JPS58190390A - 宿主−ベクタ−系における宿主として有用な枯草菌の無胞子性変異株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一及」已と止Ｉ一 本発明は、種々の遺伝子を有するベクターを組換えＤＮ
Ａの手法を用いて挿入しうる宿主−ベタ９−系の宿主と
して有用な枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｒｓ　５ｕｂｔｉｌｉ
峡の新規な変異株に関する。

発明の背景 細菌中の大抵の遺伝物質は、細胞の染色体として存在す
る巨大ＤＮＡ分子として存在する。ある縫の遺伝物質は
、プラスミドとして知られる比較的小さな閉環状ＤＮＡ
分子の形で存在することもある。特定の遺伝形質に関連
するＤＮＡ分子の部分は遺伝子と呼ばれる。

遺伝子工学と呼ばれる技術によって、特定の蛋白質の生
産のためにコード付けする遺伝子を一つの微生物からも
う一つの微生物に移すことカー■能である。新しい遺伝
物質を受容する微生物は、宿主と呼ばれる。酵素のよう
なある種の特定の蛋白質のすぐｎだ生産者である微生物
を提供するこれらの技術を多くの研究者が使用している
。

環の形に相互に連鎖をなした一連の遺伝子を含むプラス
ミドは、一つの微生物の細胞から取出されそして比較的
容易にもう一つの微生物の細胞に挿入されうることか発
見された。プラスミドは、また新しい遺伝物質を宿主微
生物に運ぶベクターとして使用されうる。これはまずで
行なわれる。所望の遺伝子をもつ外来ＤＮＡの断片は、
ＤＮＡ環が切断された場所に挿入される。環はＤＮＡ　
ＩＪガーゼを用いて処理することによって修復される。

組換えられたプラスミド、すなわち新しい環状ＤＮＡ分
子は、元のシラスミドの遺伝子に加えて挿入されたＤＮ
Ａの断片からの新しい遺伝子を有する。このプラスミド
は、宿主微生物中に導入される。新しい遺伝子を含むプ
ラスミドは、次に宿主微生物中で再生されそしてその遺
伝物質の一部となる。

遺伝子工学において使用するのに適した宿主微生物とし
ては、それは新しいＤＮＡを取込むことができなければ
ならない。更に、それは新たに挿入された遺伝子中にコ
ード付けされた形質（ｔｒａｉｔｓ）を発現する生存可
能微生物を産生じなければならない。有用な量の蛋白質
を産生ずべき微生物としては、この微生物は、また工業
的規模で増殖されうるものでなければならない。

新しい組換えＤＮＡ技術を使用する実験者は、新しい遺
伝物質を有する微生物が人、動物捷たは植物に有害な物
質を生産するかもしれないということを気遣っていた。

この懸念のゆえに、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　）（ｅａｌｔｈ）（
ＮＩＨ）は、１９７８年に５組換えＤＮＡ分子に関連す
る研究の指針（Ｇｕｉｄｅｌ　１ｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ　ＤＮＡＭｏ１ｅｃｕｌｅｓ）”を発表した。こ
の指針は、遺伝子操イ１実験が行なわれる研究室におけ
る種々の水準の物理的封じ込めに対応するものであった
。この指針は、また組換えＤＮＡを含む微生物について
の生物学的封じ込めの基Ｖｔを確立した。

生物学的封じ込めは、もし、それらが実験室から自然の
環境にもれた場合に、生残る能力の限定された宿主細胞
およびベクターを使用することに関連する。ＮＩＨ指針
は、使用された微生物および遺伝物質に依存する宿主−
ベクター系（以下肝と称する）の生物学的封じ込めの基
準を確立する。

ＨＶＩは、“中程度の封じ込めの基準を必要とする宿主
−ベクター系“と定義される。ＨＶ２宿主−ベクター系
に対しては、高い基準の生物学的封じ込めが要求される
。

ＮＩＨは、）（ｖｌ系の宿主成分として使用するだめの
枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の２種の突然変異株
を承認したにれらのうちの一つ、ＲＬＪＢ３３１は、米
国特許第４，３０２，５４４号明細書に開示されており
、その開示内容は、その全体として引証することにより
本明細書中に取入れられている。これらのうちの第二の
ものは、ＢＧＳＣＮｏ、　ｌ５５３であり、このものは
、エリス（Ｄ、　Ｍ、　Ｅ　１ｌｉｓ）およびディー７
　（Ｄ、　Ｈ，Ｄｅａｎ）により記載されている（組換
えＤＮＡ技術速報第４巻第１号、１９８１年３月（Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　１
３ｕｌｌｅｔｉｎ。

ｖｏｌ、　４．　Ａ　Ｉ、　ｍａｒｃｈ　１９８１）参
照）。ＮＩＨは、ＨＶ２系に対する一つめ１３．５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ宿主成分を承認した。ＡＳＢ２９８として知
られるこの菌株は、パーク（Ｗ、　Ｆ、　Ｂｕｒｋｅ）
およびＩＪ　−（Ｈ，Ｔ、°Ｌｅ）によって記載されて
いる（組換えＤＮＡ技術速報第３巻第１号、１９８０年
１２月（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡＴｅｃｈｎｉ
ｃａｌ　１３ｕｌｌｅｔｉｎ、　ｖｏｌ、　３．　Ａ　
１．　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ、　１９８０）参照）。

本発明は、宿主−ベクター系における宿主として有用な
り、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＥｌｏｏ（ＡＴＣＣ３９，
０９４）と名付けられた新規な無胞子性変異株を記載す
る。この変異株は、自然環境においては限られた生存能
力しかもたないが、工業的規模で増殖されうる。

この変異株は、発育に抗生物質を必要としないので、ス
トレプトマイ７ンの存在下でのみ増殖する承認された）
（Ｖ２宿主であるＡＳＢ２９８よりも酵素産生のための
よシ実用的な宿主である。

たときに約１０−７以下の胞子形成菌への復帰変異頻度
（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）を
有し、そして次の遺伝標識：すなわち虫Ａ１、並別、ｔ
ｒｐ　Ｃ２、−馳より１、および！ＯＡ△６７７を有す
ることを特徴とする、宿主−ベクター系における宿主成
分として使用する（１）　Ｋ適した無胞子性Ｉ）　１３
．５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＥｌｏｏ（ＡＴＣＣ３９，０９
４）の生物学的に純粋な培養菌が提供される。

更に、次の遺伝標識：ｔｒｐｃ２、ｐｙｒ　ＤＩ　オ！
　Ｄ３ｐＯＯＡ△６７７を含むことを特徴とする、宿主
−ベクター系の無胞子性宿主成分の調製のだめの中間体
として有用な無胞子性Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＥＩ
（ＡＴＣＣ３９，０９１）の生物学的に純粋な培養菌が
提供される。

発明の詳細な記述 本発明によシ開示され特許請求された１３．３ｕｂｔｉ
ｌｉｓ菌株は、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのすでに報告さ
れた菌株からの遺伝物質を取込むことによって調製され
た。

親株（／Ａ６は、デドンダ−（１）ｅｄｏｎｄｅｒ）ら
によッテ“応用および環境微生物学″第３３巻第９８９
−９９３・頁（１９７７年）（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ
　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ、　３３．９８９−９９３（１９７７））に記載さ
れた。それはアメリカン、タイプ、Φカルチュア拳コレ
ク／ヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅエリス（Ｅｌｌ
ｉｓ）およびディーン（１）ｅａｎ）によって報告され
た（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃ
ａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、　４　１−３（１９８１）参
照）。それはＡＴＣＣからＡＴＣＣ３９，０９０として
人手できる。菌株ｌＡ２４３、ＡＴＣＣ３９，０８７は
、ファーマー（１”ａｒｒｎｅｒ）およびｏ　スフ　ン
（Ｒｏｔｈｍａｎ）によって記載され（Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ、　８９．　２６２−２６３（１９６
５）参照）、最初は１６８　ｔｈｙス１ｎｄ−と呼ばれ
た。

ＤＥｌｏｏの調製における第一過程は、形質転換は、最
初は栄養要求マーカーについて不安定であったが、すぐ
にＤＥＩと呼ばれる安定な変異株に復帰した。この変異
株は、無胞子性であり、他の無胞子性変異株を形成する
ための中間体としてイｆ用である。

３、５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株ｌＡ２４３からのＤＮＡの一
部は、次に形質導入法を使用してファージＰＢＳ　１に
よってＤＥＩに移入された。遺伝標識：　ｔｈ３’　Ａ
Ｉ　Ｘｔｈｙ　Ｂｌ　、二ＤＩ。

±ＲＣ２およびｌ　ＯＡへ６７７を有する安定な変異株
、１）Ｆ：　１００がイｎられた。

本発明による無胞子性菌株は、約１０　　以下の胞子形
成菌への復帰変異頻度を示す。それは費用のかかる増殖
に必要な要件を必要とすることなり［ｖ、的条件下で増
煩しうる。それは自然捷たは散逸条件下では生存率が低
く、そして自然的遺伝伝達によシ他の微生物にグラスミ
ドを移入する傾向が極めて低い。この微生物は、旧来の
形質転換技術にかけた場合には、低い反応能しか示さな
いが、プロトプラスト形質転換操作を用いると、プ、ラ
スミドによる卓越した形質転換が達成される。それは、
１３．５ｕｂｔｉｌｉｓの宿主成分として使用するだめ
の有用な菌株にする各種プラスミドベクターの宿主とし
てよく機能する。

ナー（Ｈｅｎｎｅｒ）およびホソホ（）（ｏｃｈ）　Ｋ
よって出版されている（Ｍｉｃｒｏ′ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ５．４４．５７−８２（１９輌参照
）。本発明の開示において挙けられた遺伝標識を以下に
簡単に記述する： （１）±Ａ１、豊Ｂ１：　これらの突然変異は、１３、
５ｕｂｔｉｌｉｓ　　における２種の異なったチミンレ
ート・ンンセターゼに対する遺伝子において起る。両者
は、チミンおよびチミジンにχ・１する要求性を付与す
るために存在しなければならない。この敦求性は、宿主
の自然に生存する能力を低下させる。ＴｈｙＡ１突然変
異は、また宿主を同定するための不用なマーカーにトリ
メトプリム抵抗性を付与する。

付けをするインド−ルー：（−グリセロール−ホスフェ
ート遺伝子に起る。自然では遊離アミノ酸として普通に
は見出されないトリプトファンが除去されると、この突
然変異遺伝子をもつ菌株は、増殖を停止する。

（３）　　ｐｙｒ　ＤＩ　：この突然変異遺伝子は、微
生物によるピリミジンの生産にとって必須の酵素の生成
を妨げる。ピリミジンは、ＤＮＡおよびＲＮＡの必須の
前駆物質であシ、自然には普通に見出されないので、ピ
リミ／ンに対する飢餓は、宿主の発育および宿主に導入
されたプラスミ化学薬品および乾燥にさらされたときに
、通常自然に生存する形態である胞子を形成する能力を
破壊する。

（５）　　ｉｌｖ　Ａｌ　：このマーカーを含む変異体
は、発育のためにインロインンおよびバリンの両方を翠
求する。

以下の例は、本発明のある種の具体化例を例示するもの
である。特記しない限シ、すべての割合および百分率は
、重量基準で示されている。

ＡＴＣＣ寄託番号を有するすべての菌株は、アメリカン
拳タイプ・カルチャー１コレクンヨン（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から人
手できる。ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）　４称を肩するすべ
ての試薬は、ディフコ研究Ｐ９Ｔ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｊｃｈｉｇｅｎ）から人手できる
。

且 １３−、５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｌ５５３　（思ＯＡ△６７
７）から得られたＤＮＡを、胞子を形成する親株のＬｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＩＡ６（臘Ａ１、口Σ−Ｂｌ、匠Ｃ
２、ユＡ１、よりＩ）に取込むことによる無胞子性菌株
への形質転換は、下記（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）の最小培地
を含む寒天平板上で一夜培養した。スビチツェンの最小
培地は、（ａ）硫酸アンモ′ニウム０．２％；（ｂ）リ
ン酸カリウム（二塩基性）１．４％；（Ｃ）リン酸カリ
ウム（−塩基性）０．６％；（ｄ）クエンある。スビチ
ノエンの最・」＼培地９９ｍ６　Ｋ、１０％Ｍｇ５Ｏ，
、Ｏ，１ｍ１％　５０％グルニア　−、Ｘ　１．２ｒｒ
＋ｌ、　１０％１）ｉｆｃｏイースト抽出物１．０ｍ６
および２％ディフコ・カゼイン加水分解物１．ｏｍｌを
添加することによって調製されたｋｊ液３０ｍ１に上記
の寒天平板から細胞を接種した、フラスコを３７℃にお
いて培養し、２０Ｏｒｐｍの回転数で振った。赤色フィ
ルターをかけたクレノ）　（Ｋｌｅｔｔ）の分光測光器
を用いて光学密度の増加をモニターした。培養菌が対数
増殖と定常増殖との過渡期に達したとき（光学密度の変
化１５分間に５％１ソート）に、それらを０．０５Ｍの
ＣａＣ１２１，０ｍｌ！および０．ＩＭのＭｇＣｌ２２
０ｍ１を添加し、１００ｍ１の増殖用培地となるまで希
釈した。この混合物をドナーＤＮＡを添加する前に更に
９０分間培養した。

ドナーＤＮＡは、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｔｓｓ３−
（Ａ’ｒｃｃ　３９，０９０）から下記の手順によって
得られた。

ディフコ研究所（Ｄｉｆｃｏ　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ。

養した。この混合物を新鮮なりＨＩ培地５００ｍ１を用
いて希釈し、そして６６０ナノメートルにおいて測定さ
れた混合物の光学密度が０．６になる寸で３７℃におい
て培養した。細胞を遠心分離によって集め、そしてｐＨ
８，０においてトリス（ヒドロキシメチノリアミノメタ
ン０．０３Ｍ、エチレンジアミンテトラ酢酸０．００５
ＭおよびＮａＣ１０，０５Ｍを含有する溶液１０ｍ１中
に再懸濁させ、そしてリゾチーム４ｍｇと混合した。細
胞を３７℃において２０分間続やかに（１００ｒｐｍ）
振った。

次にプロナーゼ８０μｌ（１０ｍｇ／ｒｎｌ）を添加し
、培養を史に６０分間続けた。次いで２０％のドデ／ル
硫酸ナトリウム溶１　ｔ、ｏｍ７１！を添加することに
よって細胞を溶解した。細胞溶解物をフェノール、フェ
ノール−クロロホルムおよびクロロポルムラ用いて、そ
の都度水性相を保持しながら抽出した。

９５％の冷エタノール３容を添加することによってＤＮ
Ａを沈殿せしめた。沈殿したＤＮＡを集め、ＮａＣ１０
１５Ｍおよび酢酸ナトリウム０．０１５Ｍを含有する浴
液中にｐＨ７において再懸濁せしめ、そして膵リボヌク
レアーゼ（シグマ・ケミカル・カンパニー（ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕ
ｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から人手されつるウシの膵
臓からのタイプＬＡ）ｌｒｎｇとリボヌクレーアーゼＴ
Ｉにど１．ヨ＝玉二二二三、乙鼾二二２（−３うヒニ、
三５工会オリゼー（７キ、！１１２５≧２二１工」１Ｊ
−Ｊコ２〕？−ユニｚ３５　からのグレードルエｖ１　
シグマ・ケミカル・カンパニー社製）５単位との混合物
と一緒に３７℃において１時間培養した。この混合物を
次にフェノール、フェノール−クロロホルム、オヨヒク
ロロホルムで＋’Ｃ抽出しそしてエタノールを用いて再
沈殿す’＝Ｗ’、、　−Ｊ：記のＤＮＡを塩化ナト、　
ｌ）ラム０．０１５Ｍおよび酢酸ナトリウムＯ，００１
５Ｍをな有する溶液中にｐＨ７において＋ｌｒ溶解し、
それを形質転換に使用する前に２４１１１１′間の間に
上記と同じ溶成の多量を用い３肖ｔえて透析した。

上記のようにして調製しまたＢ、５ｕｂｔｊｌｉｓ　Ｉ
Ａ６の受容能力のある細胞を１０μｇ／ｍｌの濃度の最
終混合物希釈しそして３７℃において更に３時間増殖せ
しめた。細胞を遠心分離によシ集め、蒸留水で１度洗い
そしてスピチソエンの最小培地と共にチミン（５０μｇ
／ｍｌ）、　トリプトファン（２０ｐ　ｇｉｍｌ）およ
びウラ７ル（２０μｇ／ｍｌ）を含有する寒天平板上に
拡げた。

増殖したコロニーを無胞子性変異株についてスクリーニ
ングにかけた。

無胞子性変異株について試験するために３つのスクリー
ニングテストを行なった。第一に、細胞をＤＳＭ平板（
Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ。

；２０．２５３−２６５（１９７４）参照）上で培養し
たときに色素に染まらないままでなければならない。対
照的Ｉｖ１ｇＳＯ４拳７Ｈ２００，０２５％、ＫＣｅＯ
，１％、ＦｅＳＯ４１Ｘ　１０　１ＶＩ。

ＭＭｎＣ６２１Ｘ１０−５およびＣａＣｅ　２１　Ｘ　
１０−”　Ｍ　ｋ　？を有する舊’）ｒ％　−、”−’
−一す→ディフコ胞子形成培地である。第二に、もし培
養菌中に胞子が存在するならば、それらは位相差顕微鏡
下で個々の細胞中の相の明部として出現する。反対に、
無脂胞子性菌株は、相の明るい段階を現わさない。

第三のテストにおいては、培養菌中に存在する胞子は、
６０℃において２０分間の熱処理にかけて易い。無胞子
性として分類されるべき菌株としては、それはスクリー
ニングテストの３つのすべてにパスしなければならない
。これらのスクリーニングテストにパスした１つの個々
のコロニーは、栄養要求マーカーについては最初は安定
でなかったが、次のマーカー：すなわち二Ｃ２、ｐｙｒ
ｐｌ、および５Ｂ４０Ａ△６７７を有する安定な変異体
に復帰した。それはＤＥＩと名付けられた。

菌株ＤＥＩニＣ２、五二Ｄ１、肚匹ＯＡ△６７７）を、
ＡＴＣＣ３９，０８７として人手できるＬ−一二−Ａ２
４３（ｊＪＪＬＣ２、ｔｈｖ　Ａｌ　、二Ｂｌ）のドナ
ー菌株からのＤＮＡを使用してファージＰＢＳ　１で形
質導入することによって本発明による無胞子性菌株ＤＥ
１００へと変換した。

形質導入は、クロラムフェニコールを添加りなかつたこ
とを除いては、「遺伝学ハンドフック」第１巻第６９〜
７８頁（）（ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｑｅｎｅｔｉｃｓ
、　Ｖｏｌ、　１．　ｐｐ６９−７８゜Ｐｌｅｎｕｍ　
Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７４）に記載さ
れたヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓ
ｏｎ）の方法によって行なわれた。ノイハルトら（Ｎｅ
ｕｈａｒｄｔ、　ｅｔ　ａｌ）によって記載された方法
（ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、、　
Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７５゜１１９４−１１９８（１９７８
）参照）によってトリメトゲリム耐性について細胞を選
別した。この方法によって得られた生物学的に純粋な菌
株は、ＤＥｌｏｏと呼ばれた。それは、下記の遺伝標識
を有する：±ＡＩ、リヱＢ１、と工Ｃ２、医Ｄ１、およ
び三〇Ａへ６７７゜菌株ＤＥ１００は、ＡＴＣＣ３９，
０９４としてＡＴＣＣから人手されうる。

Ｉ）Ｅｌｏｏは、発育のためにはアンモニウム、カリウ
ム、ホスフェートおよびナトリウムのイオンを含有する
鉱物塩を要求する。それはグルコースを含む各１ｉｆｉ
の炭素源を利用するであろう。チミンまたはチミジン、
ピリミジンおよびトップｌファンが発育のために要求さ
れる。これらの要求物の源泉としてコーンスチープリ力
−が使用されうるが、この液にチミンを添加することは
、微生物の発育を増進させる。

菌株ＤＥ１００の栄養要求マーカーの復帰変異（ｒｅｖ
ｅｒｓｉｏｎ）に対する安定性は、下記の方法によって
６川定された。グルコース０．１％、トリブトファ／お
よびウラ７ル１０μｇ／ｍｌおよびチミン５０μｇ／ｍ
ｅを補足しだスビチソエン最小培地中で３７℃において
菌株を一夜培養した。、この培養菌を新鮮な培地に移し
、３７℃において振動下に６時間発育せしめた。次に細
胞を遠心分離により集め、水中で２回洗滌し、水中に１
１）懸濁しそして要求物のうちの１種のみを欠いた最小
培地を金石する寒天平板上でタイトレー／コンを行った
。今生（Ｉ細胞は、すべての安求物を含有する最小゛Ｖ
板トのコロニー形成ｔｌ″Ｉ−位＜ＣＩ”Ｕ）として測
定された。

ｒべての測定は、３回繰返して行なわれた。第１　ｔＧ
のデータは、菌株中の栄養要求マーカーの安定性を示す
。

第１表 ＤＥｌｏｏにおける突然変異の復帰変異頻度ｔｙ４ｃ２
　　　　　３．３７±０．５６Ｘ１０”　　　　　Ｏ（
１０−８ｙ工Ａ１．封文Ｂ１　３．３７ｆＯ，５６Ｘ１
０８０　　　　　　（１０−８Ｐｙｒ　ＤＩ　　　　　
　　３．３７±〇、５６　Ｘ　１０８１．６７±０．６
０ＸＩＯ’　　４．９Ｘ１０−８子形成菌への復帰変異
をしなかった。チミン５０ｐｇ／ｍｌを添加したＤＳＭ
（Ｄｉｒｃｏ）培地中で２０Ｏｒｐｍの回転数で振動さ
せながら３７℃において上記の細胞を培養した。２４時
間の間隔を置いてアリコートを取出しそして６０℃で２
０分間加熱した。次に、畑地された試料をタイトレーン
ヨンにかけて生存・菌数を測定した。加熱していない試
料を測定したときに得られたＣＦＵ／ｍｌ数との比較を
行なった。Ｊ第Ｈ表に示した結果は、これらの最適の胞
ｆ・形成条件下に培養したＤＥｌｏｏから耐熱性細胞は
、得られなかったことを丞している。

第■表 ＤＥｌｏｏの耐熱性細胞の形成（胞子形成）［１数　　
　　　ＣＦＵ／ｍｌ　　　　　胞子１　　　　　　５．
４Ｘ１０８　　　　　０２　　　　　　９．０　ｘ　１
０７　　　　　０３　　　　　　２．７Ｘ１０６　　　
　　０液体中におけるＤＥｌｏｏの生存数を下記のよう
にｆ１１定した。グルコース０．１％および滅菌蒸留水
を添加したスビチノエンの最小培地およびＢＨＩの試料
に接種するために対数増殖中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ）の培
養物を使用した。栓付きの１５ｍ１の試験管に１　ｍ１
３の試料入れ、次いで３０℃のエアバス中で振った。

２４時間の間隔を置いて、各グループから３個の試験管
を取出しそして生存数を測定した。

ＣＦＵ／ｍｅで表わした結果を第１ＩＩ表に示す。

第■表 液体培地におけるＤＥ　Ｚｏｏの生存率０　３．３±〇
、１２　Ｘ　１０８１．８±ｏ、１ｓＸ１ｏ８３．４　
±０．４　ｘｔ０８１　４．３±０．５０Ｘ１０８８．
０３±０．９　Ｘｌ０８１．４　＝ｌ：０．２　Ｘｌ０
８３　３．５±〇、４　Ｘ１０８１．１３±ｏ、ｏ９Ｘ
１ｏ８１．５７±０．０９ｘｌＯ６５１，０４±０．０
８刈０８２．６３±０．０３　Ｘ　１０６１．２７±０
．２２　Ｘ　１０’７　４１９±０．６２Ｘ１０７５．
８７±０．４７Ｘ１０６１．５±０．６１　Ｘ　１０４
実験室用模擬ベンチ−トップスピル（ｂｅｎｃｈ−ｔｏ
ｐｓｐｉｌｌ）におけるＤＥｌｏｏの生存率を判定する
ために、０．２５インチの無菌コンセントレーンヨ／デ
ィスクに、チミンを添加したＢＨＩ中で対数増殖中期ま
でし、そして試料を生存数について画定した。

第■表に示されたＣＦＩＪ／ｒｎｌで表わした結果は、
３る。。

第■表 ゝべ／チートップ”上でのＤＥｌｏｏの生存率０　　　
　　９．４±０．２　Ｘｌ０６１．２Ｘ１００１　　　
　　１．１±０．０４　Ｘ　１０３１．２　Ｘ　１０−
２２　　　　　３．４±０．７　ｘＨ）’　　　　　　
３．６ｘｌＯ−３３２７±０．６　ＸＩＯ’　　　　　
　２．９Ｘ１０−６４　　　　　　　　　　　　０　　
　　　　　　　　　　　　０のことは、組換えＤＮＡ用
の生物学的封じ込めに適合した宿主としてＤＥｌｏｏが
適していることの証拠の一つを提供するものである。

本明細ｎ中に記載した操作は、すべてＮＩＨガイドライ
ンに規定された物理的ならびに生物学的封じ込めの要請
事項に鉦ってなされた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、通気性条件下で増殖せしめたときに約１０ー７以下
   の胞子形成菌への復帰変異頻度を有しそして次の遺伝標
   識：止Ａ１、！ｋＢ１、垣Ｃ２、ｆｆ１Ｄ１および！Ｏ
   Ａ△６７７を有することを特徴とする、宿主−ベクター
   系の宿主成分として使用するのに好適な無胞子性枯草菌
   １μ虫ｊ１０〕ＤＥ１００　（ＡＴＣＣ３９，０９４）
   の生物学的純粋培養菌。 ２、　次の遺伝標識：」Ｃ２、ｆｆＤｌおよび上ＯＡΔ
   ６７７を有することを特徴とする、宿主−ベクター系の
   無胞子性宿主成分の調製のための中間体として有用な無
   胞子性枯草菌（４１，−一山）ＤＥＩ　（ＡＴＣＣ３９
   ，０９１）の生物学的純粋培養菌。