JPS6156077A - 高安定性酵母ベクタ−、酵母形質転換体および外来性蛋白もしくはペプチドの生産方法 - Google Patents
高安定性酵母ベクタ−、酵母形質転換体および外来性蛋白もしくはペプチドの生産方法Info
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- JPS6156077A JPS6156077A JP59157037A JP15703784A JPS6156077A JP S6156077 A JPS6156077 A JP S6156077A JP 59157037 A JP59157037 A JP 59157037A JP 15703784 A JP15703784 A JP 15703784A JP S6156077 A JPS6156077 A JP S6156077A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、酵母、特にサツカロマイセス属酵母を宿主と
して有益な外来物質を生産する場合に有用な、高安定性
プラスミドベクターおよびその利用に関する。
して有益な外来物質を生産する場合に有用な、高安定性
プラスミドベクターおよびその利用に関する。
従来技術
１９７７年にＩｔａｋｕｒｃらがペプチドホルモンの１
つソマトスフチンの大腸菌での産生に成功ＣＩｔａｋｕ
ｒａ ら、５ｃｉｅｎＣｅ １９８ ： １０５６〜
１０６３．１９７７）して以来、組↓々えＤ Ｎ 、ｌ
ｌ ；、、に術を用いて有用な生理活性物質ｆ微生物に
生Ｃξさぜようとする多くの試みがなされて、へる。竹
に、大腸Ｍを宿主微生物とした有用な物質の生産に関す
る研究がこれまで多く報告されているが、近年、枯革菌
、放線菌や酵母菌などのような犬ｌ１５１１菌以外の微
生物も、宿主微生物として注目されてきている。その中
でも酵母、特にサツカロマイセスに属する酵母は、培養
が容易な真核生物であること、大腸菌、枯軍菌、放線菌
にはみられないより高等生物に近い生物学的機能をもち
且つ安全性が高゛ハなどの特徴をもつことから、外来蛋
白（又は外来ペプチド）生産用宿主微生物の１つとして
注目され、これまでαネオエンドルフィン（轡開昭５８
−１４６２８１滲照）、インターフェロン（Ｈｉ ｔ
ｚ ｇｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ２９２ ： ７１７〜７
２２．１９８２およびＨｉ ｔ ｚ ｅｍａｎら、５ｃ
ｉｅｎｃｅ ２１９ ：６２０〜６２５．１９８３）−
セ肝炎ウィルス表面抗原蛋白（ＶｃＬｌｇｎｚｒｂｌａ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８ ： ３４７〜３５０．１９
８２およびＭｉｙａｎｏんａ ｒ ｂ ＋ Ａ 、ら、
Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｔ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳ Ｉ
Ｌ！ＩＬ： １〜５１９８３）などの生産の例がみら
れる。しかし、酵母における有用な外来蛋白の生産に、
関する例は、まだ大腸菌の場合に比べ少なく、また実用
に充分に供しうるような宿主−ベクター系を開発するに
は、多くの解決されなければならない問題が残されてい
る。
つソマトスフチンの大腸菌での産生に成功ＣＩｔａｋｕ
ｒａ ら、５ｃｉｅｎＣｅ １９８ ： １０５６〜
１０６３．１９７７）して以来、組↓々えＤ Ｎ 、ｌ
ｌ ；、、に術を用いて有用な生理活性物質ｆ微生物に
生Ｃξさぜようとする多くの試みがなされて、へる。竹
に、大腸Ｍを宿主微生物とした有用な物質の生産に関す
る研究がこれまで多く報告されているが、近年、枯革菌
、放線菌や酵母菌などのような犬ｌ１５１１菌以外の微
生物も、宿主微生物として注目されてきている。その中
でも酵母、特にサツカロマイセスに属する酵母は、培養
が容易な真核生物であること、大腸菌、枯軍菌、放線菌
にはみられないより高等生物に近い生物学的機能をもち
且つ安全性が高゛ハなどの特徴をもつことから、外来蛋
白（又は外来ペプチド）生産用宿主微生物の１つとして
注目され、これまでαネオエンドルフィン（轡開昭５８
−１４６２８１滲照）、インターフェロン（Ｈｉ ｔ
ｚ ｇｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ２９２ ： ７１７〜７
２２．１９８２およびＨｉ ｔ ｚ ｅｍａｎら、５ｃ
ｉｅｎｃｅ ２１９ ：６２０〜６２５．１９８３）−
セ肝炎ウィルス表面抗原蛋白（ＶｃＬｌｇｎｚｒｂｌａ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８ ： ３４７〜３５０．１９
８２およびＭｉｙａｎｏんａ ｒ ｂ ＋ Ａ 、ら、
Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｔ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳ Ｉ
Ｌ！ＩＬ： １〜５１９８３）などの生産の例がみら
れる。しかし、酵母における有用な外来蛋白の生産に、
関する例は、まだ大腸菌の場合に比べ少なく、また実用
に充分に供しうるような宿主−ベクター系を開発するに
は、多くの解決されなければならない問題が残されてい
る。
組換えＤＮＡ技術を用いて、ある種の微生物が本来は生
産しえない蛋白又はペプチドをその微生物に効率的につ
くらせるには、種々の要素が必要である。例えば、発現
用プラスミドベクターに関していえば、目的とする外来
の蛋白又はペプチドをコード、する遺伝子からのｍ Ｒ
Ｎ Ａへの転写を促進するプロモーターを含む５′非翻
訳領域や該ｍ ＲＮ Ａから蛋白又はペプチドへの翻訳
の効率化ＩｃＪ与する領域などの存在も、目的とする外
来蛋白又はペプチドの生産には重要な要素ではあるが、
該プラスミドベクターの宿主細胞内での安定性やコピー
数の保持が目的物質の生産効率に大きく影響することを
忘れてはならない。
産しえない蛋白又はペプチドをその微生物に効率的につ
くらせるには、種々の要素が必要である。例えば、発現
用プラスミドベクターに関していえば、目的とする外来
の蛋白又はペプチドをコード、する遺伝子からのｍ Ｒ
Ｎ Ａへの転写を促進するプロモーターを含む５′非翻
訳領域や該ｍ ＲＮ Ａから蛋白又はペプチドへの翻訳
の効率化ＩｃＪ与する領域などの存在も、目的とする外
来蛋白又はペプチドの生産には重要な要素ではあるが、
該プラスミドベクターの宿主細胞内での安定性やコピー
数の保持が目的物質の生産効率に大きく影響することを
忘れてはならない。
これまでサツカロマイセス３母（以下ｉ１ ｍ ト略す
）のプラスミドベクターとしては、主として、酵母のｃ
Ｌｒ ８ （ＧＩＬＬＯｎＯ’ｒｒＬＯｕ８ τ６７）
ｌ ＺＣα１＄？Ｌ９３ｅｑ−１ＬｅｒＬＣ６）−また
は２μｍＤＮＡＣ複製開始領域を・言み、適当な栄養要
求性に関する遺伝子、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＴＲ
Ｐｌ、Ｕ Ｉ＜ Ａ ３などを選択マーカーとして付し
たプラスミドが用いられている。しかし、それらのプラ
スミドは、宿主細胞内で必ずしも高いコピー数を安定に
保持でき、ｂとは限らず、従って該ベタターを有する宿
主細胞を有用特質生産株として大量培養に用いるには不
安があった。又、２μｍＤＮＡＣ復製開始点を含むベク
ターは比較的安定で高いコピー数を持つが、その安定的
複製には細胞内に２μｍ Ｄ ／’ｉ’ ／ｌか存在す
ることが必要である。すなわち、ｃｚｒ 宿主酵母を
使用することが必要である。しかしながら、ａｉｒ”宿
主酵母では該ベクターに、２ ｐ ｍ Ｄ Ｎ 、−１
との間で組換えが起り、該ベクターが変化する恐れもあ
るという欠点をもつ。
）のプラスミドベクターとしては、主として、酵母のｃ
Ｌｒ ８ （ＧＩＬＬＯｎＯ’ｒｒＬＯｕ８ τ６７）
ｌ ＺＣα１＄？Ｌ９３ｅｑ−１ＬｅｒＬＣ６）−また
は２μｍＤＮＡＣ複製開始領域を・言み、適当な栄養要
求性に関する遺伝子、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＴＲ
Ｐｌ、Ｕ Ｉ＜ Ａ ３などを選択マーカーとして付し
たプラスミドが用いられている。しかし、それらのプラ
スミドは、宿主細胞内で必ずしも高いコピー数を安定に
保持でき、ｂとは限らず、従って該ベタターを有する宿
主細胞を有用特質生産株として大量培養に用いるには不
安があった。又、２μｍＤＮＡＣ復製開始点を含むベク
ターは比較的安定で高いコピー数を持つが、その安定的
複製には細胞内に２μｍ Ｄ ／’ｉ’ ／ｌか存在す
ることが必要である。すなわち、ｃｚｒ 宿主酵母を
使用することが必要である。しかしながら、ａｉｒ”宿
主酵母では該ベクターに、２ ｐ ｍ Ｄ Ｎ 、−１
との間で組換えが起り、該ベクターが変化する恐れもあ
るという欠点をもつ。
本発明者らは、これらの点ｆ：改良すべく鎖意研死の結
果ｃｉｒ０の酵母宿主に形質転換して得た形質転換体の
大量培養や連続培養においても高いコピー数を保ち安定
に複製するプラスミドベクターを作製し、また具体的に
該ベクターを利用して有用な蛋白またはペプチドを効率
よく生産しうろことを見出し本発明を完成するに至った
。以下、本発明について詳しく説明する。
果ｃｉｒ０の酵母宿主に形質転換して得た形質転換体の
大量培養や連続培養においても高いコピー数を保ち安定
に複製するプラスミドベクターを作製し、また具体的に
該ベクターを利用して有用な蛋白またはペプチドを効率
よく生産しうろことを見出し本発明を完成するに至った
。以下、本発明について詳しく説明する。
発明の構成
りｅｇｇｓにより作製されたプラスミドｐＪＤＢ２１９
は、酵母の２μｍ Ｄ Ｎ 、４配列と大腸菌プラスミ
ド（ｐＭＢ９＞のＤＮＡ配列および選択マーカーとして
の酵母のＬＥＵ２遺伝子をもつ大腸菌−酵母シャトルベ
クターであり、２μｍ Ｄ Ｎ Ａを有する宿主酵母（
以下ａｉｒ＋と略す）および２μｍＤＮＡを欠失した宿
主酵母（以下ａｉｒ０と略す）で比較的安定に保持され
る（ ＥｅＱｙＳ＋ Ｊ、Ｄ、ＮａＬｕｒｌ１２７５：
１０４．１・９７８）。また、このｐ ＪＤＢ２１９を
制限酵素ｇｉｎｄ ＩＩＩ分解により得られる３、３ｋ
ｂ のＤ ７Ｖ Ａ断片は、２μｍＤＮＡＣ精製に必要
な領域とＬＥＵ２遺伝子を含んでおり（大腸菌由来のＤ
＃ ／ｌ配列は苫１れていない）、そのＤ Ｎ ｌｌ
断片１ｂ独で酵母細胞内て充分安定に保４．゛ｔされう
ることか報告されている（ Ｔｏん−ｅ＋Ａ−らＪ。
は、酵母の２μｍ Ｄ Ｎ 、４配列と大腸菌プラスミ
ド（ｐＭＢ９＞のＤＮＡ配列および選択マーカーとして
の酵母のＬＥＵ２遺伝子をもつ大腸菌−酵母シャトルベ
クターであり、２μｍ Ｄ Ｎ Ａを有する宿主酵母（
以下ａｉｒ＋と略す）および２μｍＤＮＡを欠失した宿
主酵母（以下ａｉｒ０と略す）で比較的安定に保持され
る（ ＥｅＱｙＳ＋ Ｊ、Ｄ、ＮａＬｕｒｌ１２７５：
１０４．１・９７８）。また、このｐ ＪＤＢ２１９を
制限酵素ｇｉｎｄ ＩＩＩ分解により得られる３、３ｋ
ｂ のＤ ７Ｖ Ａ断片は、２μｍＤＮＡＣ精製に必要
な領域とＬＥＵ２遺伝子を含んでおり（大腸菌由来のＤ
＃ ／ｌ配列は苫１れていない）、そのＤ Ｎ ｌｌ
断片１ｂ独で酵母細胞内て充分安定に保４．゛ｔされう
ることか報告されている（ Ｔｏん−ｅ＋Ａ−らＪ。
Ｅａｃｔｅｒｉｏｔ、＋ １４１ ： ４１３〜４１６
．１９８０）。
．１９８０）。
本発明者らは上記の点に注目しこｒＬまでｉ？ｉＩ述の
３．３ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ Ｉｌｌ断点に挿入した大腸菌
−酵ひ／ヤトルベクター（ｐｌ’Ａ７２０７）を作製し
、さらにこれに各種の遺伝子を挿入した種々のプラスミ
ドを造成してきた（％開昭５８−１４６２８１、特願昭
５７−１８４２９１参照）。そのうち、ｐＹＳｌｌｏｌ
（ｆ！＃願昭５７−１８４２９３第３図参照）より由来
したプラスミドｐＹＳ１１２８によって形質転換された
Ｃｉｒ＋株を長期間培養したところ、該宿主細胞内で極
めて安定に保持されているｐＹＥ１１２８とは異なるプ
ラスミドを見出した。尚、ｐＹＥ１１２８は、ｐ）’Ｅ
１１０１上にある酵母の抑制性酸性フォスファターゼ遺
伝子（以下ＰＨ０５と略す）領域の５′側非翻訳領域の
ｌ１ｉｎｆ ｌサイト（翻訳開始に最も近いところにあ
るＨｉｎｆ ｌサイト）上流を欠落させることにより、
ＰＨ０５の発現を１７９６度非依存性にした約１１ ｋ
ｂからなるプラスミドである。上述のｃｓｒ 形質転
換株中で安定に保持されたクローンを解析したところ、
ＬＥＵ２遺伝子活性はみられたが、存在しているべきＰ
ＩＩ０５遺伝子活性が見出されず、またそのクローンの
プラスミドを解析したところ、ｐＹＥ１１２８に相通す
る大きさく約１１ ｋｂ’）のプラスミドではなく、約
７．４ｋｂのプラスミドであった。
３．３ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ Ｉｌｌ断点に挿入した大腸菌
−酵ひ／ヤトルベクター（ｐｌ’Ａ７２０７）を作製し
、さらにこれに各種の遺伝子を挿入した種々のプラスミ
ドを造成してきた（％開昭５８−１４６２８１、特願昭
５７−１８４２９１参照）。そのうち、ｐＹＳｌｌｏｌ
（ｆ！＃願昭５７−１８４２９３第３図参照）より由来
したプラスミドｐＹＳ１１２８によって形質転換された
Ｃｉｒ＋株を長期間培養したところ、該宿主細胞内で極
めて安定に保持されているｐＹＥ１１２８とは異なるプ
ラスミドを見出した。尚、ｐＹＥ１１２８は、ｐ）’Ｅ
１１０１上にある酵母の抑制性酸性フォスファターゼ遺
伝子（以下ＰＨ０５と略す）領域の５′側非翻訳領域の
ｌ１ｉｎｆ ｌサイト（翻訳開始に最も近いところにあ
るＨｉｎｆ ｌサイト）上流を欠落させることにより、
ＰＨ０５の発現を１７９６度非依存性にした約１１ ｋ
ｂからなるプラスミドである。上述のｃｓｒ 形質転
換株中で安定に保持されたクローンを解析したところ、
ＬＥＵ２遺伝子活性はみられたが、存在しているべきＰ
ＩＩ０５遺伝子活性が見出されず、またそのクローンの
プラスミドを解析したところ、ｐＹＥ１１２８に相通す
る大きさく約１１ ｋｂ’）のプラスミドではなく、約
７．４ｋｂのプラスミドであった。
さらに、その約７．４ｋｂのプラスミドについて制限酵
素切断による解析を行ったところ、■通常の野生型の２
μｍＤＮＡＣように２種（Ａ形とＢ形）のプラスミドが
はｙｌ：１の量比で存在していること、および■野生型
２μｍ Ｄ Ｎ Ａがもつ２つのインバーテツドリピー
ト（１ｎｖｔｔｒｔｅｄ ｒｇｐａａｔ ：。
素切断による解析を行ったところ、■通常の野生型の２
μｍＤＮＡＣように２種（Ａ形とＢ形）のプラスミドが
はｙｌ：１の量比で存在していること、および■野生型
２μｍ Ｄ Ｎ Ａがもつ２つのインバーテツドリピー
ト（１ｎｖｔｔｒｔｅｄ ｒｇｐａａｔ ：。
ＩＲｌとＩＲ２）領域とＬＥＵ２遺伝子領域を有すが、
Ｐ ＩＩ Ｏ遺伝子領域と大腸菌由来のＤＮＡが欠失し
ており、あたかもｐＹＥ１１２８上にあるＬＥＵ２遺伝
子を含むＤＮＡ断片が、野生型２μｍ Ｄ Ｎ Ａに移
ったようなプラスミドであることがわかった。２つの形
（ＡとＢ）が存在するのは、野生型２μｍ Ｄ Ｎ Ａ
と同様２つのＩＮＡ域を介して分子内組み換えがおきた
ためだと考えられる。ｐＹＥ１１ｚ８（約１１ ｋｂ）
からどのようしてして上記のような約７４ ｋｂのプラ
スミドが生じたかは明らかではないが、本プラスミドは
、６１１０株の宿主細胞内でも安定に複製さＪシ、また
該形質転換株を非選択条件下で１０世代培養しても野生
型２μｍ Ｄ Ｎ Ａと同程匣のコピー数を有し、９９
％以上の保持ｉｔ有していたことがら有用なベクターで
あると考えられた。しかし、このプラスミドにば外来蛋
白又はペプチド遺伝子を挿入する適当な制限酵素切断部
位がないことや、本プラスミド上にあるＬＥＵ２遺伝子
マーカーはその形質転換体を大量培養するためには適当
ではないことなどから、本プラスミドを直接外来蛋白又
はペプチド発現用ベクターとして使用するには不適であ
った。
Ｐ ＩＩ Ｏ遺伝子領域と大腸菌由来のＤＮＡが欠失し
ており、あたかもｐＹＥ１１２８上にあるＬＥＵ２遺伝
子を含むＤＮＡ断片が、野生型２μｍ Ｄ Ｎ Ａに移
ったようなプラスミドであることがわかった。２つの形
（ＡとＢ）が存在するのは、野生型２μｍ Ｄ Ｎ Ａ
と同様２つのＩＮＡ域を介して分子内組み換えがおきた
ためだと考えられる。ｐＹＥ１１ｚ８（約１１ ｋｂ）
からどのようしてして上記のような約７４ ｋｂのプラ
スミドが生じたかは明らかではないが、本プラスミドは
、６１１０株の宿主細胞内でも安定に複製さＪシ、また
該形質転換株を非選択条件下で１０世代培養しても野生
型２μｍ Ｄ Ｎ Ａと同程匣のコピー数を有し、９９
％以上の保持ｉｔ有していたことがら有用なベクターで
あると考えられた。しかし、このプラスミドにば外来蛋
白又はペプチド遺伝子を挿入する適当な制限酵素切断部
位がないことや、本プラスミド上にあるＬＥＵ２遺伝子
マーカーはその形質転換体を大量培養するためには適当
ではないことなどから、本プラスミドを直接外来蛋白又
はペプチド発現用ベクターとして使用するには不適であ
った。
そこで本発明者らは、上記の事実、特に３母宿王中で安
定に高コピー数を保持しうるブラスミド：ては、犬、１
烏蕩由来のＤＮＡが欠落していることおよび２μｍ Ｄ
Ｎ ＡのＪＲ領領域２つ有していることに注目し、以
下に述べるような、Ｃ１γ０宿主においても安定に保持
され、そのプラスミドによる形ＪＲ転換株の犬ｌ培妥が
容易な、外来蛋白又はペプチド生産用ベタターを達成し
た。
定に高コピー数を保持しうるブラスミド：ては、犬、１
烏蕩由来のＤＮＡが欠落していることおよび２μｍ Ｄ
Ｎ ＡのＪＲ領領域２つ有していることに注目し、以
下に述べるような、Ｃ１γ０宿主においても安定に保持
され、そのプラスミドによる形ＪＲ転換株の犬ｌ培妥が
容易な、外来蛋白又はペプチド生産用ベタターを達成し
た。
このベタターは、その造成の経韓から明らかなようＶＣ
：Ｊ母の２μｍ Ｄ Ｎ Ａの配列と大腸菌由来のＤＮ
Ａ配列とをから成る雑種プラスミドであり、酵母および
大腸菌のいずれの宿主細胞内で収装が可１ｊ巨である。
：Ｊ母の２μｍ Ｄ Ｎ Ａの配列と大腸菌由来のＤＮ
Ａ配列とをから成る雑種プラスミドであり、酵母および
大腸菌のいずれの宿主細胞内で収装が可１ｊ巨である。
また、このプラスミドによって形質転換された酵母また
は大腸菌の選択を可能にするＤ ｉＶ Ａ配列筐たは遺
伝子、例えば薬剤耐性遺伝子をマーカーとして持ってい
る。本発明のベクターは上記酵母の２μｍ Ｄ Ｎ Ａ
の配列および上記大腸菌由来のＤ ７Ｖ Ａ配列を切断
しない制限酵素によって切断されるＤＮＡ配列を待ち、
したがって、有益な蛋白またはペプチドをコードしてい
る外来遺伝子またはその発現を支配するプロモーター領
域を容易に挿入することができ、有益な外来物質を生産
する形質転換された酵母を得るためのベクターを造成で
きる。
は大腸菌の選択を可能にするＤ ｉＶ Ａ配列筐たは遺
伝子、例えば薬剤耐性遺伝子をマーカーとして持ってい
る。本発明のベクターは上記酵母の２μｍ Ｄ Ｎ Ａ
の配列および上記大腸菌由来のＤ ７Ｖ Ａ配列を切断
しない制限酵素によって切断されるＤＮＡ配列を待ち、
したがって、有益な蛋白またはペプチドをコードしてい
る外来遺伝子またはその発現を支配するプロモーター領
域を容易に挿入することができ、有益な外来物質を生産
する形質転換された酵母を得るためのベクターを造成で
きる。
本発明のプラスミドベクターに有益な外来物ｊ、［全コ
ードしている遺伝子を挿入して作製したプラスミドベク
ターは、酵母宿主訓胞内て關いコピー数が安定に保たれ
、したがって有益な外来物質、例えば各種インターフェ
ロン、α−ネオエンドルフィン、カルシトニン、成長ホ
ルモン、インターロイキン２、各植免疫関連ポリペプチ
ドを動量；く生産することができる。この外来性遺伝子
をクロー二／グしだベクターは、ｃｉｒ０株のら＾０内
ても安定に保持されるという優れた将性を持つ。このこ
とは、ｃｉｒ＋株宿王酵宿主は起こる可能性のある不利
益な２μｍ Ｄ Ｎ Ａとの組換えによるベタクーの変
化を防ぐことができるという利点があることを示す。
ードしている遺伝子を挿入して作製したプラスミドベク
ターは、酵母宿主訓胞内て關いコピー数が安定に保たれ
、したがって有益な外来物質、例えば各種インターフェ
ロン、α−ネオエンドルフィン、カルシトニン、成長ホ
ルモン、インターロイキン２、各植免疫関連ポリペプチ
ドを動量；く生産することができる。この外来性遺伝子
をクロー二／グしだベクターは、ｃｉｒ０株のら＾０内
ても安定に保持されるという優れた将性を持つ。このこ
とは、ｃｉｒ＋株宿王酵宿主は起こる可能性のある不利
益な２μｍ Ｄ Ｎ Ａとの組換えによるベタクーの変
化を防ぐことができるという利点があることを示す。
同、本発明の外来性遺伝子のクロー二／グ用ベクターは
所期の外来性遺伝子を導入した後に、大腸菌由来のＤＮ
Ａ配列を適当な制限酵素で処理して除去することにより
、Ｃｌｒｏ株宿正酵母内てより高いコピー数を安定に保
持できるプラスミドベクターに変えることができる。
所期の外来性遺伝子を導入した後に、大腸菌由来のＤＮ
Ａ配列を適当な制限酵素で処理して除去することにより
、Ｃｌｒｏ株宿正酵母内てより高いコピー数を安定に保
持できるプラスミドベクターに変えることができる。
以下に、本発明の外来性遺伝子のクローニング用ベタタ
ーおよびこれを用いる外来性遺伝子を導入した酵母用プ
ラスミドベクターの作製法をより詳細に説明する。
ーおよびこれを用いる外来性遺伝子を導入した酵母用プ
ラスミドベクターの作製法をより詳細に説明する。
の解析
まず、一般の研究室で用いられている＝イ母、サソカロ
マイセスセレビジより１３−ＩＡ（ＣＺｒ株）より２μ
ｍ Ｄ Ｎ Ａを分離し、そのｐｓｔｌ切断部位にｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔＩ切断Ｄ ｔＶ Ａ断片を挿入するこ
とにより雑種プラスミドｐＹＥ３００１に挿入された２
種のプラスミド（ｐＹＥ３００１αとｐＹＥ３００１６
）ができること、また２μｍＤ ＩＶ Ａには２種の形
態（Ａ形およびＢ形）があることから、計４種の雑種プ
ラスミドか得られる（第１図参照）。次に、その１つで
あるｐＹＥ３００１ｃを用い、発現させようとする外来
遺伝子が挿入できるような制限連累切断点（Ｂｇｌ Ｉ
ｔ −ナイト）を有し、形／Ｊｊ転換体の選択に利用す
るマーカーとしての酵母のＴ ＲＰ １遺伝子が挿入さ
れたプラスミドの造成を行う。（プラスミドベクタ３０
０１ ｃ −Ｅｇｌｌに相当する、第２図参照）。尚、
ＴＲＰ１遺伝子を選択マーカーとして用いたのは、カザ
ミノ酸を含むような栄養豊富な培地でても形質転換体の
選択的培養が可能であるためてあり、後述するようにＴ
ＲＰｌの代りに３母のＵ Ｉｔ Ａ ３遺伝子を用いて
もよい。また、制限酵素切断点は、発現させようとする
外来性遺伝子を苫むＤＮＡ配列が容易に挿入されうるも
のであるならばＢｇｌ ［１サイ）Ｋ限らないことは当
然である。但し、その切断点は、その制限酵素で切断さ
れる該プラスミド上での唯一のサイトであることが好ま
しい。
マイセスセレビジより１３−ＩＡ（ＣＺｒ株）より２μ
ｍ Ｄ Ｎ Ａを分離し、そのｐｓｔｌ切断部位にｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔＩ切断Ｄ ｔＶ Ａ断片を挿入するこ
とにより雑種プラスミドｐＹＥ３００１に挿入された２
種のプラスミド（ｐＹＥ３００１αとｐＹＥ３００１６
）ができること、また２μｍＤ ＩＶ Ａには２種の形
態（Ａ形およびＢ形）があることから、計４種の雑種プ
ラスミドか得られる（第１図参照）。次に、その１つで
あるｐＹＥ３００１ｃを用い、発現させようとする外来
遺伝子が挿入できるような制限連累切断点（Ｂｇｌ Ｉ
ｔ −ナイト）を有し、形／Ｊｊ転換体の選択に利用す
るマーカーとしての酵母のＴ ＲＰ １遺伝子が挿入さ
れたプラスミドの造成を行う。（プラスミドベクタ３０
０１ ｃ −Ｅｇｌｌに相当する、第２図参照）。尚、
ＴＲＰ１遺伝子を選択マーカーとして用いたのは、カザ
ミノ酸を含むような栄養豊富な培地でても形質転換体の
選択的培養が可能であるためてあり、後述するようにＴ
ＲＰｌの代りに３母のＵ Ｉｔ Ａ ３遺伝子を用いて
もよい。また、制限酵素切断点は、発現させようとする
外来性遺伝子を苫むＤＮＡ配列が容易に挿入されうるも
のであるならばＢｇｌ ［１サイ）Ｋ限らないことは当
然である。但し、その切断点は、その制限酵素で切断さ
れる該プラスミド上での唯一のサイトであることが好ま
しい。
ＴＲＰ１遺伝子は、５ｔｒｕ、ｈｌら（Ｓｔｒｕ）Ｌｌ
、Ｋ。
、Ｋ。
らＰｒｏｃ Ｎａｔｌ、Ａｃａ、ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳ
、 ７６ ： １０３５．１９７９）によってつくられ
た雑種プラスミドＹＲｐ７から導入する。まずＹｌシｐ
７ＤＮＡをｂｃ ｏ ＲＩで部分消化しＤ ＮＡポリメ
ラーゼで〕粘着末端（ｃｏｈｅｓｉ ｇ ｅｎｄ）を平
滑末端にした後、ＢｇｌＡ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ ■リンカー（Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ）を連結すること
により、ＴＲＰ１遺伝子の近傍にあるＥｃｏＲＩサイト
をＢＱＩ ＩＩｌサイト変えたプラスミドＹＲｐ７−
Ｂｃｔｌｌ ＩＩを得る（第２因）。一方、ｐ ＹＢ２
００１ ｃｆ ｌ−１ｐα【で消化し上と同様にＢｇｌ
ＩＩ ＩＪンカーを挿入することにより、Ｈｐａ ｌ
サイトをＢＱＩＩＩサイト↓ に変えたプラスミドｐＹＥ３００１ ｃ−Ｂｇｌを得る
。
、 ７６ ： １０３５．１９７９）によってつくられ
た雑種プラスミドＹＲｐ７から導入する。まずＹｌシｐ
７ＤＮＡをｂｃ ｏ ＲＩで部分消化しＤ ＮＡポリメ
ラーゼで〕粘着末端（ｃｏｈｅｓｉ ｇ ｅｎｄ）を平
滑末端にした後、ＢｇｌＡ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ ■リンカー（Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ）を連結すること
により、ＴＲＰ１遺伝子の近傍にあるＥｃｏＲＩサイト
をＢＱＩ ＩＩｌサイト変えたプラスミドＹＲｐ７−
Ｂｃｔｌｌ ＩＩを得る（第２因）。一方、ｐ ＹＢ２
００１ ｃｆ ｌ−１ｐα【で消化し上と同様にＢｇｌ
ＩＩ ＩＪンカーを挿入することにより、Ｈｐａ ｌ
サイトをＢＱＩＩＩサイト↓ に変えたプラスミドｐＹＥ３００１ ｃ−Ｂｇｌを得る
。
行い得られるＤ Ｎ Ａ 断片をリゲーションすること
により、外来性遺伝子挿入部位としてＥｇｌ Ｉ［サイ
トをもち、選択マーカーとしてのＴＲＰ１遺伝子を有す
るプラスミドｐＹＥ３２０２（約１１Ａ６の大きさ）を
造成する。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２由来のＤＮ
Ａ配列の他に２μγルＤＮＡＣ２個のインバーテンドリ
ピート（逆方向反復）配列および２μｍ Ｄ Ｎ Ａの
複製および安定化に関与する遺伝子（ＲＥＰ ｌ、ＲＥ
Ｐ２、ＲＥＰ３、ＰＬＰと呼ばれるようなルムスミ：
Ｊａｙαγαフル、１１）・らＸ Ｃ，＋Ｕ３４：９５
．１９８３参照）も有している。
により、外来性遺伝子挿入部位としてＥｇｌ Ｉ［サイ
トをもち、選択マーカーとしてのＴＲＰ１遺伝子を有す
るプラスミドｐＹＥ３２０２（約１１Ａ６の大きさ）を
造成する。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２由来のＤＮ
Ａ配列の他に２μγルＤＮＡＣ２個のインバーテンドリ
ピート（逆方向反復）配列および２μｍ Ｄ Ｎ Ａの
複製および安定化に関与する遺伝子（ＲＥＰ ｌ、ＲＥ
Ｐ２、ＲＥＰ３、ＰＬＰと呼ばれるようなルムスミ：
Ｊａｙαγαフル、１１）・らＸ Ｃ，＋Ｕ３４：９５
．１９８３参照）も有している。
このｐＹＥ３２０２ｔ−１ｒｐ１ｃｃｉｒ０〕の酵母Ｖ
こ常法に従って形質転換してえたｔｒｐ 形質転換体
を解析したところ、７）ＹＥ３２０２と同じ大きさのプ
ラスミドのみが存在していたが、コピー数は野生型の２
μｒｎ Ｄ Ｎ Ａの場合に比べ若干少なく、また非選
択下での保持率も約１１％と低いものであった。ところ
が、ｐＹＥ３２０２ｆＰｓｔＩ処理で得たｐＢＲ３２２
由来のＤＮＡ配列が除かれたプラスミドｐＳＣ３２０２
の場合は、同じｃｉｒ０酵母細胞中でも通常のｃｉｒ＋
９母の２μｍ Ｄ Ｎ Ａと同じかまたはそれ以上のコ
ピー数（細胞当り５０から１００個）・ト安定に保持し
ていた。このことは、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列が
、酵母中でプラスミドの複製や保持、安定性と低下させ
る何らかの影響金与えていることを暗示している。
こ常法に従って形質転換してえたｔｒｐ 形質転換体
を解析したところ、７）ＹＥ３２０２と同じ大きさのプ
ラスミドのみが存在していたが、コピー数は野生型の２
μｒｎ Ｄ Ｎ Ａの場合に比べ若干少なく、また非選
択下での保持率も約１１％と低いものであった。ところ
が、ｐＹＥ３２０２ｆＰｓｔＩ処理で得たｐＢＲ３２２
由来のＤＮＡ配列が除かれたプラスミドｐＳＣ３２０２
の場合は、同じｃｉｒ０酵母細胞中でも通常のｃｉｒ＋
９母の２μｍ Ｄ Ｎ Ａと同じかまたはそれ以上のコ
ピー数（細胞当り５０から１００個）・ト安定に保持し
ていた。このことは、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列が
、酵母中でプラスミドの複製や保持、安定性と低下させ
る何らかの影響金与えていることを暗示している。
次にｐＹＥ３２０２およびｐｓｃ３２０２の形質転換体
クローン中での存在形態について検討したところ、両プ
ラスミドとも野生型の２μｍ Ｄ ＮＡと同様、２つの
形態（Ａ形とＢ形）で存在し、その量比ははソ１：１で
あった。
クローン中での存在形態について検討したところ、両プ
ラスミドとも野生型の２μｍ Ｄ ＮＡと同様、２つの
形態（Ａ形とＢ形）で存在し、その量比ははソ１：１で
あった。
続いて、ｐＹＥ３２０２についてさらに詳細な解析を行
ったところ、本来の野生を２μｍ Ｄ Ｎ Ａでは存在
しているＡｖｃＬＩ −Ｈｐａ１間のＤＮＡ配列の約１
００ ｂｐが、ｐＹＥ３２０２上の２ｔｔｍＤＮＡ由−
梃のＤＮＡ配列では欠落していることがわかった。また
、この配列は、ｐＹＥ３２０２の２μｍｍ Ｄ Ｎ Ａ
のソースとして用いたｃｔｒ 株（Ｄｌ ３− ＬＡ
）の２μｍＤＮＡにおいても欠落していることが認めら
れた。この欠落していたＤＮＡ配列は、２μｍ Ｄ ＃
Ａの複製または安定性に関与するＰＥＰ３またはＳＴ
Ｂと呼ばれる領域でありこのＤ ＮＡ配列の欠落がｐＹ
Ｅ３２０２のコピー数、保持率に悪影響を及ぼしたので
はないかと考えられる。そこで次に、このＤＮＡ配列を
有するプラスミド（ｐＹＥ３２０７）の造成を試みた。
ったところ、本来の野生を２μｍ Ｄ Ｎ Ａでは存在
しているＡｖｃＬＩ −Ｈｐａ１間のＤＮＡ配列の約１
００ ｂｐが、ｐＹＥ３２０２上の２ｔｔｍＤＮＡ由−
梃のＤＮＡ配列では欠落していることがわかった。また
、この配列は、ｐＹＥ３２０２の２μｍｍ Ｄ Ｎ Ａ
のソースとして用いたｃｔｒ 株（Ｄｌ ３− ＬＡ
）の２μｍＤＮＡにおいても欠落していることが認めら
れた。この欠落していたＤＮＡ配列は、２μｍ Ｄ ＃
Ａの複製または安定性に関与するＰＥＰ３またはＳＴ
Ｂと呼ばれる領域でありこのＤ ＮＡ配列の欠落がｐＹ
Ｅ３２０２のコピー数、保持率に悪影響を及ぼしたので
はないかと考えられる。そこで次に、このＤＮＡ配列を
有するプラスミド（ｐＹＥ３２０７）の造成を試みた。
ｐＹＥ３２０２に欠落していたＤＮＡ配列（グ、第３図
に示すように、ｐＪＤＢ２１９上１・こある２μ犠ＤＮ
Ａ断片によって補われる。まず、ｐＪＤＢ２１９をｌ１
ｐａ Ｉで切断しＢｒ）ｌ ｌリンカ−を挿入すること
によってプラスミドｐＪＤＥ２１９− Ｂｇｌ （ｐＪ
ＤＢ２１９のＨｐａ ｌサイトかなくなりＢｇｌ ＩＩ
ｌサイト付与されている）と造成し、次にＢ形の’Ｊ）
ＹＥ３２０２＜第２図参照）のＢ（ｌｌ Ｉｔ −ｘｂ
α１（部分消化）の断片を、ｐＪＤＢ２１９−Ｂｒｌｌ
のＢｇｌ ＩＩ −Ｘｂａ Ｉ Ｕｒ片とおきかえるこ
とｉ／Ｃよって目的とするプラスミドｐＹＥ ３２０７
を得る。
に示すように、ｐＪＤＢ２１９上１・こある２μ犠ＤＮ
Ａ断片によって補われる。まず、ｐＪＤＢ２１９をｌ１
ｐａ Ｉで切断しＢｒ）ｌ ｌリンカ−を挿入すること
によってプラスミドｐＪＤＥ２１９− Ｂｇｌ （ｐＪ
ＤＢ２１９のＨｐａ ｌサイトかなくなりＢｇｌ ＩＩ
ｌサイト付与されている）と造成し、次にＢ形の’Ｊ）
ＹＥ３２０２＜第２図参照）のＢ（ｌｌ Ｉｔ −ｘｂ
α１（部分消化）の断片を、ｐＪＤＢ２１９−Ｂｒｌｌ
のＢｇｌ ＩＩ −Ｘｂａ Ｉ Ｕｒ片とおきかえるこ
とｉ／Ｃよって目的とするプラスミドｐＹＥ ３２０７
を得る。
尚、ｐＹＥ３２０７は、ｐＹＥ３２０２に欠９０してい
た２ ｐ ｍ Ｄ Ｎ ＡのＡｖａ Ｉ −Ｈｐａ ｌ
断片（約１００ ｂｐ）が上記の如くして補なわれては
いるか、２μ犠ＤＮＡＣ全配列が含まれているわけては
なく、２μ７ｒＬＤＮＡＣう′Ｇ）Ｈｐａ ［−Ｐｓｔ
ｌ断片（３１２ｂｐ）が欠如した２ ｔｔ ｍ ＤＮ
Ａｌ；ＪＴ片を含むプラスミドである。
た２ ｐ ｍ Ｄ Ｎ ＡのＡｖａ Ｉ −Ｈｐａ ｌ
断片（約１００ ｂｐ）が上記の如くして補なわれては
いるか、２μ犠ＤＮＡＣ全配列が含まれているわけては
なく、２μ７ｒＬＤＮＡＣう′Ｇ）Ｈｐａ ［−Ｐｓｔ
ｌ断片（３１２ｂｐ）が欠如した２ ｔｔ ｍ ＤＮ
Ａｌ；ＪＴ片を含むプラスミドである。
続いて、このｐＹＥ３２０７をｃｉγ０昧酵母（（形質
転換し、この形質転換体と先に得たｐＹＥ３２０２の同
宿主形質転換体における各々のプラスミドの安定性、保
持率について調べた。画形質ｆ、換体を、非選択条件下
（非選択培地： ＹＰＤ培地）で約１０世代培養したあ
と各々のプラスミドの保持率を調べた結果、ｐＹＥ３２
０２では約１１％であるのに対し、ｐＹＥ３２０７は約
５４％であり、欠落していたＤＮＡ配列の付与がプラス
ミドの安定性の向上をもたらしていることが認められる
。また、このｐＹＥ３２０７からＰｓｔＩ処理でｐＢＲ
３２２由来のＤＮＡ配列が除かれたあと同じｃｉｒ０株
酵母に導入されたプラスミドｐＳＣ３２０７は、上と同
様な非選択条件下の培養でも９５％以上の保持率であり
（ｐｓｃ３２０２では同条件下で約９５％の保持率）、
コピー数も多く（細胞当り５０から１００個）また酵母
中では野生型２μｍ Ｄ Ｎ Ａと同様２つの形態で存
在している。
転換し、この形質転換体と先に得たｐＹＥ３２０２の同
宿主形質転換体における各々のプラスミドの安定性、保
持率について調べた。画形質ｆ、換体を、非選択条件下
（非選択培地： ＹＰＤ培地）で約１０世代培養したあ
と各々のプラスミドの保持率を調べた結果、ｐＹＥ３２
０２では約１１％であるのに対し、ｐＹＥ３２０７は約
５４％であり、欠落していたＤＮＡ配列の付与がプラス
ミドの安定性の向上をもたらしていることが認められる
。また、このｐＹＥ３２０７からＰｓｔＩ処理でｐＢＲ
３２２由来のＤＮＡ配列が除かれたあと同じｃｉｒ０株
酵母に導入されたプラスミドｐＳＣ３２０７は、上と同
様な非選択条件下の培養でも９５％以上の保持率であり
（ｐｓｃ３２０２では同条件下で約９５％の保持率）、
コピー数も多く（細胞当り５０から１００個）また酵母
中では野生型２μｍ Ｄ Ｎ Ａと同様２つの形態で存
在している。
＋ｉＪ項で造成したｐＹＥ３２０７が含む２ＡｒｎＤ
ＮＡ ｉＪｌ域には野生型２μｒｎ Ｄ Ａ／ Ａの内
１１ｐｙ ｌ −ＰｓｔＩ領域３１２ ｂｐが欠落して
いる。そこで、この領域を付加し結果的には野生型２μ
フルＤ ＃ Ａ全配列を含むプラスミドｐＹＥ３２１７
の造成全行なった（第４−１および４−２図）。このプ
ラスミドもｐＹＥ３２０７と同機、唯一つのＢｇｌｎＩ
切断片部位をもち、しかも制限酵素ＰｓｔＩ処理でｐＢ
Ｒ３２２由来のＤＮＡ配列を取り除くことかできる。
ＮＡ ｉＪｌ域には野生型２μｒｎ Ｄ Ａ／ Ａの内
１１ｐｙ ｌ −ＰｓｔＩ領域３１２ ｂｐが欠落して
いる。そこで、この領域を付加し結果的には野生型２μ
フルＤ ＃ Ａ全配列を含むプラスミドｐＹＥ３２１７
の造成全行なった（第４−１および４−２図）。このプ
ラスミドもｐＹＥ３２０７と同機、唯一つのＢｇｌｎＩ
切断片部位をもち、しかも制限酵素ＰｓｔＩ処理でｐＢ
Ｒ３２２由来のＤＮＡ配列を取り除くことかできる。
ｐＹＥ３２１７の造成は、第４−１および４−２図に示
すように、まずｐＪＤＢ２１９と先に造成しているｐＹ
Ｅ３００１ｃｃ第１図β照）、！：から、ｐＹＥ３２０
２では欠如していた／１ｖａ ｌ −Ｈｐａ ［領域（
約１００ ｂｐ）とｐＹＥ３２０７で江欠如していたＨ
ｐａ １− Ｐｓｔ Ｉ領域（３１２ｂｐ）が付加され
全２μｍ Ｄ ＮＡ ’（ｅ含むプラスミドｐＹＥ３０
０７を造成し、次に２つあるＰｓｔＩの内１つを消去し
、Ｂ’ｇｌｕ切断部位を挿入したプラスミドｐＹＥ３０
０７− ＢｇｌＵを造成する。続いて、ｐＹＥ３２０７
をＢｇｌ ＩＩとｐｓｔＩｆｉ！ｒ分消化で得られるＴ
ＲＰ１遺伝子断片をｐＹＥ３００７−Ｅ（ＩＩ■に挿入
することにより目的とするｐＹＥ３２１７を得る。この
ｐＹＥ３２１７はｐＹＥ３２０７と同様酵母中で高いコ
ピー数で安定に保持される。
すように、まずｐＪＤＢ２１９と先に造成しているｐＹ
Ｅ３００１ｃｃ第１図β照）、！：から、ｐＹＥ３２０
２では欠如していた／１ｖａ ｌ −Ｈｐａ ［領域（
約１００ ｂｐ）とｐＹＥ３２０７で江欠如していたＨ
ｐａ １− Ｐｓｔ Ｉ領域（３１２ｂｐ）が付加され
全２μｍ Ｄ ＮＡ ’（ｅ含むプラスミドｐＹＥ３０
０７を造成し、次に２つあるＰｓｔＩの内１つを消去し
、Ｂ’ｇｌｕ切断部位を挿入したプラスミドｐＹＥ３０
０７− ＢｇｌＵを造成する。続いて、ｐＹＥ３２０７
をＢｇｌ ＩＩとｐｓｔＩｆｉ！ｒ分消化で得られるＴ
ＲＰ１遺伝子断片をｐＹＥ３００７−Ｅ（ＩＩ■に挿入
することにより目的とするｐＹＥ３２１７を得る。この
ｐＹＥ３２１７はｐＹＥ３２０７と同様酵母中で高いコ
ピー数で安定に保持される。
またＰｓｔＩ処理でｐＢＲ３２２由米ＤＮＡが取り除か
れたｐｓｃ３２１７はさら（（よい保持率であった。
れたｐｓｃ３２１７はさら（（よい保持率であった。
本ベタターｐＹＥ３３２Ｂは、選択マーカーとしてｐＹ
Ｅ３２０７およびｐＹＥ３２１７にあるＴＲＰ１遺伝子
の代りにＵＲＡ３遺伝子が挿入されていること、および
大腸菌由来のＤＮＡ配列がＰｓｔＩではな（ＢａｍＨＩ
で取り除かれるようになっていること以外は基本的にｐ
ＹＥ３２１７と変わらないものである。伺、（ＪＲＡ３
遺伝子を選択マーカーとして用いるのは、ＴＲＰ１遺伝
子の場合と同様、カザミノ酸やポＩＪ ｇプトンヲ苫む
培地での＃、母の形質転換株の選択的培養を容易にする
ためである（カザミノ酸にはトリプトファンおよびウラ
シルはほとんど言まれでない）。
Ｅ３２０７およびｐＹＥ３２１７にあるＴＲＰ１遺伝子
の代りにＵＲＡ３遺伝子が挿入されていること、および
大腸菌由来のＤＮＡ配列がＰｓｔＩではな（ＢａｍＨＩ
で取り除かれるようになっていること以外は基本的にｐ
ＹＥ３２１７と変わらないものである。伺、（ＪＲＡ３
遺伝子を選択マーカーとして用いるのは、ＴＲＰ１遺伝
子の場合と同様、カザミノ酸やポＩＪ ｇプトンヲ苫む
培地での＃、母の形質転換株の選択的培養を容易にする
ためである（カザミノ酸にはトリプトファンおよびウラ
シルはほとんど言まれでない）。
ｐＹＥ３３２Ｂは第５−１および５−２因のようにして
造成される。まず、第５−１翔に示すように酵母Ｘ２１
８０−ＩＢの全ＤＮＡを分離し、Ｈｉｎｄｍ処理で得ら
れる約Ｌ２１ｃｂのＵ ＲＡ ３ ’ｉｎ伝子スミむ断
片（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ、７６：１０３５〜１０３９．１９７９参照）を、
ＹＥｐ１３由米のシャトルベクターに挿入する。
造成される。まず、第５−１翔に示すように酵母Ｘ２１
８０−ＩＢの全ＤＮＡを分離し、Ｈｉｎｄｍ処理で得ら
れる約Ｌ２１ｃｂのＵ ＲＡ ３ ’ｉｎ伝子スミむ断
片（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ、７６：１０３５〜１０３９．１９７９参照）を、
ＹＥｐ１３由米のシャトルベクターに挿入する。
これをｕｔ’α３−の酵母５ＨＹｚ＋ｃ形質転換後、・
ＩＬｅＧ となるクローンからＵＲＡ３遺伝子をもつ
プラスミドＹＥｐ ｌ ３ ΔＢａｍ−ＵＲＡＥを得る
。
ＩＬｅＧ となるクローンからＵＲＡ３遺伝子をもつ
プラスミドＹＥｐ ｌ ３ ΔＢａｍ−ＵＲＡＥを得る
。
次に、や＼複雑だが第５−２南に示すように、ＹＥｐ
１３ΔＢａｍ−Ｕノ＜Ａ３上に挿入されたＥａｍＨ１切
断部位に、ｐＢＲ３２２および先述のｐＹＥ３００７−
ＢｇｌＪＩＩ （第４−ＩＮ参照）由来のＤＮＡ断片を
挿入することにより、唯一のＢｇｐ■切断部位をもちｐ
ＢＲ３２２由来のＤ ／’／ Ａ配列が７３ ａ ｍＨ
Ｉ処理で簡単に取り除くことができるｐＹＥ３３２８ｔ
−得る。
１３ΔＢａｍ−Ｕノ＜Ａ３上に挿入されたＥａｍＨ１切
断部位に、ｐＢＲ３２２および先述のｐＹＥ３００７−
ＢｇｌＪＩＩ （第４−ＩＮ参照）由来のＤＮＡ断片を
挿入することにより、唯一のＢｇｐ■切断部位をもちｐ
ＢＲ３２２由来のＤ ／’／ Ａ配列が７３ ａ ｍＨ
Ｉ処理で簡単に取り除くことができるｐＹＥ３３２８ｔ
−得る。
以下、７）ＹＥ３２０７、ｐＹｌ！：３２１７およびｐ
ＹＥ３３２Ｂを用いた外来性遺伝子発現プラスミドの造
成を説明する。
ＹＥ３３２Ｂを用いた外来性遺伝子発現プラスミドの造
成を説明する。
巳 外来性遺伝子のクローニング（第６図および第７図
） 外来性遺伝子としてここでは化学合成したヒトガンマ型
インターフェロン（以下ＧＩＦと略す）・とコードする
遺伝子およびヒト白血球ｍ ＲＮＡから得られるヒトガ
ンマ型インターフェロンｃＤＮＡ（以下ＧＩＦＬｍと略
す）ｔ−用いた例を示すが、外来遺伝子はこれらに限る
ものではなく、例えば、カルシトニン、成長ホルモン、
インスリン、利尿ペプチドのようなペプチドホルモンや
インターロイキン２、ＴＮＦ （ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒ
ｅｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）のようなリンフオカイレま
たは免疫関連ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて
もよい。また、ここでは外来遺伝子の発現を促進するプ
ロモーター領域として、酵母の抑制性酸性フォスファタ
ーゼ遺伝子ＰＨ０５のプロモーター領域（以下Ｐｐｈｏ
５と略す）を用いた例を示すか、プロモーター領域はこ
れに限るものではなく酵母のグリセロアルデヒド−３−
フオスフエイトテノ・イトロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）
・や３−フオスフオグリセロキナーゼＣＰＣＩ（）遺伝
子のような酵母で高生注される蛋白をコードする遺伝子
のプロモーター領域を用いてもよい。
） 外来性遺伝子としてここでは化学合成したヒトガンマ型
インターフェロン（以下ＧＩＦと略す）・とコードする
遺伝子およびヒト白血球ｍ ＲＮＡから得られるヒトガ
ンマ型インターフェロンｃＤＮＡ（以下ＧＩＦＬｍと略
す）ｔ−用いた例を示すが、外来遺伝子はこれらに限る
ものではなく、例えば、カルシトニン、成長ホルモン、
インスリン、利尿ペプチドのようなペプチドホルモンや
インターロイキン２、ＴＮＦ （ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒ
ｅｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）のようなリンフオカイレま
たは免疫関連ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて
もよい。また、ここでは外来遺伝子の発現を促進するプ
ロモーター領域として、酵母の抑制性酸性フォスファタ
ーゼ遺伝子ＰＨ０５のプロモーター領域（以下Ｐｐｈｏ
５と略す）を用いた例を示すか、プロモーター領域はこ
れに限るものではなく酵母のグリセロアルデヒド−３−
フオスフエイトテノ・イトロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）
・や３−フオスフオグリセロキナーゼＣＰＣＩ（）遺伝
子のような酵母で高生注される蛋白をコードする遺伝子
のプロモーター領域を用いてもよい。
外来遺伝子と該外来遺伝子の発現を促進するプロモータ
ー領域とを含むＤ ＮＡ ｌｌｆｒ片（第６図および第
７図ではＧＩＦまたはＧＩＦＬｍとＰｐｈｏ５と？含む
領域：以下発現ユニットと略す）は、一旦ｐＨＲ３２２
に挿入され（ｐＢＲ３２，２’−ＧＩＦ２１２またはｐ
ＥＲ３２２’−ＧＩＦＬｍ２１２）、久に先に造成した
ｐＹル’３２０７、ｐＹＥ３２１７またはｐＹＥ３３２
ＢのＢｇｌ ＩＩサイトに発現ユニットを挿入する。ｐ
ＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列はＰｓｔＩまたはＢａｔｎ
ＨＩ処理で容易に取り除かれ、酵母中で高コピー数で安
定ＶＣ保持される外来遺伝子発現プラスミドを得る（＠
６図および第７■途照）。
ー領域とを含むＤ ＮＡ ｌｌｆｒ片（第６図および第
７図ではＧＩＦまたはＧＩＦＬｍとＰｐｈｏ５と？含む
領域：以下発現ユニットと略す）は、一旦ｐＨＲ３２２
に挿入され（ｐＢＲ３２，２’−ＧＩＦ２１２またはｐ
ＥＲ３２２’−ＧＩＦＬｍ２１２）、久に先に造成した
ｐＹル’３２０７、ｐＹＥ３２１７またはｐＹＥ３３２
ＢのＢｇｌ ＩＩサイトに発現ユニットを挿入する。ｐ
ＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列はＰｓｔＩまたはＢａｔｎ
ＨＩ処理で容易に取り除かれ、酵母中で高コピー数で安
定ＶＣ保持される外来遺伝子発現プラスミドを得る（＠
６図および第７■途照）。
尚、ヒトインターフェロンをコードする化ｌ成およびｃ
ＤＮＡ遺伝子（各々ＧＩＦとＧＩＦＬｍで表わす）を発
現させることができる酵母抑制性散性フォスファターゼ
遺伝子（ＰＨ０５）のプロモーター領域＜ｐｐルｏ５）
を含むプラスミドｐＹＧＩＦ２１２およびｐＹＧＩＦＬ
ｍ２１２は、既に本発明者らによって造成されていたも
のであり、これらのプラスミドを含む大腸菌は実施例に
示すように微工研に薔託しである。
ＤＮＡ遺伝子（各々ＧＩＦとＧＩＦＬｍで表わす）を発
現させることができる酵母抑制性散性フォスファターゼ
遺伝子（ＰＨ０５）のプロモーター領域＜ｐｐルｏ５）
を含むプラスミドｐＹＧＩＦ２１２およびｐＹＧＩＦＬ
ｍ２１２は、既に本発明者らによって造成されていたも
のであり、これらのプラスミドを含む大腸菌は実施例に
示すように微工研に薔託しである。
第６ＡはｐＹＥ３２０７およびｐＹＥ３２５７への発現
ユニットのクローニングを示す。まず、ｐＹＧＩＦ２１
２またはｐＹＧＩＦＬｍ２１２をｌ１ｉｎｄ■で完全も
しくは部分切断（ｐＹＧＩＦ２１２の場合、ＧＩＦ遺伝
子スミ Ｈｉｎｄ ｌ［［サイトがあるので部分消化す
る）シ、生じる粘着末端をＤＮＡポリメラーゼでｆｉｌ
ｌ ｉｎ後、化学合成りαｍＨＩリンカーを付加してか
らＢａｍＨＩで切断して得られる発現ユニットｔ−営む
Ｄ Ｎ Ａ ＆？ｒ片を、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ−
Ｐｖ１ＬＩＩ断片（ＡＴ）”ｙ２含−ｊなｔｌｒ片）の
代りに挿入し、ｐＢＫ３２２’−ＧＩＦ２１２またはｐ
ＢＲ３２２’−ＧＩＦＬｍ２１２ を造成する。医に、
ＢａｍＨＩ切断で得られる発現ユニットを含むＤＮＡ断
片を、ｐＹＥ３２０７もしくはＴ）ＹＥ３２１７のＢｒ
ｔｌ ＩＩサイトに挿入することによりｐＹＥ３２０７
からはｐＹＧＩＦ４Ｌ２もしくはｐＹＧＩＦＬｍ４１２
を、ｐＹＥ３２１７からは７）ＹＧＩＦ８１２もしくは
ｐＹＧＩＦＬｍ８１２を得る。続いて、ＰｓｔＩ処理に
よりｐＥＲ３２２由来のＤＮＡ配列が取り除かれたプラ
スミドを得る。
ユニットのクローニングを示す。まず、ｐＹＧＩＦ２１
２またはｐＹＧＩＦＬｍ２１２をｌ１ｉｎｄ■で完全も
しくは部分切断（ｐＹＧＩＦ２１２の場合、ＧＩＦ遺伝
子スミ Ｈｉｎｄ ｌ［［サイトがあるので部分消化す
る）シ、生じる粘着末端をＤＮＡポリメラーゼでｆｉｌ
ｌ ｉｎ後、化学合成りαｍＨＩリンカーを付加してか
らＢａｍＨＩで切断して得られる発現ユニットｔ−営む
Ｄ Ｎ Ａ ＆？ｒ片を、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ−
Ｐｖ１ＬＩＩ断片（ＡＴ）”ｙ２含−ｊなｔｌｒ片）の
代りに挿入し、ｐＢＫ３２２’−ＧＩＦ２１２またはｐ
ＢＲ３２２’−ＧＩＦＬｍ２１２ を造成する。医に、
ＢａｍＨＩ切断で得られる発現ユニットを含むＤＮＡ断
片を、ｐＹＥ３２０７もしくはＴ）ＹＥ３２１７のＢｒ
ｔｌ ＩＩサイトに挿入することによりｐＹＥ３２０７
からはｐＹＧＩＦ４Ｌ２もしくはｐＹＧＩＦＬｍ４１２
を、ｐＹＥ３２１７からは７）ＹＧＩＦ８１２もしくは
ｐＹＧＩＦＬｍ８１２を得る。続いて、ＰｓｔＩ処理に
よりｐＥＲ３２２由来のＤＮＡ配列が取り除かれたプラ
スミドを得る。
一方、第７図は酵母のＵ ＲＡ ３遺伝子を選択マーカ
ーとしてもつプラスミドｐＹＥ３３２Ｂへの発現ユニッ
トの挿入を示す（ｐＹＧＩＦ９１２またはｐＹＧＩＦ’
Ｌｍ９１２）。ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列をＢｃＬ
ｍＨＩ処理で容易に取り除かれ酵母中で高コピー数で安
定に保持される外来遺伝子ＣＧＩＦまたはＧＩＦＬｍ）
発現ベクターｐｓｃＧＩＦ９１２もしくＩｒｉｐＳＣＧ
ＩＦＬｍ９１２が得られる。
ーとしてもつプラスミドｐＹＥ３３２Ｂへの発現ユニッ
トの挿入を示す（ｐＹＧＩＦ９１２またはｐＹＧＩＦ’
Ｌｍ９１２）。ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列をＢｃＬ
ｍＨＩ処理で容易に取り除かれ酵母中で高コピー数で安
定に保持される外来遺伝子ＣＧＩＦまたはＧＩＦＬｍ）
発現ベクターｐｓｃＧＩＦ９１２もしくＩｒｉｐＳＣＧ
ＩＦＬｍ９１２が得られる。
かくして得られるプラスミドでＳ Ｉｉ Ｙ ２株（α
５ｔｅｖｃ９、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐｌ−２８９、ｔ
ｅｕ２−３、ｔｇｕ２−１１２、Ａ１５３−ｔｓｌ、ｃ
ａｎ ｌ −１００：Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ、 にｅｎ
ｅ Ｖｏｌ、 ８ １７−２４（１９７９）に記載）の
非選択条件下の培養で得られたｃｉｒ０株Ｓ ＨＹ ２
（ｃｉｒｏ） ｆ常’ｂｗ従い形質転換し、形質転換
株中でのプラスミドの安定性および外来遺伝子の発現量
を調べた結果、期待どおり本発明で得られるプラスミド
′は安定に保持され、外来遺伝子も誘導条件下（低リン
酸濃度下）で効率よく発現することが認められた。これ
らの結果の１部を第１衣および第２戒に示した。Ｉだ、
本発明のいずれのプラスミドも形質転換株中で２つの形
態（ＡＺとＢ型）を形成しその存在量ははゾ１：１であ
った。尚、第１表および第２表は実施例の後に示す。
５ｔｅｖｃ９、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐｌ−２８９、ｔ
ｅｕ２−３、ｔｇｕ２−１１２、Ａ１５３−ｔｓｌ、ｃ
ａｎ ｌ −１００：Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ、 にｅｎ
ｅ Ｖｏｌ、 ８ １７−２４（１９７９）に記載）の
非選択条件下の培養で得られたｃｉｒ０株Ｓ ＨＹ ２
（ｃｉｒｏ） ｆ常’ｂｗ従い形質転換し、形質転換
株中でのプラスミドの安定性および外来遺伝子の発現量
を調べた結果、期待どおり本発明で得られるプラスミド
′は安定に保持され、外来遺伝子も誘導条件下（低リン
酸濃度下）で効率よく発現することが認められた。これ
らの結果の１部を第１衣および第２戒に示した。Ｉだ、
本発明のいずれのプラスミドも形質転換株中で２つの形
態（ＡＺとＢ型）を形成しその存在量ははゾ１：１であ
った。尚、第１表および第２表は実施例の後に示す。
以下、実施例をもってさらに本発明を説明するが、本発
明はこれらに限定さ几るものではない。
明はこれらに限定さ几るものではない。
実施例
Ｌ ｐＹＥ：３００Ｌの造成（第１図）Ｄ １３−
Ｉ Ａ （Ｓｔｒｕｈｌ 、 Ｋ、らＰｒｏｃ 、 Ｎ
ａｔ ｌ 。
Ｉ Ａ （Ｓｔｒｕｈｌ 、 Ｋ、らＰｒｏｃ 、 Ｎ
ａｔ ｌ 。
ＡｃｃＬｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７６（１９７９）１０３
５−１０３９）をＹＥＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵
母エキス、２％グルコース） １ ｌｉｔで３０℃１８
時間撮とう培養し、遠心分離（５００ｏｒｐｍ、５分間
）するＣとにより集菌した。、０ノ１１ノルビト一ルｋ
ｇむ５０ｍ１′ｖｉリン酸カリバツフアーＣｐＨ７，５
） １０ Ｍで１回洗滌後、同バッファー５０ａ／ｒこ
懸濁した。５０μｌのβ−メルカフトエタノール及び５
０１ｎ９ＺｙｍｏＬｙａｓｅ ６０ｆ（（生化学工業）
を加え３０℃で３０分間加温することによりプロトプラ
ストを調製した。５０−の、２Ｍノルビトールでプロド
ブ２スト２洗滌後、３０ ＋ｉの蒸面水に懸濁し１０ｉ
の０．５Ｍ ＥＤＴＡ ＣｐＨ８，０）を加えプロトプ
ラストを均一にした後同餐量の２％ＳＤＳを加え室温［
１５分間置くことにより）−ロトブラストを溶解させた
。次に一答の５ＭＮａＣ６を加えＯ℃１５時間放置した
。１８０００ｒｐｍ、 ４０分間遠心分離し、その上清
：（１０％（Ｗ／ ｖ ）のＰＥＧ６０００’ｌ：加え
Ｏ℃１時間放置してｐｇａを溶解させ核酸き沈殿させた
。６０００ｒｐｍｌｏ分間の遠心分離により沈、殴物を
集め、ＴＥバッファー（１０ｍ Ａ Ｔｒｉｓ −ＨＣ
ｌ 、 ｐｌｉ ７．５．１ ｍＡｆ ＥＤＴＡ ）
’を溶解し、そｎにＣｓＣ１及びＥｔＢｒを加え、常法
に従い平衡密夏広配遠心分力ｌ法により２μｍプラスミ
ドＤＮＡを得た。
５−１０３９）をＹＥＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵
母エキス、２％グルコース） １ ｌｉｔで３０℃１８
時間撮とう培養し、遠心分離（５００ｏｒｐｍ、５分間
）するＣとにより集菌した。、０ノ１１ノルビト一ルｋ
ｇむ５０ｍ１′ｖｉリン酸カリバツフアーＣｐＨ７，５
） １０ Ｍで１回洗滌後、同バッファー５０ａ／ｒこ
懸濁した。５０μｌのβ−メルカフトエタノール及び５
０１ｎ９ＺｙｍｏＬｙａｓｅ ６０ｆ（（生化学工業）
を加え３０℃で３０分間加温することによりプロトプラ
ストを調製した。５０−の、２Ｍノルビトールでプロド
ブ２スト２洗滌後、３０ ＋ｉの蒸面水に懸濁し１０ｉ
の０．５Ｍ ＥＤＴＡ ＣｐＨ８，０）を加えプロトプ
ラストを均一にした後同餐量の２％ＳＤＳを加え室温［
１５分間置くことにより）−ロトブラストを溶解させた
。次に一答の５ＭＮａＣ６を加えＯ℃１５時間放置した
。１８０００ｒｐｍ、 ４０分間遠心分離し、その上清
：（１０％（Ｗ／ ｖ ）のＰＥＧ６０００’ｌ：加え
Ｏ℃１時間放置してｐｇａを溶解させ核酸き沈殿させた
。６０００ｒｐｍｌｏ分間の遠心分離により沈、殴物を
集め、ＴＥバッファー（１０ｍ Ａ Ｔｒｉｓ −ＨＣ
ｌ 、 ｐｌｉ ７．５．１ ｍＡｆ ＥＤＴＡ ）
’を溶解し、そｎにＣｓＣ１及びＥｔＢｒを加え、常法
に従い平衡密夏広配遠心分力ｌ法により２μｍプラスミ
ドＤＮＡを得た。
上述の様にして得た２μｍＤＮＡ３μＩを１０ユニツト
のＰｓｔＩｆ用い完全に分解した。又、２μｙのｐＢＲ
３２２を６ユニツトのＰｓｔ（を用いて完全に分解した
。この両ＤＮＡ分解物を混合後２倍造のエタノールを用
い、沈殿としてＤＮＡを回収した。このＤＮＡを２０μ
ｊのライゲーショ７反Ｌ６液Ｃ２０ｍｔ’ｙｌＴｒｉｓ
−ＭＣＩ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭｔ’１ｇＣｌ！１１
ｍＩＷ ＡＴ Ｐ １１０ ｍＭＤＴ Ｔ ） に溶
解後、５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い１５℃１
８時間ライゲーうヨンを行った。この反応を用い常ｆｂ
に従いカルンウム法により大腸菌に形質転換した。テト
ラサイタリン耐性、アノピシリン感受性形質転換体を解
析した結果、第１図に示したｐＹＥ３００１ａ、ｐＹＥ
３００ ｌ ｂ、 ７）ＹＥ３００１−ｃｐＹＥ３００
１ ｄの４ｆｍの２ｔｔｒｎＤＮＡ−ｐＢＲ３２２プラ
スミドが得られた。
のＰｓｔＩｆ用い完全に分解した。又、２μｙのｐＢＲ
３２２を６ユニツトのＰｓｔ（を用いて完全に分解した
。この両ＤＮＡ分解物を混合後２倍造のエタノールを用
い、沈殿としてＤＮＡを回収した。このＤＮＡを２０μ
ｊのライゲーショ７反Ｌ６液Ｃ２０ｍｔ’ｙｌＴｒｉｓ
−ＭＣＩ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭｔ’１ｇＣｌ！１１
ｍＩＷ ＡＴ Ｐ １１０ ｍＭＤＴ Ｔ ） に溶
解後、５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い１５℃１
８時間ライゲーうヨンを行った。この反応を用い常ｆｂ
に従いカルンウム法により大腸菌に形質転換した。テト
ラサイタリン耐性、アノピシリン感受性形質転換体を解
析した結果、第１図に示したｐＹＥ３００１ａ、ｐＹＥ
３００ ｌ ｂ、 ７）ＹＥ３００１−ｃｐＹＥ３００
１ ｄの４ｆｍの２ｔｔｒｎＤＮＡ−ｐＢＲ３２２プラ
スミドが得られた。
２、 ｐＹＥ３２０２及ＵｐＳＣ３２０２ＬＤｍ成（
第２図） 上記１で得られた４種のうちｐ）’Ｅ３００１ｃＫ、Ｙ
Ｒｐ ７ Ｃ３ｔｒｕｈｌ、に、らＰｒｏｃ 、 Ｎａ
ｔ ｌ 、 Ａｃａｄ 。
第２図） 上記１で得られた４種のうちｐ）’Ｅ３００１ｃＫ、Ｙ
Ｒｐ ７ Ｃ３ｔｒｕｈｌ、に、らＰｒｏｃ 、 Ｎａ
ｔ ｌ 、 Ａｃａｄ 。
Ｓｃｉ、Ｕ、ＳＡ ７６ （１９７９）１０３５−１０
３９）より得られるＴＲＰ１＋遺伝子を付加したｐＹＥ
３２０２それよりｐＢＲ３２２の領域を除いたｐｓｃ３
２０２を造成した。又これらは外来遺伝子発現ユニット
（プロモーター、発現遺伝子、ターミネータを含むもの
）の挿入部位としてＥｒｔｅＩ１１部位を付加しである
。
３９）より得られるＴＲＰ１＋遺伝子を付加したｐＹＥ
３２０２それよりｐＢＲ３２２の領域を除いたｐｓｃ３
２０２を造成した。又これらは外来遺伝子発現ユニット
（プロモーター、発現遺伝子、ターミネータを含むもの
）の挿入部位としてＥｒｔｅＩ１１部位を付加しである
。
５μｙのＹＲｐ７を０．５ユニツトのＥｃｏノτＩを用
いて部分的に分解し、−ケ所のみ切断さｎたＤＮ／１分
子を寒天電気泳動により分解後、寒天片より嶋気泳動法
（ｅｔｅｃｔｒｏｅｔｕｌｅ法）によりＤＮＡ分子遊離
させ、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した
。ＣのＤＮＡを５０μぎの０．５ｍＭｄ Ａ Ｔ Ｐ−
、Ｏ−５ｍＭ Ｔ Ｔ Ｐｔ苫む’Ｚ’Ａバッファー（
Ｐａｔｒｉｃｋ Ｈ，Ｏ’ｌｉ’ａｒｒｔｔｌｌ ら
ＭＧＧＬ７９（１９８０）７）４２１−４３５）に溶解
し、２ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加え３７℃
で４５分間反応させることによりＥｒ’ｃｏｌｔｌで生
じた粘着末端（ｃｏｈｅａｓｉｎｇ ｅｎｄ） ｆうめ
平ｔＢ末嬬（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）とした後、Ｄ ＮＡ
金工タール沈殿で回収した。Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて５′末をリン酸化したＢｃｔｌ ｎ Ｉ
Ｉンカー（タカラ社製）０．５μｇと共に２０μｌのラ
イゲーション反応液に溶解し５ユニツトのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用い前述の様にライゲーションを行った。この
反応液を用いてＥ、ｃｏＬｉを形質転換し、プラスミド
ＹＲｐ ７− Ｂｑｌ ＩＩを有する形質転換体を得え
、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離ｌＦｉ？製した。
いて部分的に分解し、−ケ所のみ切断さｎたＤＮ／１分
子を寒天電気泳動により分解後、寒天片より嶋気泳動法
（ｅｔｅｃｔｒｏｅｔｕｌｅ法）によりＤＮＡ分子遊離
させ、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した
。ＣのＤＮＡを５０μぎの０．５ｍＭｄ Ａ Ｔ Ｐ−
、Ｏ−５ｍＭ Ｔ Ｔ Ｐｔ苫む’Ｚ’Ａバッファー（
Ｐａｔｒｉｃｋ Ｈ，Ｏ’ｌｉ’ａｒｒｔｔｌｌ ら
ＭＧＧＬ７９（１９８０）７）４２１−４３５）に溶解
し、２ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加え３７℃
で４５分間反応させることによりＥｒ’ｃｏｌｔｌで生
じた粘着末端（ｃｏｈｅａｓｉｎｇ ｅｎｄ） ｆうめ
平ｔＢ末嬬（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）とした後、Ｄ ＮＡ
金工タール沈殿で回収した。Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて５′末をリン酸化したＢｃｔｌ ｎ Ｉ
Ｉンカー（タカラ社製）０．５μｇと共に２０μｌのラ
イゲーション反応液に溶解し５ユニツトのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用い前述の様にライゲーションを行った。この
反応液を用いてＥ、ｃｏＬｉを形質転換し、プラスミド
ＹＲｐ ７− Ｂｑｌ ＩＩを有する形質転換体を得え
、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離ｌＦｉ？製した。
一方ｐＹＥ３００１ｃｔｌｉｐａＩｃ平滑末端）で分解
後、前述の様にＢＱ、ｌｌ ｎリンカ−と共にライグー
ション後大１１ｊｌＩＬｍ Ｋ形質転換し、ｐＹＡ”
３００１ ｃ −Ｂｃｔｌ ＩＩ金有する形質転換体を
得、常法に従いプラスミドＤ ｉ’Ｊ Ａ ｆ分ｊＨ１
１Ｊ シタ、 ＹＲｐ ７− Ｂｃｔｌ ＩＩ ５ ｔ
ｔＦｌ ｔ１５ユニットのＢｇｌ ＩＩ、１５ユニツト
のＰｓｔＩを用いて完全に分解後１％寒天′−気泳動で
分離後、ＴＲＰ１’ｔｊｌむＤＮＡ１析片ｆ （ｅｌｅ
ｃｔｒｏｅＬｕｔｅ）去て溶出衾、エタノール沈殿にて
回収した。一方ｐＹＭ３υＯＩＣ−ＢｇｌＩ１５μＩを
１５ユニツトのＢａ１ｌ［，１ユニツトのＰｓｔＩを用
いてＢＱＩ Ｉｆは完全に分水、ｌ′Ｓｔｌは部分的に
分、“ゴ凌１ｊ省で二人・ｄ気泳動で分離後ｐＢＲ３２
２のすべての領域及び大部分の２μｍＤＮＡ′碩域を持
つＤＮＡ断片を前述のｅｌｅｃｔｒｏｅＬｕｔｅ法に抽
出した後エタノール沈、投にて回収した。この両ＤＮＡ
Ｉｆｒ片を前述の様にライゲーションし、その反応液金
柑いて大腸菌を・し負転換し、ｐＹＥ３２０２＜図２）
を苫む形質転換体を得た。常法に従いｐＹＥ３２０２プ
ラスミドＤＮＡｆ分離精装した。このプラスミドＤ Ｎ
、４を用い酵母Ｓ ＨＹ ２ （ｃｉｒｏ）に形質転換
した。
後、前述の様にＢＱ、ｌｌ ｎリンカ−と共にライグー
ション後大１１ｊｌＩＬｍ Ｋ形質転換し、ｐＹＡ”
３００１ ｃ −Ｂｃｔｌ ＩＩ金有する形質転換体を
得、常法に従いプラスミドＤ ｉ’Ｊ Ａ ｆ分ｊＨ１
１Ｊ シタ、 ＹＲｐ ７− Ｂｃｔｌ ＩＩ ５ ｔ
ｔＦｌ ｔ１５ユニットのＢｇｌ ＩＩ、１５ユニツト
のＰｓｔＩを用いて完全に分解後１％寒天′−気泳動で
分離後、ＴＲＰ１’ｔｊｌむＤＮＡ１析片ｆ （ｅｌｅ
ｃｔｒｏｅＬｕｔｅ）去て溶出衾、エタノール沈殿にて
回収した。一方ｐＹＭ３υＯＩＣ−ＢｇｌＩ１５μＩを
１５ユニツトのＢａ１ｌ［，１ユニツトのＰｓｔＩを用
いてＢＱＩ Ｉｆは完全に分水、ｌ′Ｓｔｌは部分的に
分、“ゴ凌１ｊ省で二人・ｄ気泳動で分離後ｐＢＲ３２
２のすべての領域及び大部分の２μｍＤＮＡ′碩域を持
つＤＮＡ断片を前述のｅｌｅｃｔｒｏｅＬｕｔｅ法に抽
出した後エタノール沈、投にて回収した。この両ＤＮＡ
Ｉｆｒ片を前述の様にライゲーションし、その反応液金
柑いて大腸菌を・し負転換し、ｐＹＥ３２０２＜図２）
を苫む形質転換体を得た。常法に従いｐＹＥ３２０２プ
ラスミドＤＮＡｆ分離精装した。このプラスミドＤ Ｎ
、４を用い酵母Ｓ ＨＹ ２ （ｃｉｒｏ）に形質転換
した。
５ＨＹ２Ｃｃｉｒ０〕株は５ＨＹ２ （Ｙｅａｓｔ ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒ ； Ｒ−Ｍｏ
ｒｔｉｍｅ Ｕｎｉｖ、 ｏｆ Ｃａｔｉｆｏｒｎｉα
より入手できる）より次に示す方法により分能した。５
ＨＹ２をｐＪＤＢ２１９で形質転換し、ＬＥＵ 形質転
換体を得、ＹＥＰＤ培地で２０世代培養後ＹＥＰＤ寒天
培地にプレート当り１００〜２００コｏニーとなる）禾
にプレートした。
ｅｎｅｔｉｃｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒ ； Ｒ−Ｍｏ
ｒｔｉｍｅ Ｕｎｉｖ、 ｏｆ Ｃａｔｉｆｏｒｎｉα
より入手できる）より次に示す方法により分能した。５
ＨＹ２をｐＪＤＢ２１９で形質転換し、ＬＥＵ 形質転
換体を得、ＹＥＰＤ培地で２０世代培養後ＹＥＰＤ寒天
培地にプレート当り１００〜２００コｏニーとなる）禾
にプレートした。
ウラシル、トリブトフマン、ヒスチジン金言む液小培地
（０，６７％Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇａ
ｎ ｂａ−ｓｅｔ２Ｘｆルコース、２％寒天）にレプリ
カレロイシン要求性となったクローンを得た。これらの
クローンのプラスミドＤＮＡＣ存在’ｋＦＪ便法（３ｔ
ｒｕｈｌ ら、ＰＮＡＳ−７６１０３５−１０３９）
（１９７９））にて検索し、２μｍＤＮＡが欠失したク
ローンＳＲ’Ｙ ２ （ｃｉｒｏ）を得た。
（０，６７％Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇａ
ｎ ｂａ−ｓｅｔ２Ｘｆルコース、２％寒天）にレプリ
カレロイシン要求性となったクローンを得た。これらの
クローンのプラスミドＤＮＡＣ存在’ｋＦＪ便法（３ｔ
ｒｕｈｌ ら、ＰＮＡＳ−７６１０３５−１０３９）
（１９７９））にて検索し、２μｍＤＮＡが欠失したク
ローンＳＲ’Ｙ ２ （ｃｉｒｏ）を得た。
ＳＨＹ ２ ［ｃｉｒ０〕 のｐＹＥ３２０２ＴＲＰ＋
形質転換体はｐＹＥ３２０２と同じ大きさのプラスミド
ＤＮＡ（！−有していた。次に簡便法にてこのプラスミ
ドを分離後再び大腸菌に形５！ｉ、転換した。得られた
テトラサイクリン耐性形質転換体を検討した結果２１頌
のプラスミドが得られた。種々の制限薄紫を用いてこの
２狸について検討した結果１つはｐＹＥ３２０２と同一
であった。他の１つは２つのＩＲ：配列間で分子内組み
換えにより生じたと考えられるものであった。また大腸
菌形質転換体がｐＹＥ３２０２とｐＹＥ３２０２組み換
えプラスミド金言有する比がほぼ１：１であった。これ
は２μｍ Ｄ Ｎ Ａが酵母細胞でみられるＩＲ配列を
介する組み換え現象き酷似していた。
形質転換体はｐＹＥ３２０２と同じ大きさのプラスミド
ＤＮＡ（！−有していた。次に簡便法にてこのプラスミ
ドを分離後再び大腸菌に形５！ｉ、転換した。得られた
テトラサイクリン耐性形質転換体を検討した結果２１頌
のプラスミドが得られた。種々の制限薄紫を用いてこの
２狸について検討した結果１つはｐＹＥ３２０２と同一
であった。他の１つは２つのＩＲ：配列間で分子内組み
換えにより生じたと考えられるものであった。また大腸
菌形質転換体がｐＹＥ３２０２とｐＹＥ３２０２組み換
えプラスミド金言有する比がほぼ１：１であった。これ
は２μｍ Ｄ Ｎ Ａが酵母細胞でみられるＩＲ配列を
介する組み換え現象き酷似していた。
次にｐＹＥ３２０２ １０μ、！／を３０ユニツトのＰ
Ｓｔｌで分解後得られる約７．６ ／ｃ ｂ （’）
Ｄ ／’／ Ａ 断片（ｐＢＲ３２２の領域を除いたも
の）を寒天心ｌ泳動により分離後、ｅｌｔｔｃｔｒｏｅ
１ｗｔｅ法で溶出し、エタール沈殿で回収したのち、前
述のライゲージ３フ反応を行い、その反応液を用いて酵
母５ＨＹ２〔ｃｉｒ０〕に形質転換した。ＴＲＰ 形
′ｊＡ転換体を簡単法で解析した結果ｉ２ｆｇのｐｓｃ
３２０２を含んでいた。又その量は５ＨＹ２＜２μｍＤ
ＮＡ＋株）の２μｍ Ｄ Ｎ Ａとほぼ同道含んでいた
ことか、寒天゛成気泳動後ＥｔＢｒ染色することにより
認められた。又ｐＹＥ３２０２の場合ンまｐｓｃ３２０
２の約３であった。又このｐｓｃ３２０２形質転換体よ
り、前述（実施例１０項）の方法によりプラスミドＤＮ
Ａを分離し、各種の’＋１ｉｌｌ限酵累を用いて解析し
た結果、ｐＹＥ３２０２と同様にＩＲ配列を介する分子
内組み換えを起していた。又その蚕比ＣｐＳＣ３２０２
とｐＳＣ３２０２Ａ且み侠えフ′ラスミド）はほぼｌ：
ｌであった。以上の３Ｖ ＭＥよりｐｓｃ３２０２は２
μフルＤＮＡとほぼ同ｊ五、酵母細胞内で安定に保持さ
れる高コピー微ベタクーとして期待できた。しかしその
安定性を非選沢下で検討したところ、約９５％であった
。安定性の検討は次の方法で行った。ｌＯ世代非選択下
（ＹＥＰＤ培地）で培養後、ＹＥＰＤ寒天培地にプレー
トし、ＴＲＰ＋とＴＲＰ−のコロニーをレプリカ法によ
り判定した。安定性（保持率）はＹＥＰＤ上に生じたコ
ロニー数を１００％としたときのＴＲＰ＋コロニー数で
算出した。プ２スミト数が多いにもかかわらず安定性が
予想以上に低い（約９５％）ので詳細に検討した結果、
用いたＤ１３−ＩＡ由米の２１ｔｍプラスミドはＡ３６
４ｃなどのものに比べ約１００ ｂｐ短かく、その部分
がＲＥＰ３又はＳＴＢと呼ばれる領域であることが知れ
た。このＤＮＡ配列の欠落が保持率に悪影響を及ぼした
のではないかと考えられる。そこで次にこのＤ ｔＶ
Ａ配列を有するｐＹＥ３２０７ｃの造成を行った。
Ｓｔｌで分解後得られる約７．６ ／ｃ ｂ （’）
Ｄ ／’／ Ａ 断片（ｐＢＲ３２２の領域を除いたも
の）を寒天心ｌ泳動により分離後、ｅｌｔｔｃｔｒｏｅ
１ｗｔｅ法で溶出し、エタール沈殿で回収したのち、前
述のライゲージ３フ反応を行い、その反応液を用いて酵
母５ＨＹ２〔ｃｉｒ０〕に形質転換した。ＴＲＰ 形
′ｊＡ転換体を簡単法で解析した結果ｉ２ｆｇのｐｓｃ
３２０２を含んでいた。又その量は５ＨＹ２＜２μｍＤ
ＮＡ＋株）の２μｍ Ｄ Ｎ Ａとほぼ同道含んでいた
ことか、寒天゛成気泳動後ＥｔＢｒ染色することにより
認められた。又ｐＹＥ３２０２の場合ンまｐｓｃ３２０
２の約３であった。又このｐｓｃ３２０２形質転換体よ
り、前述（実施例１０項）の方法によりプラスミドＤＮ
Ａを分離し、各種の’＋１ｉｌｌ限酵累を用いて解析し
た結果、ｐＹＥ３２０２と同様にＩＲ配列を介する分子
内組み換えを起していた。又その蚕比ＣｐＳＣ３２０２
とｐＳＣ３２０２Ａ且み侠えフ′ラスミド）はほぼｌ：
ｌであった。以上の３Ｖ ＭＥよりｐｓｃ３２０２は２
μフルＤＮＡとほぼ同ｊ五、酵母細胞内で安定に保持さ
れる高コピー微ベタクーとして期待できた。しかしその
安定性を非選沢下で検討したところ、約９５％であった
。安定性の検討は次の方法で行った。ｌＯ世代非選択下
（ＹＥＰＤ培地）で培養後、ＹＥＰＤ寒天培地にプレー
トし、ＴＲＰ＋とＴＲＰ−のコロニーをレプリカ法によ
り判定した。安定性（保持率）はＹＥＰＤ上に生じたコ
ロニー数を１００％としたときのＴＲＰ＋コロニー数で
算出した。プ２スミト数が多いにもかかわらず安定性が
予想以上に低い（約９５％）ので詳細に検討した結果、
用いたＤ１３−ＩＡ由米の２１ｔｍプラスミドはＡ３６
４ｃなどのものに比べ約１００ ｂｐ短かく、その部分
がＲＥＰ３又はＳＴＢと呼ばれる領域であることが知れ
た。このＤＮＡ配列の欠落が保持率に悪影響を及ぼした
のではないかと考えられる。そこで次にこのＤ ｔＶ
Ａ配列を有するｐＹＥ３２０７ｃの造成を行った。
ａ ｐＹＥ３２０７（Ｄ造成（第３図）ｐＹＥ３２０
２のＲＥＰ３Ｃ又は５ＴＢ）領域ｆ：ｐＪＤＢ２１９の
それと置き換えることによりｐＹＥ３２０７を作製した
、ｐＪＤＢ２１９ ５μりを１５ユニツトのｌ１ｐａ
ｌで完全に分解後、Ｅａｔ ［１リンカ−と共にライゲ
ーションすることにより、前述の方法によりＨｐａ １
部位にＥｇｔ■切断点を有するｐＪＤＢ２１９−Ｂｒｔ
Ｌｎを得た。、ＪＤＢ２１９−Ｂｇｔ■５μｍを１５ユ
ニツトのＢＱｔ■及び１５ユニツトのＸｂａｌを用い完
全に分解し、前述の方法によりＲＥＰ３領域を含むＤＮ
ＡＶｆｒ片を得た。一方７）ＹＥ３２０２ ５μ７を１
５ユニツトのｓｇｔ■を用いて完全に分解後α５ユニツ
トＸｂα１を用いて部分的に分解し、前述の方法により
ＲＥＰ３領域（ＢｇｔＩｆ −Ｘｂａ １断片）を除い
たＤＮＡ断片を得た。この両ＤＮＡ断片を混合しライゲ
ーションし、前述の方法によｐｐＹＥ３２０７を得た。
２のＲＥＰ３Ｃ又は５ＴＢ）領域ｆ：ｐＪＤＢ２１９の
それと置き換えることによりｐＹＥ３２０７を作製した
、ｐＪＤＢ２１９ ５μりを１５ユニツトのｌ１ｐａ
ｌで完全に分解後、Ｅａｔ ［１リンカ−と共にライゲ
ーションすることにより、前述の方法によりＨｐａ １
部位にＥｇｔ■切断点を有するｐＪＤＢ２１９−Ｂｒｔ
Ｌｎを得た。、ＪＤＢ２１９−Ｂｇｔ■５μｍを１５ユ
ニツトのＢＱｔ■及び１５ユニツトのＸｂａｌを用い完
全に分解し、前述の方法によりＲＥＰ３領域を含むＤＮ
ＡＶｆｒ片を得た。一方７）ＹＥ３２０２ ５μ７を１
５ユニツトのｓｇｔ■を用いて完全に分解後α５ユニツ
トＸｂα１を用いて部分的に分解し、前述の方法により
ＲＥＰ３領域（ＢｇｔＩｆ −Ｘｂａ １断片）を除い
たＤＮＡ断片を得た。この両ＤＮＡ断片を混合しライゲ
ーションし、前述の方法によｐｐＹＥ３２０７を得た。
このｐＹＥ３２０７によって形質転換された大腸菌ＣＪ
Ａ２２１／７）ＹＥ３２０７）を８８Ｍ２７２として微
工研に寄託した（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−７７２５）
。この’Ｉ）ＹＥ３２０７に含まれる２μｍＤＮＡの領
域は天然に存在するもの例えばＡ３６４ａに含まれる２
ｐ ｍ Ｄ ＃ Ａ Ｋ比べＨｐａ １−ＰｓｔＩ間
（３１２塩基対）の部分が欠けていた。
Ａ２２１／７）ＹＥ３２０７）を８８Ｍ２７２として微
工研に寄託した（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−７７２５）
。この’Ｉ）ＹＥ３２０７に含まれる２μｍＤＮＡの領
域は天然に存在するもの例えばＡ３６４ａに含まれる２
ｐ ｍ Ｄ ＃ Ａ Ｋ比べＨｐａ １−ＰｓｔＩ間
（３１２塩基対）の部分が欠けていた。
ｐＹＥ３２０７にこの領域を付加したｐＹＥ３２１７の
作製に関しては後述する。
作製に関しては後述する。
ｐｉ′Ａ’３２０７のただ１つの制限酵素部位であるＢ
ｇｌ １１切断部位に発現単位（プロモーター、外来性
構造遺伝子、ターミネータ−を含むもの）を挿入し、ｐ
ＢＲ３２２の領域金除いた酵母発現プラスミドを作製し
た。発現させる遺伝子としては化学合成したヒトγ−Ｉ
ＮＦｔコードする遺伝子（！爵―昭５８−２０１９９号
公報）およびヒト白血球ｍＲＮＡから得られるヒトｒ−
ＩＮＦ ｃＤＮＡに相当する遺伝子を用い、プロモー
ターとしては酵母酸性フォスファターゼの遺伝子を用い
、ターミネータはＧＡＰ ＜ＧＬｙｃｅｒ ａｌｄｅｈ
ｙｄｅ ３−Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｇｎａ
ｓｅ ）の遺伝子（特開昭５９−７４９８６号公報）と
用いた。これらの各発現機能単位（プロモーター、構造
遺伝子又はターミネータ−）を含むプラスミドとして、
例えばｐＹＧＩＦ２１２は化学合成によって作られたヒ
トーｒ−ＩＦＮ遺伝子又はｐＹＧＩＦＬｍ２１２はｒｎ
ＲｔＶ Ａ １ リＷ４られたヒト−γ−ＩＦＮに相
当する遺伝子をＰＨ０５プロモーター遺伝子、ＧＡＰの
ターミネ−遺伝子をそれぞれ上流又は下流に結合させた
発現単位を含み、２μｓ Ｄ Ｎ ＡのＱｒｉを含む領
域とＴ ＲＰ １ ”遺伝子及びｐＢＲ３２２のＱｒｉ
及びβ−１ｃＬｃ ｔα？ＦＩ５ ｓ ｅ遺伝子を富む
酵母−大腸菌シャトルベクターである。
ｇｌ １１切断部位に発現単位（プロモーター、外来性
構造遺伝子、ターミネータ−を含むもの）を挿入し、ｐ
ＢＲ３２２の領域金除いた酵母発現プラスミドを作製し
た。発現させる遺伝子としては化学合成したヒトγ−Ｉ
ＮＦｔコードする遺伝子（！爵―昭５８−２０１９９号
公報）およびヒト白血球ｍＲＮＡから得られるヒトｒ−
ＩＮＦ ｃＤＮＡに相当する遺伝子を用い、プロモー
ターとしては酵母酸性フォスファターゼの遺伝子を用い
、ターミネータはＧＡＰ ＜ＧＬｙｃｅｒ ａｌｄｅｈ
ｙｄｅ ３−Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｇｎａ
ｓｅ ）の遺伝子（特開昭５９−７４９８６号公報）と
用いた。これらの各発現機能単位（プロモーター、構造
遺伝子又はターミネータ−）を含むプラスミドとして、
例えばｐＹＧＩＦ２１２は化学合成によって作られたヒ
トーｒ−ＩＦＮ遺伝子又はｐＹＧＩＦＬｍ２１２はｒｎ
ＲｔＶ Ａ １ リＷ４られたヒト−γ−ＩＦＮに相
当する遺伝子をＰＨ０５プロモーター遺伝子、ＧＡＰの
ターミネ−遺伝子をそれぞれ上流又は下流に結合させた
発現単位を含み、２μｓ Ｄ Ｎ ＡのＱｒｉを含む領
域とＴ ＲＰ １ ”遺伝子及びｐＢＲ３２２のＱｒｉ
及びβ−１ｃＬｃ ｔα？ＦＩ５ ｓ ｅ遺伝子を富む
酵母−大腸菌シャトルベクターである。
それぞれのプラスミドで形質転換された大１揚菌＜、１
Ａ２２ｘ／ｐＹＧＩＦ２１２、およびＪＡ２２１／ｐＹ
ＧＩＦＬｍ２１２）１１それぞれ８３Ｍ２７３、および
ＳＢＭ２７４として微工研に寄託した（寄託番号：ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７７２６およびｐｐ：Ｒ，Ｖ ｐ−７７２
７）。
Ａ２２ｘ／ｐＹＧＩＦ２１２、およびＪＡ２２１／ｐＹ
ＧＩＦＬｍ２１２）１１それぞれ８３Ｍ２７３、および
ＳＢＭ２７４として微工研に寄託した（寄託番号：ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７７２６およびｐｐ：Ｒ，Ｖ ｐ−７７２
７）。
ｐＹＧＩＦ２１２、ｐＹＧＩＦＬｍ２１２の発現単位の
両末端にＢｃＬｍＨ１部位を付加したＪ） Ｎ Ａ断片
を得る為にｆｌ ａ ｍＨＩリンカ−を介してｐＨＩ（
３２２にクローニングした。ｐＹＧＩＦ２１２（又はｐ
ＹＧＩＦＬｍ２１２ ）５μｙ全２５二二ントの１ｆｉ
ｎｄｌｌｌて部分分解＜ｐＹＧＩＦＬｍ２１２の場合は
完全分解’）ｔｋ、Ｔ４ＤＮＡポリノラーゼ及び４ ｄ
ＮＴＰ （ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰと用
いてＪＪｉｎｄＩ■の粘着末端を平滑末端とした。
両末端にＢｃＬｍＨ１部位を付加したＪ） Ｎ Ａ断片
を得る為にｆｌ ａ ｍＨＩリンカ−を介してｐＨＩ（
３２２にクローニングした。ｐＹＧＩＦ２１２（又はｐ
ＹＧＩＦＬｍ２１２ ）５μｙ全２５二二ントの１ｆｉ
ｎｄｌｌｌて部分分解＜ｐＹＧＩＦＬｍ２１２の場合は
完全分解’）ｔｋ、Ｔ４ＤＮＡポリノラーゼ及び４ ｄ
ＮＴＰ （ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰと用
いてＪＪｉｎｄＩ■の粘着末端を平滑末端とした。
久ＶＣＩ乃Ｖ、４をエタール沈殿で回収後１０ユニツト
のＢａｒｎＨＩを用いて分解後、寒天電気泳動により約
、２ｋｂに相当するＤＮＡ断片（発現ユニットが含１れ
る）１に分離し、ｇｌｅｃｔｒｏ−ｅｔｕｔｇ 、エタ
ノール沈殿により回収した。一方、ｐＢＲ３２２２μｇ
を５ユニツトのＰ几ｉ、１０ユニツトのＢａｍＨＩｆ：
用いて完全に分解後Ａｐｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片（２
，（３７ｋｂ ）を前述の方法により分離後エタノール
沈殿により回収した。この両ＤＮＡ所片を混合し、ライ
ゲーション後前述の方法により１ンＢＲ３２２’−ＧＩ
Ｆ２１２Ｃ又はｐＢＲ３２２’−ＧＩＦＬＩル２１２）
ｅ得た。これらのプラスミドはｆ３ａｍｌｌｌで分解す
ることにより発現単位を得ることか出来た。
のＢａｒｎＨＩを用いて分解後、寒天電気泳動により約
、２ｋｂに相当するＤＮＡ断片（発現ユニットが含１れ
る）１に分離し、ｇｌｅｃｔｒｏ−ｅｔｕｔｇ 、エタ
ノール沈殿により回収した。一方、ｐＢＲ３２２２μｇ
を５ユニツトのＰ几ｉ、１０ユニツトのＢａｍＨＩｆ：
用いて完全に分解後Ａｐｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片（２
，（３７ｋｂ ）を前述の方法により分離後エタノール
沈殿により回収した。この両ＤＮＡ所片を混合し、ライ
ゲーション後前述の方法により１ンＢＲ３２２’−ＧＩ
Ｆ２１２Ｃ又はｐＢＲ３２２’−ＧＩＦＬＩル２１２）
ｅ得た。これらのプラスミドはｆ３ａｍｌｌｌで分解す
ることにより発現単位を得ることか出来た。
次に上記３０項で得られたＴ）ＹＥ３２０７゜Ｂｙｌ
ＩＩ ８位にこれらの発現単位をクローニングした。ｐ
ＹＥ３２０１ ２μＩを１０ユニツトのＢｇｔｕを用い
て完全に分解したもの及びｐＥＲ３２２’ −ＧＩＦ２
１２ （又はｐＢＲ３２２’−ＧＩＦＬｍ２１２）５μ
ｇを２０ユニツトのＢｒｒＨＩを用いて完全に分解後、
発現単位を含む約、２ｋｂのＤＮＡ断片を前述の方法に
より得たものを混合しライゲーション後、前述の方法に
よりｐＹＧＩＦ４１２（又は７）ＹＧＩＦＬｍ４１２
）ｔ”得た。このｐＹＧＩＦ４１２ １０μｓを３０ユ
ニツトのＰｓ ｔ Ｉを用いて完全に分解後、−ｐＢＲ
’ａ２２の領域で持たない。約７，６／ｃ６のＤＮＡ断
片（２μｙｎＤＮＡ、’Ｉ’ＲＰｌ＋遺伝子、ＧＩＦ発
現単位を含む）を分離後、３０μｔのライゲーション反
応液に溶解し２ユニントのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる
ことによシ環状にしたものを酵母５ＨＹＺＣｃｉｒＯに
プロトプラスト法によシ形質転換した。得られたＴＥＰ
＋形質転換体のプラスミドの存在を前述の簡便法によシ
検討したところすべて’７，６ｋｂに相当するプラスミ
ドを有していた。又−ＰｉＣＡ培地（２チカザミノ酸、
Ｍｙ＋＋とアンモニアで無機リンと除去したもの、２％
グルコースｔ ｔ ｔｒ −ＰｉＢｕｒｋｈｏｌｄｇｒ
培地、Ａ、ＴＯＨ−ＥらＪ、ＢａｃＬｅｒｉｏ１１１３
．７２７−７３８．１９７３）で３０℃で１８時間培養
した細胞を遠心分離で集め、１回、０Ｍソルビトールを
含む５０ ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７，０、で洗滌
後、Ｑ、１ ｍｌ ／ ｍｌのＺｙｍｏ−１ｙａｓｅ、
、０Ｍソルビトール、１０ ｒｎＭ ２−メルカプトエ
タノールを含む５０ ｍＡ（リン酸パンファーに懸濁し
、３０℃で１時間加温することにより細胞をプロトプラ
スト化した。このプロトプラストを１回、０Ｍソルビト
ールで洗滌後、５０ ｍｕＴｒｉｓ −ＨＣＬ ｐＨ
７，０１０ｍｕ ＮａＣｔ溶液に懸濁し、３回凍結・融
解することにより、プロトプラストを破壊した。１００
００ ｒｐｔｙｚ−、５分間の遠心分離によシ得た上清
両分の抗ウィルス活性を特開昭５８−２０１９９５号公
報に記載の方法により行った。その結果ＴＲＰ＋形質転
換体は１ｍｌ当り約１０００ユニツトの抗ウィルス活性
を示し、ヒトＩＦＮ−γの生産を認めた。
ＩＩ ８位にこれらの発現単位をクローニングした。ｐ
ＹＥ３２０１ ２μＩを１０ユニツトのＢｇｔｕを用い
て完全に分解したもの及びｐＥＲ３２２’ −ＧＩＦ２
１２ （又はｐＢＲ３２２’−ＧＩＦＬｍ２１２）５μ
ｇを２０ユニツトのＢｒｒＨＩを用いて完全に分解後、
発現単位を含む約、２ｋｂのＤＮＡ断片を前述の方法に
より得たものを混合しライゲーション後、前述の方法に
よりｐＹＧＩＦ４１２（又は７）ＹＧＩＦＬｍ４１２
）ｔ”得た。このｐＹＧＩＦ４１２ １０μｓを３０ユ
ニツトのＰｓ ｔ Ｉを用いて完全に分解後、−ｐＢＲ
’ａ２２の領域で持たない。約７，６／ｃ６のＤＮＡ断
片（２μｙｎＤＮＡ、’Ｉ’ＲＰｌ＋遺伝子、ＧＩＦ発
現単位を含む）を分離後、３０μｔのライゲーション反
応液に溶解し２ユニントのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる
ことによシ環状にしたものを酵母５ＨＹＺＣｃｉｒＯに
プロトプラスト法によシ形質転換した。得られたＴＥＰ
＋形質転換体のプラスミドの存在を前述の簡便法によシ
検討したところすべて’７，６ｋｂに相当するプラスミ
ドを有していた。又−ＰｉＣＡ培地（２チカザミノ酸、
Ｍｙ＋＋とアンモニアで無機リンと除去したもの、２％
グルコースｔ ｔ ｔｒ −ＰｉＢｕｒｋｈｏｌｄｇｒ
培地、Ａ、ＴＯＨ−ＥらＪ、ＢａｃＬｅｒｉｏ１１１３
．７２７−７３８．１９７３）で３０℃で１８時間培養
した細胞を遠心分離で集め、１回、０Ｍソルビトールを
含む５０ ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７，０、で洗滌
後、Ｑ、１ ｍｌ ／ ｍｌのＺｙｍｏ−１ｙａｓｅ、
、０Ｍソルビトール、１０ ｒｎＭ ２−メルカプトエ
タノールを含む５０ ｍＡ（リン酸パンファーに懸濁し
、３０℃で１時間加温することにより細胞をプロトプラ
スト化した。このプロトプラストを１回、０Ｍソルビト
ールで洗滌後、５０ ｍｕＴｒｉｓ −ＨＣＬ ｐＨ
７，０１０ｍｕ ＮａＣｔ溶液に懸濁し、３回凍結・融
解することにより、プロトプラストを破壊した。１００
００ ｒｐｔｙｚ−、５分間の遠心分離によシ得た上清
両分の抗ウィルス活性を特開昭５８−２０１９９５号公
報に記載の方法により行った。その結果ＴＲＰ＋形質転
換体は１ｍｌ当り約１０００ユニツトの抗ウィルス活性
を示し、ヒトＩＦＮ−γの生産を認めた。
ｐＹＥ３２１７はｐＹＥ３２０７に２１ｔｒｎＤＮＡＣ
Ｈｐａ ［−Ｐｓｔ ［領域を付加したプラスミドベク
ターでＹＲＰ７由来のＴＲＰ１遺伝子と２ ｐｍＤＮＡ
Ｃ全領域を持ち、ｐＹＥ：ｄ２０Ｔと同様にただ１つの
Ｅｇｔ ＩＴ 、部位（発現単位挿入部位）があシ、Ｐ
ｓｔＩによる分解でｐＢ８３２２の領域を除去できる様
になっている。ｐＸＥ：ｄｏｏｌ ５μＩを１５ユニツ
トのＨｐＧｌで完全に分解後Ｘｂａ Ｉ Ｏ１５ユニッ
トを用いて部分的に分解したのち前述の方法によりＲＥ
Ｐ８領域（Ｈｐａ Ｉ −Ｘｂａ Ｉ Ｅｒｒ片）を除
いたＤＮＡ断片を得た。一方７）ＪＤＢ２１９ ５μ夕
を１５ユニツトのＨｐＧｌ、１５ユニントのｘｂα１に
よシ完全に分解し、前述の方法によりｔ−ｔＥＰ３領域
ＤＮＡ断片（Ｈｐａ Ｉ Ｘｂａ ｌ断片）を前述の
方法で得た。この両者を混合しライゲーションすること
によジＲＥＰａ領域がｐＪＯ８２１９由米の断片を有す
る７）ＹＥ３００７を前述の方法により１けた。次にこ
のｐＹＥ３００７ ５μＩを０．５ユニツトのＰＥｔ■
で部分的に分解した後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼと４ｄＮ
ＴＰを用いてＰｓｔＩで生じた粘看末端を平とケ末端と
した後、Ｂｇｔ■りンカーと共（でライグー・／ヨンす
ることによりｐＹＥ３００Ｔ−Ｂｙｔ ＩＩを得た。ｐ
ＹＥ：ｄ００７−Ｅｒｙｌ［ｌ ５μ夕を１５ユニツ
トのＢＱｔ ｎ、１５ユニツトのＰｓｔ［て完全に分解
し２μｍＤＮＡＣ全配列を言むＤＮＡ断片を前述の方法
で得た。一方、ｐＹＥ３２０７５μｌを１５ユニツトの
ＢｇＬ １１を用いて完全に分解後０．５ユニツトのＰ
ｓｔＩによ９部分的に分解し、前述の方法でＴＲＰ１遺
伝子とｐＥＲ３２２の全領域を含むＤＮＡ断片を分離し
た。この両者を混合し、ライゲーションすることにより
ｐＹＥ３２１７を前述の方法で得た。
Ｈｐａ ［−Ｐｓｔ ［領域を付加したプラスミドベク
ターでＹＲＰ７由来のＴＲＰ１遺伝子と２ ｐｍＤＮＡ
Ｃ全領域を持ち、ｐＹＥ：ｄ２０Ｔと同様にただ１つの
Ｅｇｔ ＩＴ 、部位（発現単位挿入部位）があシ、Ｐ
ｓｔＩによる分解でｐＢ８３２２の領域を除去できる様
になっている。ｐＸＥ：ｄｏｏｌ ５μＩを１５ユニツ
トのＨｐＧｌで完全に分解後Ｘｂａ Ｉ Ｏ１５ユニッ
トを用いて部分的に分解したのち前述の方法によりＲＥ
Ｐ８領域（Ｈｐａ Ｉ −Ｘｂａ Ｉ Ｅｒｒ片）を除
いたＤＮＡ断片を得た。一方７）ＪＤＢ２１９ ５μ夕
を１５ユニツトのＨｐＧｌ、１５ユニントのｘｂα１に
よシ完全に分解し、前述の方法によりｔ−ｔＥＰ３領域
ＤＮＡ断片（Ｈｐａ Ｉ Ｘｂａ ｌ断片）を前述の
方法で得た。この両者を混合しライゲーションすること
によジＲＥＰａ領域がｐＪＯ８２１９由米の断片を有す
る７）ＹＥ３００７を前述の方法により１けた。次にこ
のｐＹＥ３００７ ５μＩを０．５ユニツトのＰＥｔ■
で部分的に分解した後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼと４ｄＮ
ＴＰを用いてＰｓｔＩで生じた粘看末端を平とケ末端と
した後、Ｂｇｔ■りンカーと共（でライグー・／ヨンす
ることによりｐＹＥ３００Ｔ−Ｂｙｔ ＩＩを得た。ｐ
ＹＥ：ｄ００７−Ｅｒｙｌ［ｌ ５μ夕を１５ユニツ
トのＢＱｔ ｎ、１５ユニツトのＰｓｔ［て完全に分解
し２μｍＤＮＡＣ全配列を言むＤＮＡ断片を前述の方法
で得た。一方、ｐＹＥ３２０７５μｌを１５ユニツトの
ＢｇＬ １１を用いて完全に分解後０．５ユニツトのＰ
ｓｔＩによ９部分的に分解し、前述の方法でＴＲＰ１遺
伝子とｐＥＲ３２２の全領域を含むＤＮＡ断片を分離し
た。この両者を混合し、ライゲーションすることにより
ｐＹＥ３２１７を前述の方法で得た。
ｐＹＥ３２１７は２ｔ１ｍＤＮＡＣ全領域、ＴＲＰ１遺
伝子を含んでおりただ１つのＢＱｔ ｎ部位があり、Ｐ
ｓｔＩでｐＢＲ３２２の全領域を除去することが出来る
プラスミドベクターで３．の項で得たｐＹＥ３２０に２
ｐｍＤＮＡＣＨｐａ ％ −Ｐｓｔ １間の３１２塩基
対が付加されたものである。次にこのｐＹＥ３２１７に
発現単位を挿入した発現プラスミドの作製を行った。発
現単位は上記４．の項で用いたもの（ＰＨ０５プロモー
ター、ヒトＩＦ、シーｒ、ＧＡＰターミネータ−）を４
の項で述べた同（１、＜の方法で挿入したｐＹＧＩＦ８
１２ （ｐＢＲ３２２乙Ｂａｍ−ＧＩＦ１２より発現単
位ｔイ（；たもの）、及びｐＹＧＩＦ Ｌｍ８１２ （
ｐＢＲ３２２ΔＢａｍ−ＧＩ ＦＬｒル１２よシ発現単
位を得たもの）を得た。又それぞれ４の項で述べた方法
でＰｓｔＩて分解し、それぞれｐＳＣｆＧＩＦ８１２お
よびｐＳＣ／ｌＧＩＦＬｍ８１２を得、酵母Ｓ Ｉｆ
Ｙ ２ （ｃｉｒＯ〕に形５４転換した。得られたＴ
ＲＰ＋形質転換体の−ＰｉＣＡ培地での生産性を前述の
方法により検討した結果、その抗ウィルス活性はｍｌ培
養液あた９１、りＬｏｔ、１００ユニット合成されてい
ることが確認された。
伝子を含んでおりただ１つのＢＱｔ ｎ部位があり、Ｐ
ｓｔＩでｐＢＲ３２２の全領域を除去することが出来る
プラスミドベクターで３．の項で得たｐＹＥ３２０に２
ｐｍＤＮＡＣＨｐａ ％ −Ｐｓｔ １間の３１２塩基
対が付加されたものである。次にこのｐＹＥ３２１７に
発現単位を挿入した発現プラスミドの作製を行った。発
現単位は上記４．の項で用いたもの（ＰＨ０５プロモー
ター、ヒトＩＦ、シーｒ、ＧＡＰターミネータ−）を４
の項で述べた同（１、＜の方法で挿入したｐＹＧＩＦ８
１２ （ｐＢＲ３２２乙Ｂａｍ−ＧＩＦ１２より発現単
位ｔイ（；たもの）、及びｐＹＧＩＦ Ｌｍ８１２ （
ｐＢＲ３２２ΔＢａｍ−ＧＩ ＦＬｒル１２よシ発現単
位を得たもの）を得た。又それぞれ４の項で述べた方法
でＰｓｔＩて分解し、それぞれｐＳＣｆＧＩＦ８１２お
よびｐＳＣ／ｌＧＩＦＬｍ８１２を得、酵母Ｓ Ｉｆ
Ｙ ２ （ｃｉｒＯ〕に形５４転換した。得られたＴ
ＲＰ＋形質転換体の−ＰｉＣＡ培地での生産性を前述の
方法により検討した結果、その抗ウィルス活性はｍｌ培
養液あた９１、りＬｏｔ、１００ユニット合成されてい
ることが確認された。
６、 ｐＹＥ３３２Ｂの作製（第５−１８よび５−２
図）今まで得られたベクターはＹＲＰＴ由来のＴＲＰｌ
ａ伝子をプスミミドベクタ−カとして含むものであった
が、トリプトファンと同様にウラシルもカザミノ酸には
ほとんど含１れず、その上池のペプチド分解物、例えば
ポリ、５２プトン、にもウラシルはほとんど言まれない
ことにより培地の選択性がＴＲＰ造伝子スミいた場合よ
りも広くなるのでウラシルの合成酵素の１つであるＵＲ
Ａ３遺伝子を選択マーカーとして持つベクターの作製を
行った。１ずＵＥＡ３ａ伝子のクスミ二／グを行った。
図）今まで得られたベクターはＹＲＰＴ由来のＴＲＰｌ
ａ伝子をプスミミドベクタ−カとして含むものであった
が、トリプトファンと同様にウラシルもカザミノ酸には
ほとんど含１れず、その上池のペプチド分解物、例えば
ポリ、５２プトン、にもウラシルはほとんど言まれない
ことにより培地の選択性がＴＲＰ造伝子スミいた場合よ
りも広くなるのでウラシルの合成酵素の１つであるＵＲ
Ａ３遺伝子を選択マーカーとして持つベクターの作製を
行った。１ずＵＥＡ３ａ伝子のクスミ二／グを行った。
Ｘ２１８０−ＩＢＣＭＡＴαＳＵＣ２ｍａｔ ｇａＬ２
ｃＵＰ１、Ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋｃ
ｅｎｔｅτ力リフオルニア大学バークレー校から入手可
能）の染色体ＤＮＡをＣｒ’）ｅγらの方広殆ｔｈｏｄ
ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１２ 、３
９−４４ ＋１９７５）に従って分離′ｎ製した。この
ＤＮＡ５０μｍを５０ユニツトのＨｉｎｄ ｍを用い完
全に分解後約１，２ｋｂに相当するＤＮＡ断片全寒天電
気泳動によシ分離し、前述の方法により精製した。
ｃＵＰ１、Ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋｃ
ｅｎｔｅτ力リフオルニア大学バークレー校から入手可
能）の染色体ＤＮＡをＣｒ’）ｅγらの方広殆ｔｈｏｄ
ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１２ 、３
９−４４ ＋１９７５）に従って分離′ｎ製した。この
ＤＮＡ５０μｍを５０ユニツトのＨｉｎｄ ｍを用い完
全に分解後約１，２ｋｂに相当するＤＮＡ断片全寒天電
気泳動によシ分離し、前述の方法により精製した。
尚、ＵＲＡ３遺伝子は、Ｋ、５ＴＲＵＨＬらによシ分離
されておシ、酵母プラスミド選択マーカーとして用いら
れておシ約、２ｋｂのＨｉｎｄｍ断片て傅られることか
報告されている。（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 。
されておシ、酵母プラスミド選択マーカーとして用いら
れておシ約、２ｋｂのＨｉｎｄｍ断片て傅られることか
報告されている。（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ 。
Ａｃａｄ Ｓｃｉ、ＵＳＡ ユ（３，１０３５−１０
，９９。
，９９。
この、２ ｋ ｂ Ｈｉｎｄ ｍ 断片をＹＥｐ１３Δ
ＢａｒｎのＨｉｎｄ ｌ１１部位にクローニングした。
ＢａｒｎのＨｉｎｄ ｌ１１部位にクローニングした。
ＹＥｐ１３ムＢａｍはＹＥｐ １３ （Ｊ、Ｂｒｏａｃ
ｈら、にｅｎｅ 旦、１２１−１３３．１９７９）５
μＪを１５ユニツトのＢａｍＦＩＩで分解後、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いてｆ３ａ、ｍＨＩ粘
号末端を平滑末端にした後１５ユニツトのＰｖ１Ｌ■で
完全分ｐｒ’を後、大きいＤＮＡ断片を前述の方法によ
り分ν；ａし、ライゲーションすることにより得た。Ｙ
Ｅｐ１３ΔＢａｒル３μＳを１５ユニツトのｌｉ’ｉｎ
ｄ Ｉｌｌで完全に分９ｉ’ｌ’ したものと先の、２
ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ断片？１昆合しＩ）’Ｉ述の
方法によシライゲーショ／した。こＯライゲータ３フ反
応液を大腸菌に形質転換し、３０００クローンよシ成る
ｇｅｎｅ ｂａｎｋ を得た。次にそれぞれ６００クロ
ーンを有する５つのグループに分けそれぞれのグループ
のプラスミドＤ ／Ｖ Ａ ｆ當法に従い分離精製した
。このプラスミドＤＮＡを共与ＤＮＡとして酵母５ＨＹ
２に形質転換し、ＬＥＵ＋ＵＲＡ＋となる形質転換体を
得た。次にこの形質転換体よシ前述の１Ｂ′５便法によ
りＤ ＮＡを旧出後、エタノール沈殿によシ回収した。
ｈら、にｅｎｅ 旦、１２１−１３３．１９７９）５
μＪを１５ユニツトのＢａｍＦＩＩで分解後、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いてｆ３ａ、ｍＨＩ粘
号末端を平滑末端にした後１５ユニツトのＰｖ１Ｌ■で
完全分ｐｒ’を後、大きいＤＮＡ断片を前述の方法によ
り分ν；ａし、ライゲーションすることにより得た。Ｙ
Ｅｐ１３ΔＢａｒル３μＳを１５ユニツトのｌｉ’ｉｎ
ｄ Ｉｌｌで完全に分９ｉ’ｌ’ したものと先の、２
ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ断片？１昆合しＩ）’Ｉ述の
方法によシライゲーショ／した。こＯライゲータ３フ反
応液を大腸菌に形質転換し、３０００クローンよシ成る
ｇｅｎｅ ｂａｎｋ を得た。次にそれぞれ６００クロ
ーンを有する５つのグループに分けそれぞれのグループ
のプラスミドＤ ／Ｖ Ａ ｆ當法に従い分離精製した
。このプラスミドＤＮＡを共与ＤＮＡとして酵母５ＨＹ
２に形質転換し、ＬＥＵ＋ＵＲＡ＋となる形質転換体を
得た。次にこの形質転換体よシ前述の１Ｂ′５便法によ
りＤ ＮＡを旧出後、エタノール沈殿によシ回収した。
このＪ） ＃ ＡをＴＥバフ７アー（１０ｍ１１ｆＴｒ
ｉｓ −ＨＣｔ、 １ ｍＡ（ＥＤＴＡ）にｐＨ８溶
解したもの金用い大腸菌を形質転換し、得られたアンピ
リンに耐性である形質転換体を得、そのプラスミドＤＮ
Ａを常法に従い、解析した結果的、２ｋｂの酵母Ｈｉｎ
ｄ ｆｆｌ ＤＮＡ断片が含まれていた。再びこのプ
ラスミドＤＮＡを５ＨＹＺ株に形質転換したところ多数
のＵＲＡ”形質転換体が得られそのクローンのすべてが
ＬＥＶ＋ＣあったことよりＵＲＡ３遺伝子を含んでいる
ことが確認できた。このプラスミドをＹＥｐＢΔＢａｍ
ＵＲＡ８とした。次にこのＵＲＡ３遺伝子を選択マーカ
ーとするベクターを作製した。又このＵＲＡ３遺伝子内
にはＰｓｔ１部位があるのでｐＢＲ３２２の除去はＢａ
ｍＨＩを用いて行える様にした。ＹＥｐ１３ΔＢａｍ−
ＵＲＡ ３ ５１’ｇを。
ｉｓ −ＨＣｔ、 １ ｍＡ（ＥＤＴＡ）にｐＨ８溶
解したもの金用い大腸菌を形質転換し、得られたアンピ
リンに耐性である形質転換体を得、そのプラスミドＤＮ
Ａを常法に従い、解析した結果的、２ｋｂの酵母Ｈｉｎ
ｄ ｆｆｌ ＤＮＡ断片が含まれていた。再びこのプ
ラスミドＤＮＡを５ＨＹＺ株に形質転換したところ多数
のＵＲＡ”形質転換体が得られそのクローンのすべてが
ＬＥＶ＋ＣあったことよりＵＲＡ３遺伝子を含んでいる
ことが確認できた。このプラスミドをＹＥｐＢΔＢａｍ
ＵＲＡ８とした。次にこのＵＲＡ３遺伝子を選択マーカ
ーとするベクターを作製した。又このＵＲＡ３遺伝子内
にはＰｓｔ１部位があるのでｐＢＲ３２２の除去はＢａ
ｍＨＩを用いて行える様にした。ＹＥｐ１３ΔＢａｍ−
ＵＲＡ ３ ５１’ｇを。
０．５ユニツトのＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて部分的に分
解後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰを用いて
粘着木端を平滑末端にした後、ＢａνｒＬＨＩ ’Ｊア
ンーとライゲーションし、前述の方法によりＹＥｐ １
ａΔＥａｍ Ｕ ＲＡ ８− ＢａｍＨＩＩ得た。又
ｐＢＲ８２２３ｐ９’ｔ１５ユニノ１の（３緒１１１て
児竺に分解後Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼとＯ：＃７’Ｐ
て粘着末端を平滑末端にした後、１５ユニツトのＰｖｖ
、 ＩＩて完全に分解後、ライゲーションし、前述の方
法によりｐＢＲｄ２２ΔＥａｍを得た。この７）ＥＲ３
２２ΔＢａｍはｐＢＥ３２２のＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ１９
ｓ’Ｊ（ｌ ６９０塩基対）が欠落したもので大腸菌内
で高コーピー数（ｐＢＲ３２２と比べ５〜８倍）となる
ので後の操作上（例えばプラスミドＤＮＡＣ分離）都合
がよい。
解後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰを用いて
粘着木端を平滑末端にした後、ＢａνｒＬＨＩ ’Ｊア
ンーとライゲーションし、前述の方法によりＹＥｐ １
ａΔＥａｍ Ｕ ＲＡ ８− ＢａｍＨＩＩ得た。又
ｐＢＲ８２２３ｐ９’ｔ１５ユニノ１の（３緒１１１て
児竺に分解後Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼとＯ：＃７’Ｐ
て粘着末端を平滑末端にした後、１５ユニツトのＰｖｖ
、 ＩＩて完全に分解後、ライゲーションし、前述の方
法によりｐＢＲｄ２２ΔＥａｍを得た。この７）ＥＲ３
２２ΔＢａｍはｐＢＥ３２２のＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ１９
ｓ’Ｊ（ｌ ６９０塩基対）が欠落したもので大腸菌内
で高コーピー数（ｐＢＲ３２２と比べ５〜８倍）となる
ので後の操作上（例えばプラスミドＤＮＡＣ分離）都合
がよい。
一方、上記５の項で得られたｐＹＥ８００Ｔ−Ｅｇｔ■
３μｙを１０ユニツトのＰｓｔＩで分解後Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰを用いて粘着末端を平滑末
端とした後、ＥａｍＨＩ ’Ｉンカーと共にライゲーシ
ョンし、前述の方法によｐ ｐＹＥ３００ ？−ＢａＬ
ＩＩ−ＢａｒｎＨＩを得た。ＹＥｐ１３ΔＢａｒｎ−Ｕ
ＲＡ８−ＢａｍＨＩ ５１１ｇを２０！−二７トのＨ
ｉｎｄｍで完全に分解後Ｓ Ｉ ｎｕｃｌｅａｓｅ を
用いて粘着末端を平滑末端とした後２０ユニツトの１３
ａｍＨｌ’を用いて完全に分解し、ＵＲＡ８’を言む約
、２ｋｂのＤＮＡ断片を前述の方法にょル得た。
３μｙを１０ユニツトのＰｓｔＩで分解後Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰを用いて粘着末端を平滑末
端とした後、ＥａｍＨＩ ’Ｉンカーと共にライゲーシ
ョンし、前述の方法によｐ ｐＹＥ３００ ？−ＢａＬ
ＩＩ−ＢａｒｎＨＩを得た。ＹＥｐ１３ΔＢａｒｎ−Ｕ
ＲＡ８−ＢａｍＨＩ ５１１ｇを２０！−二７トのＨ
ｉｎｄｍで完全に分解後Ｓ Ｉ ｎｕｃｌｅａｓｅ を
用いて粘着末端を平滑末端とした後２０ユニツトの１３
ａｍＨｌ’を用いて完全に分解し、ＵＲＡ８’を言む約
、２ｋｂのＤＮＡ断片を前述の方法にょル得た。
又ｐＹＥ３００７−Ｂｇｔ１１−ＢａｍＨＩ ５１１
ｇを２０ユニツトのＢＱｔ １１を用いて完全に分解後
、Ｔ ４ ＤＮＡポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰ を用い
て粘着末端を平均末端とした後２０ユニツトのＥａｍＨ
Ｉで完全に分解し２ｐｒｎＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約
６６２に６）を前述の方法によシ得た。上記の２つのＤ
ＮＡ断片をｐＢＲ３２２ΔＢａｍ Ｚ ｐｇを１０−
＋−二：ｙトのＢａｍＨＩで完全に分解したものと混合
した後、ライゲーションし、前述の方法でｐＹＥ３３２
８を得た。このｐＹＥ３３２１３はただ１つのＢｒａｔ
ｌ［部位（発現単位挿入部位）を持ち、ＢａｒｎＨＩ
で分解することによＦ）ｐＢＲ’８２２由来の領域を除
去することが出来るベクタープラスミドで酵母ではＵＲ
Ａ３が選択マーカーとなる。
ｇを２０ユニツトのＢＱｔ １１を用いて完全に分解後
、Ｔ ４ ＤＮＡポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰ を用い
て粘着末端を平均末端とした後２０ユニツトのＥａｍＨ
Ｉで完全に分解し２ｐｒｎＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約
６６２に６）を前述の方法によシ得た。上記の２つのＤ
ＮＡ断片をｐＢＲ３２２ΔＢａｍ Ｚ ｐｇを１０−
＋−二：ｙトのＢａｍＨＩで完全に分解したものと混合
した後、ライゲーションし、前述の方法でｐＹＥ３３２
８を得た。このｐＹＥ３３２１３はただ１つのＢｒａｔ
ｌ［部位（発現単位挿入部位）を持ち、ＢａｒｎＨＩ
で分解することによＦ）ｐＢＲ’８２２由来の領域を除
去することが出来るベクタープラスミドで酵母ではＵＲ
Ａ３が選択マーカーとなる。
次にこのｐＹＥ３３２８ に発現単位を挿入した。
発現単位は上記４．の項で用いたものを４の項で述べた
同様の方法で挿入したｐＹＧＩＦ９１２（ｐＢＲ３２２
ΔＢａｍ−ＧＩＦ１２よシ発現単位を得たもの）および
７）ＹＧＩＦＬｍ９１２（ｐＢＲ３２２ΔＢａｍ−ＧＩ
ＦＬｍ１２より発現単位を得たもの）を作製した。又そ
れぞれＢａｍＨＩで分解し、それぞれｐｓｃＧＩＦ９お
よびｐＳＣＧＩＦＬｍ９１２を得、酵母５ＨＹ２〔ｃｉ
ｒ０〕に形質転換した。得られたＵＲＡ十形質転換体の
−ＰｉＣＡ培地での生産性を前述の方法により検討した
結果、その抗ウィルス活性はＩｎｔ培養液あたシ約ｉ、
ｏ ｏ ｏ単位合成されていることが判った。
同様の方法で挿入したｐＹＧＩＦ９１２（ｐＢＲ３２２
ΔＢａｍ−ＧＩＦ１２よシ発現単位を得たもの）および
７）ＹＧＩＦＬｍ９１２（ｐＢＲ３２２ΔＢａｍ−ＧＩ
ＦＬｍ１２より発現単位を得たもの）を作製した。又そ
れぞれＢａｍＨＩで分解し、それぞれｐｓｃＧＩＦ９お
よびｐＳＣＧＩＦＬｍ９１２を得、酵母５ＨＹ２〔ｃｉ
ｒ０〕に形質転換した。得られたＵＲＡ十形質転換体の
−ＰｉＣＡ培地での生産性を前述の方法により検討した
結果、その抗ウィルス活性はＩｎｔ培養液あたシ約ｉ、
ｏ ｏ ｏ単位合成されていることが判った。
一
プラスミドの安定性を非選択下でプラスミド上にある選
択マーカーの有無で検討した。対照としては一般的に用
いられている２μｍＤＮＡＣａｄ起点及び選択マーカー
を含む酵母・大腸菌シャトルベクター（例えばｐＹＧＩ
ＦＬｍ２１２ ）を用いた。又発現ｔ ３’ｊ ４ Ｌ
、たときしないときの比較も行った。つ１勺、プラスミ
ド選択下（最小培地に２チカザミノ酸？添加）で前培養
したもの（特開昭５９−７４９８８号公報）を＋ＰｓＹ
ＰＤ培地又は−ＰｉＹＰＤ （発現を誘導する揚台）金
用い１０世代及び２０世代培養後、適当に殺菌水で希釈
後ＹＰＤ寒天上にスプレッドし、８０℃で８０日間培養
後生じたコロニーの栄養要求性をレプリカ法で検討した
。
択マーカーの有無で検討した。対照としては一般的に用
いられている２μｍＤＮＡＣａｄ起点及び選択マーカー
を含む酵母・大腸菌シャトルベクター（例えばｐＹＧＩ
ＦＬｍ２１２ ）を用いた。又発現ｔ ３’ｊ ４ Ｌ
、たときしないときの比較も行った。つ１勺、プラスミ
ド選択下（最小培地に２チカザミノ酸？添加）で前培養
したもの（特開昭５９−７４９８８号公報）を＋ＰｓＹ
ＰＤ培地又は−ＰｉＹＰＤ （発現を誘導する揚台）金
用い１０世代及び２０世代培養後、適当に殺菌水で希釈
後ＹＰＤ寒天上にスプレッドし、８０℃で８０日間培養
後生じたコロニーの栄養要求性をレプリカ法で検討した
。
表１にＴＲＰｌ＋を選択マーカーとした酵母ベクターｐ
ＳＣＧＩＦＬｍ４１２、ｐｓｃＧＩＦＬｒｎ８１２及び
２μｍＤＮＡ存在依性プラスミドｐＹＥＧＩＦＺｎｚ２
１２ ’に用いた。場合の結果を示す。それぞれの酵母
５ＨＹ２〔ｃｉｒ”〕形質転換体（ただしｐＹＥＧＩＦ
Ｌｍ２１２の場合は酵母ＳＨＹ ２〔Ｃｉｒ＋〕を用い
た）をＣＡＵ培地（０，６７％Ｄｉｆｃｏ Ｎ’ｅｔｒ
ｏｇｓｎ ｂｔｓｓａ Ｗｌｏ ａｍｉｎｏ ａ
ｃｉｄ 。
ＳＣＧＩＦＬｍ４１２、ｐｓｃＧＩＦＬｒｎ８１２及び
２μｍＤＮＡ存在依性プラスミドｐＹＥＧＩＦＺｎｚ２
１２ ’に用いた。場合の結果を示す。それぞれの酵母
５ＨＹ２〔ｃｉｒ”〕形質転換体（ただしｐＹＥＧＩＦ
Ｌｍ２１２の場合は酵母ＳＨＹ ２〔Ｃｉｒ＋〕を用い
た）をＣＡＵ培地（０，６７％Ｄｉｆｃｏ Ｎ’ｅｔｒ
ｏｇｓｎ ｂｔｓｓａ Ｗｌｏ ａｍｉｎｏ ａ
ｃｉｄ 。
２％グルコース、２４μｍ１／ｌｌウラシル、２チカザ
ミノ酸）で３０℃１８時間培養した細胞を遠心分離する
ことによシ集菌した。
ミノ酸）で３０℃１８時間培養した細胞を遠心分離する
ことによシ集菌した。
細胞を殺菌水で１回洗滌後ＯＤ、６゜−０，０１となる
様に−ＰｉＹＰＤ及び＋ＰｉＹＰＤに植菌し、３０℃で
０Ｄａａ。■１０まで培養を続けた（１０世代）。
様に−ＰｉＹＰＤ及び＋ＰｉＹＰＤに植菌し、３０℃で
０Ｄａａ。■１０まで培養を続けた（１０世代）。
次に１０世代培養細胞を新らたな−ＰｉＹＰＤ又は十Ｐ
ｉ Ｙ Ｐ Ｄ Ｋ ＯＤ ａ。。−０，０１となる
様に植菌し再び３０℃で０Ｄａａｏ＝ １０まで培養を
行った（２０世代）それぞれ椙養終了後段葭水で３し当
に希釈し、ＹＥＰＤ寒天培地に１プレート当り約１００
コロニーとなる様にスプレッドした。３０℃で３日↓邑
養後生じたコロニーをトリプトファンを営まない最小寒
天培地にレプリカし３６時間３０℃で培養した。ＹＥＰ
Ｄ寒天培地に生じたコロニー数を１００％としてＴＲＰ
＋コロニー数のＳす合を検討した。ｐＳＣＧＩＦＬｍ４
１２．７）ＳＣＧＩＦＬｍ８１２は期待通りｐＹＥＧＩ
ＦＬｍ２１２と比べ安定であった。つまり発現を誘導し
た場合ｐ ＹＥＧ Ｉ ＦＬｍ２１２ は約５０チの脱
落が認められるのに対しｐＳＣＧＩＦＬｍ４１２、ｐＳ
ＣＧＩＦＬｍ８１２は約２０％の脱落であった。１０世
代、２０世代プラスミド非選択下で検討したがその差は
あまり認められなかった。しかし非誘導下ではいずれの
場合もそのプラスミド保持率は高い傾向にあり外来性遺
伝子発現による阻害効果がある様である。
ｉ Ｙ Ｐ Ｄ Ｋ ＯＤ ａ。。−０，０１となる
様に植菌し再び３０℃で０Ｄａａｏ＝ １０まで培養を
行った（２０世代）それぞれ椙養終了後段葭水で３し当
に希釈し、ＹＥＰＤ寒天培地に１プレート当り約１００
コロニーとなる様にスプレッドした。３０℃で３日↓邑
養後生じたコロニーをトリプトファンを営まない最小寒
天培地にレプリカし３６時間３０℃で培養した。ＹＥＰ
Ｄ寒天培地に生じたコロニー数を１００％としてＴＲＰ
＋コロニー数のＳす合を検討した。ｐＳＣＧＩＦＬｍ４
１２．７）ＳＣＧＩＦＬｍ８１２は期待通りｐＹＥＧＩ
ＦＬｍ２１２と比べ安定であった。つまり発現を誘導し
た場合ｐ ＹＥＧ Ｉ ＦＬｍ２１２ は約５０チの脱
落が認められるのに対しｐＳＣＧＩＦＬｍ４１２、ｐＳ
ＣＧＩＦＬｍ８１２は約２０％の脱落であった。１０世
代、２０世代プラスミド非選択下で検討したがその差は
あまり認められなかった。しかし非誘導下ではいずれの
場合もそのプラスミド保持率は高い傾向にあり外来性遺
伝子発現による阻害効果がある様である。
以上の結果は他のプラスミド、例えばＬＩＲＡ ３ｔＳ
択マーカーとしたもの、の場合も同様であつた。第８図
の写真には２０世代培養後のブラミドＤＮＡを前述の簡
便法によ）調整したものを１チ寒天電気泳動分離後、エ
チジウムブロマイド染色した結果を示す。非誘導下（第
８図〔Ａ〕）ではｐｓｃＧＩＦＬｒｎ４１２（サンプル
／１６１）、ｐｓｃＧＩＦ８１２（サンプル腐２）のプ
ラスミドコピー数はＳ ＨＹ ２ （ａｉｒ”Ｊ の含
有する２ ｐｍ ＤＮＡ （ｆンプル雇４）とほぼ同一
であった。ｐＹＥＧＩＦＬｒｒＬ２１２ （サンプル、
％３）はそれらと比べ約２であった。しかし誘導下（第
８図〔Ｂ〕においては約イに減少した。このことは外来
性遺伝子発現による阻害効果と考えることが出来る。こ
の傾向はここで作製した他のプラスミドでも同様でめっ
た。
択マーカーとしたもの、の場合も同様であつた。第８図
の写真には２０世代培養後のブラミドＤＮＡを前述の簡
便法によ）調整したものを１チ寒天電気泳動分離後、エ
チジウムブロマイド染色した結果を示す。非誘導下（第
８図〔Ａ〕）ではｐｓｃＧＩＦＬｒｎ４１２（サンプル
／１６１）、ｐｓｃＧＩＦ８１２（サンプル腐２）のプ
ラスミドコピー数はＳ ＨＹ ２ （ａｉｒ”Ｊ の含
有する２ ｐｍ ＤＮＡ （ｆンプル雇４）とほぼ同一
であった。ｐＹＥＧＩＦＬｒｒＬ２１２ （サンプル、
％３）はそれらと比べ約２であった。しかし誘導下（第
８図〔Ｂ〕においては約イに減少した。このことは外来
性遺伝子発現による阻害効果と考えることが出来る。こ
の傾向はここで作製した他のプラスミドでも同様でめっ
た。
次に外来遺伝子の生産性を抗ウィルス活性及びαＨＥ活
性（ＧＩＦ−αＮＥ雑種蛋白質の場合）によシ検討した
。嵌２に５ＨＹ２ＣＣｉｒ０、ｐＳＣＧＩＦＬｍ４１２
．５ＨＹ２〔ｃｉｒ＋、ｐ ＹＥＧ Ｉ ＦＬｍ２１２
）−ＰｉＹＰＤ培地で培養した細胞における生産性を検
討した結果を示す。培養法は表１の場合と同様にして行
った。それぞれ培養終了後、細胞を遠心分離により集め
、前述の方法により抗ウィルス活性を測定した。茨２に
示す様にｐＹＥＧＩＦＬｒｎ２１２に比ベア＞ＳＣＧＩ
ＦＬｍ４１２の方が２〜３倍生産性が優れていた。これ
らの結果はここで得られた他のプラスミドでも同様のも
のであった。しかしトリプトファン（もしくはウラシル
）非存在培地つまシ、ＣＡＵ培地、ＣＡＴ培地（ＣＡＵ
のウラシルの代シに８０μｆｌ／ｒｎｌのトリプトファ
ンを加えたもの）で前述の方法で安定性全検討した結果
、ｐＳＣＧＩＦＬｍ４１２（又はｐＳＣＧＩＦＬｍ９１
２）は１０世代、２０世代培養においても９５％以上の
保持率を示す。ｐＹＥＧＩＦｌ、ｍ２１２の場合もプラ
スミド選択条件下では９０チの保持率を示すが生産性は
７）ＳＣＧＩＦＬｍ４１２の約２であった。従って長期
安定的に大容貸培ｊ９を行うにはｐｓｃＧＩＦＬｒｎ４
１２ （またはｐＳＣＧＩＦＬｍ９１２ ）を用いる方
のが好ましい）。
性（ＧＩＦ−αＮＥ雑種蛋白質の場合）によシ検討した
。嵌２に５ＨＹ２ＣＣｉｒ０、ｐＳＣＧＩＦＬｍ４１２
．５ＨＹ２〔ｃｉｒ＋、ｐ ＹＥＧ Ｉ ＦＬｍ２１２
）−ＰｉＹＰＤ培地で培養した細胞における生産性を検
討した結果を示す。培養法は表１の場合と同様にして行
った。それぞれ培養終了後、細胞を遠心分離により集め
、前述の方法により抗ウィルス活性を測定した。茨２に
示す様にｐＹＥＧＩＦＬｒｎ２１２に比ベア＞ＳＣＧＩ
ＦＬｍ４１２の方が２〜３倍生産性が優れていた。これ
らの結果はここで得られた他のプラスミドでも同様のも
のであった。しかしトリプトファン（もしくはウラシル
）非存在培地つまシ、ＣＡＵ培地、ＣＡＴ培地（ＣＡＵ
のウラシルの代シに８０μｆｌ／ｒｎｌのトリプトファ
ンを加えたもの）で前述の方法で安定性全検討した結果
、ｐＳＣＧＩＦＬｍ４１２（又はｐＳＣＧＩＦＬｍ９１
２）は１０世代、２０世代培養においても９５％以上の
保持率を示す。ｐＹＥＧＩＦｌ、ｍ２１２の場合もプラ
スミド選択条件下では９０チの保持率を示すが生産性は
７）ＳＣＧＩＦＬｍ４１２の約２であった。従って長期
安定的に大容貸培ｊ９を行うにはｐｓｃＧＩＦＬｒｎ４
１２ （またはｐＳＣＧＩＦＬｍ９１２ ）を用いる方
のが好ましい）。
又ＧＩＦを外来発現遺伝子として用いた↓゛る合（ｐｓ
ｃａｌＦ４１２、 ｐｓｃＧＩＦ９ １ ２等）も、同
様の結果でめった。
ｃａｌＦ４１２、 ｐｓｃＧＩＦ９ １ ２等）も、同
様の結果でめった。
第２表 抗ウィルス活性（ユニ７）／ｄ）ｐＳＣ−Ｇ
ＩＦＬｒｎ４１２ ３０３５ ２２７５ｐＹＥ−Ｇ
ＩＦＬｍ２１２ ｋ １１５ １１１５
ＩＦＬｒｎ４１２ ３０３５ ２２７５ｐＹＥ−Ｇ
ＩＦＬｍ２１２ ｋ １１５ １１１５
第１図は２ Ａ ｍ Ｄ Ｎ ＡとｐＥＲ３２２とから
二窃稲プラスミドｐＹＥ３００１ ｃＬ−ｄを造成する
ｊ路を示す図である。 第２図は第１図で造成したｐＹＡ’３００１ｃを用いシ
ャトルベクターｐＹＥ３２０２の造成およびこのシャト
ルベクターから制限酵素ＰｓｔＩで大腸菌由来のＤ Ｎ
Ａ ｆＫ除去してプラスミドベクターｐＳＣ３２０２
を造成する経路金示す図である。 第３図ｔ′ｉＺ２図で造成したプラスミドベクターｐＹ
Ｅ３２０２に２ ｔ’ ？ＦＬ ＤＡ’ Ａ （Ｄ 復
製−ｉたＨ安定性に関与するＤＮＡ配列を補って得られ
るプラスミドペタターｐＹＥ３２０７の造成経路を示す
図である。 第４−１図および第４−２図は第１因で造成されたｐＹ
Ｅ３００１ｃからプラスミドベクターｐＹＥ３２１７（
２μｍＤＮＡＣ全配列か含祉九ている）を造成する経路
を示す図である。 第５−１図および第５−２図は選択マーカーとして（Ｊ
ＲＡ３迫伝子を含み、かつ大腸菌由来のＤＮＡ配列がＢ
ａｔｎＨＩで除去できるプラスミドベクターｐＹＥ３３
２Ｂを造成する２（路を示す図である。 第６図は第３図およびｉ＠４−、４ ２１′２１で造成
されたプラスミドベクターｐＹＥ３２０７およびｐＹＥ
３２１７に外来性遺伝子およびその発現ユニットを挿入
して得られる（ヒトーγ−インターフエ０／遺伝子）プ
ラスミドベクターｐＹＧＩＩＩ’４１２、ｐＹＧＩＦ８
１２、ｐＹＧＩＦＬｍ４１２およびｐＹＧＩＦＬｍ８１
２を造成する長路、および更にこれらプラスミドベクタ
ーからＰｓｔＩＬより大腸菌由来のＤＮＡ配列を除去し
て得られるｐｓｃＧＩＦ４１２、ｐｓｃＧＩＦ８１２、
ｐＳＣＧ Ｉ Ｆ ＬｎＬ−１１２およびｐ Ｓ ＣＧ
Ｉ Ｆ″Ｌｍ８１２企造成する’６’ｆ＝’ｎ６を示す
図である。 第７図は第５−１図Ｊｄよび第５−２図で得られたプラ
スミドベクターｐＹＥ３３２８に外来性ｊ点スミ（ヒト
γ−インターフェロ／遺伝子）およびその発現ユニツト
ヲ挿入して得られるプラスミドベクターｐＹＧＩ、Ｉ”
９１２、ｐＹＧＩＦＬｍ９１２の造成経路、およびこれ
らプラスミドベクターからＢａｍＨＩて大腸菌由来のＤ
ＮＡ配列を除去して得られるｐｓｃＧＩＦ９１２．７）
Ｓ ＣＧ Ｉ Ｆ Ｌ ｒｒｔ９１２の造成経路を示
す図である。 第８図は本発明で得たプラスミドベクターｐＳＣＧＩＦ
Ｌｍ４１２およびｐＳＣＧＩＦＬｍ８１２の酵母内での
保持状態をｐ Ｙ Ｅ Ｇ Ｉ Ｆ Ｌ ｍ２１２のも
のと比較するための電気泳動の結果を示す写真である。 〔Ａ〕および〔Ｂａはプラスミドの発現ヲ請導しない培
地、および誘導をかけた培地でそれぞれ３０℃、２０世
代培養した結果を示す。 本１図 帆４−１図 奉４−２図 纂ろ−１図 【 Ｔｒａｎｓｆａｒｍ ｔｏ ５ＨＹ２ ｕＷＡｆｃａｍｅ ＤＮＡ １ｓｏｌａｔｅ 算フ３−２０ 手 続 補 正 書 昭和６０年９月！を日 １、事件の表示 昭和５９年特許ｍ第１５７０３７ 号２、発明の名称 高安定性酵母×フタ−、酵母形質転換体および外来性蛋
白もしくははプチドの生産方法６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 （１９０） サントリー株式会社４、代理
人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ６補正の内容 （１） 明細書の記載を下記の通り補正する。 頁 行 補正前 補正後１２ 下Ｉ
Ｍｉｙａｎｏｈａｒｂ Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ１５
下２ 精製 複製 １６ 下１ 翻訳開始にｉｋ 翻訳開始点に最
も・・・も・・・ １８ ５ ７４ｋｂ ７．４ｋｂ１９
６ 達成した。 造成した。 ９ 翫ソリとをから・・・ 翫７１とから・・・ ２
３ ２ ｃｏｈｅｓｉ ｅ ｅｎｄ ｃｏ
ｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ、 下Ｉ ＰＬＰ
Ｆ’ＬＰ２５ １３ ＰＥＰ３ Ｒ
ＥＰ３２８ ７ 切断片部位 塩析部位３１
１３ ｎｅｃｒｅｏｓｉｓ ｎｅｃｒｏｓｉ
ｓ１４ リンフ才力イン リンフ才力イン３４
１２ 翫ｌりを 配列が３４ 下２ Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ Ｄ、 Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、 Ｄ、。 ３５ ７ 結果の１部を 結果の一部を３６
１３ １５時間 、５時間を溶解させ・・・ ｌ 下３ １０ｍＡ Ｔｒｉｓ ｒＯｍＭ Ｔｒｉ
ｓｌ 下１ 蜜度広配 密度勾配３７
９ ＮＣＩ ＭｇＣ１２３８４３２０２そ
れよ ３２０２よシ・・・シ・・・ １１ 分解後 分離後 １２ ・・・ＤＮＡ分子 ＤＮＡ分子を１５
０．５ｍＭ ＴＴＰ ０．５ｍＭｃｌ ＴＴＰ′
下１ ｃｏｈｅｓｉｎｅ ｅｎｄ ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ ｅｎｃ１３９ １ エタール沈殿 エ
タノール沈殿８ ・・・全得え、・・・ ・・・を
得、・・・４０ ４ ・・・法に抽出した・・・
・・・法により抽出した・・・１２ Ｍｏｒｔｉｍ
ｅ Ｍｏｒｔｉｍｅｒｌ 下３ トリプ
トファン トリプトファン４１ １４ ・・・工
Ｒ：配列 ・・・ＩＲ翫ソリ・・・４２ １ 約７
．６ｋｂ 約６．８ｋｂ４ エターノイワ設
エタノール沈殿７ 簡単法 簡
朗法 ４５ １ 欠けていた。 欠けている。 ｌ 下５ ＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙＡＢＧ１ｙｃ
ｅｒａ１ａ４ｅ ｌ−’ニアｃ、４６ ５
ターミネ−タ リンカ−を混合し ４８ ４ ＢｍＨ工 ＢａｍＨＩ４
８ １１ 持たない。約７．６ｋｂ 持たない約３
０ｋｂ１２ ＴＲＰＩ■遺伝子 ＴＲＰｌ遺伝
子１５ ５ＨＹＺ ５ＨＹ２１
下３ すべで７．６ ｋ ｂに すべて約８０ｋ
ｂに４９ 下４ ・・・行つ六−・・・迎１定しも
５０ ５ ＢｇＩＩＩ、部位 Ｂｇｌ
［［部位７ ｐＸＥ３００１ ｐＹＥ３
００１１ １４〜１５ ・・・を前述の方法で得 ・
・・を得た。 た。 １６ ｐＪＯＢ２１９ ｐＪＤＢ２１９
５１ 下４ ３２０に ３２０７に５２１２
約１００００ 約１０００４ 転換体を得、
その−転換体の・・・９ ＬＥｖ＋ Ｌ
ＥＵ＋１１ ＢＡＢａｍＵＲＡ３ １３ＪＢ
ａｍＵＲＡ３５６ ７ 高コーピー
高コピーＩ 下５ ３００７−ＢａｌＩＩ−３００
７−Ｂｇｌｌｌ−５７５千珈同１■ 平滑末端 ５８ 下４ 最小培地 最少培地５９２３
０℃で３０日間 ３０℃で３日間７ ＤＮＡ存在依
性 ＤＮＩ＠存性８ 用いた。場合の 用いた場
合の １２ Ｎｅｔｒｏｇｅｎ Ｎｉｔ、ｒｏｇｅ
ｎＩ 下２ 新らたな 新たな６０
２ 世代）それぞれ 世代）。それぞれ６ 最少
寒天培地 最少寒天培地６１ １ プラミ
ド プラスミド１０ （第８図同におい （
第８図力）において て Ｉ 下４ ＝−Ｌｍ４１Ｚ、 ５ｆｆｆ２ ・・−
Ｌｍ４１２）、＄１（Ｙ２１ 下３ Ｌｍ２１２）
−ＰｉＹＰＤ Ｌｍ２１２］Ｔｈ−ＰｉＹＰＤ６２
下４ 用いる方のが 用いる方がの２段目 （２）図面の第５−２図、第６図、および第７図を添付
の通９訂正する。 メ、６−２図
二窃稲プラスミドｐＹＥ３００１ ｃＬ−ｄを造成する
ｊ路を示す図である。 第２図は第１図で造成したｐＹＡ’３００１ｃを用いシ
ャトルベクターｐＹＥ３２０２の造成およびこのシャト
ルベクターから制限酵素ＰｓｔＩで大腸菌由来のＤ Ｎ
Ａ ｆＫ除去してプラスミドベクターｐＳＣ３２０２
を造成する経路金示す図である。 第３図ｔ′ｉＺ２図で造成したプラスミドベクターｐＹ
Ｅ３２０２に２ ｔ’ ？ＦＬ ＤＡ’ Ａ （Ｄ 復
製−ｉたＨ安定性に関与するＤＮＡ配列を補って得られ
るプラスミドペタターｐＹＥ３２０７の造成経路を示す
図である。 第４−１図および第４−２図は第１因で造成されたｐＹ
Ｅ３００１ｃからプラスミドベクターｐＹＥ３２１７（
２μｍＤＮＡＣ全配列か含祉九ている）を造成する経路
を示す図である。 第５−１図および第５−２図は選択マーカーとして（Ｊ
ＲＡ３迫伝子を含み、かつ大腸菌由来のＤＮＡ配列がＢ
ａｔｎＨＩで除去できるプラスミドベクターｐＹＥ３３
２Ｂを造成する２（路を示す図である。 第６図は第３図およびｉ＠４−、４ ２１′２１で造成
されたプラスミドベクターｐＹＥ３２０７およびｐＹＥ
３２１７に外来性遺伝子およびその発現ユニットを挿入
して得られる（ヒトーγ−インターフエ０／遺伝子）プ
ラスミドベクターｐＹＧＩＩＩ’４１２、ｐＹＧＩＦ８
１２、ｐＹＧＩＦＬｍ４１２およびｐＹＧＩＦＬｍ８１
２を造成する長路、および更にこれらプラスミドベクタ
ーからＰｓｔＩＬより大腸菌由来のＤＮＡ配列を除去し
て得られるｐｓｃＧＩＦ４１２、ｐｓｃＧＩＦ８１２、
ｐＳＣＧ Ｉ Ｆ ＬｎＬ−１１２およびｐ Ｓ ＣＧ
Ｉ Ｆ″Ｌｍ８１２企造成する’６’ｆ＝’ｎ６を示す
図である。 第７図は第５−１図Ｊｄよび第５−２図で得られたプラ
スミドベクターｐＹＥ３３２８に外来性ｊ点スミ（ヒト
γ−インターフェロ／遺伝子）およびその発現ユニツト
ヲ挿入して得られるプラスミドベクターｐＹＧＩ、Ｉ”
９１２、ｐＹＧＩＦＬｍ９１２の造成経路、およびこれ
らプラスミドベクターからＢａｍＨＩて大腸菌由来のＤ
ＮＡ配列を除去して得られるｐｓｃＧＩＦ９１２．７）
Ｓ ＣＧ Ｉ Ｆ Ｌ ｒｒｔ９１２の造成経路を示
す図である。 第８図は本発明で得たプラスミドベクターｐＳＣＧＩＦ
Ｌｍ４１２およびｐＳＣＧＩＦＬｍ８１２の酵母内での
保持状態をｐ Ｙ Ｅ Ｇ Ｉ Ｆ Ｌ ｍ２１２のも
のと比較するための電気泳動の結果を示す写真である。 〔Ａ〕および〔Ｂａはプラスミドの発現ヲ請導しない培
地、および誘導をかけた培地でそれぞれ３０℃、２０世
代培養した結果を示す。 本１図 帆４−１図 奉４−２図 纂ろ−１図 【 Ｔｒａｎｓｆａｒｍ ｔｏ ５ＨＹ２ ｕＷＡｆｃａｍｅ ＤＮＡ １ｓｏｌａｔｅ 算フ３−２０ 手 続 補 正 書 昭和６０年９月！を日 １、事件の表示 昭和５９年特許ｍ第１５７０３７ 号２、発明の名称 高安定性酵母×フタ−、酵母形質転換体および外来性蛋
白もしくははプチドの生産方法６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 （１９０） サントリー株式会社４、代理
人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ６補正の内容 （１） 明細書の記載を下記の通り補正する。 頁 行 補正前 補正後１２ 下Ｉ
Ｍｉｙａｎｏｈａｒｂ Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ１５
下２ 精製 複製 １６ 下１ 翻訳開始にｉｋ 翻訳開始点に最
も・・・も・・・ １８ ５ ７４ｋｂ ７．４ｋｂ１９
６ 達成した。 造成した。 ９ 翫ソリとをから・・・ 翫７１とから・・・ ２
３ ２ ｃｏｈｅｓｉ ｅ ｅｎｄ ｃｏ
ｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ、 下Ｉ ＰＬＰ
Ｆ’ＬＰ２５ １３ ＰＥＰ３ Ｒ
ＥＰ３２８ ７ 切断片部位 塩析部位３１
１３ ｎｅｃｒｅｏｓｉｓ ｎｅｃｒｏｓｉ
ｓ１４ リンフ才力イン リンフ才力イン３４
１２ 翫ｌりを 配列が３４ 下２ Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ Ｄ、 Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、 Ｄ、。 ３５ ７ 結果の１部を 結果の一部を３６
１３ １５時間 、５時間を溶解させ・・・ ｌ 下３ １０ｍＡ Ｔｒｉｓ ｒＯｍＭ Ｔｒｉ
ｓｌ 下１ 蜜度広配 密度勾配３７
９ ＮＣＩ ＭｇＣ１２３８４３２０２そ
れよ ３２０２よシ・・・シ・・・ １１ 分解後 分離後 １２ ・・・ＤＮＡ分子 ＤＮＡ分子を１５
０．５ｍＭ ＴＴＰ ０．５ｍＭｃｌ ＴＴＰ′
下１ ｃｏｈｅｓｉｎｅ ｅｎｄ ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ ｅｎｃ１３９ １ エタール沈殿 エ
タノール沈殿８ ・・・全得え、・・・ ・・・を
得、・・・４０ ４ ・・・法に抽出した・・・
・・・法により抽出した・・・１２ Ｍｏｒｔｉｍ
ｅ Ｍｏｒｔｉｍｅｒｌ 下３ トリプ
トファン トリプトファン４１ １４ ・・・工
Ｒ：配列 ・・・ＩＲ翫ソリ・・・４２ １ 約７
．６ｋｂ 約６．８ｋｂ４ エターノイワ設
エタノール沈殿７ 簡単法 簡
朗法 ４５ １ 欠けていた。 欠けている。 ｌ 下５ ＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙＡＢＧ１ｙｃ
ｅｒａ１ａ４ｅ ｌ−’ニアｃ、４６ ５
ターミネ−タ リンカ−を混合し ４８ ４ ＢｍＨ工 ＢａｍＨＩ４
８ １１ 持たない。約７．６ｋｂ 持たない約３
０ｋｂ１２ ＴＲＰＩ■遺伝子 ＴＲＰｌ遺伝
子１５ ５ＨＹＺ ５ＨＹ２１
下３ すべで７．６ ｋ ｂに すべて約８０ｋ
ｂに４９ 下４ ・・・行つ六−・・・迎１定しも
５０ ５ ＢｇＩＩＩ、部位 Ｂｇｌ
［［部位７ ｐＸＥ３００１ ｐＹＥ３
００１１ １４〜１５ ・・・を前述の方法で得 ・
・・を得た。 た。 １６ ｐＪＯＢ２１９ ｐＪＤＢ２１９
５１ 下４ ３２０に ３２０７に５２１２
約１００００ 約１０００４ 転換体を得、
その−転換体の・・・９ ＬＥｖ＋ Ｌ
ＥＵ＋１１ ＢＡＢａｍＵＲＡ３ １３ＪＢ
ａｍＵＲＡ３５６ ７ 高コーピー
高コピーＩ 下５ ３００７−ＢａｌＩＩ−３００
７−Ｂｇｌｌｌ−５７５千珈同１■ 平滑末端 ５８ 下４ 最小培地 最少培地５９２３
０℃で３０日間 ３０℃で３日間７ ＤＮＡ存在依
性 ＤＮＩ＠存性８ 用いた。場合の 用いた場
合の １２ Ｎｅｔｒｏｇｅｎ Ｎｉｔ、ｒｏｇｅ
ｎＩ 下２ 新らたな 新たな６０
２ 世代）それぞれ 世代）。それぞれ６ 最少
寒天培地 最少寒天培地６１ １ プラミ
ド プラスミド１０ （第８図同におい （
第８図力）において て Ｉ 下４ ＝−Ｌｍ４１Ｚ、 ５ｆｆｆ２ ・・−
Ｌｍ４１２）、＄１（Ｙ２１ 下３ Ｌｍ２１２）
−ＰｉＹＰＤ Ｌｍ２１２］Ｔｈ−ＰｉＹＰＤ６２
下４ 用いる方のが 用いる方がの２段目 （２）図面の第５−２図、第６図、および第７図を添付
の通９訂正する。 メ、６−２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）酵母由来のＤＮＡ配列と大腸菌由来のＤＮＡ配列か
らなる雑種プラスミドであつて、 ａ、酵母および大腸菌各々の宿主複製を可能にするＤＮ
Ａ配列、 ｂ、該プラスミドによつて形質転換された酵母または大
腸菌の選択を可能にするＤＮＡ配列または遺伝子、およ
び ｃ、酵母の２μｍＤＮＡの配列および上記大腸菌由来の
ＤＮＡ配列のいずれも切断しない制限酵素によつて切断
されるサイトを持つＤＮＡ配列 を有し、１種類の制限酵素の処理によつて上記大腸菌由
来のＤＮＡ配列を除去することができ且つ酵母宿主細胞
中で同じサイズではあるが２つの形態で存在することを
特徴とするプラスミドベクター。 ２）酵母由来のＤＮＡ配列が酵母の２μｍＤＮＡの全配
列または断片と酵母の染色体ＤＮＡの断片とからなる特
許請求の範囲第１項記載のプラスミドベクター。 ３）酵母の２μｍＤＮＡの断片が２個のインバーテッド
リピート（逆方向反復）配列および複製開始領域を有し
ている特許請求の範囲第２項記載のプラスミドベクター
。 ４）酵母の染色体ＤＮＡＣ断片が少くともトリプトファ
ン合成酵素の１つを支配している遺伝子ＴＲＰ１もしく
はウラシル合成酵素の１つを支配している遺伝子ＵＲＡ
３を有している特許請求の範囲第２項または第３項記載
のプラスミドベクター。 ５）大腸菌由来のＤＮＡ配列がｐＢＲ３２２由来のＤＮ
Ａ配列である特許請求の範囲第１項から第４項のいずれ
かの項記載のプラスミドベクター。 ６）ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列に、少くとも１つの
薬剤耐性遺伝子が含まれている特許請求の範囲第５項記
載のプラスミドベクター。 ７）薬剤耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子である特
許請求の範囲第６項記載のプラスミドベクター。 ８）制限酵素ＢｇｌIIによる切断サイトが１ケ所である
特許請求の範囲第１項から７項のいずれかの項に記載の
プラスミドベクター。 ９）外来性遺伝子および該外来性遺伝子の発現をコント
ロールする領域を含むＤＮＡ配列（発現ユニット）が挿
入される部位がＢｇｌII切断部位である特許請求の範囲
第８項記載のプラスミドベクター。 １０）大腸菌由来のＤＮＡ配列を取り除く制限酵素がＰ
ｓｔ I またはＢａｍＨ I である特許請求の範囲第９項
記載のプラスミドベクター。 １１）ｐＹＥ３２０７、ｐＹＥ３２１７もしくはｐＹＥ
３３２８で表わされる特許請求の範囲第１項記載のプラ
スミドベクター。 １２）酵母由来のＤＮＡ配列と大腸菌由来のＤＮＡ配列
からなる雑種プラスミドであつて、 ａ、酵母および大腸菌各々の宿主で複製を可能にするＤ
ＮＡ配列、 ｂ、該プラスミドによつて形質転換された酵母または大
腸菌の選択を可能にするＤＮＡ配列または遺伝子、およ
び ｃ、酵母の２μｍＤＮＡの配列および上記大腸菌由来の
ＤＮＡ配列のいずれも切断しない制限酵素によつて切断
されるサイトを持つＤＮＡ配列 を有し、１種類の制限酵素の処理によつて上記大腸菌由
来のＤＮＡ配列を除去することができ且つ酵母宿主細胞
中で同じサイズではあるが２つの形態で存在するプラス
ミドベクターに外来性遺伝子および該外来性遺伝子の発
現をコントロールする領域を含むＤＮＡ配列が挿入され
ていることを特徴とするプラスミドベクター。 １３）外来性遺伝子がヒトペプチドホルモン、ヒトリン
フオカインまたは免疫関連物質をコードしている遺伝子
である特許請求の範囲第１２項記載のプラスミドベクタ
ー。 １４）外来性遺伝子が化学的に合成された遺伝子である
特許請求の範囲第１３項記載のプラスミドベクター。 １５）化学的に合成された遺伝子がアルフアネオエンド
ルフイン、ヒトガンマ型インターフエロンまたはインタ
ーロイキン２をコードするＤＮＡ配列を有する特許請求
の範囲第１４項記載のプラスミドベクター。 １６）外来性遺伝子の発現をコードする領域が酵母のプ
ロモーター領域を含んでいる特許請求の範囲第１２項記
載のプラスミドベクター。 １７）酵母のプロモーター領域が酵母の抑制性酸性フオ
スフアターゼまたはグリセロアルデヒド−３−フオスフ
エイトデハイドロゲナーゼを支配している遺伝子由来の
ものである特許請求の範囲第１６項記載のプラスミドベ
クター。 １８）ｐＹＧＩＦ４１２、ｐＹＧＩＦＬｍ４１２、ｐＹ
ＧＩＦ８１２、ｐＹＧＩＦＬｍ８１２、ｐＹＧＩＦ９１
２もしくはｐＹＧＩＦＬｍ９１２で表わされる特許請求
の範囲第１２項記載のプラスミドベクター。 １９）酵母由来のＤＮＡ配列と大腸菌由来のＤＮＡ配列
からなる雑種プラスミドであつて、 ａ、酵母および大腸菌各々の宿主で複製を可能にするＤ
ＮＡ配列、 ｂ、該プラスミドによつて形質転換された酵母または大
腸菌の選択を可能にするＤＮＡ配列または遺伝子、およ
び ｃ、酵母の２μｍＤＮＡの配列および上記大腸菌由来の
ＤＮＡ配列のいずれも切断しない制限酵素によつて切断
されるサイトを持つＤＮＡ配列 を有し、１種類の制限酵素の処理によつて、上記大腸菌
由来のＤＮＡ配列を除去することができ且つ酵母宿主細
胞中で同じサイズではあるが２つの形態で存在するプラ
スミドベクターに外来性遺伝子および該外来性遺伝子の
発現をコントロールする領域を含むＤＮＡ配列が挿入さ
れ、その後前記１種類の制限酵素の処理で大腸菌由来の
ＤＮＡ配列が取り除かれることによつて得られるプラス
ミドベクター。 ２０）外来性遺伝子がヒトペプチドホルモン、ヒトリン
フオカインまたは免疫関連物質をコードしている遺伝子
である特許請求の範囲第１９項記載のプラスミドベクタ
ー。 ２１）外来性遺伝子が化学的に合成された遺伝子である
特許請求の範囲第２０項記載のプラスミドベクター。 ２２）化学的に合成された遺伝子がアルフアネオエンド
ルフイン、ヒトガンマ型インターフエロンまたはインタ
ーロイキン２をコードするＤＮＡ配列を有する特許請求
の範囲第２１項記載のプラスミドベクター。 ２３）外来性遺伝子の発現をコードする領域が酵母のプ
ロモーター領域を含んでいる特許請求の範囲第１９項記
載のプラスミドベクター。 ２４）酵母のプロモーター領域が酵母の抑制性酸性フオ
スフアターゼまたはグリセロアルデヒド−３−フオスフ
エイトデハイドロゲナーゼを支配している遺伝子由来の
ものである特許請求の範囲第２３項記載のプラスミドベ
クター。 ２５）大腸菌由来のＤＮＡ配列がＰｓｔ I またはＢａ
ｍＨ I で取除かれた特許請求の範囲第１９項記載のプ
ラスミドベクター。 ２６）プラスミドベクターｐＹＥ３２０７またはｐＹＥ
３３２８のＢｇｌII切断部位に外来性遺伝子および該外
来性遺伝子の発現をコントロールする領域を含むＤＮＡ
配列が挿入されたプラスミドベクターからＰｓｔ I 処
理によつて大腸菌由来のＤＮＡ配列が取除かれた特許請
求の範囲第１９項記載のプラスミドベクター。 ２７）ｐＳＣＧＩＦ４１２、ｐＳＣＧＩＦＬｍ４１２、
ｐＳＣＧＩＦ８１２またはｐＳＣＧＩＦＬｍ８１２で表
わされる特許請求の範囲第２６項記載のプラスミドベク
ター。 ２８）プラスミドベクターｐＹＥ３３２３のＢｇｌII切
断部位に外来性遺伝子および該外来性遺伝子の発現をコ
ントロールする領域を含むＤＮＡ配列が挿入されたプラ
スミドベクターからＢａｍＨ I 処理によつて大腸菌由
来のＤＮＡ配列が取除かれた特許請求の範囲第１９項記
載のプラスミドベクター。 ２９）ｐＳＣＧＩＦ９１２またはｐＳＣＧＩＦＬｍ９１
．２で表わされる特許請求の範囲第２８項記載のプラス
ミドベクター。 ３０）プラスミドベクターによつて形質転換された酵母
形質転換体であつて、該プラスミドベクターが酵母由来
のＤＮＡ配列と大腸菌由来のＤＮＡ配列からなる雑種プ
ラスミドであつて、 ａ、酵母および大腸菌各々の宿主で複製を可能にするＤ
ＮＡ配列、 ｂ、該プラスミドによつて形質転換された酵母または大
腸菌の選択を可能にするＤＮＡ配列または遺伝子、およ
び ｃ、酵母の２μｍＤＮＡの配列および上記大腸菌由来の
ＤＮＡ配列のいずれも切断しない制限酵素によつて切断
されるサイトを持つＤＮＡ配列 を有し、１種類の制限酵素の処理によつて、上記大腸菌
由来のＤＮＡ配列を除去することができ且つ酵母宿主細
胞中で同じサイズではあるが２つの形態で存在するプラ
スミドベクターに外来性遺伝子および該外来性遺伝子の
発現をコントロールする領域を含むＤＮＡ配列が挿入さ
れ、その後前記１種類の制限酵素の処理で大腸菌由来の
ＤＮＡ配列が取り除かれることによつて得られるプラス
ミドベクターであることを特徴とする形質転換体。 ３１）プラスミドベクターによつて形質転換された酵母
形質転換体を培養することにより外来性蛋白もしくはペ
プチドを製造する方法において、該プラスミドベクター
が、酵母由来のＤＮＡ配列と大腸菌由来のＤＮＡ配列か
らなる雑種プラスミドであつて、 ａ、酵母および大腸菌各々の宿主で複製を可能にするＤ
ＮＡ配列、 ｂ、該プラスミドによつて形質転換された酵母または大
腸菌の選択を可能にするＤＮＡ配列または遺伝子、およ
び ｃ、酵母の２μｍＤＮＡの配列および上記大腸菌由来の
ＤＮＡ配列のいずれも切断しない制限酵素によつて切断
されるサイトを持つＤＮＡ配列 を有し、１種類の制限酵素の処理によつて、上記大腸菌
由来のＤＮＡ配列を除去することができ且つ酵母宿主細
胞中で同じサイズではあるが２つの形態で存在するプラ
スミドベクターに外来性遺伝子および該外来性遺伝子の
発現をコントロールする領域を含むＤＮＡ配列が挿入さ
れ、その後前記１種類の制限酵素の処理で大腸菌由来の
ＤＮＡ配列が取り除かれることによつて得られるプラス
ミドベクター、であることを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59157037A JPS6156077A (ja) | 1984-07-27 | 1984-07-27 | 高安定性酵母ベクタ−、酵母形質転換体および外来性蛋白もしくはペプチドの生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59157037A JPS6156077A (ja) | 1984-07-27 | 1984-07-27 | 高安定性酵母ベクタ−、酵母形質転換体および外来性蛋白もしくはペプチドの生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6156077A true JPS6156077A (ja) | 1986-03-20 |
Family
ID=15640810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59157037A Pending JPS6156077A (ja) | 1984-07-27 | 1984-07-27 | 高安定性酵母ベクタ−、酵母形質転換体および外来性蛋白もしくはペプチドの生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6156077A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03191778A (ja) * | 1989-12-22 | 1991-08-21 | Tax Adm Agency | 栄養要求性実用醸造酵母 |
-
1984
- 1984-07-27 JP JP59157037A patent/JPS6156077A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03191778A (ja) * | 1989-12-22 | 1991-08-21 | Tax Adm Agency | 栄養要求性実用醸造酵母 |
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