JPH03501680A - キュウリモザイクウイルスの外皮蛋白遺伝子 - Google Patents

キュウリモザイクウイルスの外皮蛋白遺伝子

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、ＣＭＶ−Ｃからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプ ロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス遺伝子またはファゼオラス・ブ ルガリス種子貯蔵蛋白遺伝子いずれかのボリアデニシーシヲンシグナルを含有す る形質転換植物体細り包。
５、請求の範囲第４項記載の形質転換細胞よりなるウリ科またはナス科から選択 される植物体。
６、請求の範囲第５項記載のウリ科植物体。
７、請求の範囲第５項記載のナス科植物体。
８、請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するウリ科植物体を増殖させ ることを特徴とするウィルス耐性ウリ科植物体の生産方法。
Ｓ、請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するナス科植物体を増殖させ ることを特徴とするウィルス耐性ナス科植物体の生産方法。
明細書 キュウリモザイクウィルスの外皮蛋白遺伝子発明の分野 本発明はキュウリモザイクウィルス株ｃ　（ＣＭＶ−Ｃ）の外皮蛋白遺伝子に関 する。さらに詳しくは、本発明は該遺伝子の製法ならびに移入ベクターへのその 組み込みおよび形質転換植物体細胞を産生ずるためのその使用およびＣＭＶウィ ルス感染に対して耐性である形質転換植物体に関する。
二服９宣屡 キュウリモザイクウィルス（ＣＭｖ）は、機能的に分かれたゲノムを有する一本 鎖（＋）ＲＮＡ植物ウィルスである。該ウィルスのゲノムは、各々、ＲＮＡ５１ −４；３３８９ヌクレオチド（ｎｔ）、３０３５ｎｔ、２１９３ｎｔおよび１０ ２７ｎｔと命名される４種のＲＮ　Ａ種を含有する（ペデンおよびシモンズ（Ｐ ｅｄｅｎ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）、１９７３；ボルドおよびシモンズ（Ｇｏｕ ｌｄ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ、１９８２：レザイアンら（Ｒｅｚａｉａｎ　ｅｔ 　ａｌ）、１９８４；レザイアン（Ｒｅｚａｉａｎ　ｅｔａｌ）、１９８５　） 　ｏ　ＲＮＡ　ｓ　１−３　ノミカ感染ニ必要テアル（ヘテンおよびシモンズ（ Ｐｅｄｅｎ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）　、１９７３）　ｏ何故ならば・ＲＮＡ４ によってコード付けされる外皮蛋白もまたＲ　Ｎ　Ａ　３によってコード付けさ れるからである。ＣＭＶ　ＲＮＡ５の翻訳によ：）、ＲＮＡ　ｌから９５ＫＤａ ｌのポリペプチド、ＲＮＡ２から９４　ＫＤａｌのポリペプチド（ゴートンら（ Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８３）およびＲＮＡ３から２種のポリペプチ ドが得ろれる：その５′末端は３５ＫＤａｌのポリペプチドをコード付け、その ３゛°末端は２４　、５ＫＤａｌＯポ１．゛ヘブチドをコード付けする（ボルド およびシモンズ（Ｇｏｕｌｄ　ａｎｄ　Ｓｙ−ｍｏｎｓ）、１９８２）、該２４ ．５ＫＤａｌのポリペプチドはＲＮＡ４によってコード付けされるものと同一で あり、外皮蛋白である。
ＣＭＶ外皮蛋白遺伝子は、一旦植物ゲツムに移入され、組み込まれると、その発 現に要するシグナルを含有しない。それ：±、そ、つ翻訳開始コドン（ＡＴＧ） に対して５“側に構成的プロモーターおよびその鮭訳停止フドンニ対して３′側 、＝ポリ（Ａ）付加シグナル（八ＡＴＡＡＡ）を含有するように設計されなけれ ばならない。植物で機能するいくつかのプロモーターが利用できるが、本発明者 らは、最良のプロモーターはＣａＭＶ％Ｔｉ遺伝子ツバリンシンターゼ（ベバン ら（Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ））およびオクトビンシンクーゼ（デピッカーら（ Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、１９８２）、および豆類貯蔵蛋白遺伝子ファゼ オリンからの構成的プロモーター類であると信じる。これらの遺伝子からのポリ （Ａ）付加シグナルは本発明者らの目的に適している。
情報の開示 ウィルス病に耐性の植物およびそれらの産生法がＥＰ２２３４５２に記載されて いる。
アン・シイら（Ａｎ、　Ｇ、＋　ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）ｒ高等植物の形質 転換用の新しいクローニングビヒクル類（Ｎｅｗ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｈｉｃ ｌｅｓｆｏｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎ ｔｓ）Ｊ　、ＥＭＢＯＪ　、４　：　２７７〜２８４；ドッグ・ジェイ・エイ’ ｌ　（Ｄｏｄｄｓ、　Ｊ、Ａｌ　ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）、キーウリ・モザ イクウィルスの株間の交叉保護：宿主および接種物のタイプが攻撃株のウィルス 粒子および二本鎖ＲＮＡの蓄積に与える影響（Ｃｒｏｓｓ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ ｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　５ｔｒａｉｎｓＯｆ　ｃｕ−ｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ 　ｖｉｒｕｓ：　ｅｒｒｅｃｔ　ｏｒ　ｈｏｓｔ　ａｎｄ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｉ ｎｏｃｕｌｕｍ　ｏｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｉｏｎｓ　ａｎ ｄ　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈａｌ−１ｅ ｎｇｅ　５ｔｒａｉｎ）　、パイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４４　：　 ３０１〜３０９；ピエトルザアクー、ｚムら（Ｐｉｅｔｒｚａｋ、　Ｍ、、　ｅ ｔ　ａｌ）　（１９８６）新しい植物発現ベクターでのプロトプラスト形質転換 後の２種の細菌抗生物質耐性遺伝子の植物における発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆｔｗｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｔｏｂｉｏｔｉ ｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｔｒ ａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｅｖｒ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ、 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１４　：　５８５７〜５８６８゜ 発明の要約 本発明は、 キュウリモザイクウィルスの０株（ＣＭＣ−Ｃ）からの外皮蛋白遺伝子； ＣＭＣ−Ｃからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ遺伝 子のプロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子またはファ ゼオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）種子貯蔵蛋白遺 伝子いずれかのポリアデニシーシジンシグナルよりなる植物体形質転換ベクター ；ＣＭＶ−Ｃからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプ ロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子またはファゼオラ ス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）種子貯蔵蛋白遺伝子 いずれかのボリアテニシーションシグナルよりなる植物体形質転換ベクターを含 有する細菌細胞；ＣＭ　Ｖ　−Ｃからの外、支蛋白遺伝子、カリフラワーモザイ クウィルス３５Ｓプロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス遺伝子また はファゼオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｉｕｓ〜ｕ１ｇａｒｉｓ）種子貯蔵 蛋白遺伝子（ファゼオ”ｌン（Ｐｈａｓｅｏｌｉｎ：）　）いずれかのポリアゾ ニレ−ジョンシグナルを含有する形質転換植物１本細り包；ＣＭ　Ｖ　−Ｃの外 皮蛋白遺伝子、でリフラフ−モザイクウィルス３５Ｓプロモーターおよびカリフ ラワーモザイクウィルス遺伝子またはファゼオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏ ｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）種子貯蔵蛋白遺伝子（ファゼオリン）いずれかのポ リアゾニレ−ジョンシグナルを含有する形質転換細胞よりなる植物体［本発明の 形質転換植物体はビート、柑橘類果実、トウモロコシ、キュウリ、コシヨウ、ジ ャガイモ、大豆、カボチ、およびトマトを包含する。特に好ましいのはウリ科（ すなわち、カポチャ、キュウリ）およびナス科（すなわち、コシヨウ、トマト） の成員であるコ；キニウリウイルスの０株からの外皮蛋白遺伝子を発現する植物 体を増殖させることを特徴とするウィルス耐性植物体の生産方法［特に好ましい のはウリ科およびナス科の成員の生産方法であるコニ好ましい具体例の記載 チャートエないし５は本発明の詳細な説明するために記載する。
プラスミドおよびＤＮＡ断片を説明するために、以下のごときある種の約束を用 いる。
（１）単一線の図は環状および直線状二本ｆｍ　Ｄ　Ｎ　、へを共に表わす。
（２）星印（＊）は、表わす分子が環状であることを示す。星印の欠如は分子が 直線状であることを示す。
（３）機能成分の自然な境界間の接合は水平線に垂直の直線で示す。
（４）遺伝子または機能成分を示す。
（５）遺伝子類および制限部位類間の距離はスケール通りでない。
特に断りのない限り、図は相対的位置のみを示す。
本発明を実施するのに使用するＤＮＡ組操法のほとんどは、当業者によく知られ た標準的な手法であって、例えばＥＰ−２２３４，５２に詳細に記載されており 、ここに参照のために挙げる。酵素類は商業的源から入手し、販売業者の推奨法 または当該分野で知られた他の変法に従って使用する。また、試薬、緩衝液、お よび培養条件も当業者に公知である。かかる標準的な技術を含有する一般的文献 は以下の二アール・ウー（Ｒ，Ｗｕ）綱、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８巻ニジエイ−ｘイチ・ミラー（Ｊ、　）！ 、　Ｍｉｌｌｅｒ）（１９７２）、分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）　：テイーマニアティス ら（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌＸｌ　９８２）、分子コローニング； 実験室マニニアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　；　ＡＬａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　；およびディ・、ｍム・グロバー（Ｄ、　Ｍ、　Ｇ ｌｏｖｅｒ）ｍ（１９８５）ディ・エヌ・エイ・クローニング（ＤＮＡ　Ｃｏｎ ｉｎｇ）、■巻を含み、それらずてをここに参照のために挙げる。
ｚ旌■ユＣＭ　ＣＲＮ　Ａ　ノ単離 ロフトら（Ｌｏｔ　ｅｔ　ａｌ）　（アナルズ・オブ・フィトパソロジ−（Ａｎ −ｎａｌｓ　ｏｆ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ））４　：　２５．１９７２ ）の方法に従い、タバコ植物体中でキュウリモザイクウィルス株Ｃ（ＣＭＶ−Ｃ ）　ヲ４１１オリゴｄＴプライマーのアニーリング用の部位を供するために全Ｃ ＭＶ−ＣＲＮＡをポリアデニル化した。反応緩衝液は＝５μＱ１１ＭトリスｐＨ ７，９：　１μＱ　−ＩＭ　ＭｇＣＱ　ｔ：　２．５μＱ、０．１Ｍ　ＭｎＣＱ ｖ：５μＱＮａＣ（１：０．５μ（１，１００ｍλ１ＡＴＰ　；　１８ｕＱ　、 ２．８ｍｇ／ｍｃ　ウ’ｙ血清アルブミンテアツタ。
この緩衝液３．２μｇをＣＭＶ−Ｃ全ＲＮＡ２μｇと混合した。水３．８μＣお よびポリーＡポリメラーゼ１μｇを添加し、反応混合物を３７℃で１０分間イン キュベートした。
ＮａＣｌ２５０ｍＭの代わりに０．７５ｍＭ　ＫＣＱを用い、１０〜５０ｔｔＣ ｉ／　１００Ｊ、ｔｆ２　ｆ）代わｔ）に１３０μｃｉ／１００μＣ”Ｐ−ｄＣ ＴＰを用いる以外はボリテスおよびマロッティ（Ｐｏｌｉｔｅｓａｎｄ　Ｍａｒ ｏｔｔｉ）　（バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）４　：　３ １４．１９８６）のｃＤＮＡＱ成プロトコルにより、得られたポリアデニル化Ｒ ＮＡを用いた。
ｄｓ−ｃＤＮＡを合成した後、Ｇ−１００カラムクロマトグラフイーによって精 製し、エタノールで沈殿させ、ＩＸ　ＥｃｏＲＩメチラーゼ＠衝ｉ（！（１００ ｎＭ　ＮａＣ（！　、１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ２　ｐＨ８，０，１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、、８０μＭ　Ｓ−７デノシルメチオニン、１００μｇ／ｍＱウシ血清ア ルブミン）２０μｇに懸濁した。引き続いてのデル分析のために２μＱ分を取り 出した後、反応混合物ミックスに３２ｍＭ　Ｓ−アゾ／シルメチオニンをさらに １μＱ１およびＲｃｏＲＩメチラーゼ１μＣ（２０単位）を添加した。反応物を ３７°Ｃで３０分間インキュベートし、７０℃での１０分間のインキベーション によって反応を停止した。
前記反応物から２μＱを取り出し、イー・コ１バＥ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメ ラーゼＩクレノー断片１μＱ　（５単位）を添加した。反応物を３７°Ｃで１０ 分間インキュベートし、次いで、フェノール／クロホルムで抽出した後エタノー ルで沈殿させた。ベレットを７０％エタノール、次いで７０％エタノール１０． ３Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄した。
該ペレットを乾燥し、（フルラボラテイブ・リサーチ・インコーホレイテッド（ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、）、スプリング・ス トリート（Ｓｐｒｉｎｇ　５ｔｒｅｅｔ）　１２８番地、レキシントン、マキチ ニーセソツ州０２１７３から入手可能な）０．５μｇ／μＱリン酸化Ｅｃ。
Ｒ１リンカ−８μＱに再懸濁した。リガーゼ緩衝液（８００ｍＭトリス−ＨＣｇ 、ｐＨ８，０，２０ＱｍＭ　Ｍｇ　ＣＯｔ、１５ＱｍＭＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴ Ｐ）　１ｕＱを１０回およびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（４単位／μｍ２）１μＱを 添加し、反応物を１５℃で一晩インキユベートした。
次いで、結ぶ反応を６５°Ｃ，１０分間のインキユベーションによって停止した 。水６０ａＱ、ＥｃｏＲＩ塩（９００ｍＭ　トリス、ｐＨ８，０，１００ｍＭ　 ＭｇＣｌ２１．１００ｍＭ　ＮａＣＱ）１０μｎｏ回、およびＥｃｏＲＩ　（１ ０単位／μＱ）１０μＱを添加し、反応物を３７℃で１時間インキュベートした （続いてのゲル分析のために５μＱ分を最初に取り出した）。フェノール／クロ ロホルムによって反応を停止し、クロロホルム抽出した。ゲル分析のために５μ Ｑ分を取り出し、残りの半分を後の使用のために冷凍した。
他の半分をＧ−１００カラムクロマトグラフイーによって精製した。
ｃＤＮＡを含有するＧ−１００画分をブタノール抽出によって濃縮し、エタノー ルで沈殿させ、水１０μＱに再懸濁した。引き続いての分析用に３μＱを取り出 した後、（ストラタジーン・カンパニー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏ、）、タ ンティ”ストリート（Ｔａｎｄｙ　Ｓｔ、）３７７０番地、サンジエゴ、カリフ ｔルニア州９２１２１より入手可能な）ラムダｇｔ＋ｉアーム１μに、リガーゼ 緩衝液１μｍ２１０回、およびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ１μＱを添加し、反応 物を１５°Ｃで一晩インキユベートした。
パッケージング−エキストラクト（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔ）　’ −ジガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）の外にストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）からも入手可能］の製造業者によって推奨される方法に従い、結び得られた ラムダｇ　ｔ　ｌ　ｌ／ｃＤＮＡ分子をパッケージングした。これにより、組換 体ラムダファージを得、これを当業者に公知の方法に従って平板培養した。
（ディ・ゴンサルベス（Ｄ、　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ）博士、イーネル大学、ジェ ニμ（Ｇｅｎｅｖａ）、ニューヨークから入手した）ＣＭＶのホワイトリーフ（ ｗｂｉｔｅｌｅａｆ）株の精製したＲ　Ｎ　Ａ　４からの放射性同位元素標識一 本漬ｃＤＮＡでのハイブリダイゼーションによって、外皮蛋白遺伝子を含有する ラムダクローンを同定した。このＲＮＡ４一本漬ｃＤＮＡは以下のごとくに合成 した：ＲＮＡ４　５．８μｇを用いた以外は全ＣＭＶ−ＣＲ，ＮＡについて前記 したごとくにＲＮＡ４分子をポリアデニル化した。第一の鎖合成は、非放射性ｄ ＣＴＰが包含されていないことを除き、ポリテスおよびマロノティ（Ｐｏｔｉｔ ｅｓ　ａｎｃｌＭａｒｏｔｔｉ）　（バイオテクニンクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ）４　：　５１４．１９８６）の記載によった。代わりに、２６０μＣ ｉ／１００μｇ放射性ｄＣＴＰを用いた。
Ｐ６カラムクロマトグラフイーによって標識一本１１ｃＤＮＡを精製し、それを 用いて前記ラムダファージ平板から取り上げた複製フィルターをプローブした。
該一本漬ｃ　Ｄ　ＮＡはい（つかのファージクローンからのＤＮＡとハイブリダ イズし、これはそれらが少なくともＣＭ　Ｖ　−Ｃ外皮蛋白遺伝子の一部を含有 することを示した。これらのラムダクローンのいくつかを増殖させ、それらから のＤＮＡを当業者に公知の方法に従って単離した。
襟章的な方法を用い、前記実施例に記載したクローン化ｃ　ＤＮＡのいくつかを （ベセスダ・リサーチ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、私書箱６００ ９号、ガイセルスブルグ、メリーランド州３２０８７７から入手可能な）プラス ミドベクターｐＵｃ１９に移した。次いで、マキサムおよびギルバート（Ｍａｘ ａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）　［酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　６５　：　４９９．１９８０コによって記載され ている技術によって、ｐＵｃ１９中のクローン化断片の配列決定を行った。この 情報に基づいて、１のクローンは全外皮蛋白遺伝子を含有するものとして同定さ れた。このクローン（ｐ　ＣＭＶ９．９と命名）の配列をチャー１・１に示す。
ＣａＭＶ　３５ＳプロモーターおよびボリアデニシーシＳンシグナルを結合させ るために、（３１１位の）　Ａｃ　ｃ　１部位から（１４２１位の）ＥｃｏＲ１ 部位に伸びる断片をｐ　ＣＭ　Ｖ　９　、９から取り出し、　（トーツス・ホー ン（Ｔｈｏｍａｓ　Ｈｏｈｎ）、フリードリノヒ・ミーシャー・インスティテユ ート（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ　Ｍｉｅｓｅｈｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、私書箱 ２５４３番、ＣＨ−４００２、ベイセル（Ｂａｓｅｌ）、スイス国から入手可能 な）ベクターｐＤＨ５１（ビニトルザックら（Ｐｉｅｔｒｚａｋｅｔ　ａｌ）、 １９８６）の多重クローニング部位に結んだ。これは、ｐ　ＣＭＶ　９．９　ヲ Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ１完全？Ｆｌ化オヨヒＡ　ｃ　ｃ　Ｉ部分消化シ、（イー・コリ ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて）適当なＡｃ　ｃ　１−Ｅｃ　ｏ ＲＩ断片から平滑末端分子を生成させ、それをｐＤＨ５１のＳｍａ　１部位に結 ぶことによって達成される（チャート２）。マキサム−ギルバート技術によって ｐＤＨ５１／ＣＰ１９と命名したこのクローンの配列決定を行い、植物体での発 現についてその適当性を確認した。
次いで、植物体発現可能外皮蛋白遺伝子をアグロバクテリウム−媒介遺伝子移入 に適したベクターに移した。ＥｃｏＲＩ−Ｅｃ。
Ｒ１断片をｐＤＨ５１／ＣＰ１９かろ取り比し、（ロバート・カイ（Ｒｏｂｅｒ ｔ　Ｗａｙ）、ワシントン州、プルマン（Ｆ’ｕｌ１ｍａｎ）、ワシントン州立 大学、化学部門から入手可能な）プラスミドｐＵｃ１８１３のＥｃｏＲＩ部位に 入れ、プラスミドｐＵＣ１８１３／ＣＰ　１９を得た。部分的Ｈｉ　ｎ　ｄ　３ 消化によって植物体発現可能遺伝子を含有する１、Ｂｋｂ断片を取り出し、（ギ ネフング・アン（Ｇｙｎｅｈｕｎｇ　Ａｎ）、インスティチュート・オブ・バイ オロジカル・ケミストリー（ｌｎｓｔｉ−ｔｕｔ、ｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ワシントン州立大学から入手可能な）ベクターｐ ＧＡ４８２　（アンら（Ａｎ、　ｅｔ　ａｌ）、１９８５）のＨ４ｎｃ１３部位 に結んだ。
得られたプラスミドをｐＧＡ４８２／ＣＰ１９Ｈ（チャート３）と命名した。次 いで、遺伝子を含有するｐＵｃ１８１３クローンから部分的ＢａｍＨＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片を取り出し、それをｐＧＡ４８２／ＣＰ１９のＢｇｌＩｔ部位に挿入す ることによって、（クローンチク・ラボラトリーズ・インゴーポレイテ・ノド（ Ｃ１ｏｎｅｔ、ｅｃｈ　Ｌａｂｏｒ−ａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、カリフォル ニア州、パロ・アルド（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）、ファビアン・ウェイ（Ｆａｂｉ ａｎ　Ｗａｙ）　４０５５から入手可能な）グルクロニダーゼについての植物体 発現可能遺伝子をｐＧＡ４８２／ＣＰ１９Ｈに付加した。この最終構築体をＰＧ Ａ４８２／ＣＰ　１９／ＧＵＳ（チャート３）と命名し、マキサム−ギルバート 配列決定法によって確認した。
このプラスミドまたはその誘導体は、アグロバクテリウム株Ａ２０８、Ｃ５８、 ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ７０７、Ａ４Ｒ８，Ａ４Ｒ３（ｐＲｉ　２７８ｂ）そ の他に移入できる。株Ａ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、およびＡ４Ｒ３１＊ ＡＴＣＣ，パーりａ−７（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　１２３０１、ロッ クビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州から入手可能である。Ａ４Ｒ５ （ｐＲｉ２７８ｂ）はエフ・カセーデルバール（Ｆ、　Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａ ｒｔ）博士、フランス国、ベルサイユ、Ｆ７８０００、ルデド？’セー・シル（ Ｒｏｕｔｅｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｃｙｒ）、Ｃ，Ｎ、　Ｒ，Ａ、から入手可能であ る。Ｃ５８２７０７はエイ・シイ・ヘブバーン（Ａ、　Ｇ、　）［ｅｐｂｕｒｎ ）、イｌノ／イ大学、ウルバナ（Ｕｒｂａｎａ）、イリノイ州から入手可能であ る。
実施例５　ファゼオリン・ポリアゾニレ−ジョンシグナルを用いての植物体発現 可能Ｃ＼４Ｖ外皮蛋白遺伝子を含有するｐＤＨ５１／ＣＰ　１９からＡｖｒＩ［ −Ｘｂａ断片を取り出すことによって、３５Ｓポリアゾニレ−ジョンシグナルを ファゼオリンのそれと置き換えた。この消化により、外皮蛋白クローンの３′末 端、人工的に導入したＡ−残基のストレッチ、およびｐＤＨ５１ポリリンカーの 一部を包含するＤＮＡ領域を取り出した（しかしながら、ＣＭＶ外皮蛋白コーデ ィング領域は無傷で残る）。ファゼオリンボリアデニシーションシグナルを含有 するｐＵｃ１８１３クローンからのＸｂａ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉ断片を用いてＡｖｒ 　ＩＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片を置き換えた。次いで、ＥｃｏＲＩでの消化によってこ の構築体を取り已し、ｐＵｃ１８１３のＥｃｏＲ１部位にクローン化した。次い で、このｐｕｃ　１８１３クローンをＸｂａｌでｉ南北し、３５Ｓプロモーター 、外皮蛋白コーディング領域、およびファゼオリンボリアデニシーションシグナ ルよりなる断片をｐＧＡ４８２のＸｂａ　Ｉ部位に結んだ。次いで、グルクロニ ダーゼ遺伝子を前記したごとくに付加してプラスミドｐＧＡ４８２／ＣＰ　１９ Ａ　−／４１１ＣＵＳ　（チャート４）を得た。該プラスミドの構造をマキサム −ギルバート法によって確認した。
ｐＵｃ１８１３（前記参照）からのファゼオリンポリアデニシーションシグナル をｐＤＨ５１／ＣＰ１９のＸｂａ１部位に入れることによって、（Ａ−残基のス トレッチが発現に対して与える影響をテストするために設計した）別のプラトミ ドを構築した。次いで、３５Ｓ７’ロモーター、外皮蛋白コーディング配列、お よびファゼオリンおよび３５Ｓボリアデニレーシ１ンシグナルを含有する断片を 、ＥｃｏＲ１消化によってｐＤＨ５１／ＣＰ１９−から取り出し、ｐＵＣ１８１ ３に結んだ。次いで、３５Ｓプロモーター、（人工的に合成した八−残基のスト レッチを包含する）外皮蛋白コーディング配列、およびファゼオリンポリアデニ シーションシグナルを含有する断片を部分的Ｘｂａｌ消化によってそのプラスミ ドから取り出し、ｐＧＡ４８２のＸｂａ−１部位に結んだ。グルクロニダーゼ遺 伝子を引き続いて前記のごとくに挿入した。得ろれたプラスミドをｐＧＡ４８２ ／ＣＰ１９／４１１／ＧＵＳ　（チャート５）と命名し、マキサム−ギルバート 配列決定法によって構造を確認した。
これらのプラスミドまたはそれらの誘導体はアグロバクテリウム株Ａ２０８、Ｃ ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ７０７、Ａ４Ｒ３、Ａ４Ｒ５（ｐＲｉ２４８ｂ ）その他に移入し、「発芽植物種子のアグロバクテリウム媒介形質転換（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍｅｄｆａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓ−ｆｏｒ＋＋＋ａｔｉｏ ｎ　ｏｒ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｐｌａｎｔ　５ｅｅｄｓ）Ｊと標題された １９８７年１２月２１日出願の米国特許出願１３５６５５号の実施例４およびチ ャート３に記載された方法によってＣＭＶ−Ｃ外皮蛋白遺伝子を植物体に挿入す るのに利用する。実施例およびチャートを証拠Ａとして付は加える。
証拠人 実施例３ 本実施例の目的は高パーセンテージの含硫黄アミノ酸をフード付けする修飾種子 貯蔵蛋白を取り込むことにある；かかる遺伝子を高硫黄貯蔵蛋白（ＨＳＳＰ）− 遺伝子という。この遺伝子を、発育に際し双子葉植物の種子で発現されるように 構築する；これは該ツヤゼオリンプロモーターを用いることによって達成された 。該修飾遺伝子はかなりの数の含硫黄アミノ酸をコード付けするにちがいない。
天然に生じるＨＳＳＰ−遺伝子も用いることができる。２種の最良の天然に生じ るＨ８５Ｐ−遺伝子はベータゼイン遺伝子（１５ｋＤ）［ベダーセンら（Ｐｅｄ ｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）、（１９８６）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２０１：６２７９］および ブラジルナツト蛋白ロアルチンバッハら（Ａｌｔｅｎｂａｃｈｅｔ　ａｔ）（１ ９８７）、ブラント・モレキユラー・バイオロジー（ＰｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉ ｏ、）８　：　２３９：である。しかしながら、ＨＳＳＰ−遺伝子のいずれの他 の天然また：ま合成遺伝子誘導体も種子の栄養価値の改良に用いることができる 。
証拠Ａ チャート４ と−一一一一」・ 脈　植物体　突然変異体　植物体　。
４８、　プロモーター　人ＬＳまたはＥＰＳＰＳ遺伝子　ポリ（Ａ）または他の 除草剤耐性 または解毒遺伝子 チャート５ 、Ｒａ物体　バチ５Ｘまたは　植物体ＢＲ２ら墾１１−一−［］−り、　・　プ °“−′−害虫に°い、、＝　ｏ　、　ｆ　１５５０−一一−ｆ二＝１ほかの毒 性遺伝子 チャート１ キュウ、ノ、ザイクウィルスＣ外皮、配列長さ：　１４２６１９８７年ｌＯ月２ ０日１２時２６分　チェック：　６４７３１ｅＡＡＴＴ（（（ＣＣ（Ｃ（Ａ＾了 ｃｃｃｃａｃｖｉｃｎｃｃｃ（ＣＴ（ＣＣＣ（Ｔ（（ＣＡＡＣＣ（ＴＴＣＧｌ　 ＡＣＡ（（ＣＣＡＣＣＴＣＣＴ７＾＾（ＣＣＴ（ＴＴＴＡＣＴ（Ａ　（Ｔ丁ＴＣ Ｃ７Ｃ（ＣＴＡＴ１＾ＣＴ人了＾１・Ｉ　Ｔ入＾ＱＴ＾丁丁ＴＣ’ＩＣＡＣＴ（ ＴＣＴＡ　ＣＡＴＡ＾ＴＡＣ丁人　Ｔ入子ＣＴＡＴＡＣＡ　ＣＴ（ＣＴＣＴＣＴ Ｃ１＄１ＡＣＴＴＣＡＴＡ（ＡＣｌＡＣＡ（ＡＴＣ７Ｇ？＋ＪＣＣＣＣＡＴＣ（ ＣＣＴＣＴＴＣＡＣｕＣＣＣ＾ＴＣ＾２Φｌ　Ｃａ＋Ｃｔｃｃ＋＋ｔ　ｔ＾ＣＴ ＡＡＣ（（Ｉ　ＡＣＡｔ（ＡＴＡＣＴ　ＴＨＯ＾ＯＣ’ｌＴＣＡＡＩＴＣ（Ｔ（ ＴＴ２ＧＬ　Ａｃｔ（Ｃ（ＴＣＴＴ　ＣＡＣＴＡ（ＣＴ７Ａ　ＣＴ丁ｔｃＴｃＡ １ｃ　ＣＡ？！ＴＴＣＴ（ＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴ３８２　ＣＴ（ＣＴＴＡＴＴｅ 　Ｔ（ＴＡＣＴｅＡ（Ｔ　ＡＴＡＴＡＣＡＣＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣζτ　ＣＴＣ ＴＴＴＴ（Ｔｅ−４６１ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴ　ＡＡ（（ＡＴ（ＨＡζｃＴｃｃ ｔｃｃｃｅｃ　ｖｃｃｔｃｃｖｙｃｅ　ｃｃｃτｃｃｃｃｃｃＪＧ１　（（Ｔ（ （Ｔ（（Ｃ（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴ（Ｙ　ＴＣＴ（Ｃ（ＡＣ（ Ａ　ｅ（ＴＴＴＣＣＣｅ＆≦−１ＣＴＴＡＡＴ人＾ＣＡＣＣＴフＡＣＣＡＣ（Ｔ ｅｅＴＣＣＴＣ（ＡＡ（ＴＡＴＴＡＡＣＣＡ（（（ＡＡ（ＣＴＴＧＧＩ　ＴＯτ ＡＣＯＣ＾ｅＴ　ｅｚＡ（Ｃ（ＴＣＴＡ　Ｃ＾ＣＣ？Ａ（ｉｃＴＡ　（＾（ＣＴ ＴＣＡ（Ａ　Ｔ（１＾ＴＴ＾ζＣＣ６・１　？Ａ＾＾ｃｃｃＡｃζ　＾＾入＾＾ ＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣｌＣＴＴ　ＡＴＴＡ（ＣＯＴ＾＾　＾＾ＣＣＴＴＣｉＴ ＴＡ８６１　（１＾（（フＣ＾Ｔ？（＾ＣＴＣＡＣＣＣ人　＾ＴＡＴＣＡＴ＾＾ Ｃ＾＾ＣＣＴＴＣＴＴｒ　ＣＣ（Ｃ（ＡＴＴＣ＾７＠ｍ　ＡＡｔＴ（ＣＡＣＴＴ 　ＡＡｌ（（ＴＴＴＣ（ＣＣ＾ＡＡＴＴＴＩＩＪ　？ＴＣＴＡ（ＣＣＴＣＴＣＣ ＣＴ（ｉＡｃＡｃ′ｌＨＴ（ＣｃＴＡ人ＡＣＴ　Ｔ（ＣＴＣ（（Ｔ（ｅ　ＴＣＣ Ｃ＾（ＴＴＡＴ　（（ＣＴｖｃｃｃｃｃ　（Ａ’Ｉ（τｃｖｃｃｙａｍｌＡｙｃ ｒｔｃｃｃｃｃ＾（ＣＪｕＱ（（７ζ＾Ｃ（ＣＣＴＡＣＴＣＣＩＴＴＡＴＣ＾Ｃ Ｔ＾ｔｃｃｃｃｃ＾丁Ｃｌ１ｌ　！ＧＣＡＣＴＣＣ＆Ａ　ＣＪ：Ｃ入＾ＣＡＡζ ＾　＾＾（ＴＣＴＴＣＴＹ　ＴＣ，ＡＴ（了ＴＴＣＣＣＣＣＡＴｅＣＣ（０９６ １（ＴＣＡＴ＾τＡＣＣ１０ＡＣＡＴＣＡＣ＾＾＾ＣＴ＾（Ｃ（ＣＣｔｃｃｖｃ ｃｔｃ了＾Ｔτ（入＾＾＾０＾Ｃ９１ζ＾ＴＣ（Ｃ（Ｔ（１：　ＡＣＡ（ｅｃＡ ＣＣＡ　ＣＣＴＡＣＴＡＣＴＴ　（＾τＣＴＴＣＡＣ＾　フＣＣＡＣ（Ａ（ＣＡ １１１１８１　ＡＣＣＣＡＴＴ（Ｃ（ＡＣＡＴＣＴＣＧＡＣＴＣＣＴ（（ＣＡＣ Ｔ　（ＴｃＡＴＴ（（ＣＴ　（：τＴζＣ（＾ＣＡＡＩＪＧ４（ζ〔Ｔζ（ＣＴ （（ＣＡＴ（ＴＣＴＣＴＣＣ（ＣＣｉＣＡＣ（ＴＣＡＣ丁ＴＣＣＣＡＣ”１Ｔ（ Ｙ＾〔Ｔ＾（ＡＡｍ１ＪＩ　Ａ（ＴＣＴ（ｔｃｃＡ　ＣＴ（ＡζＴＡ、ＬＡＣＣ ＴＴＴＴＡＣＣＣＴ　ＣＡＡ（ＣｅＣＴＴＣＴＣＣＡＴ（ＣＡＣＣ１１１１ｎ＾ ｃｃｃｃｖ＾＾＾ＡＴＣ４Ｔ（ＡＣＴｃｃｙｃｃＡｃＡＡＡＴ（ＣＡＣＣＣ（＾ ＣＣ＾ＣＡτ７ＴＡＣ＾Ｈ１ｅｌ　ム＾１（Ｔ（τＣＡＣＣ（Ｃ（（Ｔ１１ＣＡ 　ＡＡＣ（ＡＴＣＴＣζ　ＴＡＣＣＴＴＴＣＴＴ　（ＣｃＡＡＣＣＣ；ＣＴ１２ Ｇ１　ｆｆｃｃｃＴ（（ＣＴＣｆｆ１ｉ（（マ（ＴＡＣ（Ｃ（＾ｐＨ〔ｃＩＧＣ ｌ　＾ｃｔｏｃ＾ＣＣＣＴ＾ＣＣＣＧＴＣ（Ｃ１３１１ｃ（ｃｃｃ＾ｃｙｔｔ　 ｃｃｔｃｃｃｃｃｃｃ　ｔζ（ＡＡＡＡ（：ＣＡ　ｃＡＣＣｋＡｋ入ＪＪ　ＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡ１３＄１　ｕＡ＾＾＾＾＾ＡＡＡ＾＾入＾＾＾ＡＡＡ　＾＾Ａ ＡＡＡ＾＾＾＾　Ａム＾＾＾＾＾＾Ａ＾　入Ａｔ＾＾入友人＾＾１４侵１　人人 へ人人人人＾Ａ＾　人人人入人＾＾入＾＾　ｃ、ＡＡＴ　Ｔ　Ｃチャート２ Ｃａ）Ｎ　３５５ プロモーター チャート３ ポリー八　シグナル チャート４ Ｃ頌３５５ポリ−Ａシグナル 団＝＝３男可 チャート５ ２Ｇｒへ４８２／ＣＰ１９／４１１／ＧＵＳの構蘂プロそ一ター　残基 補正音の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年５月２１日

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. １．チャート１に示した配列を有するキュウリモザイクウイルスのＣ株からの外 皮蛋白遺伝子。
  2. ２．請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウイルスの ３５Ｓプロモーターおよびカリフラワーモザイク３５Ｓ遺伝子またはファゼオラ ス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）種子貯蔵遺伝子いずれ かのポリアデニレーションシグナルよりなる植物体形質転換ベクター。
  3. ３．請求の範囲第１項記載の植物体形質転換ベクターを含有する細菌細胞。
  4. ４．ＣＭＶ−Ｃからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプ ロモーターおよびカリフラワーモザイクウイルス遺伝子またはファゼオラス・ブ ルガリス種子貯蔵蛋白遺伝子いずれかのポリアデニレーションシグナルを含有す る形質転換植物体細胞。
  5. ５．請求の範囲第４項記載の形質転換細胞よりなるウリ科またはナス科から選択 される植物体。
  6. ６．請求の範囲第５項記載のウリ科植物体。
  7. ７．請求の範囲第５項記載のナス科植物体。
  8. ８．請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するウリ科植物体を増殖させ ることを特徴とするウイルス耐性ウリ科植物体の生産方法。
  9. ９．請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するナス科植物体を増殖させ ることを特徴とするウイルス耐性ナス科植物体の生産方法。
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