KR101034822B1 - 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법, 이를 이용하여 형성된 형질 전환 균주 및 단백질 - Google Patents

해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법, 이를 이용하여 형성된 형질 전환 균주 및 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법, 이를 이용하여 형성된 형질 전환 균주 및 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법은, (S1) 해마토코쿠스 플루비알리스 배양액을 형성하는 단계; (S2) 아그로박테리움 배양액을 형성하는 단계; 및 (S3) 상기 해마토코쿠스 플루비알리스 배양액 및 아그로박테리움 배양액을 혼합하고 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 전처리 없이 그리고 고가의 장비나 재료 없이 미세조류를 형질 전환할 수 있으며, 외래 유전자가 염색체의 DNA로 바로 도입되어 형질 전환을 안정적으로 유지할 수 있고 지속적으로 유전자를 발현할 수 있다. 본 발명의 미세조류의 형질 전환 방법은 해마토코쿠스를 포함한 다양한 미세조류의 형질을 전환시켜 다양한 균주를 제조할 수 있으며, 이와 같이 제조된 균주를 통해 여러 유용 단백질 및 이 단백질에 의해 합성되는 생리 활성 물질들의 대량 생산이 기대된다.
미세조류, 형질 전환, 해마토코쿠스, 아그로박테리움, 배양액

Description

해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법, 이를 이용하여 형성된 형질 전환 균주 및 단백질{METHOD FOR GENETIC TRANSFORMATION OF HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS, STRAIN AND PROTEIN FORMED USING THE SAME}
본 발명은 미세조류의 형질 전환 방법, 이를 통해 형성된 형질 전환 균주 및 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전처리 과정 없이 미세조류를 형질 전환할 수 있으며 형질 전환을 안정적으로 유지할 수 있고 지속적으로 유전자를 발현할 수 있는 미세조류의 형질 전환 방법, 이를 통해 형성된 형질 전환 균주 및 단백질에 관한 것이다.
적색을 띄는 케토카로티노이드(Ketocarotenoid)인 아스타잔틴(Astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 베타-카로틴(β-carotene)과 같은 화학적 구조를 가진 카로티노이드계 색소의 일종으로, 유해 활성산소를 없애는 항산화 기능성 물질로 베타-카로틴에 비해 양쪽 말단기에 하이드록실기(-OH)와 케톤기(=O)를 하나씩 더 가지는 독특한 분자 구조적 특성 때문에 기존의 항산화 물질보 다 월등히 높은 항산화 활성을 갖는다. 아스타잔틴은 대표적인 항산화제인 비타민 E보다 500배, 베타-카로틴보다 20배 정도 높은 항산화 활성을 지닌다. 이러한 높은 항산화 활성기능으로 인해 아스타잔틴은 의약품, 식품 첨가제 및 동물과 치어의 사료 첨가제로 널리 사용되고 있고, 그 수요량 및 활용 범위가 급격히 확대될 것으로 예상되고 있다.
아스타잔틴은 효모 균주인 파피아 로드지마(Phaffia rthodozyma)와 조류인 해마토코쿠스 종(Haematococcus) 및 버비박테리아(Bervibacterium)에서 생성되며, 해양 동물과 담수 동물에 많이 분포되어 있지만, 새우나 가재 등의 갑각류에서 추출된 아스타잔틴은 함량이 적고, 추출 과정이 어려워 적용되지 않고 있으며, 파피아 로드지마 균주는 성장률이 높으나 아스타잔틴의 생산성이 적고, 단단한 세포벽 때문에 추출에도 많은 어려움이 있다. 또한 녹조류 해마토코쿠스 종(Haematococcus)은 효모 파피아 로드지마에 비해 월등히 높은 아스타잔틴 축적량을 가지고 있으나, 낮은 성장 속도와 두꺼운 세포벽 및 낮은 세포 밀도와 같은 문제점으로 인해 빠른 성장성을 갖는 파피아 로드지마보다 선호성 및 산업성이 미약하다.
그에 비해 해마토코쿠스 종(Haematococcus)은 높은 아스타잔틴의 축척량을 가지고 있어 천연 아스타잔틴의 생산을 위해서는 균주의 배양을 통한 생합성이 요구되며 그 가운데서도 가장 산업적으로 이용될 수 있는 가능성을 가진 균주는 바로 파피아 로드지마와 해마토코쿠스 플루비알리스이다. 녹조류 해마토코쿠스 플루비알리스는 효모 파피아 로드지마에 비해 월등히 높은 아스타잔틴 축적량을 지님에도 불구하고 낮은 성장속도와 두꺼운 세포벽, 그리고 낮은 세포밀도 같은 문제점으로 인해 고 성장성의 파피아 로드지마보다 선호성 및 산업성이 뒤쳐져 있지만 해마토코쿠스 종만이 갖는 3S, 3S'의 아스타잔틴 이성질체가 지질환경에서의 안정성을 높이는 것으로 추정되어 가장 장래성 있는 생산 방법으로 판단된다. 따라서 해마토코쿠스 종에 의한 아스타잔틴의 상업화를 위해서는 세포의 고농도 배양 및 아스타잔틴의 고농도 생산 관련 기술뿐만 아니라 이를 보다 강화하기 위해 생산성 및 배양 조건의 효율이 좋은 균주의 개발이 필수적이라 할 수 있다. 특히 광합성 미세조류의 고농도 배양 기술은 광 배양기 개발 등을 통하여 활발히 이루어지고 있으나 해마토코쿠스 종에 관한 형질 전환 기술은 아직까지 미비하여 고성장성 고생산성의 균주 개발이 이루어지지 않고 있다.
본 발명의 목적은 외래 유전자 도입을 통해 미세조류를 형질 전환시켜 기존의 균주를 개량하거나 새로운 균주를 개발하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다른 생물에서 유래한 유전자를 이용하여 미세조류를 형질 전환시킴에 있어서 미세조류를 전처리 과정 없이 배양액을 바로 형질 전환에 사용함으로써 비용과 시간을 절감하고 도입하고자 하는 외래 유전자가 지속적으로 발현되며 형질 전환 돌연변이가 안정적으로 유지되는 효율적인 형질 전환 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, (S1) 미세조류 배양액을 형성하는 단계; (S2) 아그로박테리움 배양액을 형성하는 단계; 및 (S3) 상기 미세조류 배양액 및 아그로박테리움 배양액을 혼합하고 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 형질 전환 방법을 제공한다.
상기 미세조류로는 예를 들어 해마토코쿠스 플루비알리스가 사용될 수 있다.
상기 미세조류의 형질 전환 방법은 상기 아그로박테리움 배양액을 아세토사이린곤을 함유하는 배지에 배양하여 전처리하는 단계를 더 포함한다.
상기 아세토사이린곤을 함유하는 배지의 상기 아세토사이린곤 농도는 1mM 내지 100 mM이 바람직하다.
상기 (S3) 단계에서는 상기 미세조류 배양액 및 아그로박테리움 배양액을 혼합하여 형성된 혼합물을 2일 이상 배양하는 것이 바람직하다.
상기 미세조류의 형질 전환 방법은 (S4) 상기 (S3) 단계를 통해 형질 전환된 균주를 하이그로마이신과 세포탁심을 함유하는 고체 배지에 도말하여 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 고체 배지에서 상기 하이그로마이신의 농도는 10mg/L~50mg/L이 바람직하다. 상기 고체 배지에서 상기 세포탁심의 농도는 250mg/L~500mg/L이 바람직하다.
상기 미세조류의 형질 전환 방법은 (S5) 상기 (S4) 단계에서 선별된 형질 전환된 균주를 하이그로마이신이 들어 있는 배지를 이용하여 배양조에서 배양하는 단 계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 배양조에서의 빛의 세기는 50μE/m2s~200μE/m2s이 바람직하다.
본 발명은 또한, 아그로박테리움을 이용하여 미세조류에 외래 유전자를 도입하여 형성된 것을 특징으로 하는 형질 전환 균주를 제공한다.
여기서, 상기 미세조류로는 예를 들어 해마토코쿠스 플루비알리스가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 아그로박테리움을 이용하여 미세조류에 외래 유전자를 도입하여 형성된 형질 전환 균주를 이용하여 제조되는 단백질을 제공한다.
여기서, 상기 미세조류로는 예를 들어 해마토코쿠스 플루비알리스가 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 전처리 없이 그리고 고가의 장비나 재료 없이 미세조류를 형질 전환할 수 있으며, 외래 유전자가 염색체의 DNA로 바로 도입되어 형질 전환을 안정적으로 유지할 수 있고 지속적으로 유전자를 발현할 수 있다. 본 발명의 미세조류 형질 전환 방법은 해마토코쿠스를 포함한 다양한 미세조류의 형질을 전환시켜 다양한 균주를 제조할 수 있으며, 이와 같이 제조된 균주를 통해 여러 유용 단백질 및 이 단백질에 의해 합성되는 생리 활성 물질들의 대량 생산이 기대된다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환법을 이용한 미세조류의 형질 전환을 통한 균주 개발 방법에 관한 것으로, 형질 전환의 대상이 되는 미세 조류로 고 부가 유용 카로테노이드계(carotenoid) 색소(Astaxanthin) 생산 균주인 미세조류 해마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)가 예시적으로 소개된다.
구체적으로, 본 발명은 원형질체 형성이나 고체 배지 배양 등의 전처리 과정이 필요 없이 영양세포 배양액에 외래 유전자 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움 배양액을 유전자 전달 유도물질(Acetosyringone)과 함께 섞어준 후 배양하는 방법을 이용하여 영양세포 단계에서 바로 형질 전환시킬 수 있는 방법이며, 자연계에 존재하는 아그로박테리움의 유전자 전달 기작을 이용하므로 미세조류의 염색체로 유전자를 직접 도입할 수 있으며 별도의 실험 장비가 없이도 유전자의 안정적인 발현과 형질전환 돌연변이의 안정적인 유지가 가능한 저 비용 고 효율의 형질 전환 방법이다.
본 발명의 미세조류 형질 전환 방법에 따르면, 먼저 미세조류 배양액을 형성한다(S1). 여기서, 형질 전환 대상 미세조류로는 예를 들어 치어 사료에 직접 이용되거나 식품의 첨가물, 건강 식품, 건강 보조 식품 및 의약품의 원료로 사용되는 해마토코쿠스 플루비알리스가 사용될 수 있다.
다음으로, 아그로박테리움 배양액을 형성한다(S2). (S1) 단계 및 (S2) 단계 는 미세조류 배양액 및 아그로박테리움 배양액을 준비하는 단계이므로 형성 순서의 전후는 제한되지 않는다.
아그로 박테리움 배양액이 형성되면, 아그로박테리움 배양액을 아세토사이린곤을 함유하는 배지에 배양하여 전처리한다. 이때, 아세토사이린곤을 함유하는 배지의 아세토사이린곤 농도는 1 내지 100 mM이 바람직하다. 아세토사이린곤의 농도가 1 mM에 미달하는 경우 형질 전환 효율이 떨어지며, 100 mM을 초과하는 경우 용매에 의한 부작용이 발생할 수 있어 바람직하지 못하다.
다음으로, 앞서 제조된 미세조류 배양액 및 아그로박테리움 배양액을 혼합하고 배양한다(S3). 미세조류 배양액 및 아그로박테리움 배양액을 혼합하여 형성된 혼합물은 헤마토코쿠스의 DNA로 외래 유전자가 충분히 도입되도록 하기 위하여 2일 이상 배양하는 것이 바람직하다.
상기 미세조류의 형질 전환 방법은 상기 (S3) 단계를 통해 형질 전환된 균주를 하이그로마이신과 세포탁심을 함유하는 고체 배지에 도말하여 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 고체 배지에서 상기 하이그로마이신의 농도는 10mg/L~50mg/L이 바람직한데, 하이그로마이신의 농도가 10mg/L에 미달하면 자연 상태에서도 내성 균주가 존재할 수 있으므로 충분한 선별 효과를 기대할 수 없으며, 50mg/L로도 충분한 선별 효과를 얻을 수 있으므로 이를 초과하는 것은 효율적이지 못하다. 한편, 상기 고체 배지에서 상기 세포탁심의 농도는 250mg/L~500mg/L이 바람직한데, 세포탁심의 농도가 2501mg/L에 미달하면 아그로박테리움에 의한 오염의 문제가 있고, 세포탁심의 농도가 500mg/L를 초과하면 부작용이 발생할 수 있어 바 람직하지 못하다.
또한, 상기 미세조류의 형질 전환 방법은 상기 선별된 형질 전환된 균주를 하이그로마이신이 들어 있는 배지를 이용하여 배양조에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 배양조에서의 빛의 세기는 배양 효율을 고려할 때 50μE/m2s~200μE/m2s이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 항생제 저항 유전자 표지(genetic marker)로 하이그로마이신 트랜스포스포타아제(hygromycin transphosphotase; hpt)를 이용하여 형질전환에 의하여 도입된 외래 유전자가 미세조류에서 발현되며 발현된 유전자는 항생제 내성을 갖는 균주의 선별을 통해서 확인할 수 있다.
보고유전자(reporter gene)를 이용하면, 형질전환에 의하여 도입된 유전자가 미세조류에서 발현되며 이를 통해 합성된 단백질이 제대로 기능한다는 것을 확인할 수 있다. 보고유전자로는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 이용할 수 있는데, 이 단백질은 488nm 파장의 빛을 조사하면 녹색을 띠는 515nm 근처 파장의 형광을 내기 때문에 형질 전환된 미세조류에서 GFP 유전자가 발현되었는지를 형광 현미경 장비를 통해서 쉽게 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예
1) 재료
MCC-NIES(Microbial Culture Collection, National Institute of Environmental Studies, Japan)에서 분양 받은 해마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)를 250mL 플라스크를 사용하여 NIES 배지에 초기 접종 농도 10%(배지; 120mL, 배양액 13.5mL)로 133.5mL 배양하였으며 광배양기에서 23 ℃, 150 rpm 조건에서 형광등을 이용하여 50 μmol E m-2 s-1 세기의 빛을 12시간:12시간 광주기 조건으로 8~10일 배양한 배양액을 이용하였다. NIES 배지의 조성은 아래 표 1과 같다.
형질전환을 위한 매개 아그로박테리움은 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 사용하였으며 형질전환에는 pCAMBIA1302 벡터를 이용하였다. pCAMBIA1302 벡터는 항생제 카나마이신 내성 유전자를 코딩하고 있고, 도입유전자(T-DNA)에는 녹색 형광 단백질 유전자(gfp; green fluorescence protein)와 항생제 하이그로마이신 내성 유전자(hpt; hygromycin phosphotransferase)가 코딩되어 있다. pCAMBIA1302 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움을 카나마이신 100 mg/L을 넣은 YEP 배지에 1~2일 배양하였다.
성분 함량 (L-1)
Ca(NO3)2 0.15 g
KNO3 0.10 g
Na2Glycerophosphate·5H2O 0.05 g
MgSO4·7H2O 0.04 g
Tris-aminomethane 0.50 g
Thiamine 0.01 mg
Biotin 0.10 μg
Vitamin B12 0.01 μg
NaAcetate 0.82 g
PIV metal solution (per liter) 3 mL(Na2EDTA; 1 g, FeCl3·6H2O; 0.196 g, MnCl2·4H2O; 0.036 g, ZnSO4·7H2O; 0.022 g, CoCl2·6H2O; 4 mg, Na2MoO4·2H2O; 2.5 mg)
2) 해마토코쿠스 배양액 준비
8~10일 배양한 해마토코쿠스(OD660 ≒1.0) 50mL을 튜브에 넣고 50 × g에서 10분 동안 원심 분리하여 수확하고 상등액을 버리고 10mL NIES(NIES-C + 1mM NaAcetate) 배지로 재현탁하고 4℃ 암실에서 12시간 이상 보관하였다.
3) 아그로박테리움 배양액 준비
1~2일 배양한 아그로박테리움(OD600 ≥ 1.0)을 4℃, 8000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하고 상등액을 버리고 3차 증류수로 재현탁한 후 4℃, 8000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하고 재현탁하는 방법으로 3번 씻었다. 3번 씻은 아그로박테리움을 OD600 ; 0.5 가 되도록 NIES배지로 희석하고 아세토사이린곤(Acetosyringone) 농도를 10 mM이 되도록 넣어준 뒤 29~31℃에서 200rpm으로 배양기에서 12시간 배양하였다.
4) 해마토코쿠스의 형질전환
4℃ 암실에서 보관해 두었던 해마토코쿠스 배양액과 29~31℃에서 12시간 배양한 아그로박테리움 배양액을 같은 부피로 섞어서 29℃에서 200rpm으로 배양기에서 2~3일 함께 배양하고 이후에 4℃에서 30 × g로 원심 분리하고 10mL NIES 배지로 씻고 다시 원심분리하는 방법으로 3번 씻었다.
5) 형질전환된 해마토코쿠스의 선별
형질 전환된 해마토코쿠스 균주의 선별을 위해 10 mg/L ~ 50 mg/L 하이그로마이신과 250 mg/L ~ 500mg/L 세포탁심을 넣은 NIES 고체 배지(15 g/L agarose)에 도말하였다. 해마토코쿠스를 도말한 고체배지는 23℃, 광배양기에서 2~3주 정도 배양하면 하이그로마이신 내성 해마토코쿠스 균주의 군체가 형성된다. 형성된 군체를 시험관에 하이그로마이신 10mg/L ~ 50mg/L과 세포탁심 250 mg/L ~ 500mg/L이 들어있는 NIES 배지 10mL에 접종하고 23℃ 200rpm으로 광배양기에서 배양하였다. 이후 플라스크에 지속적으로 계대배양을 통해 형질전환 돌연변이 형질이 유지된다는 것을 확인하였다.
6) 도입유전자의 도입과 발현 여부 확인
녹색 형광 단백질의 경우 형광 현미경을 통해 단백질의 실제 발현 여부를 간단하게 확인할 수 있다. 488nm 파장의 빛을 조사하면 녹색 형광 단백질이 여기 되어 515nm 부근 파장의 빛이 관찰된다. 이를 통해 녹색 형광 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 녹색 형광 단백질의 형광은 미세조류가 가지고 있는 엽록체의 자체형광과는 차이가 있다. 자체형광은 543nm 파장의 빛을 조사하면 637nm 파장의 빛이 관찰된다. 이를 통해서 녹색형광단백질이 발현되고 있음을 검증하였다.
하이그로마이신 트랜스포스포타제 (hygromycin transphosphotase) 유전자(hpt)의 염색체 DNA로의 도입 여부는 PCR 분석을 통해서 확인하였다. 형질 전환된 미세조류의 염색체 DNA를 추출하여 hpt 유전자의 PCR primer를 이용하여 PCR을 실시하였다. hpt primer의 염기서열은 5'-AGC TGC GCC GAT GGT TTC TAC AA-3'과 5'-ATC GCC TCG CTC CAG TCA ATG-3이며, PCR 산물의 크기는 약 0.5kb이다.
7) 결과
외래 유전자 도입을 통해 형질 전환된 돌연변이 균주의 선별 결과는 도 1에서 볼 수 있듯이 형질 전환 돌연변이 균주는 10 mg/L ~ 50mg/L 하이그로마이신이 들어 있는 고체 배지에서 군체가 형성되었고 대조군(형질 전환되지 않은 헤마토코쿠스 균주)에서는 군체가 형성되지 않았다.
도 1에서처럼 형성된 군체를 선별하여 시험관에 옮겨 10 mg/L ~ 50mg/L 하이그로마이신이 포함된 10mL NIES 배지에 2주 이상 배양한 후 형광현미경으로 관찰하였다(도 2). 형질 전환된 돌연변이 균주에서 488nm 파장의 빛을 조사하였을 때 녹색 형광 (515nm)을 띄는 것을 관찰하였다.
형질 전환된 돌연변이 균주의 염색체 DNA를 추출하여 hpt 유전자의 primer를 사용하여 PCR을 실시하였고. PCR 산물을 전기영동하였다(도 3). 2번과 3번 레인(lane)에서 hpt primer에 대한 PCR 산물이 존재함을 볼 수 있으며, 이를 통해서 hpt 유전가가 염색체 내로 도입되었음을 확인할 수 있다.
도 1은 실시예의 형질 전환 돌연변이 균주(우)와 대조군 균주(좌)를 비교한 사진이다.
도 2a는 야생형 균주의 공초점 현미경 형광 이미지이고, 도 2b는 실시예의 형질 전환 돌연변이 균주의 공초점 현미경 형광 이미지이다.
도 3은 실시예의 형질 전환 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 hpt primer에 대한 PCR을 통한 hpt의 PCR 산물(0.5kb)의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다(좌측부터 1번 lane; 1kb DNA lader, 2번 lane, 3번 lane; 형질전환 돌연변이)

Claims (14)

  1. (S1) 해마토코쿠스 플루비알리스 배양액을 형성하는 단계;
    (S2) 아그로박테리움 배양액을 형성하는 단계; 및
    (S3) 상기 해마토코쿠스 플루비알리스 배양액 및 아그로박테리움 배양액을 혼합하여 형성된 혼합물을 2일 이상 배양하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아그로박테리움 배양액을 아세토사이린곤을 함유하는 배지에 배양하여 전처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 아세토사이린곤을 함유하는 배지의 상기 아세토사이린곤 농도는 1 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    (S4) 상기 (S3) 단계를 통해 형질 전환된 균주를 하이그로마이신과 세포탁심을 함유하는 고체 배지에 도말하여 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 고체 배지에서 상기 하이그로마이신의 농도는 10mg/L~50mg/L인 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 고체 배지에서 상기 세포탁심의 농도는 250mg/L~500mg/L인 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    (S5) 상기 (S4) 단계에서 선별된 형질 전환된 균주를 하이그로마이신이 들어 있는 배지를 이용하여 배양조에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 배양조에서의 빛의 세기는 50μE/m2s~200μE/m2s인 것을 특징으로 하는 해마토코쿠스 플루비알리스의 형질 전환 방법.
  11. 삭제
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  13. 삭제
  14. 삭제
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