CN110564621B

CN110564621B - 具有高脂质生产能力的链带藻属物种t9分离株及其用途

Info

Publication number: CN110564621B
Application number: CN201810789846.6A
Authority: CN
Inventors: 黄英娥; 郭杨正; 黄政谕; 简美枝; 江尹玲; 尹韵慈; 董志宏; 朱燕华; 廖丽玲
Original assignee: Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: TWI687517B; TW202003835A; CN110564621A

Abstract

本发明涉及具有高脂质生产能力的链带藻属物种T9分离株及其用途。本发明揭示一株具有高脂质生产能力的链带藻属物种(Desmodesmus sp.)T9分离株，它以寄存编号BCRC 980048寄存于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以寄存编号CCTCC M 2018152寄存于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。该链带藻属物种T9分离株可用于生产藻油。

Description

具有高脂质生产能力的链带藻属物种T9分离株及其用途

技术领域

本发明有关于一株具有高脂质生产能力(high lipid-producing ability)的链带藻属物种(Desmodesmus sp.)T9分离株，它以寄存编号BCRC 980048寄存于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以寄存编号CCTCC M 2018152寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。该链带藻属物种T9分离株可用于生产藻油。

背景技术

微藻(microalgae)是一群会进行光合作用的藻类，广泛分布于海水以及淡水水域。微藻具有生长快速、适应力佳且富含人类必需的蛋白质、脂质、多糖以及类胡萝卜素(carotenoid)等优点，因而受到各种不同的领域的关注，包括食品产业、生物能源产业以及生物医药产业等。特别地，与传统油料作物(oil crop)相较之下，微藻可生产较大量的脂质并累积在体内，所以已被开发来制备藻油(algal oil)。藻油通常通过使用下列多种有机溶剂来进行萃取：氯仿/甲醇(chloroform/methanol)、己烷(hexane)、异丙醇(isopropanol)以及石油醚(petroleum ether)，并且可以组合使用压榨(expelling)或微波/超声波处理(microwave/ultrasonic treatment)来提高萃取效率。另外，超临界流体(supercriticalfluid)[例如超临界二氧化碳(supercritical carbon dioxide)]也被提出可取代上述有机溶剂。

藻油的主要成分三酰甘油(triacylglycerol,TAG)，其中含有大量的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)[包括二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)以及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)]以及单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)，而这些不饱和脂肪酸可以有效地降低人体血液中的胆固醇，以减少心血管疾病(cardiovascular disease)的发生。此外，藻油的脂肪酸种类主要以C₁₆与C₁₈为主，适合用于生产生质柴油(biodiesel)。因此，食品与生物能源产业的相关研究人员致力于开发可供藻油生产的微藻藻株。

目前已有许多可供藻油生产的微藻藻株被分离出来，它们大多属于绿球藻属物种(Chlorella sp.)、节螺藻属物种(Arthrospira sp.)、栅藻属物种(Scenedesmus sp.)、链带藻属物种(Desmodesmus sp.)、杜氏藻属物种(Dunaliella sp.)以及拟球藻属物种(Nannochloropsis sp.)等。例如，TW I429746B揭示一株分离自台湾西南海岸苦咸水的链带藻属物种(Desmodesmus sp.)F2分离株BCRC 980018，该藻株被证实具有良好的耐热性，并且在氮饥饿(nitrogen starvation)的培养条件下具有经提高的脂质含量，因而被预期可供用于生质柴油的生产。

在Selvarajan R.et al.(2015),Energies,8:7502-7521中，Selvarajan R.等人从中欧的淡水与碱湖(soda lake)中分离出小球藻(Chlorella vulgaris)LC8分离株，它被发现会累积高含量的脂质，而其脂质具有C₁₆-C₁₈脂肪酸型态(C₁₆-C₁₈fatty acid profile)、高十六烷值、低粘度以及低碘价，因而被认为可供应用于生产高质量的生质柴油。

虽然已存在有上述文献报导，申请人仍积极致力于筛选出具有高脂质含量的微藻藻株以供食品产业以及生物能源产业之用。经研究，申请人意外地从屏东县海边的海水中分离出一株新颖的微藻分离株[它后来经过特征鉴定而被称为链带藻属物种(Desmodesmussp.)T9分离株]，它在种系上(phylogenetically)不同于所属藻属中已公开的藻种，并且具有优异的脂质生产能力。特别地，申请人发现在藻油中含有1,3-二酰甘油(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)。而已有文献指出，含有1,3-DAG的油可以有效地抑制体内脂肪堆积(accumulation of body fat)并且防止体重增加(Meng X.et al.(2014),FoodChem.,143:319-324)。然而，就申请人所知，迄今尚无任何文献或专利前案曾经揭示栅藻科物种(Scenedesmaceae sp.)所生产的藻油含有1,3-二酰甘油。

发明内容

于是，在第一个方面，本发明提供一种链带藻属物种(Desmodesmus sp.)T9分离株，它以寄存编号BCRC 980048寄存于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以寄存编号CCTCC M 2018152寄存于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection,CCTCC)。

在第二个方面，本发明提供一种用于生产藻油的方法，其包括：将如上所述的链带藻属物种T9分离株培养于适于所述藻株生长的培养基中。

本发明所述用于生产藻油的方法，所述藻油包含1,3-二酰甘油。

在第三个方面，本发明提供一种藻油，它通过如上所述的方法而制得。

在第四个方面，本发明提供一种食品产品，其包含如上所述的藻油。

在第五个方面，本发明提供一种生质燃料，其包含如上所述的藻油。

在第六个方面，本发明提供如上所述的藻油用来作为生质燃料、生质燃料的组分或生产生质燃料的起始材料的用途。

具体实施方式

本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例后，将变得明显。

除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。熟悉本技艺者会认知到许多与那些描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。

如本文中所使用的，术语“藻油(algal oil)”意指从藻类生质(algal biomass)中萃取而得到的油组合物(oil composition)。该藻油可包含游离的脂肪酸(free fattyacid,FFA)、含有脂肪酸的脂质(lipid)、蜡(wax)以及极性可溶物(polar soluble)。该脂肪酸分布于中性脂质(neutral lipid)[例如，单酰甘油(monoacylglycerol,MAG)、二酰甘油(diacylglycerol,DAG)以及三酰甘油(triacylglycerol,TAG)]与极性脂质(polar lipid)[例如，卵磷脂(phosphatidylcholine,PC)以及磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)]中。

微藻(microalgae)可生产大量的脂质并累积在体内，因而已被开发来制备藻油，以供各种不同领域的产业之用(例如，食品产业以及生物能源产业)。而为了因应产业界对于藻油的广大需求，申请人积极致力于筛选出具有高脂质含量(high lipid-producingability)的微藻藻株。

申请人从取自于屏东县的不同地区的海水中分离出6株微藻分离株，接着通过尼罗红染色(nile red staining)而从中筛选出一株具有高脂质含量的微藻分离株T9。申请人对该微藻分离株T9进行特征鉴定并且参考Fawley M.W.et al.(2013),Phycologia,52:565-572以及Hoshina R.(2014),BMC Res.Notes,doi:10.1186/1756-0500-7-592等微生物学相关文献，而判断该微藻分离株T9属于一种新颖的链带藻属物种(Desmodesmus sp.)。由于此新颖藻种的正式种名(species name)尚未决定，因而被称为“链带藻属物种(Desmodesmus sp.)T9分离株”。链带藻属物种T9分离株已于公元2018年3月12日以寄存编号BCRC 980048寄存于台湾的食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC ofFIRDI)，也依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty)的规定，于公元2018年3月24日以寄存编号CCTCC M 2018152寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

申请人接着使用氯仿(chloroform)-甲醇混合物来对本发明的链带藻属物种T9分离株进行萃取，而由此所得到的藻油经由实验而被发现除了含有三酰甘油(TAG)与1,2-二酰甘油(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)外，还含有首次被发现存在于栅藻科物种(Scenedesmaceae sp.)的藻油中的1,3-二酰甘油(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)。此外，这些脂质的脂肪酸组成进一步被发现以C₁₆-C₁₈为主。

基于上述，本发明的链带藻属物种T9分离株的藻油被预期具有发展成为供用于生产食用油以及生质柴油(biodiesel)的原料的高潜力。于是，本发明提供一种用于生产藻油的方法，其包括：将如上所述的链带藻属物种T9分离株培养于适于该藻株生长的培养基中。较佳地，该藻油包含1,3-二酰甘油(1,3-DAG)。

如本文中所使用的，术语“培育(cultivation)”以及“培养(culturing)”可交换地使用。

有关培养链带藻属物种T9分离株的操作过程与参数条件等落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，TW I429746B以及CN 106467897A。

依据本发明，适用于培养链带藻属物种T9分离株的培养基是本领域技术人员所熟知的，这包括，但不限于：韦因培养基(Walne's medium)、BG-11培养基(BG-11 medium)、F/2培养基(F/2 medium)、TAP培养基(TAP medium)、C培养基(C medium)、Chu's培养基(Chu'sMedium)以及L1培养基(L1 medium)。在本发明的一个较佳具体例中，该培养基是韦因培养基。在本发明的另一个较佳具体例中，该培养基是BG-11培养基。

依据本发明，适用于本发明的培养基具有范围落在7至12内的pH值。在本发明的一个较佳具体例中，该培养基具有8的pH值。

依据本发明，该链带藻属物种T9分离株可在范围落在20℃至37℃的温度下进行培养。在本发明的一个较佳具体例中，该链带藻属物种T9分离株在30℃的温度下进行培养。

依据本发明，该链带藻属物种T9分离株可在范围落在200μmol/m²s至450μmol/m²s的照度(illuminance)下进行培养。在本发明的一个较佳具体例中，该链带藻属物种T9分离株在450μmol/m²s的照度下进行培养。

依据本发明，该链带藻属物种T9分离株可在范围落在0.1vvm至0.5vvm的空气(含有5％CO₂)的通气量下进行培养。在本发明的一个较佳具体例中，该链带藻属物种T9分离株在0.5vvm的空气(含有5％CO₂)的通气量下进行培养。

依据本发明，链带藻属物种T9分离株的藻油通过对链带藻属物种T9分离株的培养物进行萃取处理(extraction treatment)而制得。适用于本发明的萃取处理包括，但不限于：溶剂萃取(solvent extraction)、超临界流体萃取(supercritical fluidextraction)、酶萃取(enzymatic extraction)、渗透压冲击(osmotic shock)，以及它们的组合。有关这些萃取处理的操作过程与参数条件等落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Folch J et al.(1957),J.Biol.Chem.,226:497-509、US 8580160 B2以及US 20120040443 A1。

较佳地，该萃取处理是溶剂萃取。适用于本发明的溶剂萃取的有机溶剂包括，但不限于：氯仿/甲醇(chloroform/methanol)、己烷(hexane)、异丙醇(isopropanol)、石油醚(petroleum ether)，以及它们的组合。

依据本发明，该萃取处理可以进一步组合使用机械压制(mechanical pressing)来提高萃取效率。该机械压制可以采用本领域技术人员所详知且惯用的技术来进行，这包括，但不限于：压榨(expelling)、微波/超声波处理(microwave/ultrasonic treatment)、珠磨(bead milling)、液态剪力破坏(liquid shear disruption)，以及它们的组合。

在本发明的一个较佳具体例中，该藻油通过使用氯仿/甲醇来对该链带藻属物种T9分离株进行萃取并且同时组合使用珠磨以及超声波处理而制得。

依据本发明，该链带藻属物种T9分离株具有范围落在10％至20％的藻油含量。在本发明的一个较佳具体例中，该链带藻属物种T9分离株的藻油含量百分比为12.81％。

本发明也提供一种藻油，它通过如上所述的方法而制得。较佳地，该藻油包含1,3-二酰甘油(1,3-DAG)。

本发明也提供一种食品产品，其包含如上所述的藻油。该藻油可以当作食品添加物(food additive)而通过现有方法于原料制备时添加，或配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，该食品产品的种类包括，但不限于：奶制品(milk products)、饮料(beverages)、甜点(confectionery)、糖果(candies)、发酵食品(fermented foods)、动物饲料(animal feeds)、健康食品(health foods)、膳食补充品(dietary supplements)、果冻(jellys)、婴儿配方(infant formulas)、沙拉酱(dressings)、蛋黄酱(mayonnaise)、涂酱(spreads)以及酱料(sauces)。

此外，本发明也提供一种生质燃料，其包含如上所述的藻油。本发明又提供如上所述的藻油用来作为生质燃料、生质燃料的组分(component)或生产生质燃料的起始材料(starting material)的用途。

如本文中所使用的，术语“生质燃料(biofuel)”意指源自于藻类的任何燃料(fuel)[例如，生质柴油以及生质乙醇(bioethanol)]、燃料添加物(fuel additive)，以及芳香族和/或脂肪族化合物(aromatic and/or aliphatic compound)。较佳地，该生质燃料是生质柴油。

依据本发明，该生质燃料可通过对藻油进行酯交换(transesterification)而制得。该酯交换可以采用本领域技术人员所详知且惯用的技术来进行，这包括，但不限于：酸催化反应(acid catalyzed reaction)、碱催化反应(base catalyzed reaction)、酶催化反应(enzyme-catalyzed reaction)，以及它们的组合。

本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只供例示说明用，而不应解释为本发明的实施上的限制。

<实施例>

一般实验材料：

1.在下面的韦因培养基(Walne's medium)中所使用的营养物储备溶液(nutrientstock solution)具有如下面表1所示的配方。

表1.营养物储备溶液的配方

*：微量金属溶液通过将2.1g ZnCl₂、2.0g CoCl₂·6H₂O、0.9g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O以及2.0g CuSO₄·5H₂O配于100mL的蒸馏水中，继而利用3N的HCl来改善沉淀情形而制得。

2.在下面的韦因培养基以及BG-11培养基(BG-11medium)中所使用的维生素储备溶液(vitamin stock solution)具有如下面表2所示的配方。

表2.维生素储备溶液的配方

成分	用量
		维生素B12(cyanocobalamin)	10mg
硫胺素盐酸盐(thiamine HCl)	10mg
		生物素(biotin)	200μg
蒸馏水	加至100mL

3.韦因培养基(Walne's medium)的制备：

将1mL的营养物储备溶液加入至1L的海水(得自于新竹市海山渔港)中并予以混合均匀，继而于121℃下进行灭菌历时15分钟。之后，待温度降至大约50℃，加入0.1mL的维生素储备溶液并予以混合均匀，借此而得到韦因培养基。

4.在下面实施例中所使用的韦因琼脂培养基(Walne's agar medium)通过对该韦因培养基添加以琼脂(购自于MERCK)(15g/L)而制得。

5.BG-11培养基(BG-11medium)的制备：

首先，依据下面表3所示的配方来配制50X的BG-11培养基的储备溶液(stocksolution)，接着取20mL的BG-11培养基的储备溶液，继而加入980mL的蒸馏水并予以混合均匀，然后以1N的NaOH来将所形成的混合物的pH值调整至8.0，继而于121℃下进行灭菌历时15分钟。之后，待温度降至大约50℃，加入0.1mL的维生素储备溶液并予以混合均匀，借此而得到BG-11培养基。

表3.BG-11培养基的储备溶液的配方

6.在下面实施例中所使用的BG-11琼脂培养基(BG-11agar medium)通过对该BG-11培养基添加以琼脂(15g/mL)而制得。

实施例1.微藻分离株的分离与筛选(Isolation and screening of microalgalisolates)

A、试验藻株的来源与分离：

申请人使用多种取自于屏东县的不同地区(包括海边、大鹏湾以及后壁湖等)的海水作为样品来源来进行微藻分离株的分离。首先，将10mL的海水样品与30mL的韦因培养基加入至离心管(50mL)中，继而置于一个温度维持在25℃、照度(illuminance)维持在200-300μmol/m²s以及光暗周期设定为12小时光照/12小时黑暗的光照培养箱(illuminatedincubator)(型号LTI-613-H，厂牌TKS)中进行培养，然后将适量的所得到的微藻培养物(microalgal culture)均匀涂布于韦因琼脂培养基上，并置于该光照培养箱中进行培养。之后，申请人分别以肉眼与显微镜来观察该韦因琼脂培养基上的藻落(algal colonies)的形态以及藻株的生长情形，继而从中挑选出6个藻落并以四区划线法(four-quadrantstreak method)的方式分别涂布于韦因琼脂培养基上，并置于该光照培养箱中进行培养。上述藻株纯化步骤重复进行数次，而得到6株经纯化的微藻分离株，其中包括：藻株编号T4、T9、G1、G2、G4以及G5。

B、筛选具有高脂质生产能力(high lipid-producing ability)的微藻分离株：

对依据上面第A项中所得到的6个微藻分离株的新鲜藻体各取适量并加入20μL的无菌去离子水予以混合，然后分别以1μL的0.1mg/mL的尼罗红(Nile red)(配于DMSO中)来进行胞内油滴(intracellular lipid droplets)的染色，继而在室温下静置历时5分钟，之后以倒立式荧光显微镜(型号DM IL LED/X-Cite-120Q，厂牌Leica)在1,000倍的放大倍率下来进行观察以及拍照。

实验结果显示：在所纯化出的6株微藻分离株当中，微藻分离株T9具有较明显且呈黄色的油滴分布(数据未显示)，申请人据此而认为：微藻分离株T9是最具有开发潜力的藻株，因此将它拿来进行下面的特征鉴定。

实施例2.微藻分离株T9的特征鉴定

为了确认在上面的实施例1中所筛选出的微藻分离株T9的所属藻种，微藻分离株T9被拿来进行下面的内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析、谱系分析(phylogenetic analysis)、18S rRNA序列分析以及形态特征分析(analysis ofmorphological traits)。

A、ITS序列分析：

将适量的依据上面实施例1的第A项“试验藻株的来源与分离”中所得到的微藻分离株T9的新鲜藻体置于2mL微量离心管中，并使用ZR真菌/细菌DNA MiniPrep^TM试剂盒(ZRFungal/Bacterial DNA MiniPrep^TMkit)(Zymo Research)来进行基因组DNA(genomic DNA)的萃取。由此所得到的基因组DNA被溶于适量的无菌去离子水中，借此而形成含有该微藻分离株T9的基因组DNA的样品。

以所得到的基因组DNA作为模板(template)，并使用在White T.J.et al.(1990),PCR protocols:A guide to methods and applications,315-317中所揭示的1组针对18SrRNA-ITS基因的保守序列(conserved sequence)而设计的具有下面所示核苷酸序列的引物对(primer pair)正向引物NS1-F与反向引物ITS4-R来进行聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)，而PCR的反应条件显示于下面表4中。

正向引物NS1-F

5’-gtagtcatatgcttgtctc-3’(序列辨识编号：1)

反向引物ITS4-R

5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(序列辨识编号：2)

表4.PCR的反应条件

于完成PCR后，通过1％琼脂糖凝胶电泳来确认有否得到大小约3,610bp的PCR扩增产物，并从凝胶回收纯化该经确认的PCR产物。

经纯化的PCR扩增产物使用BigDye^TMTerminator v3.1循环测序试剂盒(BigDye^TMTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)(Applied Biosystems)并分别使用在White T.J.et al.(1990)(同上述)中所揭示的4个针对ITS序列而设计的引物来进行循环测序(cycle sequencing)，所述引物的核苷酸序列显示于下面的表5中，而该循环测序的反应条件显示于下面表6中。

表5.用来进行循环测序的4个引物

表6.循环测序的反应条件

之后，将所得到的4个循环测序产物(cycle sequencing product)进行纯化。所述经纯化的循环测序产物分别添加以10μL的Hi-Di^TM甲酰胺(Hi-Di^TMFormamide)并于95℃下进行加热历时5分钟，接着使用3730DNA分析仪(3730 DNA analyzer)(AppliedBiosystems)来进行测序，而所得到的测序结果利用Vector NTI Suite 9软件(VNTI)的ContigExpress程序来进行序列拼接，借此而得到该微藻分离株T9的ITS序列(序列辨识编号：6)。

该微藻分离株T9的ITS序列被拿来与NCBI网站上的基因数据集进行比对分析，而分析结果显示于下面的表7中。从表7可见，该微藻分离株T9的ITS序列与5种链带藻属物种(Desmodesmus sp.)的藻株[也就是链带藻属物种F2分离株、链带藻属物种GM4i分离株、奥菠菜链带藻(Desmodesmus opoliensis)GS2j分离株、链带藻属物种GM4j分离株以及链带藻属物种GM4c分离株]的ITS序列间具有高度的序列相似性(sequence similarity)。

表7.本发明的微藻分离株T9的ITS序列与5种链带藻属物种的藻株的ITS序列间的序列相似性

B、谱系分析：

有关微藻分离株T9的谱系分析参考Hadi S.I.et al.(2016),PLoS One,11:e0149284来进行。将该微藻分离株T9的ITS序列(序列辨识编号：6)拿来与NCBI网站上的基因数据集中的栅藻属物种、链带藻属物种以及尖带藻属物种(Acutodesmus sp.)的标准藻株的ITS序列进行比对分析，继而使用MEGA 6.0软件并通过最大概似方法(maximumlikelihood method)而绘制出亲缘关系树(phylogenetic tree)。

依据谱系分析结果，与其他标准藻株间(包括奥菠菜链带藻GS2j分离株、链带藻属物种GM4j分离株以及链带藻属物种GM4c分离株)相较之下，该微藻分离株T9与链带藻属物种GM4i分离株具有较为接近的亲缘关系。

综合上面第A项与第B项的实验结果，本发明的微藻分离株T9初步鉴定属于链带藻属的藻株，而为了进一步确认该微藻分离株T9的所属物种，该微藻分离株T9被进一步拿来进行下面第C至D项的分析。

C、18S rRNA序列分析：

有关微藻分离株T9的18S rRNA序列分析依照上面第A项当中所述的方法来进行该微藻分离株T9的基因组DNA萃取、18S rRNA-ITS基因的保守序列的聚合酶链式反应、琼脂糖凝胶电泳以及循环测序，不同处在于：循环测序使用在White T.J.et al.(1990)(同上述)中所揭示的8个针对18S rRNA序列而设计的引物来进行，而所述引物的核苷酸序列显示于下面的表8中。

表8.用来进行循环测序的8个引物

之后，将所得到的8个循环测序产物进行纯化。所述经纯化的循环测序产物分别添加以10μL的Hi-Di^TM甲酰胺并于95℃下进行加热历时5分钟，接着使用3730DNA分析仪来进行测序，而所得到的测序结果利用Vector NTI Suite 9软件的ContigExpress程序来进行序列拼接，借此而得到该微藻分离株T9的18S rRNA序列(序列辨识编号：14)。

该微藻分离株T9的18S rRNA序列被拿来与NCBI网站上的基因数据集进行比对分析，而分析结果显示：该微藻分离株T9的18S rRNA序列与链带藻属物种GM4i分离株、链带藻属物种GM4j分离株以及链带藻属物种GM4c分离株的18S rRNA序列间分别只具有73％、71％以及71％的序列覆盖率(coverage)，特别地，该微藻分离株T9的18S rRNA序列的核苷酸残基位置923至1275处以及2007至2446处的核苷酸序列(序列辨识编号：15以及16)无法比对到该链带藻属物种GM4i分离株的18S rRNA序列上的任一段核苷酸序列。

D、形态特征分析：

依据上面实施例1的第A项“试验藻株的来源与分离”中所得到的含有微藻分离株T9的新鲜藻体使用倒立式显微镜(型号DM IL LED，厂牌Leica)并在1,000倍的放大倍率下来进行观察以及拍照。

依据形态特征分析结果，该微藻分离株T9的细胞呈圆形、大小约4-8μm、单细胞、叶绿体(chloroplast)周生，并且具有明显的蛋白核(pyrenoid)以及叶绿体。申请人进一步参照Hoshina R.(2014)(同上述)与TW I429746B而将上面表7中的5种标准藻株的形态特征拿来与微藻分离株T9所具者进行比对，而比对结果发现：该微藻分离株T9的形态与链带藻属物种GM4i分离株、链带藻属物种GS2j分离株以及链带藻属物种F2分离株所具者皆不相同，而与链带藻属物种GM4j分离株以及链带藻属物种GM4c分离株所具者较为接近。

综合以上各项的特征鉴定结果，同时参考Fawley M.W.et al.(2013)(同上述)以及Hoshina R.(2014)(同上述)等微生物学相关文献，申请人认为：本发明的微藻分离株T9是一种新颖的链带藻属物种的藻株，由于此新颖藻种的正式种名(species name)尚未决定，该藻株以下称为“链带藻属物种(Desmodesmus sp.)T9分离株”。链带藻属物种T9分离株已于公元2018年3月12日以寄存编号BCRC 980048寄存于台湾的食品工业发展研究所(FoodIndustry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号，台湾)，也于公元2018年3月24日以寄存编号CCTCC M 2018152寄存于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。

实施例3.链带藻属物种T9分离株的藻油(algal oil)的制备与成分分析

实验方法：

A、链带藻属物种T9分离株的大规模培养(large-scale culture)：

首先，将适量的依据上面实施例1的第A项“试验藻株的来源与分离”中所得到的链带藻属物种T9分离株的新鲜藻体置于250mL锥形瓶中，继而以50mL的BG-11培养基来充分悬浮该藻体，并于光照下以200rpm进行振荡培养历时7天，而得到链带藻属物种T9分离株的接种源(inoculum)。

接着，将适量的链带藻属物种T9分离株的接种源接种至含有1L的BG-11培养基的血清瓶中，并置于一个温度维持在30℃、含有5％CO₂的空气的通气量为0.5vvm、照度维持在200-300μmol/m²s以及光暗周期设定为24小时光照的光照培养箱中进行培养，以活化链带藻属物种T9分离株。将由此所形成的链带藻属物种T9分离株的培养物(OD₆₈₂值约为2)的浓度以BG-11培养基来调整至OD₆₈₂值0.5，并置于一个温度维持在30℃、含有5％CO₂的空气的通气量为0.5vvm、照度维持在450μmol/m²s以及光暗周期设定为24小时光照的1L柱状光反应器(column photoreactor)中来进行培养历时6天。之后，将所形成的链带藻属物种T9分离株的培养物(OD₆₈₂值为7.35)进行冷冻干燥，借此而得到链带藻属物种T9分离株的冷冻干燥粉末。

B、链带藻属物种T9分离株的藻油制备：

有关链带藻属物种T9分离株的藻油的制备大体上参考Folch J et al.(1957)(同上述)当中所述的方法来进行藻油的萃取，并略作修改。简言之，将依据上面第A项中所得到的链带藻属物种T9分离株的冷冻干燥粉末(30mg)置于2mL的微量离心管中并加入2mL的氯仿(chloroform)-甲醇混合物(2:1,v/v)与适量的玻璃珠，继而以撞击式细胞破碎仪(

MM400)(Thermo Fisher Scientific Inc.)来进行振荡共计2次，每次历时5分钟，以打破细胞。接着以10,000rpm来进行离心历时5分钟，而得到上清液以及残余物。收取该上清液，并对该残余物加入2mL的氯仿-甲醇混合物(2:1,v/v)，继而以超声波振荡器(PowerSonic 410)(Hwashin)来进行振荡萃取历时10分钟，接着以10,000rpm来进行离心历时5分钟，而得到上清液以及残余物。收取该上清液，而该残余物重复进行上述振荡萃取-离心步骤，直到所收取的上清液颜色呈现透明为止，继而合并所有收集到的上清液，然后加入等体积的145mM NaCl溶液并予以混合均匀，接着以4,500rpm来进行离心历时10分钟，继而以玻璃量吸管来将所形成的下层液体移至玻璃瓶中，接着予以风干(air-dried)过夜以去除溶剂，借此而得到萃取自该链带藻属物种T9分离株的藻油。

之后，申请人进一步对依据上述所得到的藻油进行称重并将所测得的重量代入下列公式(1)，而得到链带藻属物种T9分离株的藻油含量百分比(％)：

公式(1)：A＝(B/30)×100

其中：A＝藻油含量百分比(％)

B＝藻油的重量(mg)

而计算结果发现，链带藻属物种T9分离株的藻油含量百分比为12.81％。

C、藻油的组成分析：

首先，依据上面第B项中所得到的藻油被溶于己烷(hexane)中以配制成具有浓度约3-6mg/mL的待测溶液样品。接着，该待测溶液样品被拿来进行高效能液相层析(highperformance liquid chromatography,HPLC)分析，以测定三酰甘油(triacylglycerol,TAG)、1,3-二酰甘油(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)、1,2-二酰甘油(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)、单酰甘油(monoacylglycerol,MAG)以及游离的脂肪酸(freefatty acid,FFA)的含量百分比。本实验所使用的HPLC分析仪器如下：HITACHI高效能液相层析系统(L-2000,HITACHI)；分析柱为硅胶(silica gel)(5μm)(MERCK)，长度：250mm×4.6mm。而HPLC操作条件显示于下面的表9中。

表9.HPLC的操作条件

此外，为供比对，使用已知的TAG、1,3-DAG、1,2-DAG、MAG以及FFA的溶液来进行相同的分析，继而依据各个溶液在层析图谱中的滞留时间来比对出待测溶液样品的层析图谱中各波峰所对应的成分，接着通过比对各波峰的面积，以计算出TAG、1,3-DAG、1,2-DAG、MAG以及FFA在该藻油中所占的含量百分比。

所得到的结果显示于下面的表10中。从表10可见，链带藻属物种T9分离株的藻油含有较多的TAG与1,3-DAG以及少量的1,2-DAG，而完全没有MAG与FFA。特别地，1,3-DAG首次被发现存在于栅藻科物种(Scenedesmaceae sp.)的藻油中，且其含量高达28.6％。

表10.脂质的种类与含量百分比

脂质种类	含量百分比(％)
		三酰甘油(TAG)	69.7
1,3-二酰甘油(1,3-DAG)	28.6
		1,2-二酰甘油(1,2-DAG)	1.7
单酰甘油(MAG)	－
		游离的脂肪酸(FFA)	－

D、藻油的脂肪酸种类分析：

首先，将适量的依据上面第A项中所得到的链带藻属物种T9分离株的冷冻干燥粉末置于玻璃试管中，继而加入1mL的含有0.15g/mL NaOH的甲醇-水溶液(1:1,v/v)并予以振荡混合，然后于100℃下进行加热历时5分钟，继而予以振荡混合并继续进行加热历时25分钟。接着，加入2mL的6N HCl的甲醇溶液并于80℃下进行加热历时10分钟。待冷却至室温后，加入1.25mL的己烷(hexane)-甲基叔丁基醚(tert-butyl methyl ether)混合物(1:1,v/v)并予以缓慢地混合历时10分钟，借此而形成有机上层(organic upper layer)与水性下层(aqueous lower layer)。接着，移除该水性下层并加入3mL的0.012g/mL NaOH溶液予以混合历时5分钟，借此而得到待测样品。该待测样品的脂肪酸的种类及其含量使用气相层析/质谱分析系统(gas chromatography/mass spectrometry system,GC/MS system)(型号GC7890B/MS5977A，厂牌Agilent Technologies)来进行测定。有关该气相层析/质谱分析系统的各项操作条件显示于下面表11中。

表11.气相层析/质谱分析系统的操作条件

此外，为供比对，使用

37Component FAME Mix(Cat.No.18919-1AMP,Sigma-Aldrich)来作为对照标准品(control standard)并进行相同的分析。

所得到的结果显示于下面的表12中。从表12中可见，在链带藻属物种T9分离株的藻油的TAG、1,3-DAG以及1,2-DAG中，主要脂肪酸为C_16:0、C_18:1n9c以及C_18:2。此外，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量百分比显著地高于单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)与饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)所具者。

表12.脂肪酸的种类与含量百分比

脂肪酸种类	含量百分比(％)
		C<sub>16:0</sub>	19.94
C<sub>16:1</sub>	6.07
		C<sub>16:2</sub>	9.11
C<sub>16:3</sub>	9.44
		C<sub>16:4</sub>	1.58
C<sub>18:1</sub>n9c	17.84
		C<sub>18:2</sub>	19.55
C<sub>18:3</sub>n6c	3.84
		C<sub>18:3</sub>n3	10.77
C<sub>18:4</sub>	1.86
		饱和脂肪酸	19.94
单不饱和脂肪酸	23.91
		多不饱和脂肪酸	56.15

此外，申请人进一步将上述所测得的单不饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸的含量百分比代入下列公式(2)而计算出藻油的不饱和度(degree of unsaturation,DU)：

公式(2)：C＝(2×D)+E

其中：C＝不饱和度

D＝多不饱和脂肪酸的含量百分比(％)

E＝单不饱和脂肪酸的含量百分比(％)

而计算结果发现，链带藻属物种T9分离株的藻油的不饱和度为136，符合欧洲生质柴油标准EN14214(European biodiesel standard EN14214)的规范而可供应用于生产生质柴油(biodiesel)。

综合以上的实验结果可知：本发明的链带藻属物种T9分离株具有优异的脂质生产能力，而其藻油含有对人体具有健康效益的1,3-DAG。此外，本发明的链带藻属物种T9分离株的脂肪酸组成也符合欧洲生质柴油标准。因此，本发明的链带藻属物种T9分离株具有发展成为供用于生产食用油以及生质柴油的原料的高潜力。

于本说明书中引述的所有专利和文献以其整体并入本申请作为参考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。

虽然本发明已参考上述特定的具体例描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如权利要求书所示者的限制。

生物材料保藏信息说明

保藏编号：CCTCC M 2018152

分类命名：链带藻属物种(Desmodesmus sp.)T9

保藏日期：2018年3月24日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏单位地址：中国武汉武汉大学

序列表

<110> 财团法人食品工业发展研究所

<120> 具有高脂质生产能力的链带藻属物种T9分离株及其用途

<150> TW107119267

<151> 2018-06-05

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA-ITS序列的正向引物NS1-F

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA-ITS序列的反向引物ITS4-R

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的ITS序列的正向引物ITS1-F

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的ITS序列的反向引物ITS2-R

<400> 4

gctgcgttct tcatcgatgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的ITS序列的正向引物ITS3-F

<400> 5

gcatcgatga agaacgcagc 20

<210> 6

<211> 631

<212> DNA

<213> 链带藻属物种(Desmodesmus sp.)

<400> 6

aatatgcaaa ccacaacacg cactctttta tctgtgtacc gacgttaggt cgaaccctca 60

ccggtttggc ctacttacac acacacacac accattgacc aaccattgat caaaccaaac 120

tctgaagttt cggctgctgt taatcggcag ttttaacgaa aacaactctc aacaacggat 180

atcttggctc tcgcaacgat gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtagtg tgaattgcag 240

aattccgtga accatcgaat ctttgaacgc atattgcgct cgactcctcg gagaagagca 300

tgtctgcctc agcgtcggtt tacaccctca cccctcttcc tcttcggagg gagcttgtcg 360

tgcttgctta agccggcatc aggggtggat ctggccctcc caatcggact cacctctggt 420

tgggttggct gaagcacaga ggcttaaact gggacccgat tcgggctcaa ctggataggt 480

agcaacaccc ttgtggtgcc tacacgaagt tgtgtctgag gacctggtta ggagccaagc 540

aggaaacgtg cctttggcat gtatctctgt attcgacctg agctcaggca aggctacccg 600

ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga a 631

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA基因序列的反向引物NS2-R

<400> 7

ggctgctggc accagacttg c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA基因序列的正向引物NS3-F

<400> 8

gcaagtctgg tgccagcagc c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA基因序列的反向引物NS4-R

<400> 9

cttccgtcaa ttcctttaag 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA基因序列的正向引物NS5-F

<400> 10

aacttaaagg aattgacgga ag 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA基因序列的反向引物NS6-R

<400> 11

gcatcacaga cctgttattg cctc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA基因序列的正向引物NS7-F

<400> 12

gaggcaataa caggtctgtg atgc 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增微藻藻株的18S rRNA基因序列的反向引物NS8-R

<400> 13

tccgcaggtt cacctacgga 20

<210> 14

<211> 2979

<212> DNA

<213> 链带藻属物种(Desmodesmus sp.)

<400> 14

ctgccagtag tcatatgctt gtctcaaaga ttaagccatg catgtctaag tataaactgc 60

ttatactgtg aaactgcgaa tggctcatta aatcagttat agtttatttg gtggtacctt 120

cttactcgga ataaccgtaa gaaaattaga gctaatacgt gcgtaaatcc cgacttctgg 180

aagggacgta tatattagat aaaaggccga ccgggctctg cccgacccgc ggtgaatcat 240

gatatcttca cgaagcgcat ggccttgtgc cggcgctgtt ccattcaaat ttctgcccta 300

tcaactttcg atggtaggat agaggcctac catggtggta acgggtgacg gaggattagg 360

gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg 420

cgcaaattac ccaatcctga tacggggagg tagtgacaat aaataacaat accgggcatt 480

tcatgtctgg taattggaat gagtacaatc taaatccctt aacgaggatc cattggaggg 540

caagtctggt gaacacatca acgcaatgct gttgacgcca gagatagtag ggcagttgcc 600

tttgtgtgta gctgttatgc ctgctagtcg agctgtcttt atttgaacgg gctgacagcc 660

ggcgagacaa cctggtacgg ggaaggcctt cactactttc atacaggcta atcccgtggc 720

gagctggtga agagtgatct ttgcacagcc gtcgtaacgc acggaaaggt gtcggctgac 780

tctctgagtt ggcttaaggg acgtgctaac cccatccgat gataaaggat gctcagagca 840

ataacacccg ttctgtgaag gctttgaggg gctgtagtgt gctgaggaaa tgctgcacac 900

tgcccggtat tgatgcattg gaatttcaat ctgtgtccaa atcaacttgt taccatatcc 960

gatgcgatgt tcagcgtatc tgctgctcca atgctggcgt ctgtccatgc ctcgaccacc 1020

gctgcactga cactccaagg ctgtggcttc accatcaagc tgctccacag ctgagggtcg 1080

ctagactcaa agtagtcgat gaaggcagtg aacagcggtg gattttcatc caaagcctgg 1140

atcacgtcgt gctggctcat tgctcagttc aggtgaggcg cagattgtat tgggacaagt 1200

tgagaatggc gacgaggcag gtgcgacgcc aataaaactc gtgtgtcgcg agtcttggaa 1260

ttggcgttga cgttgcctcg gacagatcga atccatgtca agtggccagc agccgcggta 1320

attccagctc caatagcgta tatttaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttggattt 1380

cgggtgggtt tcagcggtcc gcctatggtg agtactgctg tggcctatct tactgtcggg 1440

gacctgcttc tgggcttcat tgtccgggac agggattcgg catggttact ttgagtaaat 1500

tagagtgttc aaagcaggct tacgccgtga atactttagc atggaataac atgataggac 1560

tctgccctat tctgttggcc tgtaggagtg gagtaatgat taagaggaac agtcgggggc 1620

attcgtattt cattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat gaaagacgaa ctactgcgaa 1680

agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca agaacgaaag ttgggggctc gaagacgatt 1740

agataccgtc gtagtctcaa ccataaacga tgccgactag ggattggcgg acgtttttgc 1800

atgactccgt cagcaccttg agagaaatca aagtttttgg gttccggggg gagtatggtc 1860

gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggcgtgga gcctgcggct 1920

taatttgact caacacggga aaacttacca ggtccagaca taggaaggat tgacagattg 1980

agagctcttt cttgattcta tgggtgaaca agtgtttgtt tgcactaact gcccatgaaa 2040

gggaggggtc cgggttaatc gccgggtaaa gcccctctct agtccagcct cacccgattt 2100

ggcgagggtg ttgtttgggc gagaccgtcg aattgcgggg acgccctgag agctcaagct 2160

accaactcca gagggaaacc tactggaggg ccggggtaat gacctagggt atggtaaaaa 2220

cgcttgagat tgggtaatcc gcagccaagc tcctaagggt agcaatacct atggagaagg 2280

ttcagagact aggtggcggt cggttccctt tttttgctgt tcaagacaag ggagcttaag 2340

atagagtccg gtagcagcga aagctgtcct tgagatgaaa gtccccagcc gggacaggag 2400

ctcaaggagg gatgcaaaac tgagtttctg catcctgttg tttccgggtg gtgcatggcc 2460

gttcttagtt ggtgggttgt cttgtcaggt tgattccggt aacgaacgag acctcagcct 2520

ttaaatagtc actgtcgctt tttgcggctg gctttgactt cttagaggga cagttggcgt 2580

ttagtcaacg gaagtatgag gcaataacag gtctgtgatg cccttagatg ttctgggccg 2640

cacgcgcgct acactgatgc attcaacaag cctatcccta gccgaaaggc tcgggtaatc 2700

tttgaaactg catcgtgatg gggatagatt attgcaatta ttagtcttca acgaggaatg 2760

cctagtaagc gcaattcatc agattgcgtt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc 2820

ccgtcgctcc taccgattgg gtgtgctggt gaagtgttcg gattggcaat tgaaggtggc 2880

aacaccgtcg attgccgaga agttcattaa accctcccac ctagaggaag gagaagtcgt 2940

aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggaa ggatcattg 2979

<210> 15

<211> 353

<212> DNA

<213> 链带藻属物种(Desmodesmus sp.)

<400> 15

atttcaatct gtgtccaaat caacttgtta ccatatccga tgcgatgttc agcgtatctg 60

ctgctccaat gctggcgtct gtccatgcct cgaccaccgc tgcactgaca ctccaaggct 120

gtggcttcac catcaagctg ctccacagct gagggtcgct agactcaaag tagtcgatga 180

aggcagtgaa cagcggtgga ttttcatcca aagcctggat cacgtcgtgc tggctcattg 240

ctcagttcag gtgaggcgca gattgtattg ggacaagttg agaatggcga cgaggcaggt 300

gcgacgccaa taaaactcgt gtgtcgcgag tcttggaatt ggcgttgacg ttg 353

<210> 16

<211> 440

<212> DNA

<213> 链带藻属物种(Desmodesmus sp.)

<400> 16

aacaagtgtt tgtttgcact aactgcccat gaaagggagg ggtccgggtt aatcgccggg 60

taaagcccct ctctagtcca gcctcacccg atttggcgag ggtgttgttt gggcgagacc 120

gtcgaattgc ggggacgccc tgagagctca agctaccaac tccagaggga aacctactgg 180

agggccgggg taatgaccta gggtatggta aaaacgcttg agattgggta atccgcagcc 240

aagctcctaa gggtagcaat acctatggag aaggttcaga gactaggtgg cggtcggttc 300

cctttttttg ctgttcaaga caagggagct taagatagag tccggtagca gcgaaagctg 360

tccttgagat gaaagtcccc agccgggaca ggagctcaag gagggatgca aaactgagtt 420

tctgcatcct gttgtttccg 440

Claims

1.一种链带藻属物种(Desmodesmus sp.)T9分离株，其特征在于，所述链带藻属物种T9分离株以寄存编号CCTCC M 2018152寄存于中国典型培养物保藏中心。

2.一种用于生产藻油的方法，其特征在于，所述方法包括：将根据权利要求1所述的链带藻属物种T9分离株培养于适于所述藻株生长的培养基中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述藻油包含1,3-二酰甘油。