JPS5998692A - アグロバクテリウムのｔ−ｄｎａを利用して緑藻類中への外部遺伝子導入方法 - Google Patents
アグロバクテリウムのｔ−ｄｎａを利用して緑藻類中への外部遺伝子導入方法Info
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は藻類の中での外因性遺伝子の０．製と発現の方
法に関するものである。さらに特定的には。
法に関するものである。さらに特定的には。
本発明は緑藻類の遺伝子的操作における媒介体としての
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｒｕｍ ）
ノ使用に関するものであるっ 藻類は光合成微生物のきわめて大きい群である。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｒｕｍ ）
ノ使用に関するものであるっ 藻類は光合成微生物のきわめて大きい群である。
この群は単細胞微生物と多細胆微生物を含む。緑色、青
緑色、赤色、および褐色の藻類が存在するっこれらの微
生物は生成必要条件に幅があり海水または淡水のいずれ
の環境においても生育できる。
緑色、赤色、および褐色の藻類が存在するっこれらの微
生物は生成必要条件に幅があり海水または淡水のいずれ
の環境においても生育できる。
すべての藻類は二酸化炭素と光をそれらの炭素源および
エネルギー源として使用し得る。それらは太陽エネルギ
ーを有機物ａへ変換する最も効率的な微生物の中ｒある
。いくつかの種は野外において光合成効率が１から２係
であると測定されており、それは１５〜ろ０１乾燥重量
／ｍ′／日の生物体生成を表わす。Ｇ。シエレフおよび
Ｃ，Ｊ、セーブ−編集（１９８０年）のＡｌｇａｅ Ｂ
ｉｏｍａｓｓの５４６−６５９頁（ゴールドマンＪ、Ｇ
、） （エルゼビール／ノースホランドバイオケミカル
プレス）。最適の実験室的条件下では、２０受の光合成
効率が報告されたことがある。シエレフ、Ｇ、：オズワ
ルド。
エネルギー源として使用し得る。それらは太陽エネルギ
ーを有機物ａへ変換する最も効率的な微生物の中ｒある
。いくつかの種は野外において光合成効率が１から２係
であると測定されており、それは１５〜ろ０１乾燥重量
／ｍ′／日の生物体生成を表わす。Ｇ。シエレフおよび
Ｃ，Ｊ、セーブ−編集（１９８０年）のＡｌｇａｅ Ｂ
ｉｏｍａｓｓの５４６−６５９頁（ゴールドマンＪ、Ｇ
、） （エルゼビール／ノースホランドバイオケミカル
プレス）。最適の実験室的条件下では、２０受の光合成
効率が報告されたことがある。シエレフ、Ｇ、：オズワ
ルド。
Ｗ、Ｊ 、およびマクガイ、 Ｐ、）ｉ、によるＪ、Ｓ
ａｉｎｔＥｎｇｉｎ、Ｄｉｖ、Ａｍ、Ｓｏｃ、 Ｃ１１
ｖ、Ｅｎｇｒｓ、 第９ｔ５巻。
ａｉｎｔＥｎｇｉｎ、Ｄｉｖ、Ａｍ、Ｓｏｃ、 Ｃ１１
ｖ、Ｅｎｇｒｓ、 第９ｔ５巻。
ＳＡＩ （１９７０’ｌ、９１−１１０負。
藻類は各種の生合成的機構をもち、多くの種が将来の産
業的応用をもつ化合物を生成するっこれらの化学品のい
くつかは藻類によってきわめて高い水準において生成さ
れる。一つの棟はその細胞質量の５０％をこえる量をグ
リセリンとして合成し、そしであるもの１末高水準の炭
化水素、脂質。
業的応用をもつ化合物を生成するっこれらの化学品のい
くつかは藻類によってきわめて高い水準において生成さ
れる。一つの棟はその細胞質量の５０％をこえる量をグ
リセリンとして合成し、そしであるもの１末高水準の炭
化水素、脂質。
および蛋白質を生成するっさらに５数多くの独得の化合
物が藻類によって作られ多方面の分野において潜在的応
用をもってい６つア〜ロンソン、Ｓ；ベルナー７Ｔ、；
およびデュビンスキー・２．による。ＡｌｇａｅＢ
ｉｏｍａｓｓ 、 上記、５７５−６０１貢っ藻類を
有用化合物用の未来源とさせめものは藻類の生合成的能
力である。工業的目的に対してｔθ類を魅力的なものと
させろ特性は二酸化炭素のような単純化合物と光を成長
用に用いる能力、および各ＸΦかつ効率的な生合成能力
を含むっ遺伝子操作法の最終的目的は特別な有用特性の
暗号を解１Ｍ７ｊする外部遺伝子を新しい宿主紬肚中に
移し、そこでその外部遺伝子が次に発現されることであ
ろう外部遺伝子の移入はいくつかの段階を含む。第一に
は、所望特性を解読する外部遺伝子は追伝子切りｈ±ｒ
ぎ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ）法によって媒介体中に組入れ
られゐっ媒介体、すなわち、クローニング伝播体、は外
部遺伝子を新しい宿主細胞へ物理的に移入するＤＮＡ
（チオキシリボ核酸）分子であるっ媒介体は一般には１
円形ＤＮＡ分子であるプラスミドであるかあるいハ線状
ＤＭＡ分子であるビールスかのいずれかでありっ媒介体
−外部遺伝子のハイブリッドを次に形η転換法を使用し
て宿主セルへ移入するっその結果は新しい宿主細胞中に
今ベコ存在する所望外部辿伝子をもった遺伝子的に操作
された細胞である。
物が藻類によって作られ多方面の分野において潜在的応
用をもってい６つア〜ロンソン、Ｓ；ベルナー７Ｔ、；
およびデュビンスキー・２．による。ＡｌｇａｅＢ
ｉｏｍａｓｓ 、 上記、５７５−６０１貢っ藻類を
有用化合物用の未来源とさせめものは藻類の生合成的能
力である。工業的目的に対してｔθ類を魅力的なものと
させろ特性は二酸化炭素のような単純化合物と光を成長
用に用いる能力、および各ＸΦかつ効率的な生合成能力
を含むっ遺伝子操作法の最終的目的は特別な有用特性の
暗号を解１Ｍ７ｊする外部遺伝子を新しい宿主紬肚中に
移し、そこでその外部遺伝子が次に発現されることであ
ろう外部遺伝子の移入はいくつかの段階を含む。第一に
は、所望特性を解読する外部遺伝子は追伝子切りｈ±ｒ
ぎ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ）法によって媒介体中に組入れ
られゐっ媒介体、すなわち、クローニング伝播体、は外
部遺伝子を新しい宿主細胞へ物理的に移入するＤＮＡ
（チオキシリボ核酸）分子であるっ媒介体は一般には１
円形ＤＮＡ分子であるプラスミドであるかあるいハ線状
ＤＭＡ分子であるビールスかのいずれかでありっ媒介体
−外部遺伝子のハイブリッドを次に形η転換法を使用し
て宿主セルへ移入するっその結果は新しい宿主細胞中に
今ベコ存在する所望外部辿伝子をもった遺伝子的に操作
された細胞である。
成功した遺伝子操ｌ／Ｉ−細胞はその中で外ｇｌｓ遺伝
子従って所望の特性、が［発現］されり細胞である。
子従って所望の特性、が［発現］されり細胞である。
遺伝子の発現ｐｉｍＲｔＪＡ（伝令リボ核酸）中へのＤ
ＮＡの転写と蛋白中へのｍＦＩＮＡの翻訳とを必要とす
る一つの多段工程である。これらの目的のために、ＤＮ
Ａは、情報の発現を伝達する調節部位と、蛋白に暗号づ
けをする構造的部位とに分割されるつ転写を始めるため
Ｋは、宿主細胞のＨＮＡ−ポリメラーゼはＤＮＡの調節
部位（以後は「プロモーター」どよぷ）を「認識する」
かあるいはそれへ結合せねばならない。プロモーター配
列は使用す／）Ｄ Ｎ Ａ物質、例えば涼核性ＪＩＪＮ
Ａ対兵核性Ｄ Ｎ Ａ 、π応じてしばしば異なりっＲ
ＮＡポリメラーゼ酵素は構造遺伝子に沿って移動してＤ
ＮＡ暗号による伝達情′：４．をｍ ＲＮ Ａの中へ転
写する１ｍ）（ＮＡＩｊ’ｂう−っの調節配列（ｃｏｎ
ｔｒｏｌ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）。
ＮＡの転写と蛋白中へのｍＦＩＮＡの翻訳とを必要とす
る一つの多段工程である。これらの目的のために、ＤＮ
Ａは、情報の発現を伝達する調節部位と、蛋白に暗号づ
けをする構造的部位とに分割されるつ転写を始めるため
Ｋは、宿主細胞のＨＮＡ−ポリメラーゼはＤＮＡの調節
部位（以後は「プロモーター」どよぷ）を「認識する」
かあるいはそれへ結合せねばならない。プロモーター配
列は使用す／）Ｄ Ｎ Ａ物質、例えば涼核性ＪＩＪＮ
Ａ対兵核性Ｄ Ｎ Ａ 、π応じてしばしば異なりっＲ
ＮＡポリメラーゼ酵素は構造遺伝子に沿って移動してＤ
ＮＡ暗号による伝達情′：４．をｍ ＲＮ Ａの中へ転
写する１ｍ）（ＮＡＩｊ’ｂう−っの調節配列（ｃｏｎ
ｔｒｏｌ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）。
翻訳出発８１５位、を含まねばならず、これはｍＲＮ
Ａリポソームへ結合させ、そこで蛋白へ翻訳されゐっ遺
伝子操作系をつくり出すいくつかの試みは、外部ＤＮＡ
は新しい宿主細胞へうま（移入され７）けれども細胞自
身の転写系および翻訳系が外部ＤＮ ｐ。
Ａリポソームへ結合させ、そこで蛋白へ翻訳されゐっ遺
伝子操作系をつくり出すいくつかの試みは、外部ＤＮＡ
は新しい宿主細胞へうま（移入され７）けれども細胞自
身の転写系および翻訳系が外部ＤＮ ｐ。
の調節配列を認識し得すそして外ｆ！Ａ遺伝子は発現さ
れなかったために失敗してきた。ホンプウッド。
れなかったために失敗してきた。ホンプウッド。
ダビットＡ１．［工業用微生物の遺伝子的プログラミン
グｊ 、５ｃｉｅｎｔｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ 、 ２
３？、２４５−ｊ％、Ａ１．９１：１−１０２負、（１
９月１年９月）。
グｊ 、５ｃｉｅｎｔｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ 、 ２
３？、２４５−ｊ％、Ａ１．９１：１−１０２負、（１
９月１年９月）。
遺伝子操作系各村の段階が決定された独は現在はほんの
二、三しかない。例えば、細菌を遺伝的に操作す０方法
シエチヤクラバルテイの米国的許鋪４．２５９，４４４
号、デバボフらの米国特許第４．２７８，７６５号、ア
ルフォルティらの米国特許第４．２９４．９２７号、コ
ーエンらの米国特許第４．２５７．２２４号、プクシュ
ンらの米国特許第４、ろろ２．８９２号、およびギルバ
ートらの米国特許第４，３５８．．１５９７号に記載さ
れている。ミュリロ・アラウジョらの米国特許第４１８
，９８７号、およびイルゲン・クリスチン；ファラバウ
フＰ、Ｊ、”、ヒンネン、Ａ；つアルシュ。ジーンＭ；
およびフインク、Ｇ、）ｔ、のＧｅｎｒ＋ｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｐ、ｐｒｉｎｇ 、 第１巻（１９７９年）ｉ１
７−１６２匹（ジエインＫ。
二、三しかない。例えば、細菌を遺伝的に操作す０方法
シエチヤクラバルテイの米国的許鋪４．２５９，４４４
号、デバボフらの米国特許第４．２７８，７６５号、ア
ルフォルティらの米国特許第４．２９４．９２７号、コ
ーエンらの米国特許第４．２５７．２２４号、プクシュ
ンらの米国特許第４、ろろ２．８９２号、およびギルバ
ートらの米国特許第４，３５８．．１５９７号に記載さ
れている。ミュリロ・アラウジョらの米国特許第４１８
，９８７号、およびイルゲン・クリスチン；ファラバウ
フＰ、Ｊ、”、ヒンネン、Ａ；つアルシュ。ジーンＭ；
およびフインク、Ｇ、）ｔ、のＧｅｎｒ＋ｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｐ、ｐｒｉｎｇ 、 第１巻（１９７９年）ｉ１
７−１６２匹（ジエインＫ。
セットロウおよび了レキサンダー・ホＶンダー編集）に
ューヨークのプレナムプレス）、ばカひと酵母について
の遺伝子操作系を述べているっ動物細胞内において遺伝
子的操作すり方法もまた記載されできた。概観すめため
には、ロイド・Ｈ・グラフ、Ｊｒ、の［遺伝子形質転換
４ 、 ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｉｅｎｃｅ 、 第７０
％、４９６ ５０５ＦＥ（１９８２年９−１０月）を見
よ。
ューヨークのプレナムプレス）、ばカひと酵母について
の遺伝子操作系を述べているっ動物細胞内において遺伝
子的操作すり方法もまた記載されできた。概観すめため
には、ロイド・Ｈ・グラフ、Ｊｒ、の［遺伝子形質転換
４ 、 ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｉｅｎｃｅ 、 第７０
％、４９６ ５０５ＦＥ（１９８２年９−１０月）を見
よ。
現在では、謔拳眞おけ／：）遺伝子操作のための系は存
在していないっ利用でき心媒介体、形躍転換機楊、あり
いは選択系、が全く存在していないっ従って、外部ＤＮ
Ａを先づｍＭへ移入し１次いで九′、！類中で発現させ
る遺伝子操作系を求めり要望が存在している。
在していないっ利用でき心媒介体、形躍転換機楊、あり
いは選択系、が全く存在していないっ従って、外部ＤＮ
Ａを先づｍＭへ移入し１次いで九′、！類中で発現させ
る遺伝子操作系を求めり要望が存在している。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｎｍ ’
）は多数の双子葉植物に感染する植物病原体の一群であ
る。
）は多数の双子葉植物に感染する植物病原体の一群であ
る。
これらの双子葉植物は、ひまわり、たばこ、および人参
を含むっこのバクテリアは芝、１異、または白゛合のよ
っな双子葉植物を感染できたいつ感染過程中において、
細菌プラスミドＤＮＡの小部分。
を含むっこのバクテリアは芝、１異、または白゛合のよ
っな双子葉植物を感染できたいつ感染過程中において、
細菌プラスミドＤＮＡの小部分。
Ｔ、ＤＮＡ、は（風物細胞へ移入され、植物ゲノムの中
へ沖入れられる。チルトン、マリ−デル、らの、［篩次
植物細胞中へのプラスミドＤＮＡの安定的組入れ：クラ
ウンゴール腫瘍形成の分子的基礎Ｊ 、 Ｃｅ１ｌ ＋
第１１巻、２６５−２７１１：ｒ。
へ沖入れられる。チルトン、マリ−デル、らの、［篩次
植物細胞中へのプラスミドＤＮＡの安定的組入れ：クラ
ウンゴール腫瘍形成の分子的基礎Ｊ 、 Ｃｅ１ｌ ＋
第１１巻、２６５−２７１１：ｒ。
（１９７フイ１−６月）。Ｔ −Ｄ Ｎ Ａ ｌま複製
され発現さ、プ れて植物ｆｆ’ｆ’！胆に完全に変異された代謝をもた
せり。
され発現さ、プ れて植物ｆｆ’ｆ’！胆に完全に変異された代謝をもた
せり。
その上、感染した植物細胞は各投の異常な了ミノ酸また
ＩゴオバインＩ ｏｐｉｎｅ ）を合成すル。
ＩゴオバインＩ ｏｐｉｎｅ ）を合成すル。
１） Ｎ １日ま４！ＩｆαＳに）＋７胞から植物細胞
へ移入されるので、遺伝的に植物に（１ｊ胞を操作する
媒介体としてクラウンゴール（根頭藺康病）細菌（アグ
ロバクテリウムＱツメファシエｙ ス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｐｒｉｕｍｔｕｍｐ、ｆａｃｊｐ、ｎｓ ））、 Ｔ
グロバクテリｒ） ム（７）−ツノ種、を使用すること
を多（のグループが考えたつ一つの計画においては、所
望の遺伝子は；に伝子接合技ｆ）：、によってＴｉプラ
スミドのＴ−ＤＮＡｇ３位へ結合される。クラウンゴー
ル菌株は植物細胞を感染させそれへＤＮＡを移入し得る
菌株であるか。
へ移入されるので、遺伝的に植物に（１ｊ胞を操作する
媒介体としてクラウンゴール（根頭藺康病）細菌（アグ
ロバクテリウムＱツメファシエｙ ス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｐｒｉｕｍｔｕｍｐ、ｆａｃｊｐ、ｎｓ ））、 Ｔ
グロバクテリｒ） ム（７）−ツノ種、を使用すること
を多（のグループが考えたつ一つの計画においては、所
望の遺伝子は；に伝子接合技ｆ）：、によってＴｉプラ
スミドのＴ−ＤＮＡｇ３位へ結合される。クラウンゴー
ル菌株は植物細胞を感染させそれへＤＮＡを移入し得る
菌株であるか。
しかし植物＃Ｉｊ 胞を腫瘍性（でさせないものである
っこの植物細胞をそこでクラウンゴール菌で以て感染さ
せ、そして外部遺伝子ＩＴ−ＤＮＡで以て植物細胞へ移
入するっその結果は、外部遺伝子を含む遺伝子的に操作
した植物細胞である。
っこの植物細胞をそこでクラウンゴール菌で以て感染さ
せ、そして外部遺伝子ＩＴ−ＤＮＡで以て植物細胞へ移
入するっその結果は、外部遺伝子を含む遺伝子的に操作
した植物細胞である。
いくつかのグループはクラウンゴール閑を用いて植物細
胞へ外部遺伝子を移入させることができたつしかし、こ
れらの外部ｊ）”２伝子の多くはその梗物細紀によって
発見されることかなかった。ガルフィンケル、デビット
Ｊ０．らの「クラウンゴールの遺伝子的解析： ５ｉｔ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ変異誘発によるＴ−ＤＮＡの微細
構造地図Ｊ 、 Ｃｅ１ｌ 、１Ｌ２７巻、１４ろ一１
５３頁、（１９８１年１１月）、を見よ。
胞へ外部遺伝子を移入させることができたつしかし、こ
れらの外部ｊ）”２伝子の多くはその梗物細紀によって
発見されることかなかった。ガルフィンケル、デビット
Ｊ０．らの「クラウンゴールの遺伝子的解析： ５ｉｔ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ変異誘発によるＴ−ＤＮＡの微細
構造地図Ｊ 、 Ｃｅ１ｌ 、１Ｌ２７巻、１４ろ一１
５３頁、（１９８１年１１月）、を見よ。
クラウンゴール菌およびその他のアグロバクテリウム４
Φはしかし、外部遺伝子を藻類細胞の中へ移入するのに
使用されたことシヱなかった。上記の通り、浅類の遺伝
子ｈｉ咋に利用し得ゐ系は現在は存在していブ、【い。
Φはしかし、外部遺伝子を藻類細胞の中へ移入するのに
使用されたことシヱなかった。上記の通り、浅類の遺伝
子ｈｉ咋に利用し得ゐ系は現在は存在していブ、【い。
それゆえ２不発明の一つの目的シま、遺伝子的に藻類を
操作しその除に外部遺伝子が演。類の甲へ移入され、＊
ｙ’ｉ 刀１’２’さ」１１．そして発現される方法を
つくり出すことであゐっ不発明のさらに一つの目的は外
部遺伝子か中で発現される遺伝子的に操作した藻類＆ｌ
’ｌｉ ｌｊｆ！ｌをつくり出１−ことであゐっ本発明
の目的（まアグロバクテリウムのプラスミドＤＮＡを媒
介体として第１」用して緑藻類中に外部、ｙｊ伝子を心
入する方法を通じて達成されたのであるっ特定的にいえ
ば、、アＣＰ、：性または原核性のＤＮＡのいずれかで
＋ｊ、、成されろ外部遺伝子はアグロバクテリウムＴ−
ＤＦＩ Ａｆ媒介体として利用して宿主縁ｔｉす細胞の
中へ移入され、その粘合に、その外部旬伝子はＢｔ’；
Ｗｒのゲノムυ中へ組入れられ、そして藻類の生合成
的機構圧よって複製および発現され得ろうこの方法は遺
伝子的に操作された紛紛細胞を生成しその中で外部ＤＮ
Ａが糺込・まれ、複製され１発現されろう アグロバクテリウムはそれが高等植物に感染する過程と
類似の過程に？いて緑藻類に感染し得ろことを本発明者
１ま発見したのである。これは、すべての下等植物を−
４）！、除する従来認めらＪｔてきたアグロバクテリウ
ムの宿主域から考えて、驚４？、的なことである。例え
は、ド・クリーヌ、マーセルおよびド・レプ、ジョセフ
の「クラウンゴールの宿主域Ｊ ＋ ＴｂｅＥｏｔａ
ｎｉｃａｌ Ｒｐｖｉｅｗ、 ｇｉ４２（４ｉ巻。
操作しその除に外部遺伝子が演。類の甲へ移入され、＊
ｙ’ｉ 刀１’２’さ」１１．そして発現される方法を
つくり出すことであゐっ不発明のさらに一つの目的は外
部遺伝子か中で発現される遺伝子的に操作した藻類＆ｌ
’ｌｉ ｌｊｆ！ｌをつくり出１−ことであゐっ本発明
の目的（まアグロバクテリウムのプラスミドＤＮＡを媒
介体として第１」用して緑藻類中に外部、ｙｊ伝子を心
入する方法を通じて達成されたのであるっ特定的にいえ
ば、、アＣＰ、：性または原核性のＤＮＡのいずれかで
＋ｊ、、成されろ外部遺伝子はアグロバクテリウムＴ−
ＤＦＩ Ａｆ媒介体として利用して宿主縁ｔｉす細胞の
中へ移入され、その粘合に、その外部旬伝子はＢｔ’；
Ｗｒのゲノムυ中へ組入れられ、そして藻類の生合成
的機構圧よって複製および発現され得ろうこの方法は遺
伝子的に操作された紛紛細胞を生成しその中で外部ＤＮ
Ａが糺込・まれ、複製され１発現されろう アグロバクテリウムはそれが高等植物に感染する過程と
類似の過程に？いて緑藻類に感染し得ろことを本発明者
１ま発見したのである。これは、すべての下等植物を−
４）！、除する従来認めらＪｔてきたアグロバクテリウ
ムの宿主域から考えて、驚４？、的なことである。例え
は、ド・クリーヌ、マーセルおよびド・レプ、ジョセフ
の「クラウンゴールの宿主域Ｊ ＋ ＴｂｅＥｏｔａ
ｎｉｃａｌ Ｒｐｖｉｅｗ、 ｇｉ４２（４ｉ巻。
（１９７６年）、ろ８９−４６６頁を見られたい。
また、緑漂類が感染されるということｌｉ、アグロバク
テリウムが以下の諸実施例において明らかにされる通り
青緑の藻類を明らかに感染させ得ないことを考えろと、
鵞＜べきことであるつアグロバクテリウムの限られた宿
主域の記録および青緑トキ類感染不能性からは、この細
菌が緑藻類を感染させることは予ル（されるもので１尤
ないつしがし１本発明者は、アグロバクテリウムが緑藻
類を感染し細菌Ｔ−ＤＮＡを藻類ゲノムの中へ移入し得
ろことを発見したのであるっ 本発明の卯−の段階は外部ＤＮＡを媒介体の中へ什入れ
ろこと全必要とするっ感染される細胞のゲノムの中へ組
入れられるのはアグロノ（クテリウムブラスミドＤＮＡ
のＴ−ＤＮＡｉ７［５分であるので。
テリウムが以下の諸実施例において明らかにされる通り
青緑の藻類を明らかに感染させ得ないことを考えろと、
鵞＜べきことであるつアグロバクテリウムの限られた宿
主域の記録および青緑トキ類感染不能性からは、この細
菌が緑藻類を感染させることは予ル（されるもので１尤
ないつしがし１本発明者は、アグロバクテリウムが緑藻
類を感染し細菌Ｔ−ＤＮＡを藻類ゲノムの中へ移入し得
ろことを発見したのであるっ 本発明の卯−の段階は外部ＤＮＡを媒介体の中へ什入れ
ろこと全必要とするっ感染される細胞のゲノムの中へ組
入れられるのはアグロノ（クテリウムブラスミドＤＮＡ
のＴ−ＤＮＡｉ７［５分であるので。
移入されるべき遺伝子または遺伝子類はＴ−ＤＮＡ配列
内部に組入」１．られ不ことが肝要であろっ所望の外部
遺伝子またｌＬ工遺伝子類は当業において既知の遺伝子
切り継ぎ過程を用いてＴ−ＤＮＡの中へ挿入されろこと
かできろ。一つのこの種の過程は、ガルフィンケン、デ
ビソドＪ、、らの１クラウンコ。
内部に組入」１．られ不ことが肝要であろっ所望の外部
遺伝子またｌＬ工遺伝子類は当業において既知の遺伝子
切り継ぎ過程を用いてＴ−ＤＮＡの中へ挿入されろこと
かできろ。一つのこの種の過程は、ガルフィンケン、デ
ビソドＪ、、らの１クラウンコ。
−ルの遺伝子的解析： ５ｉｔｅ−ｄＩｒｅｃｔｅｄ変
異訪発によるＴ−ＤＮＡの微細栴造地証」、第２７巻。
異訪発によるＴ−ＤＮＡの微細栴造地証」、第２７巻。
１４５−１５６負、〔１９８１年９月）、において記載
されていて、それはここに文献として組入れられてい７
：Ｉ。
されていて、それはここに文献として組入れられてい７
：Ｉ。
Ｄ ｉｉ Ａの中に挿入されろ外部遺伝子は真核性また
は原核性のＤＮＡから構成されろことができ７−１゜緑
藻の生合成的機構１まプロモーター配列を認識しかつ真
核性プロモーターのみを認識する緑色植物とちがって両
方の系からの遺伝子を発現することができろ。
は原核性のＤＮＡから構成されろことができ７−１゜緑
藻の生合成的機構１まプロモーター配列を認識しかつ真
核性プロモーターのみを認識する緑色植物とちがって両
方の系からの遺伝子を発現することができろ。
広範な＋１類の遺伝子を広範な紳類の起源から外部遺伝
子として採用することができろっプラスミド伝播体へ結
合することができろ健全な遺伝子はどれでも採用できろ
っ 直接的に有用である蛋白の一つの群はホルモンであろう
例示的なホルモンは副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、
ゴナトドロフィン（ＦＳ）］、ｉ体形成ホルモン、絨毛
性性腺刺戟ホルモン、および糖蛋白）、インシュリン、
ＡＧＴＨ，ソマトスフチン・グロックテン。胎盤性催乳
ホルモン、メラニン形成細胞側戟ホルモン、甲状腺刺戟
ホルモン。
子として採用することができろっプラスミド伝播体へ結
合することができろ健全な遺伝子はどれでも採用できろ
っ 直接的に有用である蛋白の一つの群はホルモンであろう
例示的なホルモンは副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、
ゴナトドロフィン（ＦＳ）］、ｉ体形成ホルモン、絨毛
性性腺刺戟ホルモン、および糖蛋白）、インシュリン、
ＡＧＴＨ，ソマトスフチン・グロックテン。胎盤性催乳
ホルモン、メラニン形成細胞側戟ホルモン、甲状腺刺戟
ホルモン。
副甲状腺ホルモン、カルシトニン、エンセファリン、お
よびアンギオテンシンを含むっ その他の興味のある蛋白は血清蛋白・フイブリノゲン、
グロトロンビン、トロンボプラスチン。
よびアンギオテンシンを含むっ その他の興味のある蛋白は血清蛋白・フイブリノゲン、
グロトロンビン、トロンボプラスチン。
グロブリン例えばガンマグロブリンまたは抗体。
ヘパリン１抗血友病性プロティン、オキシトシン。
アルブミン、アクチン、ミオシン、ヘモグロビン。
フェリチン、シトクロム、ミオグロビン、ラクトグロブ
リン、ピストン類、アビジン、テログロブリン・インタ
ーフェリン、キニン類およヒトランスコルチンを含むっ 遺伝子またν巧１４伝子類が一つまた（耐一つより多く
の酵素を生成する場合には、酵素は広範な柚類の機能を
果たすのに使用してよい。これらの機能の中に含まれろ
ものは、窒素固定・アミノ酸例えばポリョードチロニン
特にチロキシン、ビタミン類、水浴性および脂溶性の両
ビタミン・抗菌性架剤、化学僚法剤例えば抗腫瘍物質、
ポリペプチドおよびプロティン類例えばアポ酵素および
プロホルモンからのホルモン、診断試薬、エネルギー生
成組合せ物例えば光合成と水素生成、プロスタグランジ
ン、ステロイド、強心剤グリコシド、補酵素・などの生
成である。
リン、ピストン類、アビジン、テログロブリン・インタ
ーフェリン、キニン類およヒトランスコルチンを含むっ 遺伝子またν巧１４伝子類が一つまた（耐一つより多く
の酵素を生成する場合には、酵素は広範な柚類の機能を
果たすのに使用してよい。これらの機能の中に含まれろ
ものは、窒素固定・アミノ酸例えばポリョードチロニン
特にチロキシン、ビタミン類、水浴性および脂溶性の両
ビタミン・抗菌性架剤、化学僚法剤例えば抗腫瘍物質、
ポリペプチドおよびプロティン類例えばアポ酵素および
プロホルモンからのホルモン、診断試薬、エネルギー生
成組合せ物例えば光合成と水素生成、プロスタグランジ
ン、ステロイド、強心剤グリコシド、補酵素・などの生
成である。
これらの酵素＋ｔ７類と別に商業的応用例えば洗剤・合
成的形質転換１診断試薬、などのための薬剤として個別
的に有用であり得ろっ酵素は１．ｔＪ、Ｂ。
成的形質転換１診断試薬、などのための薬剤として個別
的に有用であり得ろっ酵素は１．ｔＪ、Ｂ。
により、■、オキシドレダククーゼ、■、トランスフェ
ラーゼ、ｎ＋、ヒドロラーゼ、■、り了−ゼ。
ラーゼ、ｎ＋、ヒドロラーゼ、■、り了−ゼ。
■、イソメラーゼ、および■、リガーゼ・どしての分類
下で分類されろ。
下で分類されろ。
外部遺伝子／Ｔ：媒介体中に挿入するときには選択標識
も挿入さＪｔろことが好ましいっ選択標識はうまく遺伝
的（て操作された細胞をされながった細胞から分離する
ことを可能にする特性について暗号を与えろｍ一つの遺
伝子または一組の遺伝子であるっ選択標識は白菜におい
ては周知でちり、抗生物先抵抗性を伺与する配列、解毒
を行なう配列、および原栄養を回復する配列を含んでい
ろ。ある特別の系において使用すべき選択系は使用する
決類株および所望の最終生成物を含むいくつかの要因に
依存するが、ただしそれらに限定されろものではない。
も挿入さＪｔろことが好ましいっ選択標識はうまく遺伝
的（て操作された細胞をされながった細胞から分離する
ことを可能にする特性について暗号を与えろｍ一つの遺
伝子または一組の遺伝子であるっ選択標識は白菜におい
ては周知でちり、抗生物先抵抗性を伺与する配列、解毒
を行なう配列、および原栄養を回復する配列を含んでい
ろ。ある特別の系において使用すべき選択系は使用する
決類株および所望の最終生成物を含むいくつかの要因に
依存するが、ただしそれらに限定されろものではない。
媒介体の調製か終ると、藻類は操作されたプラスミドを
含むアグロバクテリウム菌株によっテ感染される３代証
的に活性な細菌細胞がより多くの原級を生成することが
植物細胞において見出されたっそれゆえ、中対数期また
は後（ｌａｔｅ）対数期（Ｃあるアグロバクテリウム培
養株を用いることが好ましいっこの培養株中の細胞は無
菌の藻類増殖培地で以て洗面して、藻類細胞が選択培地
上で平板培養されろときに細菌が藻類の上知はびこそ）
のを防ぐよう細菌増殖培地を除去するべきであろっ植物
内において？工、細胞は細菌によって感染されろため（
（活溌に分裂しつつあらねばならない。それゆえ、活溌
に分裂中であるかあるいは中または後対数期にある藻類
を使用することが好ましいっ酬！１菌の培養株と藻類と
は鴻＠増殖培地上において一緒に混合さ、れろっ細胞は
６２℃以下で３０秒から１５分間、好ましくは５分間培
養されろつアグロバクテリウムは５２°Ｃまたはそれよ
り高い温度において植物を感染することは知られていな
い。
含むアグロバクテリウム菌株によっテ感染される３代証
的に活性な細菌細胞がより多くの原級を生成することが
植物細胞において見出されたっそれゆえ、中対数期また
は後（ｌａｔｅ）対数期（Ｃあるアグロバクテリウム培
養株を用いることが好ましいっこの培養株中の細胞は無
菌の藻類増殖培地で以て洗面して、藻類細胞が選択培地
上で平板培養されろときに細菌が藻類の上知はびこそ）
のを防ぐよう細菌増殖培地を除去するべきであろっ植物
内において？工、細胞は細菌によって感染されろため（
（活溌に分裂しつつあらねばならない。それゆえ、活溌
に分裂中であるかあるいは中または後対数期にある藻類
を使用することが好ましいっ酬！１菌の培養株と藻類と
は鴻＠増殖培地上において一緒に混合さ、れろっ細胞は
６２℃以下で３０秒から１５分間、好ましくは５分間培
養されろつアグロバクテリウムは５２°Ｃまたはそれよ
り高い温度において植物を感染することは知られていな
い。
感染のための実貯の温度は好ましくは用いる特別なり′
Ｊ知梗の増殖のための最適温度である。それより著しく
低い温度は感染のための必要条件である活溌な分裂を藻
類細胞に可能にさせない。感染中に、細菌フーラスミド
のＴ−ＤＮＡは藻類ＤＮＡの中に組込まれ、そこで複製
および発現されろ。
Ｊ知梗の増殖のための最適温度である。それより著しく
低い温度は感染のための必要条件である活溌な分裂を藻
類細胞に可能にさせない。感染中に、細菌フーラスミド
のＴ−ＤＮＡは藻類ＤＮＡの中に組込まれ、そこで複製
および発現されろ。
アグロバクテリウムはすべての緑藻類の操作における媒
介体として使用することができろ、緑藻類は緑藻植物門
の各員を含むっこの門は例えばクラミドモナス（Ｇｈｌ
ａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ） 属、テユナリエラ（Ｄｕｎ
ａｌ １ｅｌｌａ ）属、およびりＯＬ’う（Ｃｈｌｏ
ｒｅｌｌａ）属を含むっこの門は特にクラミドモナス・
レインハルティー（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅ
ｉｎｈａｒｄｔｉｉ ）−ブ １０トゾフオン
・ボトリオイデス（Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎｂｏｔｒｙ
ｏｉｄｅｓ ） 、およびクロレラ・ピレノイドサ（Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｈｒｅｎｏｉｄｏｓａ ）を含む
っ状在、この方法において使用できるアグロバクテリウ
ムのいくつかの種が同定されている。プラスミドおよび
感染方法に関して徐められた広汎な情報に基づき好まし
いどされる種はアグロバクテリウム−リゾゲネス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）オヨ
ヒアグロバクテリウム９ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃ’ｃｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）を含
むっ実施例 以下に列記の実施例においては１次の培養株と条件を使
用した。
介体として使用することができろ、緑藻類は緑藻植物門
の各員を含むっこの門は例えばクラミドモナス（Ｇｈｌ
ａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ） 属、テユナリエラ（Ｄｕｎ
ａｌ １ｅｌｌａ ）属、およびりＯＬ’う（Ｃｈｌｏ
ｒｅｌｌａ）属を含むっこの門は特にクラミドモナス・
レインハルティー（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅ
ｉｎｈａｒｄｔｉｉ ）−ブ １０トゾフオン
・ボトリオイデス（Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎｂｏｔｒｙ
ｏｉｄｅｓ ） 、およびクロレラ・ピレノイドサ（Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｈｒｅｎｏｉｄｏｓａ ）を含む
っ状在、この方法において使用できるアグロバクテリウ
ムのいくつかの種が同定されている。プラスミドおよび
感染方法に関して徐められた広汎な情報に基づき好まし
いどされる種はアグロバクテリウム−リゾゲネス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）オヨ
ヒアグロバクテリウム９ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃ’ｃｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）を含
むっ実施例 以下に列記の実施例においては１次の培養株と条件を使
用した。
緑ｕ”： ’＜貞クラミドモナス・レインノ・ルテイー
（Ｃｂｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈ２ｒｄｔｉ
ｉ ） （ＵＴ ＥＸ２２４６）はＯＡ培地（第１表）
上で増殖させた。
（Ｃｂｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈ２ｒｄｔｉ
ｉ ） （ＵＴ ＥＸ２２４６）はＯＡ培地（第１表）
上で増殖させた。
ｌａｋ Ｍプロトシフオン・ボトリオイデス（Ｐｒｏｔ
ｏ−ｓｉｐｈω１ｂｏｉｒｙｏｉｄｅｓ ’） （ケ
ンブリッジ培養株コレクション７５１／１ａ）は６２５
培地（鉋、１聚）上で増殖させたつ 青緑凛匁４了ナシスチスーニテユランス（八ｎａｃｙ
−５ｔｉｓ ｎ１ｄｕｌａｎｓ ） （ＡＴＣＣ２７
３４４）ｊｉ６２５培地（第１表）上で増殖させたつ アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏ−１
）２ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｐｆａｃｉｅｎｓ ）の３
２０株をオイゲン・ネスクーおよびミルトンゴートン博
士から爬で（ガルフィンケルら、 １９３１ ） 、栄
養源培地上で増殖させた。
ｏ−ｓｉｐｈω１ｂｏｉｒｙｏｉｄｅｓ ’） （ケ
ンブリッジ培養株コレクション７５１／１ａ）は６２５
培地（鉋、１聚）上で増殖させたつ 青緑凛匁４了ナシスチスーニテユランス（八ｎａｃｙ
−５ｔｉｓ ｎ１ｄｕｌａｎｓ ） （ＡＴＣＣ２７
３４４）ｊｉ６２５培地（第１表）上で増殖させたつ アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏ−１
）２ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｐｆａｃｉｅｎｓ ）の３
２０株をオイゲン・ネスクーおよびミルトンゴートン博
士から爬で（ガルフィンケルら、 １９３１ ） 、栄
養源培地上で増殖させた。
この６２０株１１ Ｔ ｉプラスミドのＴ−ＤＮＡｅ位
中にトラスボゾン’Ｉ’Ｈ５ｆ！ｒ含んでいろ。Ｔｎ５
は蛋白アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（５
勺−ＩＩ（ＡＰＨ）について情報を伝達する原核性遺伝
子である。この蛋白はＡＴＰのガンマ燐酸塩基を移入す
ることによって抗性物質ネオマイシン。
中にトラスボゾン’Ｉ’Ｈ５ｆ！ｒ含んでいろ。Ｔｎ５
は蛋白アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（５
勺−ＩＩ（ＡＰＨ）について情報を伝達する原核性遺伝
子である。この蛋白はＡＴＰのガンマ燐酸塩基を移入す
ることによって抗性物質ネオマイシン。
カナマイシンおよび０４１８′ｆ：解毒するっこれらの
抗生物質は多くの異なる秤に対ｔ２て毒性である。
抗生物質は多くの異なる秤に対ｔ２て毒性である。
Ｔｎ ５遺伝子を含むいくつかの細菌と酵母の細胞は抗
性物質の存在下において増殖し得ろ。
性物質の存在下において増殖し得ろ。
寒天から水性抽出物を１０１のディフコーバクト寒天を
１ｔの水の中で２時間攪拌することによってつくった。
１ｔの水の中で２時間攪拌することによってつくった。
この懸濁液を２層のミラクロスを通してｐ過１−たっＣ
ＡＡ天培地の１ｔを１ｔの水性抽出物を用いてつくった
。
ＡＡ天培地の１ｔを１ｔの水性抽出物を用いてつくった
。
第１表
Ｕき類増殖培地
ＣＡ培地
ｍｇ／’Ｉ
Ｎ）ＩＣ／−５Ｑ
Ｍ ｇ ＳＯ４７Ｈ２０２０
ＣａＣＺｚ ２１−１２０
１０Ｋ ）ＩＰ○ ７２０
４ ＫＨＰＯろ６０ ４ 酢「致ナトリウム ２０００培地１
ｔあたり１．Ｔｎｌのハントナー痕跡元素を追加。
１０Ｋ ）ＩＰ○ ７２０
４ ＫＨＰＯろ６０ ４ 酢「致ナトリウム ２０００培地１
ｔあたり１．Ｔｎｌのハントナー痕跡元素を追加。
１／１
Ｎａ ＥＤＴＡ
５０８Ｂ○
１１．４３ ｚｎ ＳＯ４７Ｈ２０２２ ＭｎＣ１２４Ｈ２０５，ｌ ＦｅＳＯ４７Ｈ２０５ ｃｏｃｚ２６１−１２０
１．６Ｃｕ ｂ Ｏ４５Ｈ２０１，６ （ＮＨ４）６ＭＯ７０□４４１−１２０
１．１６２５培地 ｍ９／１ Ｎ ａ Ｎ Ｏ３４９６ Ｋ ＨＰＯろ９ ４ Ｍ ｇ Ｓ Ｕ ４ ７１−１゜○
７５ＣａＣＺ ２ ２ Ｈ２０５６ Ｆｅ く九ん似４６ Ｎａ２Ｓｉ○３９Ｈ２０５８ Ｎａ ＣＯ２０ ３ くえん酸 ・
６１実施例 ろ２０菌株の５０ｍＡの培養菌を中乃至後対数期へ増殖
させた。細胞を遠心分離によって捕集し無菌ＯＡ培地で
１Ｊて２回洗滌した。これらの細胞を５祷の培地の中で
再ＩＶ、濁させたつ２日経ったクラミドモナス培養株（
中乃至後対数期）からの約１ＵＪ６の細胞を０．２Ｍの
細閉散、濁液と室温においてて混合した。この混合物を
ＯＡ培培地へ１０’Ｌｎ９／ｌｃ、４’＋Ｂ硫酸塩（ボ
テｙ シー ５００ ｔｎｃＰ／’ｆ） 。
５０８Ｂ○
１１．４３ ｚｎ ＳＯ４７Ｈ２０２２ ＭｎＣ１２４Ｈ２０５，ｌ ＦｅＳＯ４７Ｈ２０５ ｃｏｃｚ２６１−１２０
１．６Ｃｕ ｂ Ｏ４５Ｈ２０１，６ （ＮＨ４）６ＭＯ７０□４４１−１２０
１．１６２５培地 ｍ９／１ Ｎ ａ Ｎ Ｏ３４９６ Ｋ ＨＰＯろ９ ４ Ｍ ｇ Ｓ Ｕ ４ ７１−１゜○
７５ＣａＣＺ ２ ２ Ｈ２０５６ Ｆｅ く九ん似４６ Ｎａ２Ｓｉ○３９Ｈ２０５８ Ｎａ ＣＯ２０ ３ くえん酸 ・
６１実施例 ろ２０菌株の５０ｍＡの培養菌を中乃至後対数期へ増殖
させた。細胞を遠心分離によって捕集し無菌ＯＡ培地で
１Ｊて２回洗滌した。これらの細胞を５祷の培地の中で
再ＩＶ、濁させたつ２日経ったクラミドモナス培養株（
中乃至後対数期）からの約１ＵＪ６の細胞を０．２Ｍの
細閉散、濁液と室温においてて混合した。この混合物を
ＯＡ培培地へ１０’Ｌｎ９／ｌｃ、４’＋Ｂ硫酸塩（ボ
テｙ シー ５００ ｔｎｃＰ／’ｆ） 。
２５ｍｇ／ｌストレプトマイシン、および２５ｍｇ／ｌ
カナマイシンと一緒に平板培養を行なったつこれらのプ
レートを２７°Ｃで培養した。２７°Ｃはそれがクラミ
ドモナスの増殖に対する最適已度であるからである。葎
類りラミドモナス・レインハルティーからの非処理細胞
は抗生物質Ｇ４１Ｂの存在下で増殖させるときに死滅さ
せられたつアグロバクテリウム菌体と混合された藻類細
ＩＩ包力１ら構成されろ藻類コロニーは４−５日以内に
回心ΔＶζ態に１より抗生物ａの存在下にお―・て仏し
く増殖した。これらの結果は、ろ２０菌株１ま藻類へＴ
ａ２を感染および移入し、その藻類がＴａ２ 遺伝子を
発現させてイ幾能性蛋白をつくることができたことを示
しているつアグロノくクテリウム感染りラミドモナスの
コロニー’ｒｅ−ｔｌｉｆＤ、’Ｌ、 １０〜／ｌ Ｇ
４１８および１０＃＆／４カルベニシリンを含む０Ａ９
Ｊ大培地上で増り１ｑさせた。
カナマイシンと一緒に平板培養を行なったつこれらのプ
レートを２７°Ｃで培養した。２７°Ｃはそれがクラミ
ドモナスの増殖に対する最適已度であるからである。葎
類りラミドモナス・レインハルティーからの非処理細胞
は抗生物質Ｇ４１Ｂの存在下で増殖させるときに死滅さ
せられたつアグロバクテリウム菌体と混合された藻類細
ＩＩ包力１ら構成されろ藻類コロニーは４−５日以内に
回心ΔＶζ態に１より抗生物ａの存在下にお―・て仏し
く増殖した。これらの結果は、ろ２０菌株１ま藻類へＴ
ａ２を感染および移入し、その藻類がＴａ２ 遺伝子を
発現させてイ幾能性蛋白をつくることができたことを示
しているつアグロノくクテリウム感染りラミドモナスの
コロニー’ｒｅ−ｔｌｉｆＤ、’Ｌ、 １０〜／ｌ Ｇ
４１８および１０＃＆／４カルベニシリンを含む０Ａ９
Ｊ大培地上で増り１ｑさせた。
この感染クラミドモナス細胞はまた変容代請（の他の徴
候も示したつ正常のクラミド４三ナス細胞１１鞭状培地
まブゴ固体に；地上で等しくよく増殖するが、感染細胞
はデイフコーバクト寒天の水性抽出物で補足しである液
状培地中でのみ増殖するつ細胞し、これら（丁通常（１
単細胞として増殖するのであるが、凝集塊どして増殖す
る。形態上の変容ｌ’Ｉ’−ＤＮＡの他の部位の発現に
基因するかあるいはＴ−ＤＮＡ挿入に基づく正常の藻類
遺伝子または遺伝子数の破壊に帰せられろかのいずれか
であったっ この根拠をさらに実証するために、感染細胞についてい
くつかの試験全実施したつクラウンコ°−ル閉細胞を除
去した感染クラミドモナス細胞の培養株から蛋白全単離
し検定した。結果は抗生物質抵抗性を与え不機能的ＡＰ
）（蛋白の存在を示し。
候も示したつ正常のクラミド４三ナス細胞１１鞭状培地
まブゴ固体に；地上で等しくよく増殖するが、感染細胞
はデイフコーバクト寒天の水性抽出物で補足しである液
状培地中でのみ増殖するつ細胞し、これら（丁通常（１
単細胞として増殖するのであるが、凝集塊どして増殖す
る。形態上の変容ｌ’Ｉ’−ＤＮＡの他の部位の発現に
基因するかあるいはＴ−ＤＮＡ挿入に基づく正常の藻類
遺伝子または遺伝子数の破壊に帰せられろかのいずれか
であったっ この根拠をさらに実証するために、感染細胞についてい
くつかの試験全実施したつクラウンコ°−ル閉細胞を除
去した感染クラミドモナス細胞の培養株から蛋白全単離
し検定した。結果は抗生物質抵抗性を与え不機能的ＡＰ
）（蛋白の存在を示し。
Ｔｎ５遺伝子が移入され発現されたことを表わしている
。告白の検定はまた藻類細胞中にオフトノ（インシンタ
ーゼが存在することを示した。オクトパインシンターゼ
はＴ−ＤＮＡによって遺伝情報を指定されかつ真核性プ
ロモーターを含む蛋白であろっ ＳＤＳポリアクリルアマイドゲル電気体動によろＡＰＨ
およびオクトパインシンターゼの分析は。
。告白の検定はまた藻類細胞中にオフトノ（インシンタ
ーゼが存在することを示した。オクトパインシンターゼ
はＴ−ＤＮＡによって遺伝情報を指定されかつ真核性プ
ロモーターを含む蛋白であろっ ＳＤＳポリアクリルアマイドゲル電気体動によろＡＰＨ
およびオクトパインシンターゼの分析は。
これらの蛋白が藻類生合成系によって固有的に合成され
たことを示したつ感染クラミドモナス細胞は細菌起諒の
二つの遺伝子、Ｔｎ５遺伝子どオクトバインシンターゼ
遺伝子、全忠実に合成することができたつＴｎ５遺伝子
は細菌プロモーターを含ミ、オクトバインシンターゼ遺
伝子は恐らくは植物プロモーターを含むわなぜならば遺
伝子がアグロバクテリウム感染植物細胞中でのみ発現さ
れるからであるっクラミドモナス細胞は両りイグのプロ
モーターを認識することができた。この特性はクラミド
モナスを遺伝子移入実験のだめのきわめて望ましい宿主
とさせるものであろっＤ Ｎ Ａハイブリッド形成検定
法をまた。アグロバクテリウムＤＮＡの藻類ＤＮＡの中
への取込みを確かめるために実施した。結果は感染クラ
ミドモナス細胞ＤＮＡ中にＴ−ＤＮＡが存在することを
示している。
たことを示したつ感染クラミドモナス細胞は細菌起諒の
二つの遺伝子、Ｔｎ５遺伝子どオクトバインシンターゼ
遺伝子、全忠実に合成することができたつＴｎ５遺伝子
は細菌プロモーターを含ミ、オクトバインシンターゼ遺
伝子は恐らくは植物プロモーターを含むわなぜならば遺
伝子がアグロバクテリウム感染植物細胞中でのみ発現さ
れるからであるっクラミドモナス細胞は両りイグのプロ
モーターを認識することができた。この特性はクラミド
モナスを遺伝子移入実験のだめのきわめて望ましい宿主
とさせるものであろっＤ Ｎ Ａハイブリッド形成検定
法をまた。アグロバクテリウムＤＮＡの藻類ＤＮＡの中
への取込みを確かめるために実施した。結果は感染クラ
ミドモナス細胞ＤＮＡ中にＴ−ＤＮＡが存在することを
示している。
二九旌りＬＪＬ
笑施例１の場合と同様に、６２０株の５０ｒｆＬｅの培
養株を中乃至後対数期へ増殖させたつ細胞を遠心分離に
よって捕集し無菌の６２５培地で以て２回洗滌した）細
胞を５Ｎの培地中で再懸濁させた。
養株を中乃至後対数期へ増殖させたつ細胞を遠心分離に
よって捕集し無菌の６２５培地で以て２回洗滌した）細
胞を５Ｎの培地中で再懸濁させた。
グロトシフオン感染のために、４−６日経った培地（中
乃至後対数期）からの約１０６細胞を０．２鞭の細菌懸
濁液と混合した。混合物を室温において５分間培養し次
いで１００〜／ｌカナマイシンと２５ｍｇ／ｌノ、トレ
ブトマイシンとで以て補足した６２５培地上へ平板培養
を行ない、２７℃で増殖させたつコロニーは約７−１０
日以内に肉視できるようになった。
乃至後対数期）からの約１０６細胞を０．２鞭の細菌懸
濁液と混合した。混合物を室温において５分間培養し次
いで１００〜／ｌカナマイシンと２５ｍｇ／ｌノ、トレ
ブトマイシンとで以て補足した６２５培地上へ平板培養
を行ない、２７℃で増殖させたつコロニーは約７−１０
日以内に肉視できるようになった。
カナマイシンはグロトシ７オン細胞に対して毒性であり
、非処理藻類細胞はこの選択培地上で増殖しなかつたつ
感染藻類細胞（１抗生物質存在下で増殖した。これらの
結果はろ２０クラウンタ一ル細菌株）ｉＴｎ５遺伝子を
１０トシフオンへ感染および移入したこと２および藻類
細胞がＴｎ５遺伝子を発現させて機能的蛋白をつくるこ
とができたことを示している。
、非処理藻類細胞はこの選択培地上で増殖しなかつたつ
感染藻類細胞（１抗生物質存在下で増殖した。これらの
結果はろ２０クラウンタ一ル細菌株）ｉＴｎ５遺伝子を
１０トシフオンへ感染および移入したこと２および藻類
細胞がＴｎ５遺伝子を発現させて機能的蛋白をつくるこ
とができたことを示している。
実施例 ｍ
実施例１の場合と同じ＜、５２０菌株の５ＯＮの培養株
全中乃至後対数期へ増殖させたつ細胞を遠心分離によっ
て捕集し無菌の６２５培地で以て２回洗酔した。細胞を
５Ｎの培地中に再懸濁させたつ アナシスチス感染のために、２−６日経った培養株（中
乃至後対数期）からの約１０６個の細胞を０．２ Ｎの
細菌懸濁液と混合したつ混合物を室温で５分間培養し１
次いで１０ｍｇ／ｌカナマイシンで以て補足した６２５
培地上に平板培養し、２７℃で増殖させた。藻類コロニ
ーは４週間後も形成されなかったっ これらの結果は、アグロバクテリウムが青緑藻類を感染
し得ないかあるいは機能的遺伝子を藻類細胞の中へ移入
し得ないかのいずれかであったことを示しているっ 上記晶例は説明のためにのみ提供されたものであり１本
発明の制約を意図するものではない。これらの方法と生
成物の追加的な用法は当業者にどつては明らかである。
全中乃至後対数期へ増殖させたつ細胞を遠心分離によっ
て捕集し無菌の６２５培地で以て２回洗酔した。細胞を
５Ｎの培地中に再懸濁させたつ アナシスチス感染のために、２−６日経った培養株（中
乃至後対数期）からの約１０６個の細胞を０．２ Ｎの
細菌懸濁液と混合したつ混合物を室温で５分間培養し１
次いで１０ｍｇ／ｌカナマイシンで以て補足した６２５
培地上に平板培養し、２７℃で増殖させた。藻類コロニ
ーは４週間後も形成されなかったっ これらの結果は、アグロバクテリウムが青緑藻類を感染
し得ないかあるいは機能的遺伝子を藻類細胞の中へ移入
し得ないかのいずれかであったことを示しているっ 上記晶例は説明のためにのみ提供されたものであり１本
発明の制約を意図するものではない。これらの方法と生
成物の追加的な用法は当業者にどつては明らかである。
特許出願人 スタンダード−オイル・カンパニー（外
４名）
４名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ＋１１ 細菌プラスミドのＴ−ＤＮＡ配列内部に取込
んだ生物学的機能性の外部遺伝子ビ含む遺伝的に変性し
たアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
で以て緑藻細胞ン感染させろことから成る。緑藻内部に
外部ＤＮＡｖ導入する方法。 （２）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｐ、ｒｉ
ｕｍ ）がアグロバクテリウム参ツメファシェンス（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｎｍｅｆａｃｉｅｎｓ
） とアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏ −ｇｐ、１ｅＳ ）
から成ゐ群から選ばれる。特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 （３］ 外部ＤＮＡが真核性ＤＮＡ、原核性ＤＮＡお
よびそれらの組合せから成る群から選ばれ／）５特許請
求の範囲第１項に記載の方法っ （４）緑Ｗｋがクラミドモナス・レインハルティー （
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
）、プロトシホン・ボトリオイデス（Ｐｒｏｔｏｓｉ
ｐｈｏｎ ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ ）およびクロレラ・
ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌａｐｙｒｅｎｏｉｄｏ
ｓａ ）の種から選ばれる音さ類から成る。 特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （５） 外部ＤＮＡが選択標識から成る。特許請求の
範囲第１項に記載の方法っ （６）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ）プラスミドのＴ−ＤＮＡ配列を含み、その際Ｔ
−ＤＮＡが生物学的機能性の外部遺伝子を含む、遺伝子
的に操作した物質組成物としての緑藻細胞。 （７）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ）がアグロバクテリウム・ソメフ了シエンス（Ａｇ
ｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
） とアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｐｓ ）から成る
群から選ばれる。特許請求の範囲第６項に記載の物質組
成物。 （８）外部ＤＮＡが真核性ＤＮＡ、原核性ＤＮＡおよび
それらの組合せから成る群から選ばれる。 特許請求の範囲第６項に記載の組成物。 （９） 緑藻類がクラミドモナス・レインハルティー
（Ｇｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔ
ｉｉ ）−プロトシホ７−ボトリオイデス（Ｐｒｏｔｏ
ｓｉｐｈｏｎ ｂｏｔｏｒｙｏｉｄｅｓ’）およびクロ
レラ・ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｙｒｅｎ
ｏｉｄｏｓａ ”）の種から選ばれる藻類から成る。 特許請求の範囲第６項ｆ記載の物質組成物っ０α 外部
ＤＮＡが選択標識から成る。特許請求の範囲第６項に記
載の物質組成物。 ０１）特許請求の範囲第１項の方法によって得られる生
成物っ
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US43973682A | 1982-11-08 | 1982-11-08 | |
| US439736 | 1982-11-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5998692A true JPS5998692A (ja) | 1984-06-07 |
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|---|---|---|---|
| JP58209784A Pending JPS5998692A (ja) | 1982-11-08 | 1983-11-08 | アグロバクテリウムのｔ−ｄｎａを利用して緑藻類中への外部遺伝子導入方法 |
Country Status (5)
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| JP (1) | JPS5998692A (ja) |
| DK (1) | DK509283A (ja) |
| ES (1) | ES8602132A1 (ja) |
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-
1983
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- 1983-11-07 DK DK509283A patent/DK509283A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-11-08 JP JP58209784A patent/JPS5998692A/ja active Pending
- 1983-11-08 ES ES527131A patent/ES8602132A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DK509283A (da) | 1984-05-09 |
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