4-IL6转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后接合转移至变铅青链霉菌S.lividans TK24，获得重组菌株S.lividans TK24[pIMB4-IL6]。同样构建了重组菌株S.lividans TK24[pIMB3-IL6]。重组菌株发酵后，经检测表明IL6在S.lividans TK24中获得分泌表达，以pIMB4为载体的产量比以pIMB3为载体的产量略高，约为0.61mg/L。进一步对重组菌株S.lividans TK24[pIMB4-IL6]72h发酵液进行硫酸铵沉淀、阳离子交换层析、凝胶过滤层析等分离纯化后，每升发酵液可获得重组人IL6纯品0.3mg，经HPLC分析纯度达90％以上。

发明的有益效果

应用pIMB4在链霉菌中表达外源蛋白，具有以下优点：

1)pIMB4采用质粒pSGL1的最小复制子，其拷贝数高，pSGL1在原宿主中的拷贝数为70，其衍生质粒pSGLS3在变铅青链霉菌中拷贝数达到250(洪斌，李元，球孢链霉菌质粒pSGL1的性质研究，微生物学报，1998，38(4)：256-26)，可通过基因剂量效应达到外源基因的高表达。

2)pIMB4采用质粒pSGL1的最小复制子，与链霉菌常用的pIJ101系列质粒载体相容，可以用于在同一宿主中同时表达多种蛋白。

3)pIMB4同时具有大肠杆菌复制起始区ori，便于在大肠杆菌中进行遗传操作。由于链霉菌中进行基因操作相对复杂，所以本发明在pIMB4中加入大肠杆菌复制区，可先在大肠杆菌中完成重组质粒构建，再导入链霉菌中表达。

4)pIMB4具有链霉菌接合转移的必需区oriT，便于导入链霉菌宿主。在链霉菌中导入质粒通常采用原生质体转化方法，操作复杂，转化效率低。本发明在pIMB4种克隆入接合转移的必需区oriT，可通过大肠杆菌与链霉菌之间的接合转移导入质粒，更加方便。

5)p IMB4具有两种抗性基因，方便导入不同宿主或与不同质粒并存于同一宿主。

6)pIMB4具有强启动子ermE*p和力达霉素辅基蛋白基因cagA的启动子，双启动子串联方式能增强蛋白的表达量。

pIMB4采用突变后的cagA信号肽编码序列，cagA编码蛋白在球孢链霉菌中的表达量非常高，其信号肽可被用于外源蛋白的分泌，突变后的cagA信号肽编码序列可进一步提高异源蛋白的表达量。

附图说明

图1A质粒pIMB4构建过程示意图；图1B质粒pIMB4示意图。

图2、重叠PCR法扩增包含cagA启动子cagAp及其突变型信号肽SP_cagA(CTG)的编码序列cagA^CTG示意图。

图3、重组菌株S.lividans TK24[pIMB3-IL6]和S.lividans TK24[pIMB4-IL6]的SDS-PAGE分析(A)和Western blot分析(B)。泳道M：预染蛋白分子量Marker；泳道1，2：对照菌株；泳道3：S.lividans[pIMB4-IL6]；泳道4：S.lividans[pIMB3-IL6]。

图4、重组菌株S.lividans TK24[pIMB3-IL6]和S.lividans TK24[pIMB4-IL6]的生长曲线及IL6最适表达时间。(A)重组菌株的生长曲线；(B)重组菌株培养液pH变化示意图；(C)S.lividans[pIMB3-IL6]不同培养时间上清液的Western blot分析。泳道M：预染蛋白分子量Marker；泳道1：S.lividans[pIMB3-IL6]发酵24h上清液；泳道2：S.lividans[pIMB3-IL6]发酵48h上清液；泳道3：S.lividans[pIMB3-IL6]发酵72h上清液；泳道4：S.lividans[pIMB3-IL6]发酵96h上清液。(D)S.lividans[pIMB4-IL6]不同培养时间上清液的Western blot分析。泳道M：预染蛋白分子量Marker；泳道1：S.lividans[pIMB4-IL6]发酵24h上清液；泳道2：S.lividans[pIMB4-IL6]发酵48h上清液；泳道3：S.lividans[pIMB4-IL6]发酵72h上清液；泳道4：S.lividans[pIMB4-IL6]发酵96h上清液。

图5、ELISA分析重组菌株S.lividans TK24[pIMB3-IL6]和S.lividans TK24[pIMB4-IL6]中IL6表达水平。

图6、HPLC检测重组人IL6样品纯度。

图7、重组人IL6表达质粒信号肽切割示意图(A)和N端氨基酸序列测定(B)。

图8、pIMB4启动子cagAp和信号肽SP_cagA(CTG)区示意图

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1pIMB4的构建过程

1.表达载体链霉菌复制区的选择

将pSGL1用SalI和SacI双酶切，回收包含最小复制子的小片段，并连接到同样以SalI和SacI双酶切的pUC19-E[pUC19(Kieser T，BibbMJ，Buttner MJ，Chater KF，Hopwood DA：Practical StreptomycesGenitics，2000)的EcoR I位点被人工缺失]载体上，得到质粒pUC19-E/SG(图1A)。

2.抗性基因，大肠杆菌复制起始区ori、链霉菌接合转移的必需区ori T的获得

大肠杆菌复制起始区ori和氨苄青霉素抗性基因bla来源于pBluescript II KS+质粒(Kieser T，Bibb MJ，Buttner MJ，Chater KF，Hopwood DA：Practical Streptomyces Genitics，2000)，链霉菌接合转移的必需区oriT和阿普霉素抗性基因aac(3)IV通过质粒pOJ446(Kieser T，Bibb MJ，Buttner MJ，Chater KF，Hopwood DA：PracticalStreptomyces Genitics，2000)酶切得到。

在质粒pOJ446上，链霉菌接合转移的必需区oriT和阿普霉素抗性基因aac(3)IV可通过EcoR I和Pst I双酶切一起获得，但由于在oriT两侧均存在Pst I位点，所以采取先将pOJ446用EcoR I完全酶切，再以Pst I部分酶切的方式。将pUC19-E/SG用Sac I和Pst I双酶切，回收含最小复制子的大片段，与上述pOJ446 EcoR I和Pst I酶切获得的约2.2kb的片段，再与经过Sac I和EcoR I双酶切的pBluescript IIKS+载体进行3片段一起连接，得到质粒pIMB1(图1A)，经酶切鉴定正确。

3.启动子，信号肽，多克隆位点的获得

3.1ermE*p基因的获得

以含有ermE*p片段的质粒pL646(Hong B，Phornphisutthimas S，Tilley E，Baumberg S，McDowall KJ，Streptomycin production byStreptomyces griseus can be modulated by a mechanism notassociated with change in the adpA component of the A-factorcascade，Biotechnol Lett，2007，29：57-64)为模板，设计两条引物，

Ea：5’GCCAAGCTTGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGA 3’(SEQ ID NO：2)

Eb：5’GCTCTAGATGGGGTCCTCCTGTGGAGTGGTTCT 3’(SEQ ID NO：3)

以Ea和Eb为引物，pL646为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小为220bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到pGEM-T载体(购自Promege公司)上，得到质粒pGEM-ermE*p，质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞，挑取白斑，行快速裂解初步鉴定。将快速裂解初步鉴定正确的阳性克隆进行插入片段的序列测定，分别用T7和SP6引物进行测序，测序结果与GenBank数据库进行Blast比对和分析。结果表明获得的阳性克隆上的插入片段与已知ermE*p启动子序列一致。

3.2 cagA启动子、信号肽序列及多克隆位点的获得

为了获得cagA的启动子及其突变的信号肽，本发明提取力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027(国家药用微生物菌种资源共享平台保藏，编号为CPCC 200270)的基因组为模板，设计了4条引物C1、C2、C3、C4。

C1：5’GCTCTAGACTACCGGTCCGACCTCGCGC 3’(SEQ ID NO：4)

C2：5’TCGGAGCCTACGCATGTCGCTGCGTCACAT 3’(SEQ ID NO：5)

C3：5’AAGCACGGCGGGACATGTGACGCAGCGAC 3’(SEQ ID NO：6)

C4：5’GGAATTCAGATCTGATATCCCGCGGCATATGGGCGAAGGCGACGGACTGTG3’(SEQ ID NO：7)

在C1的5’端加上了XbaI酶切位点，C2和C3为定点突变TTA为CTG的引物，C4引物设计在cagA信号肽切割位点后加上了多克隆位点(MCS)，依次为NdeI，SacII，EcoRV，BglII和EcoRI(图2)。利用重叠PCR的方法(图2)获得包含cagA启动子cagAp及其突变型信号肽SP_cagA(CTG)的编码序列cagA^CTG，分三步法。

第一步：用C1和C2引物PCR扩增cagA-C1C2段，以C-1027的基因组DNA为模板进行扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约300bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化。

第二步：用C3和C4引物PCR扩增cagA-C3C4段，以C-1027的基因组DNA为模板进行扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，56℃退火40秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约为120bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化。

第三步：用C1和C4引物PCR扩增cagA-C1C4段，以cagA-C1C2片段和cagA-C3C4片段做模板进行扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，52℃退火40秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约为390bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-cagA^CTG

采用一步PCR法扩增野生型cagA^TTA的序列，以C1和C4为引物，以C-1027的基因组DNA为模板进行扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，52℃退火40秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约为390bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-cagA^TTA。

4.pIMB4和pIMB3表达载体的构建

将质粒pGEM-ermE*p用Hind III和Xba I双酶切，回收ermE*p片段，再将质粒pGEM-cagA^CTG用Xba I和EcoR I双酶切，回收cagA^CTG片段，将ermE*p片段和cagA^CTG片段一起连接到经Hind III和EcoR I酶切的pIMB1质粒上，得到表达载体pIMB4(图1A和图1B)，经酶切鉴定正确。其中pIMB4启动子cagAp和信号肽SP_cagA(CTG)区参见图8。同时，本发明也构建了含有未突变的cagA信号肽的质粒载体pIMB3，将质粒pGEM-ermE*p用Hind III和Xba I双酶切，回收ermE*p片段，再将质粒pGEM-cagA^TTA和用Xba I和EcoR I双酶切，回收cagA^TTA片段，一起连接到经Hind III和EcoR I双酶切的pIMB1质粒上，得到表达载体pIMB3，经酶切鉴定正确。pIMB3与pIMB4的序列仅有3个碱基不同，位于信号肽的编码序列上，pIMB3将pIMB4序列1572位至第1574位的CTG替换为TTA。

实施例2IL6在新型链霉菌表达载体pIMB3、pIMB4中的克隆表达

1IL6重组表达菌株的构建

根据已知人IL6基因编码序列，设计两条引物IL6a和IL6b，

IL6a：5’TCCATATGGTACCCCCAGGAGAAGATTC 3’(SEQ ID NO：8)

IL6b：5’CGGGATCCTTACATTTGCCGAAGAGCCCTC 3’(SEQ ID NO：9)

在上游引物IL6a 5’端加上了Nde I酶切位点，下游引物IL6b 5’端加上了BamH I酶切位点，且在酶切位点前引入终止密码子TAA。采用Pfu高保真DNA聚合酶进行PCR，以人外周血单核细胞总RNA逆转录而成的cDNA为模板，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，55℃退火40秒，72℃延伸2分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约为560bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-IL6。测序结果表明获得的阳性克隆上的插入片段与已知IL6基因cDNA序列完全一致。将克隆有IL6基因片段的质粒pGEM-IL6用Nde I和BamH I双酶切，回收IL6片段。将酶切回收IL6片段分别与经Nde I和Bgl II双酶切的载体pIMB3、pIMB4进行连接(BamH I和Bgl II为同尾酶)，连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，挑选转化子并提取质粒进行鉴定。

将酶切鉴定正确的重组质粒命名为pIMB3-IL6、pIMB4-IL6，转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(Kieser T，Bibb MJ，Buttner MJ，ChaterKF，Hopwood DA：Practical Streptomyces Genitics，2000)，然后接合转移至变铅青链霉菌S.lividans TK24(国家药用微生物菌种资源共享平台保藏，编号为CPCC 200079)。挑取接合子进行PCR鉴定，证实重组质粒成功转化S.lividans TK24，获得的菌株命名为S.lividansTK24[pIMB3-IL6]和S.lividans TK24[pIMB4-IL6]。

2重组菌株的表达情况

2.1SDS-PAGE分析和Western blot分析

重组菌株S.lividans[pIMB3-IL6]、S.lividans[pIMB4-IL6]和对照菌株同时采用CM培养基28℃发酵，取72h发酵液上清，经90％饱和度硫酸铵沉淀后充分透析，冻干后样品进行12％SDS-PAGE分析和Western blot分析，S.lividans[pIMB3-IL6]和S.lividans[pIMB4-IL6]发酵液上清在分子量约20kD处有明显的特异条带出现，与IL6预计分子量相符，S.lividans[pIMB4-IL6]中IL-6的表达量略高于S.lividans[pIMB3-IL6]，而含空质粒的对照菌株并不产生IL6(图3)。

2.2重组菌生长曲线及IL6最适表达时间研究

2.2.1菌丝干重与培养基pH曲线

重组菌株S.lividans[pIMB3-IL6]、S.lividans[pIMB4-IL6]和对照菌株同时采用CM培养基28℃发酵，分别在24h、48h、72h、96h取样，测定菌丝干重及发酵液pH值，绘制菌株的生长曲线和pH变化曲线(图4A，4B)。从图中可以看出，重组菌株在48h内生长较快，代谢旺盛，pH低于8，在48h菌体干重达到最大；72h时pH上升到8.0上，此时菌体干重开始缓慢下降，说明菌丝体已开始自溶；96h时，pH值达到9.0以上，菌体干重继续下降。对照菌株的生长情况和重组菌株相似。

2.2.2Western blot分析重组人IL6最适表达时间

分别取重组菌株S.lividans[pIMB3-IL6]、S.lividans[pIMB4-IL6]和对照菌株24h、48h、72h、96h的发酵液上清，硫酸铵沉淀处理后进行12％的SDS-PAGE。结果显示，随培养时间延长，S.lividans[pIMB3-IL6]和S.lividans[pIMB4-IL6]在分子量约20kD处条带逐渐变粗，在72h时达到最高(图4C，4D)。Western blot验证了该结果，因此确定采取72h发酵。

2.2.3ELISA检测重组人IL6不同时间的表达水平

采用IL6ELISA检测试剂盒(R&D公司)检测重组菌株S.lividans[pIMB3-IL6]、S.lividans[pIMB4-IL6]24h、48h、72h、96h的发酵液上清，重组菌株中IL6的表达量随着培养时间的延长，浓度逐渐升高，在72h达到最高，而后重组蛋白随时间延长而浓度降低。S.lividans[pIMB3-IL6]中重组人IL6最高表达水平约0.5mg/L，S.lividans[pIMB4-IL6]中重组人IL6最高表达水平约0.61mg/L(图5)。

实施例3重组人IL6的纯化及生物学活性验证

1.IL6理化性质及结构预测

在纯化蛋白前首先对目标蛋白的性质做初步分析，主要包括分子量大小和等电点等。我们用蛋白序列分析软件包ANTHREPORT 5.0预测实施例2 S.lividans[pIMB4-IL6]表达的IL6的理化性质，IL6蛋白分子量为20813.87，等电点pI＝6.175；整个分子为疏水与亲水交错排列的结构；蛋白完全可溶性；无跨膜区结构。

2.分离纯化链霉菌表达的重组人IL6

我们选择强阳离子交换树脂Q Sepharose Fast Flow作为分离介质，离子交换起始缓冲液pH高于目标蛋白等电点值2个单位以上，以保证目标蛋白带有净负电荷，因此缓冲液pH设定为8.5。Superdex HR 7510/300分离物质分子量范围为3,000-70,000，IL6分子量20813.87，位于以上分离范围之内。

IL6的分离纯化流程如下：

首先离心、收集实施例2的S.lividans[pIMB4-IL6]72h发酵液上清，用90％饱和度硫酸铵沉淀，离心、弃上清，然后加水溶解、透析，冷干；接着进行阳离子交换层析(Q Sepharose FF)，再透析、冷干；再进行凝胶过滤层析(Superdex HR 75 10/300)，最后超滤浓缩、冷干。

3.HPLC分析

对经过上述步骤纯化后的重组人IL6样品进行高效液相检测，结果表明纯化后的蛋白样品中重组人IL6的含量高于90％(图6)。

4.重组人IL6 N端氨基酸序列测定

对经过上述步骤纯化后的重组人IL6 N-端9个氨基酸的序列测定结果如下：His-Met-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser，His-Met为信号肽切割位点后加入的酶切位点Nde I序列(CATATG)编码，Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser紧接Nde I位点之后，与天然IL6的N端氨基酸序列完全一致(图7)。

5.重组人IL6的纯化收率

采用500ml三角摇瓶，以50mL/瓶进行S.lividans[pIMB4-IL6]的发酵研究，取发酵72h发酵液进行纯化，ELISA检测重组IL6含量为0.61mg/L。1升发酵液经过90％饱和度硫酸铵沉淀处理后平均能够得到约400mg发酵粗品，经BCA蛋白定量试剂盒测定发酵粗品中的蛋白含量约为25％；发酵粗品经SDS-PAGE电泳、使用Quantity One软件分析考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，估算得出IL6蛋白约占蛋白总量的0.5％。经Q Sepharose FF离子交换层析后，收集组分，充分透析冷干，蛋白称重总量为1.8mg，利用SDS-PAGE、Quantity One软件分析，重组IL6占总量的24％。在进行Superdex HR 75 10/300凝胶过滤层析后，收集组分，超滤脱盐，冷冻干燥，最终获得蛋白产物为0.3mg，经HPLC分析，重组IL6占总量的90％(见表1)。

表1重组IL6纯化收率

n.a.：不适用；a：使用IL6 ELISA定量试剂盒检测；b：使用BCA蛋白定量试剂盒检测经饱和硫酸铵沉淀后得到的粗品中蛋白的含量；c：利用Quantity One软件分析经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶中重组IL6蛋白的百分含量；d：蛋白称重；e：HPLC分析重组IL6蛋白纯度。

6.重组IL6的生物学活性

根据在不同白细胞介素-6(IL6)的浓度下，IL6依赖株7TD1细胞增殖存活率不同，通过活细胞内琥珀酸脱氢酶将MTT还原成蓝紫色结晶Formazan程度的差异来检测IL6的生物学活性。7TD1增殖程度与IL6浓度在一定条件下成线性关系。能引起50％最大生长刺激的IL-6浓度定为1U/ml。据此，由回归曲线求出标准品半效量的OD₅₇₀值，再确定样品达到这一OD₅₇₀值时的稀释倍数，根据以下活性公式计算出待测样品IL-6的生物学活性水平：

Pr：标准品生物学活性，U/mg；

Es：样品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er：标准品半效稀释倍数。

经测定，S.lividans[pIMB4-IL6]表达的重组人IL6的生物学活性为7.7×10⁶U/mg。

证明本发明的表达载体能够在链霉菌中分泌表达具有生物学活性的细胞因子等重组蛋白质。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>一种新型链霉菌分泌表达质粒及应用

<130>IDC100072

<160>9

<170>PatentIn version 3.2

 

<210>1

<211>8862

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctcacggtaa ctgatgccgt atttgcagta ccagcgtacg gcccacagaa tgatgtcacg  60

ctgaaaatgc cggcctttga atgggttcat gtgcagctcc atcagcaaaa ggggatgata  120

agtttatcac caccgactat ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt  180

catcagcggt ggagtgcaat gtcgtgcaat acgaatggcg aaaagccgag ctcatcggtc  240

agcttctcaa ccttggggtt acccccggcg gtgtgctgct ggtccacagc tccttccgta  300

gcgtccggcc cctcgaagat gggccacttg gactgatcga ggccctgcgt gctgcgctgg  360

gtccgggagg gacgctcgtc atgccctcgt ggtcaggtct ggacgacgag ccgttcgatc  420

ctgccacgtc gcccgttaca ccggaccttg gagttgtctc tgacacattc tggcgcctgc  480

caaatgtaaa gcgcagcgcc catccatttg cctttgcggc agcggggcca caggcagagc  540

agatcatctc tgatccattg cccctgccac ctcactcgcc tgcaagcccg gtcgcccgtg  600

tccatgaact cgatgggcag gtacttctcc tcggcgtggg acacgatgcc aacacgacgc  660

tgcatcttgc cgagttgatg gcaaaggttc cctatggggt gccgagacac tgcaccattc  720

ttcaggatgg caagttggta cgcgtcgatt atctcgagaa tgaccactgc tgtgagcgct  780

ttgccttggc ggacaggtgg ctcaaggaga agagccttca gaaggaaggt ccagtcggtc  840

atgcctttgc tcggttgatc cgctcccgcg acattgtggc gacagccctg ggtcaactgg  900

gccgagatcc gttgatcttc ctgcatccgc cagaggcggg atgcgaagaa tgcgatgccg  960

ctcgccagtc gattggctga gctcatgagc ggagaacgag atgacgttgg aggggcaagg  1020

tcgcgctgat tgctggggca acacgtggag cggatcgggg attgtctttc ttcagctcgc  1080

tgatgatatg ctgacgctca atgccgtttg gcctccgact aacgaaaatc ccgcatttgg  1140

acggctgatc cgattggcac ggcggacggc gaatggcgga gcagacgctc gtccgggggc  1200

aatgagatat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa  1260

agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca  1320

gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct  1380

acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc  1440

ttgacattgg ggaattcaga tctgatatcc cgcggcatat gggcgaaggc gacggactgt  1500

gcggcggcgg ccaggccgat ggatgcgacg gccacgacgc cgaacctgga agcacggcgg    1560

gacatgtgac gcagcgacat gcgtaggctc cgattcgagg agggggttga tcactccatg    1620

aaaggatcac ctcgccggac ggccgcctgc atctccctct gtgctctcgt ggatttccgg    1680

cacgcactcc cgtcgacggc cgcccgcaga atgcggcaga ccccccgcac ctcctccggc    1740

cccaccgccg taccggtggg cagcgacacg acccgctcgg tgagcgcctc caccttcggg    1800

agcggatcgg gcgcgtggcg cgcgaggtcg gaccggtagt ctagatgggg tcctcctgtg    1860

gagtggttct gtatcctacc aaccggcacg attggcccac aacagcatcg cggtgccacg    1920

tgtggaccgc gtcggtcaga tcctccccgc acctctcgcc agccgtcaag atggaccgcg    1980

tgcacctgcg atcgccgatc aaccgcgact agcatcgggc gcaagccgcc actcgaacgg    2040

acactcgcat ggacgtcaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc    2100

agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg    2160

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata    2220

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca    2280

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc    2340

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg    2400

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta    2460

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc    2520

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag    2580

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac    2640

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc    2700

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt    2760

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc    2820

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga    2880

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta    2940

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta    3000

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga    3060

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg    3120

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag    3180

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc    3240

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact    3300

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt    3360

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta    3420

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta    3480

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc    3540

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat    3600

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt    3660

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg    3720

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca    3780

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta    3840

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg    3900

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact    3960

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg    4020

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt    4080

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga    4140

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc    4200

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa    4260

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctaaattgta agcgttaata    4320

ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg    4380

aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc    4440

cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa    4500

ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt    4560

cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac    4620

ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta    4680

gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg    4740

cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat    4800

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat    4860

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgagc    4920

gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctccc gcccgaaccg ccagacctcc    4980

cgccggatca cgagtctccg cacgacctcc ggcccgcagt agatcgccac cagcgggccg    5040

tacgtcaccg ccaccacagg ccagagccca agcaattcgc ggcctatcag caccccaccg    5100

atcagcagtg ccacagccag ggtcagcgcg agactgtctc gctcgctcac gatcacaccc    5160

ccgtacgtag atcaacacgc accgtagtga tcaccgctga caatgtcgcg ggattaccgg    5220

ccctcgtccc gctcgacacc cggcggaggc ggcagcagcc gccgccgccg cttcgccggg    5280

gccgcccgcc acgcggacgg aatcacgggg ctgacctgcc ccggagacgt ttcgacaact    5340

gacggatcgg gaccccgttt cgcgggcccc gtttcgacaa ctgacgattc cgacgctgcg    5400

gccgcgagcg cctgggcaac cgcctcgtcc accgcccgct gctgccgccg tgcccggtag    5460

gccagctccc gatgcgtccg cccgcagtac tcgcgcttgc gcccgatccc ggactgtcgg    5520

accggctcgc cgcaccaggc gcacgggctc cctgccgtcg tcgtctcgct catccgccgg    5580

acgctaccgg ccgtgccatg agatacgccg tatcgggcga cgacgacgag caccaggagc    5640

acgagcacga ccaggagcac gaagagggtt cctcgaggcg gatccggttc ggccggcaca    5700

aatgcggtgc aggccgatcc ggcccggcgg ccgtgatgaa ccgccgggcc agaacagggt    5760

cagtcggtcg gggtcgccgg gaccgggaga acgtcccggc cccactccag cccccatccg    5820

gtgatgagcg actggaccgc gccgacgccg ccgatctcgg cggcccgaat caggtcgagc    5880

gagcggccac ggtgccggag gatcacgccg taccaggtct ctgccgggat cagggcgacg    5940

ccagtgccgc caacgtcctc ggaggcaatc tcctcgtcgg tccgctcgtc gagctgcacg    6000

agcttgccga gcagtgcccg caggccgttg gaccagtaga ttgcccggat cccatgggcg    6060

ccgtgctcgt actcgtgcca cagcggcacg tcctcggcga gcccggccgc cgcccctgcc    6120

gccaccctcg aacggcatcc gggacgcctt acgcccggcc tgtcggcact ggtcagctcc    6180

gcgcccggcg cccagcgctc gaaccgcgcc ttgccgtctg ggacttgaac aggtagcggc    6240

tgaactgttg ggcgtcctgc ggccggggga cgtcgatccg gagtccacgg tcgttgggcc    6300

ggtagccccc tgcccgctcc acggagcgga cccaacgggc ccgggccgtc tcctcgaacg    6360

agtcggcatg gtctcgcgtc cacggctccg acgtgaaaag caggacgtga aagtgcgggt    6420

gccagccgtg atcggcgccg acggtgcact cccacacgcg gacgtacccg acgaccccgt    6480

gatcctcctg gagccgctgc cacatcttcc cggcgcggct tccgaacgcg aggatccagg    6540

cgtcgtgctg aacgccgatc aggccgcccc tctcggcccg ccggatggtg ccgagcggca    6600

tccgccggta gtgccggagg gtgagcgtca tcatcgccag cccatgctct gctgcctgcc    6660

aggcgcccgt gaccgtgtcg atctcctcgg accgggcggc ccggatcttg gctgagcaga    6720

ccgggcagag gtggatcttt ccgcacgtgg caacgccgga caggtgggcc gtcttgccgt    6780

tcaggacgac gccgacgccg cccgcgatgg cggaccggcc gcagcccttc agccccttgt    6840

cctcggtgac ccgctggagg ccttcccgga gggtccacct ggcatcgcgg gtccgcatcc    6900

cgggcctgtc cgcttttgca tttccggaca cgtccgcagc gctctgacct gcacgggttg    6960

cactttctcc ggtagtacct aggcgcctgt ccggatttgc tgcggccggt cgtgcctcag    7020

cggtcgtggt gggcagtgca gtgccccgct cgatggctcg ctttgccgcc ttccggcagg    7080

cgtccgagca gtacacacgc ggccgcttgc ccggcgtccg ggcgatgggg gtcccgcagt    7140

gacagcgggg tccggcgggg cgaggtaccg ggttacgctg atctcgttac gctcgtcaca    7200

gagcaaacgt cctcactcgg catgcgacgc cgattcgggg gcggcggccc cggcctccta    7260

cagccggggt cgtgccattt cctgggcccc atgaggcccg ttcagatcct tgcagccgtt    7320

ggggcattcg ttgcccccgg tcctcctgac gcgccgtgtg gcggatgtga tcaggagaga    7380

gctaagatta catagccatc gcgttgcctg caatgccatc gcgatgttgg tgtgtccaga    7440

cagccgaaag ccccgcccgg atctccgggc ggggctcggc tcgttgctgg tcagctctcg    7500

tcgggccagc tccgcaggta gagcgagacc gtaacgctct tgccgttctt cgcggtccgc    7560

tcggtgcggc cgtggtaggt cacttcgccg tcactgtcgg gtcgggccgt cagctcgatg    7620

ccgaggtgat cggcccacgc ggtgagcgcg gccagtcgct ccgggcgggt cccgctcggc    7680

ggctcgccct ggagctgggc ggtggtggcc actcgccagg tgatcgggga gaggtcagcc    7740

tccgtgatcg tggagagcac gttgatcgcg gcgtactgcc agcgtcggcg gtcggtgtcg    7800

gtgatgggca tggagtctct cctcagtcag gcggcgggtg cgagtcgggc ggcaagctgg    7860

gcggctgtca ccaggatcag ccggacatcg gcggcggctt cgggcgggat cggggccccg    7920

accgattcgg ccggcacatt cggcggaggg gtcgggacgg ggcggcggcg gagggccacc    7980

gcgaggacga cgaccgcgac caggagcgag agcaggtagg cgagagccat ggtcatgccc    8040

ccgccgccgt cgacctgcag gtccccgggg atcggtcttg ccttgctcgt cggtgatgta    8100

cttcaccagc tccgcgaagt cgctcttctt gatggagcgc atggggacgt gcttggcaat    8160

cacgcgcacc ccccggccgt tttagcggct aaaaaagtca tggctctgcc ctcgggcgga    8220

ccacgcccat catgaccttg ccaagctcgt cctgcttctc ttcgatcttc gccagcaggg    8280

cgaggatcgt ggcatcaccg aaccgcgccg tgcgcgggtc gtcggtgagc cagagtttca    8340

gcaggccgcc caggcggccc aggtcgccat tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat    8400

agtccacgac gcccgtgatt ttgtagccct ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc    8460

tcatgccggc cgccgccgcc ttttcctcaa tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca    8520

ccttgatagg tgggctgccc ttcctggttg gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct  8580

catctgttac gccggcggta gccggccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg  8640

ccaggtgcga ataagggaca gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac  8700

ctatcctgcc cggctgacgc cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc  8760

aaaatcctgt atatcgtgcg aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc  8820

cgaagcaggg ttatgcagcg gaaaagatcc gtcgacctgc ag                     8862

 

<210>2

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccaagcttg acgtccatgc gagtgtccgt tcga    34

 

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gctctagatg gggtcctcct gtggagtggt tct    33

 

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gctctagact accggtccga cctcgcgc    28

 

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcggagccta cgcatgtcgc tgcgtcacat    30

 

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aagcacggcg ggacatgtga cgcagcgac    29

 

<210>7

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggaattcaga tctgatatcc cgcggcatat gggcgaaggc gacggactgt g    51

 

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tccatatggt acccccagga gaagattc    28

 

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgggatcctt acatttgccg aagagccctc    30

Claims (10)

1.一种表达载体，其为环状，且可操作地连接有：

源于pSGL1的复制子序列：其由SEQ ID NO：1中第5086-7372位所示序列的互补序列构成；

大肠杆菌复制起始区ori序列：其由SEQ ID NO：1中第2497-3164位所示序列构成；

氨苄青霉素抗性基因bla序列：其由SEQ ID NO：1中第3315-4172位所示序列的互补序列构成；

多克隆酶切位点序列：其由SEQ ID NO：1中第1452-1481位所示序列构成；

阿普霉素抗性基因aac(3)IV序列：其由SEQ ID NO：1中第204-980位所示序列的构成；

源于链霉菌接合转移的必需区oriT序列：其由SEQ ID NO：1中第8602-8713位所示序列构成；

cagAp和ermE*p串联的强启动子序列：其由SEQ ID NO：1中第1581-2057位所示序列的互补序列构成；和

信号肽序列：其由SEQ ID NO：1中第1482-第1580位所示序列的互补序列构成或者由SEQ ID NO：1中第1482-第1580位所示序列中第1572位至第1574位的CTG替换为TTA的互补序列构成。

2.权利要求1的表达载体，其为环状，且由SEQ ID NO：1所示序列构成。

3.权利要求1或者2的表达载体，其中还可操作地插入有表达外源蛋白的基因。

4.权利要求3的表达载体，其中的外源蛋白选自细胞因子、肽类生物药物和功能蛋白。

5.权利要求4的表达载体，其中的外源蛋白是白细胞介素6。

6.宿主细胞，其含有权利要求1或2所述的表达载体。

7.权利要求6的宿主细胞，其为链霉菌。

8.权利要求1或2所述的表达载体在链霉菌中表达外源蛋白的用途。

9.权利要求8的用途，其中所述的外源蛋白选自细胞因子、肽类生物药物和功能蛋白，优选白细胞介素6。

10.权利要求8的用途，其中的表达为分泌型表达。

Images