JPS611381A - 宿主‐ベクタ‐系における宿主として有用なバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生、無芽胞性突然変異株 - Google Patents
宿主‐ベクタ‐系における宿主として有用なバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生、無芽胞性突然変異株Info
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- JPS611381A JPS611381A JP60121627A JP12162785A JPS611381A JP S611381 A JPS611381 A JP S611381A JP 60121627 A JP60121627 A JP 60121627A JP 12162785 A JP12162785 A JP 12162785A JP S611381 A JPS611381 A JP S611381A
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡの組み換え技術を用いてアミラーゼのコ
ードはれた遺伝子を有するベクターが導入される宿主と
して有用なバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌ工Ｓ）の新規なアミラーゼ非産生突然変異
株に関する。
ードはれた遺伝子を有するベクターが導入される宿主と
して有用なバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌ工Ｓ）の新規なアミラーゼ非産生突然変異
株に関する。
細菌の遺伝物質の大部分は、細胞中の染色体に巨大なり
ＮＡ分子として存在している。ある量の遺伝物質は、プ
ラスミドとし、て知られる、よセ小さな環の閉じたＤＮ
Ａ分子の形で存在する場合もある。特異な遺伝的性質に
関連したＤＮＡ分子の部分を遺伝子と呼称する。
ＮＡ分子として存在している。ある量の遺伝物質は、プ
ラスミドとし、て知られる、よセ小さな環の閉じたＤＮ
Ａ分子の形で存在する場合もある。特異な遺伝的性質に
関連したＤＮＡ分子の部分を遺伝子と呼称する。
遺伝子工学に関連する技術によって、特別な蛋白質をそ
の産生物質としてコードしている遺伝子を、一つの微生
物から他の微生物へと移すことが可能である。新しい遺
伝物質を受容する微生物を宿主と呼称する。多くの研究
渚は、これらの技術を用いて、ある特別な蛋白η例えば
酵素などを産生ずることにすぐれた微生物を供給してき
た。
の産生物質としてコードしている遺伝子を、一つの微生
物から他の微生物へと移すことが可能である。新しい遺
伝物質を受容する微生物を宿主と呼称する。多くの研究
渚は、これらの技術を用いて、ある特別な蛋白η例えば
酵素などを産生ずることにすぐれた微生物を供給してき
た。
連続した遺伝子が環状の形に連鎖しているプラスミドは
、ある微生物の細胞からの移動と他の微生物の細胞への
導入が比較的容易になさｔうろことが発見されている。
、ある微生物の細胞からの移動と他の微生物の細胞への
導入が比較的容易になさｔうろことが発見されている。
また、プラスミドｉ＋１、ｐｒシい遺伝物質全宿主体に
導入するベクターと１２でも使用可能である。このこと
は制限酵素とｊで知Ｃ・ノする、環状ＤＮＡを開裂させ
る酵素によるプラスミドの最初の切断によシ遂行される
。楯望の遺伝子を含イ１するＪ’＋’ＦＪＤＮｈ鎖はＤ
ＮＡ環の切断きハた部分に挿入される。環状構迄はＤ
Ｎ、 Ａリガーゼによる処理で再構成される。新しい環
状ＤＮＡ分子である再構成されたフシスミトリ、元のプ
ラスミドの遺伝子に加えて、押入されたＤＮＡの小銃で
ある新しい遺伝子を含有（７ている。このプラスミドは
宿主微生物体中に導入されうる。ついで新しい遺伝子を
含むプラスミドは、宿主微生物体中で複製され、その遺
伝物質の一部となる。
導入するベクターと１２でも使用可能である。このこと
は制限酵素とｊで知Ｃ・ノする、環状ＤＮＡを開裂させ
る酵素によるプラスミドの最初の切断によシ遂行される
。楯望の遺伝子を含イ１するＪ’＋’ＦＪＤＮｈ鎖はＤ
ＮＡ環の切断きハた部分に挿入される。環状構迄はＤ
Ｎ、 Ａリガーゼによる処理で再構成される。新しい環
状ＤＮＡ分子である再構成されたフシスミトリ、元のプ
ラスミドの遺伝子に加えて、押入されたＤＮＡの小銃で
ある新しい遺伝子を含有（７ている。このプラスミドは
宿主微生物体中に導入されうる。ついで新しい遺伝子を
含むプラスミドは、宿主微生物体中で複製され、その遺
伝物質の一部となる。
遺伝子工学で適切な宿主微生物体として用いられるため
には、新しいＤＮＡの導入が可能でなければならない。
には、新しいＤＮＡの導入が可能でなければならない。
さらに、新らたに挿入された遺伝子にコードされた遺伝
的性質を発現することが実行可Ｒヒな微生物が得られ力
ければならない。有用な量の蛋白質を産生ずる微生物で
あるには、その微生物はまた工業規模で生育できるもの
でなければならない。
的性質を発現することが実行可Ｒヒな微生物が得られ力
ければならない。有用な量の蛋白質を産生ずる微生物で
あるには、その微生物はまた工業規模で生育できるもの
でなければならない。
新しいＤＮＡ組み換え技術を用いた実験から、新しい遺
伝物質を導入された微生物は、ヒト、動物および植物に
有害な物りｊ′ｌＫ：産生する可能性があるとみなされ
ている。この判断から、１９７８年にナショナル・イン
ステイテユート・メブ・ヘルス（ＮＩＨ）は「ＤＮＡ分
子組み換えに伴う実験の手引き」を発行した。この手引
招には、遺伝子工学実験が行なわれる実験室における物
理的封じ込めのための種々の基準が規定されている。ま
た、紹み換えＤＮＡを含有する微生物の生物学的封じ込
めの基準もそこに確立されている。
伝物質を導入された微生物は、ヒト、動物および植物に
有害な物りｊ′ｌＫ：産生する可能性があるとみなされ
ている。この判断から、１９７８年にナショナル・イン
ステイテユート・メブ・ヘルス（ＮＩＨ）は「ＤＮＡ分
子組み換えに伴う実験の手引き」を発行した。この手引
招には、遺伝子工学実験が行なわれる実験室における物
理的封じ込めのための種々の基準が規定されている。ま
た、紹み換えＤＮＡを含有する微生物の生物学的封じ込
めの基準もそこに確立されている。
宿主細胞とベクターの使用に関する生物学的封じ込めは
、それらが実験室から自然環境の中へ逃げ出した時の生
存可能性の限定として規定されている。そのような限定
された生育可能性を有する微生物細胞は、芽胞を形成し
ないものである（例えば、無゛芽胞性の微生物）。
、それらが実験室から自然環境の中へ逃げ出した時の生
存可能性の限定として規定されている。そのような限定
された生育可能性を有する微生物細胞は、芽胞を形成し
ないものである（例えば、無゛芽胞性の微生物）。
本発明は室生−ベクター系の宿主として有用な新しい無
芽胞性突然変異株バチルス・ズブチリス（Ｒ，５ｕｂｔ
ｉｌ土ｓ） Ｂ １−１０９である。この宿主は、アミ
ラーゼ非産生突然変異株であるというざらにつけ加える
べき有効性も有する。この突然変異株は、熱安定性のα
−アミラーゼなどの特異なアミラーゼ産生能をコードさ
れた遺伝子を含む組み換えプラスミドの宿主として用い
る揚台には特に適している。これらのアミラーゼは、デ
ンプン加水分解物、グルコース、および高フルクトース
シロップを製造する方法に使用するのに対し商業的に１
砂である。
芽胞性突然変異株バチルス・ズブチリス（Ｒ，５ｕｂｔ
ｉｌ土ｓ） Ｂ １−１０９である。この宿主は、アミ
ラーゼ非産生突然変異株であるというざらにつけ加える
べき有効性も有する。この突然変異株は、熱安定性のα
−アミラーゼなどの特異なアミラーゼ産生能をコードさ
れた遺伝子を含む組み換えプラスミドの宿主として用い
る揚台には特に適している。これらのアミラーゼは、デ
ンプン加水分解物、グルコース、および高フルクトース
シロップを製造する方法に使用するのに対し商業的に１
砂である。
本発明の突然変異株には熱安定性α−アミラーゼ遺伝子
を含むプラスミドがたやすく導入される。得らｆ＋だ微
生物は、熱安定性α−アミラーゼ酵素の産生能において
、１９８３年１０月２６日に発行きれた公開ヨーロッパ
特許出願扁０９２２３５に発表されたＡＴＯＣ３９，０
９６のようなバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生
株よシ、宿主−ベクター系用として優れている。
を含むプラスミドがたやすく導入される。得らｆ＋だ微
生物は、熱安定性α−アミラーゼ酵素の産生能において
、１９８３年１０月２６日に発行きれた公開ヨーロッパ
特許出願扁０９２２３５に発表されたＡＴＯＣ３９，０
９６のようなバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生
株よシ、宿主−ベクター系用として優れている。
本発明によれば、アミラーゼをコードした遺伝子を含ま
ず、好気的条件下の生育で約１０−７未満の芽胞形成株
への復帰頻度をもち、以下の３２１を有することを特徴
とする、宿主−ベクター系における宿主としての使用に
適する無芽胞性バチルス・ズブチリスＢ１−１０９の培
養株が提供される。これらの特性をもつバチルス・ズブ
チリスの菌株は、ＡＴＣＣ３９，７０１としてアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてい
る。
ず、好気的条件下の生育で約１０−７未満の芽胞形成株
への復帰頻度をもち、以下の３２１を有することを特徴
とする、宿主−ベクター系における宿主としての使用に
適する無芽胞性バチルス・ズブチリスＢ１−１０９の培
養株が提供される。これらの特性をもつバチルス・ズブ
チリスの菌株は、ＡＴＣＣ３９，７０１としてアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてい
る。
はらに、以下の遺伝様Ｒ：ｍθｔＢ５、ａｍｙ Ｅ、お
よびｓａｃ Ａ ３２１を有することを特徴とする、宿
主−ベクター系における宿主としての使用に適し、そし
て宿主−ベクター系の他のアミラーゼ非産生宿主作製の
中間体として有用であるアミラーゼ非産生バチルス・ズ
ブチリスＢ１−２０の培養株が提供される。これらの特
性をもつバチルス・丈う゛チリスの菌株はＡＴＣＣ；
３９，７０６としてアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄７ｉｆ；されている。
よびｓａｃ Ａ ３２１を有することを特徴とする、宿
主−ベクター系における宿主としての使用に適し、そし
て宿主−ベクター系の他のアミラーゼ非産生宿主作製の
中間体として有用であるアミラーゼ非産生バチルス・ズ
ブチリスＢ１−２０の培養株が提供される。これらの特
性をもつバチルス・丈う゛チリスの菌株はＡＴＣＣ；
３９，７０６としてアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄７ｉｆ；されている。
また、本発明によれば、バチルス・ズブチリス１Ａ２２
１株からのＤＮＡ１バチルス・ズブチリス１Ａ２８９株
のコンビテント細胞に導入し、α−アミラーゼ酵素を産
住し々い細胞を分離することよシなる。遺伝標識： ｍ
ａｔ Ｂ ５、ａｎｙ Ｅ 、およびＳａｃ Ａ ５２
ｉを有するノくチルス・ズブチリスの菌株の作製方法
が提供される。
１株からのＤＮＡ１バチルス・ズブチリス１Ａ２８９株
のコンビテント細胞に導入し、α−アミラーゼ酵素を産
住し々い細胞を分離することよシなる。遺伝標識： ｍ
ａｔ Ｂ ５、ａｎｙ Ｅ 、およびＳａｃ Ａ ５２
ｉを有するノくチルス・ズブチリスの菌株の作製方法
が提供される。
さらに、本発明によれば、バチルス・ズブチリスｌ８３
０株からのＤＮＡをバチルス°ズブチリスＢ１−２０株
のコンビテント細胞に導入し、添加したメチオニンの々
い状態で生育し、α−アミラーゼ酵素を産生せず、そし
て９０Ｃで１０分間の熱シヨツク処理したとき芽胞を形
成しない細胞を分離することよりなる、遺伝様を有する
バチルス・ズブチリスの菌株の作製方法が提供される。
０株からのＤＮＡをバチルス°ズブチリスＢ１−２０株
のコンビテント細胞に導入し、添加したメチオニンの々
い状態で生育し、α−アミラーゼ酵素を産生せず、そし
て９０Ｃで１０分間の熱シヨツク処理したとき芽胞を形
成しない細胞を分離することよりなる、遺伝様を有する
バチルス・ズブチリスの菌株の作製方法が提供される。
最後に、バチｌｔス・ズブチリスの菌株の１つのコンビ
テント細胞に、所望の遺伝物質を含有するプラスミドを
導入し、プラスミドが細胞内に維持されるような条件下
で該細胞を培養するととよシなる、宿主−ベクター系に
おける宿主としてバチルス・ズブチリスＢ１−１０９お
よびＢ１−２０株を使用する方法が提供される。
テント細胞に、所望の遺伝物質を含有するプラスミドを
導入し、プラスミドが細胞内に維持されるような条件下
で該細胞を培養するととよシなる、宿主−ベクター系に
おける宿主としてバチルス・ズブチリスＢ１−１０９お
よびＢ１−２０株を使用する方法が提供される。
本明細書に明らかにされ、特許請求の範囲に記載された
バチルス・ズブチリスの菌株は、バチルス・ズブチリス
の他の菌株から遺伝物ｅｌｌ導入することによシ作製さ
れた。標識： ａｒｏ ｌ９０６、ｍｅｔ Ｂ ５、ｓ
ａｃ Ａ ３２１、およびａｍｙＥを有する、アミラー
ゼ非産生株バチルス・ズブチリスＩ Ａ ２８９ （Ａ
ＴＣＣ３９，７１１）は、バチルス・ズブチリス１Ａ２
２’１株（ＡＴＣＣ３９，０８６）よＪＤ ＮＡの一部
を導入されることによってもはや芳香族アミノ酸を要求
しない菌株へ変換された。
バチルス・ズブチリスの菌株は、バチルス・ズブチリス
の他の菌株から遺伝物ｅｌｌ導入することによシ作製さ
れた。標識： ａｒｏ ｌ９０６、ｍｅｔ Ｂ ５、ｓ
ａｃ Ａ ３２１、およびａｍｙＥを有する、アミラー
ゼ非産生株バチルス・ズブチリスＩ Ａ ２８９ （Ａ
ＴＣＣ３９，７１１）は、バチルス・ズブチリス１Ａ２
２’１株（ＡＴＣＣ３９，０８６）よＪＤ ＮＡの一部
を導入されることによってもはや芳香族アミノ酸を要求
しない菌株へ変換された。
１Ａ２８９株は、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、 １
４８巻。
４８巻。
２８１−２８５頁（１９７６年） ＫＳｔｅｉｎｍｏｔ
ｚらにより報督１〜１ｒｙｔ＝ている。これは、ＡＴＣ
Ｃ５９，７１１とし、でメリーランド州、ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、より
入手可能である。１Ａ２２１株は、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａ、ｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ６５巻、９
６−１０５頁（１ｑ７０年）にＤｕｂｎａｕとＳｍ１ｔ
ｈ によシ報告されている。これは、ＡＴＯＣ３？、０
８６としてメリーランド州、ロックビルのアメリカン・
タイプ・コレクションよシ入手可能である。
ｚらにより報督１〜１ｒｙｔ＝ている。これは、ＡＴＣ
Ｃ５９，７１１とし、でメリーランド州、ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、より
入手可能である。１Ａ２２１株は、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａ、ｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ６５巻、９
６−１０５頁（１ｑ７０年）にＤｕｂｎａｕとＳｍ１ｔ
ｈ によシ報告されている。これは、ＡＴＯＣ３？、０
８６としてメリーランド州、ロックビルのアメリカン・
タイプ・コレクションよシ入手可能である。
Ｂ１−２０と表示される、得られた導入産物は以下の標
識を含む： ｍｅｔ Ｂ ５、ａｍｙＥ、および５ａｃ
Ａ３２１ｏこれは、ＡＴＣＣ３９，７０６としてアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手′ｒ
ｊＪ能でを・る。このアミラーゼ非産生株は、宿主−ベ
クター系でのアミラーゼ非産生宿主の作製に際しての中
間体として有用である。この株に１、芽胞形成宿主の使
用が容認されるφ件）では、それ自身また宿主として用
いられる。
識を含む： ｍｅｔ Ｂ ５、ａｍｙＥ、および５ａｃ
Ａ３２１ｏこれは、ＡＴＣＣ３９，７０６としてアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手′ｒ
ｊＪ能でを・る。このアミラーゼ非産生株は、宿主−ベ
クター系でのアミラーゼ非産生宿主の作製に際しての中
間体として有用である。この株に１、芽胞形成宿主の使
用が容認されるφ件）では、それ自身また宿主として用
いられる。
バチルス・ズブチリスの無芽胞性株のＤＮＡの一部は、
新しいＢ１−１０９株を作製するためＢ１−２０株に導
入された。そのＤＮＡ供与体として用いた無芽胞株は、
オハイオ州、コロンブスのバチルス・ジェネテック・ス
トック・センターの微生物部門よシ得たｌ５３０′Ｔ：
あった。標識ｓｐｏ ＩＩ Ａ １２ ｆ持つこの菌株
は、１ｕａｓｃｂおよび５ｃｈａｅｆｆｅｒによｔ）
Ａｎｎ、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｏｕｒ。
新しいＢ１−１０９株を作製するためＢ１−２０株に導
入された。そのＤＮＡ供与体として用いた無芽胞株は、
オハイオ州、コロンブスのバチルス・ジェネテック・ス
トック・センターの微生物部門よシ得たｌ５３０′Ｔ：
あった。標識ｓｐｏ ＩＩ Ａ １２ ｆ持つこの菌株
は、１ｕａｓｃｂおよび５ｃｈａｅｆｆｅｒによｔ）
Ａｎｎ、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｏｕｒ。
Ｐａｒｉｓ 、 １１４巻、１−９（１９６８年）に発
表されている。これは、ＡＴＧＣ３９，７１２として、
メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ−カ
ルチャー・コレクションよシ入手できる。
表されている。これは、ＡＴＧＣ３９，７１２として、
メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ−カ
ルチャー・コレクションよシ入手できる。
本発明の無芽胞性アミラーゼ非産生株Ｂ１−１０９は、
約１０−７未満の芽胞題生菌への復帰頻度を示す。工業
的条件での午前はｒｘＪ能で、また高価な生育に心太な
添加物ケ要求しない。自然または逃亡した場合の像境下
での生き残る率は低く、また自然発生的遺伝子移動によ
る他の菌体へのプラスミドの導出傾向は大変低い。標準
的遺伝子導入法に用いた場合、この菌株は晶いプラスミ
ド取り込み頻度を示す。このコンビテント細胞を遺伝う
一導入操作に用いた場合、卓越した遺伝子導入効果が得
られる。この菌株は種々のプラスミドベクターの宿主と
して良好に機能シ、バチルス・ズブチリス宿主−ベクタ
ー糸の宿主とし５て有用性が高い。アミラーゼ非産生で
あるので、この菌株はアミラーゼ産生能をコードされた
遺伝子を含む組み換え型プラスミドの宿主として用いる
際、特に適する。
約１０−７未満の芽胞題生菌への復帰頻度を示す。工業
的条件での午前はｒｘＪ能で、また高価な生育に心太な
添加物ケ要求しない。自然または逃亡した場合の像境下
での生き残る率は低く、また自然発生的遺伝子移動によ
る他の菌体へのプラスミドの導出傾向は大変低い。標準
的遺伝子導入法に用いた場合、この菌株は晶いプラスミ
ド取り込み頻度を示す。このコンビテント細胞を遺伝う
一導入操作に用いた場合、卓越した遺伝子導入効果が得
られる。この菌株は種々のプラスミドベクターの宿主と
して良好に機能シ、バチルス・ズブチリス宿主−ベクタ
ー糸の宿主とし５て有用性が高い。アミラーゼ非産生で
あるので、この菌株はアミラーゼ産生能をコードされた
遺伝子を含む組み換え型プラスミドの宿主として用いる
際、特に適する。
バチルス・ズブチリスの染色体の詳細な遺伝子地図は、
ｌ旧ｎｎａｒおよびＨｏｃｈによシ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ、 Ｒｅｖｉｅｗｓ 、 ４４巻、 ５
７−８２頁（１９８０年）に発表されている。
ｌ旧ｎｎａｒおよびＨｏｃｈによシ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ、 Ｒｅｖｉｅｗｓ 、 ４４巻、 ５
７−８２頁（１９８０年）に発表されている。
本発明の記載中に述べられる遺伝標識の簡潔な記述は以
下の通シである： （ＩＪ ｓｐａ Ｍ Ａ １２ ：これは、芽胞形成の
最も初期の段階におりる障害を起こす欠損突然変異であ
る。この突然変異はバチルスの芽胞形成能を消滅略せる
。この芽胞は熱、紫外線、化学物質および乾燥に曝尽れ
た時の自然状態における菌の正常な生き残少の形である
。
下の通シである： （ＩＪ ｓｐａ Ｍ Ａ １２ ：これは、芽胞形成の
最も初期の段階におりる障害を起こす欠損突然変異であ
る。この突然変異はバチルスの芽胞形成能を消滅略せる
。この芽胞は熱、紫外線、化学物質および乾燥に曝尽れ
た時の自然状態における菌の正常な生き残少の形である
。
（２１ａｒｏＩ９０６：フェニルアラニン、チロシン、
およびトリプトファン袈求性全起こす突然変異である。
およびトリプトファン袈求性全起こす突然変異である。
これらのアミノ酸が欠損した時、この突然変異株の生育
は止まる。
は止まる。
（３１ａｍｙＥ：この標識は、α−アミラーゼ全産生す
る構造遺伝子の欠損に関連している。この突然変異は、
非常に低い復帰頻度によシ特徴づけられる。
る構造遺伝子の欠損に関連している。この突然変異は、
非常に低い復帰頻度によシ特徴づけられる。
（４）ｌｉｎ２：この遺伝様Ｒを持つ菌株は、適当なア
ミノ酸および１００μ１７ｒｎｔの濃度のリンコミシン
（ｌｉｎｃｏｍｙｏｉｎ） ｆ添加した最小培地を含有
する平板で生育する。この標識を持たない菌株は、その
ような平板上では生育できない。
ミノ酸および１００μ１７ｒｎｔの濃度のリンコミシン
（ｌｉｎｃｏｍｙｏｉｎ） ｆ添加した最小培地を含有
する平板で生育する。この標識を持たない菌株は、その
ような平板上では生育できない。
（５１ｍｅｔＢ５ ：この突然変異は、メチオニン要求
性を引き起こす。このアミノ酸が欠１−ｊＡ ｔ、た場
合、この突然変異をもつ菌株は生育を止める。
性を引き起こす。このアミノ酸が欠１−ｊＡ ｔ、た場
合、この突然変異をもつ菌株は生育を止める。
（６） ５ａｃＡ３２１ ：これは、微生物によるショ
糖の代謝に必須な酵素の産生を失わせる突然変異である
。炭素源としてショ糖を含む培地での宿主の生育は妨げ
られる。
糖の代謝に必須な酵素の産生を失わせる突然変異である
。炭素源としてショ糖を含む培地での宿主の生育は妨げ
られる。
以下に例″を′示して本発明を具体的に説明する。
特記される以外は、すべての比率およびパーセントはＴ
（（さを基礎に算出されたものである。
（（さを基礎に算出されたものである。
ＡＴＣＣナンバーを冠せられたすべての菌株は。
メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから入手できる。これらの菌株
は、％許目的のための微生物の寄託についでのブタペス
ト条約の規定のもとに寄託されたものである。ディフコ
社商品名を冠されたすべての試薬は、ミシガン州、デト
ロイトのディフコ研究所より人手できる。
ルチャー・コレクションから入手できる。これらの菌株
は、％許目的のための微生物の寄託についでのブタペス
ト条約の規定のもとに寄託されたものである。ディフコ
社商品名を冠されたすべての試薬は、ミシガン州、デト
ロイトのディフコ研究所より人手できる。
例
バチルス會ズブチリス１Ａ２Ｂ９株（ＡＴＣＣ５９，７
／！ ／・）の、生育に芳香族アミノ酸を要求しない菌
株への形質転換は、バチルス・ズブチリス１Ａ２２１株
（ＡＴＣＣ５９，０８６）から得たＤＮＡを導入するこ
とで実現された。その方法は以下の通りである。
／！ ／・）の、生育に芳香族アミノ酸を要求しない菌
株への形質転換は、バチルス・ズブチリス１Ａ２２１株
（ＡＴＣＣ５９，０８６）から得たＤＮＡを導入するこ
とで実現された。その方法は以下の通りである。
バチルス曇ズブチリスＩ Ａ ２ Ｂ ９株（ＡＴＣＣ
５９，７１１）の細胞は、トリプトース・血液・寒天・
培養基（−ディフコ）を含む平板培地上で一晩生育され
た。この平板培地上の細胞は、ペナセイ・プロス（ディ
フコ）に接種され％５７℃で２０ Ｏｒｐｍの振盪下で
一晩生育された。この細胞は遠心操作で分離され、５倍
容量の増殖培養液に懸濁された。増殖培養液の組成は。
５９，７１１）の細胞は、トリプトース・血液・寒天・
培養基（−ディフコ）を含む平板培地上で一晩生育され
た。この平板培地上の細胞は、ペナセイ・プロス（ディ
フコ）に接種され％５７℃で２０ Ｏｒｐｍの振盪下で
一晩生育された。この細胞は遠心操作で分離され、５倍
容量の増殖培養液に懸濁された。増殖培養液の組成は。
０．５％グルコース、ロ、６％リン酸−カリウム。
１．４％リン酸二カリウム、０．１％クエン酸ナトリウ
ム、０．２％硫安および０．０７％硫酸マグネシウムを
含み、５０μ９７−の濃度になるようにロイシン、イン
ロイシン、メチオニンを刃口え。
ム、０．２％硫安および０．０７％硫酸マグネシウムを
含み、５０μ９７−の濃度になるようにロイシン、イン
ロイシン、メチオニンを刃口え。
２５μｌｌ／ｍｌの濃度となるようにヒスチジン、トリ
プトファン、アルギニン、バリン、リジン。
プトファン、アルギニン、バリン、リジン。
スレオニン、グリシン、アスパラギン酸をカロえたもの
である。分光光度計を用い、培養液の波長６２０ ｎｍ
における吸光度の増加が計測された。培養細胞が対数
増殖期から定常増殖期に転換する時点で（１５分で吸光
度変化が５％よシ小となる）、この培養細胞はＤＮＡ導
入に用いられた。
である。分光光度計を用い、培養液の波長６２０ ｎｍ
における吸光度の増加が計測された。培養細胞が対数
増殖期から定常増殖期に転換する時点で（１５分で吸光
度変化が５％よシ小となる）、この培養細胞はＤＮＡ導
入に用いられた。
供給されるＤ Ｎ Ａは、バチルス・ズブチリス１Ａ２
２１株（ＡＴＣＣ３９，０８６）から以下の操作で得ら
れた。
２１株（ＡＴＣＣ３９，０８６）から以下の操作で得ら
れた。
１Ａ２２１株は、１００−のペナセイ・プロス（ディフ
コ）中で生育された。培養細胞は。
コ）中で生育された。培養細胞は。
３７℃で、波長６６０ナノメーターの吸光度が０．６に
なるまで培養された。この細胞は、遠心操作で集め、０
゜００５Ｍエチレンシアばン四酢酸（ＥＤＴＡ）および
０．０５ Ｍ塩化ナトリウムを含み、２〜のリゾチーム
を含む溶液１Ｍに再懸濁された。細胞がこわれ始めた時
、ドライアイス−アセトン槽中に容器を沈め凍結させた
。次いで、０．０３Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−１Ｓ，０、０，００５ＭＥＤＴＡ を含む
緩衝ｍ液が凍結＋１ｆｌｌ胞に加えられ、この混合液は
２回凍結融解をく夛返えされた。これに同量のフェノー
ルを加え、この混合液は４℃で７０分間振盪された。沈
殿した蛋白質は遠心操作で除去された。ＤＮＡを沈殿さ
せるために、透明な上清に０．１２ｍの３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ８゜０）およびｏ、／ｉ”Ｋｍｊのイングロ
バノールが、溶液１−当りに加えられた。沈殿したＤＮ
Ａはガラス棒でかき回して集められ、さらにイングロパ
ノールで洗浄された。ＤＮＡは、０．０１５Ｍ塩化ナト
リウムおよび０．００１５酢酸ナトリウムを含むｐＨ７
の溶液に再溶解され、導入操作に用いるまで４℃で保存
された。
なるまで培養された。この細胞は、遠心操作で集め、０
゜００５Ｍエチレンシアばン四酢酸（ＥＤＴＡ）および
０．０５ Ｍ塩化ナトリウムを含み、２〜のリゾチーム
を含む溶液１Ｍに再懸濁された。細胞がこわれ始めた時
、ドライアイス−アセトン槽中に容器を沈め凍結させた
。次いで、０．０３Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−１Ｓ，０、０，００５ＭＥＤＴＡ を含む
緩衝ｍ液が凍結＋１ｆｌｌ胞に加えられ、この混合液は
２回凍結融解をく夛返えされた。これに同量のフェノー
ルを加え、この混合液は４℃で７０分間振盪された。沈
殿した蛋白質は遠心操作で除去された。ＤＮＡを沈殿さ
せるために、透明な上清に０．１２ｍの３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ８゜０）およびｏ、／ｉ”Ｋｍｊのイングロ
バノールが、溶液１−当りに加えられた。沈殿したＤＮ
Ａはガラス棒でかき回して集められ、さらにイングロパ
ノールで洗浄された。ＤＮＡは、０．０１５Ｍ塩化ナト
リウムおよび０．００１５酢酸ナトリウムを含むｐＨ７
の溶液に再溶解され、導入操作に用いるまで４℃で保存
された。
上記の方法で調製されたバチルス・ズブチリス１Ａ２Ｂ
９株（１，Ｏｄ）のコンビテント細胞は最終混合物の濃
度１０μｌ／ａｔでＤＮＡと混合され、培養液は３７℃
で３０分温和な振盪（１ｏ ｏ ｒｐｍ ）下に置かれ
た。この培養液は。
９株（１，Ｏｄ）のコンビテント細胞は最終混合物の濃
度１０μｌ／ａｔでＤＮＡと混合され、培養液は３７℃
で３０分温和な振盪（１ｏ ｏ ｒｐｍ ）下に置かれ
た。この培養液は。
２ｍｊのペナセー・プロス（ディフコ）で希釈され、更
に６７℃で９０分間培養が行なわれた。
に６７℃で９０分間培養が行なわれた。
この細胞は遠゛心操作によシ集められ、蒸留水で１度洗
浄され、当初の容量の培地に再Ｉ＠濁され。
浄され、当初の容量の培地に再Ｉ＠濁され。
スビジジエン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ） の最小培地にメ
チオニン（５μ９７ａ）を加えた平板培地の上に広けら
れた。スビジジエン最小培地の組成は、（ａ）硫安０．
２％：（ｂ）リン酸カリウム（２＊基） −１，４％；
ｆｃｌ ｌへ↓酸カリウム（１塩基） −０，６％；
（ｄ）クエン酸ツートリウム−０，１％；および（θ）
慌酸マグ洋シウノ、−［１，０２％を含み−７，４に調
整した溶液である。０．５ｍ）の細胞懸濁液を加えた時
に、２つのコロニーが生育し、その内の１つはアミラー
ゼ非産生である。このものは、芳香族アミノ酸欠損条件
下での生育可能性によシ選択され。
チオニン（５μ９７ａ）を加えた平板培地の上に広けら
れた。スビジジエン最小培地の組成は、（ａ）硫安０．
２％：（ｂ）リン酸カリウム（２＊基） −１，４％；
ｆｃｌ ｌへ↓酸カリウム（１塩基） −０，６％；
（ｄ）クエン酸ツートリウム−０，１％；および（θ）
慌酸マグ洋シウノ、−［１，０２％を含み−７，４に調
整した溶液である。０．５ｍ）の細胞懸濁液を加えた時
に、２つのコロニーが生育し、その内の１つはアミラー
ゼ非産生である。このものは、芳香族アミノ酸欠損条件
下での生育可能性によシ選択され。
Ｂ１−２０と表示される。このものは以下の標識：μす
〜県５、ａｍｙ Ｅ 、およびシ四Ｊ３２１をもつ。
〜県５、ａｍｙ Ｅ 、およびシ四Ｊ３２１をもつ。
この生物学的に純粋な培養株は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ３９，７０６とし
て寄託されている。
カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ３９，７０６とし
て寄託されている。
Ｂ１−２０株（肌す５．とび、μピＡ３２１）は、供給
法Ｉ Ｓ ５０ （ＡＴＣＯ５９，７１２）からＩ’）
ＮＡを導入され、無芽胞性株Ｂ１−１０９に転換させら
れた。導入はＢ１−２０細胞を用いて行′なわれた。
法Ｉ Ｓ ５０ （ＡＴＣＯ５９，７１２）からＩ’）
ＮＡを導入され、無芽胞性株Ｂ１−１０９に転換させら
れた。導入はＢ１−２０細胞を用いて行′なわれた。
供給されるＤＮＡは、バチルス・ズブチリス１Ｓ３０株
（ＡＴ（Ｃ： ５ ？、７１２ ）より以下のノミ法
で得らｉｔた。細胞の培養は、５７℃で１００ｍ１のグ
ルコース操加トリプティク・ンイ（ＴＳＧ）培地（ディ
フコ）中で、−晩方なわｈた。次いで、４０ｒｎ９のり
ゾチームを加え、との涜合液は６０℃で３０分保温され
た。スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）は４
５００ ｒｐｍで１０分の遠心操作で分離され、０．１
５ＭｔＪｉ化ナトリウムおよび０．１ Ｍ ＥＤ’ＦＡ
を含むＰＦｉｌｏ、２＋７）Ｍ液４ｏＮに懸濁された。
（ＡＴ（Ｃ： ５ ？、７１２ ）より以下のノミ法
で得らｉｔた。細胞の培養は、５７℃で１００ｍ１のグ
ルコース操加トリプティク・ンイ（ＴＳＧ）培地（ディ
フコ）中で、−晩方なわｈた。次いで、４０ｒｎ９のり
ゾチームを加え、との涜合液は６０℃で３０分保温され
た。スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）は４
５００ ｒｐｍで１０分の遠心操作で分離され、０．１
５ＭｔＪｉ化ナトリウムおよび０．１ Ｍ ＥＤ’ＦＡ
を含むＰＦｉｌｏ、２＋７）Ｍ液４ｏＮに懸濁された。
５ ｍｌの２５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えた
後、この混合液は７０℃に保温し１時間置かれ友。０．
０５ Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００５ Ｍクエン酸
ナトリウムを含み。
後、この混合液は７０℃に保温し１時間置かれ友。０．
０５ Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００５ Ｍクエン酸
ナトリウムを含み。
フェノールで飽和したｐＨ７の溶液を加えることによシ
２回蛋白質を沈殿させた。この上清に５４の３Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液が加えられた。この溶液にインプロパツー
ル層が加えられた。二層間に存在するＤＮＡはガラス棒
で巻き取られた。ガラス棒上のＤＮＡは、冷イングロパ
ノールで２度洗浄され、 ０．０５ Ｍ塩化ナトリウ
ムおよびｏ、ｏｏｘＭクエン酸ナトリウムを含むｐＦ１
７の溶液に溶解された。０．０１５ Ｍ塩化ナトリウム
および０．９１５ Ｍクエン酸ナトリウムを含むｐＨ７
の入谷賞溶液に対し、上記の得られた溶液をＴ′ｊ５析
し、透析外液は３度交換し、２４時間透析した。この結
果借られた透析内液を遺伝子導入に用いた。
２回蛋白質を沈殿させた。この上清に５４の３Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液が加えられた。この溶液にインプロパツー
ル層が加えられた。二層間に存在するＤＮＡはガラス棒
で巻き取られた。ガラス棒上のＤＮＡは、冷イングロパ
ノールで２度洗浄され、 ０．０５ Ｍ塩化ナトリウ
ムおよびｏ、ｏｏｘＭクエン酸ナトリウムを含むｐＦ１
７の溶液に溶解された。０．０１５ Ｍ塩化ナトリウム
および０．９１５ Ｍクエン酸ナトリウムを含むｐＨ７
の入谷賞溶液に対し、上記の得られた溶液をＴ′ｊ５析
し、透析外液は３度交換し、２４時間透析した。この結
果借られた透析内液を遺伝子導入に用いた。
バチルス・ズブチリスＢ１−２０株の細胞ハ。
トリプトース・血液・寒天・培黄基（ディフコ）を含む
一甲板１′？ｉ地上で、−晩５７℃で培養された。
一甲板１′？ｉ地上で、−晩５７℃で培養された。
平板培地上からの細胞は、小量の増殖培養液に’Ｍ濁さ
り、５ｏ ｏｍｔのエルシンマイヤーフラスコ中の６０
ｍ６の増殖培養液に接種され友。この混合液は３３−３
７℃で振盪培養された。増殖培養液は以下の成分を含有
した＝０．５％グルコース、０．６％リン酸−カリウム
、１．４％リン酸二カリウム、０．１％クエン酸ナトリ
ウム、０．２％硫安、０．０１％硫酸マグネシウム、０
．０２％カサミノ酸（ディフコ）、０．１％イーストエ
クストラクト（ディフコ）、および０．０２％Ｌ−トリ
グトファン。生育は６２０ ｎｍ の吸光度により監
視された。培養細胞が対数増殖期から定常増殖期に転換
する時（１５分で吸光度変化が５％より小となる）、こ
の培養細胞はＤ Ｎ Ａ ４人に用いられた。細胞懸濁
液は２倍容量の導入用培地によυ希釈された。この導入
用培地は。
り、５ｏ ｏｍｔのエルシンマイヤーフラスコ中の６０
ｍ６の増殖培養液に接種され友。この混合液は３３−３
７℃で振盪培養された。増殖培養液は以下の成分を含有
した＝０．５％グルコース、０．６％リン酸−カリウム
、１．４％リン酸二カリウム、０．１％クエン酸ナトリ
ウム、０．２％硫安、０．０１％硫酸マグネシウム、０
．０２％カサミノ酸（ディフコ）、０．１％イーストエ
クストラクト（ディフコ）、および０．０２％Ｌ−トリ
グトファン。生育は６２０ ｎｍ の吸光度により監
視された。培養細胞が対数増殖期から定常増殖期に転換
する時（１５分で吸光度変化が５％より小となる）、こ
の培養細胞はＤ Ｎ Ａ ４人に用いられた。細胞懸濁
液は２倍容量の導入用培地によυ希釈された。この導入
用培地は。
２％の０．１Ｍ塩化マグネシウムおよび１％の０．０５
Ｍ塩化カルシウムが追加的に加えられている以外は、
増殖培養液と同じ組成である。希釈は５５−５７℃にあ
らかじめ保温しである導入用培地に加えることにより行
なわれ念。この混合液は、同温度で９０分間、３０Ｄｒ
ｐｍで振盪された。振盪終了５分前に、最終濃度１ ｍ
ｌＪとなるように２０ ｍＭエチレングリコール−ビス
（β−アミンエチルエーテル） −Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’
−四酢酸が加えられ友。
Ｍ塩化カルシウムが追加的に加えられている以外は、
増殖培養液と同じ組成である。希釈は５５−５７℃にあ
らかじめ保温しである導入用培地に加えることにより行
なわれ念。この混合液は、同温度で９０分間、３０Ｄｒ
ｐｍで振盪された。振盪終了５分前に、最終濃度１ ｍ
ｌＪとなるように２０ ｍＭエチレングリコール−ビス
（β−アミンエチルエーテル） −Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’
−四酢酸が加えられ友。
１Ｓ３０株から上記の方法で分離された２０μｌのＤＮ
Ａと上記の８１−２０株のコンビテント細胞０．５属を
混合することにより導入を行なった。この混合液は、５
０−５７℃で９０分間２５ Ｏｒｐｍで振盪された。得
られた細胞は、滅菌水で希釈後、寒天平板培地上にまか
れた。メチオン産生、アεラーゼ非産生の特性をもつ細
胞は、この寒天平板培地上で生育する培養株としてｔｏ
ｌ（択された。この寒天平板培地の組成は。
Ａと上記の８１−２０株のコンビテント細胞０．５属を
混合することにより導入を行なった。この混合液は、５
０−５７℃で９０分間２５ Ｏｒｐｍで振盪された。得
られた細胞は、滅菌水で希釈後、寒天平板培地上にまか
れた。メチオン産生、アεラーゼ非産生の特性をもつ細
胞は、この寒天平板培地上で生育する培養株としてｔｏ
ｌ（択された。この寒天平板培地の組成は。
スビジジエンｆ］λ小培地にトリプトファン（５μｇ／
ｍ６）および１％リンドナー（Ｌｉｒ、ｔｎｅｒ）デン
粉を力ｎえたものである。９０℃で１０分の熱ショクに
よる無芽胞特性選別のため、６００のコロニーがスクリ
ーニングされた。その結果、１つのコロニー、８１−１
０９が無芽胞性でｂつた。
ｍ６）および１％リンドナー（Ｌｉｒ、ｔｎｅｒ）デン
粉を力ｎえたものである。９０℃で１０分の熱ショクに
よる無芽胞特性選別のため、６００のコロニーがスクリ
ーニングされた。その結果、１つのコロニー、８１−１
０９が無芽胞性でｂつた。
このものは遺伝柳識： ｓｐｏ Ｉ Ａ １２ 、
ａｍｙＥ 、および５ａｃＡ３２１を有する。この生物
学的に純粋な培養株は、ＡＴＣＯ５９，７０１としてア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。
ａｍｙＥ 、および５ａｃＡ３２１を有する。この生物
学的に純粋な培養株は、ＡＴＣＯ５９，７０１としてア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。
Ｂ１−１０？株は、生育のためにアンモニウム、カリウ
ム、リン酸、およびナトリウムイオンを含む無機塩を要
求する。この株は、グルコースを含むＪｊｉｉ々の炭素
源を利用する。以下の試、１７’（ｊｌで１はめられる
ように、芽用形成株への逆行はなイｏ ＃ｔｌ１Ｍｌｌ
Ｌ、 ５７℃でＤＳＭ（ディフコ）培地を含む寒天斤板
上で生育された。２４時間後。
ム、リン酸、およびナトリウムイオンを含む無機塩を要
求する。この株は、グルコースを含むＪｊｉｉ々の炭素
源を利用する。以下の試、１７’（ｊｌで１はめられる
ように、芽用形成株への逆行はなイｏ ＃ｔｌ１Ｍｌｌ
Ｌ、 ５７℃でＤＳＭ（ディフコ）培地を含む寒天斤板
上で生育された。２４時間後。
この細胞は０．１％グルコースを含むトリグテイク・ン
イ培地中に懸濁され、９０℃で１０分間加熱された。次
いでこの細＠は、トリプトース・血液・寒天・培養基（
ディフコ）を含む平板培地上に滴下された。これら平板
培地上でのコロニー形成単位として、生存可能な総細胞
数が決定された。非加熱検体を滴下して、平板培地上に
展開する１ミリリツトル当シのコロニー形成単位数が比
較された。非加熱検体は、１ｍ７当り１．２７ Ｘ・０
コロニー形成単位を含有するに対し、加熱された！胞
は単に１ ｒｎｌ当シ５コロニー形成単位しか含有しな
かった。このことは。
イ培地中に懸濁され、９０℃で１０分間加熱された。次
いでこの細＠は、トリプトース・血液・寒天・培養基（
ディフコ）を含む平板培地上に滴下された。これら平板
培地上でのコロニー形成単位として、生存可能な総細胞
数が決定された。非加熱検体を滴下して、平板培地上に
展開する１ミリリツトル当シのコロニー形成単位数が比
較された。非加熱検体は、１ｍ７当り１．２７ Ｘ・０
コロニー形成単位を含有するに対し、加熱された！胞
は単に１ ｒｎｌ当シ５コロニー形成単位しか含有しな
かった。このことは。
この株は好気的条件下の生育で約１０ 未満の芽胞形成
株への復帰頻度をもつことを示す。
株への復帰頻度をもつことを示す。
Ｂ１−２０および８１−１０９の雨林は、標準的導入方
法において高頻度でのプラスミド導入を示す。このベク
ターを含有するこれら宿主が４５℃という高温で生育さ
れる場合でも、グラスミド・ベクターはこれら宿主中に
保持され本明細′ル（にＢｊ、５載された研究は、すべ
てＮＩＨの手引きに４Ｋ ＞ｅされた物理的および生物
学的危険封じ込めに関する要求項目に合致して行われた
ものである。
法において高頻度でのプラスミド導入を示す。このベク
ターを含有するこれら宿主が４５℃という高温で生育さ
れる場合でも、グラスミド・ベクターはこれら宿主中に
保持され本明細′ル（にＢｊ、５載された研究は、すべ
てＮＩＨの手引きに４Ｋ ＞ｅされた物理的および生物
学的危険封じ込めに関する要求項目に合致して行われた
ものである。
Claims (8)
- （１）アミラーゼをコードした遺伝子を含まず、好気的
条件下の生育で約１０＾−＾７未満の芽胞形成株への復
帰頻度をもち、以下の遺伝標識：￥ｓｐｏ II Ａ￥
１２、￥ａｍｙ Ｅ￥、および￥ｓａｃ Ａ￥ ３２１
を有することを特徴とする、宿主−ベクター系における
宿主としての使用に適する無芽胞性バチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ１−１０
９の培養株。 - （２）ＡＴＣＣＮｏ．３９，７０１を有する特許請求の
範囲第１項記載のバチルス・ズブチリスの培養株。 - （３）以下の遺伝標識：￥ｍｅｔ Ｂ￥ ５、￥ａｍｙ
Ｅ￥、および￥ｓａｃ Ａ￥ ３２１を有することを
特徴とする、宿主−ベクター系における宿主としての使
用に適し、そして宿主−ベクター系の他のアミラーゼ非
産生宿主作製の中間体として有用であるアミラーゼ非産
生バチルス・ズブチリスＢ１−２０の培養株。 - （４）ＡＴＣＣＮｏ．３９，７０６を有する特許請求の
範囲第３項記載のバチルス・ズブチリスの培養株。 - （５）バチルス・ズブチリス１Ａ２２１株からのＤＮＡ
をバチルス、ズブチリス１Ａ２８９株のコンビテント細
胞に導入し、α−アミラーゼ酵素を産生しない細胞を分
離することよりなる、遺伝標識：￥ｍｅｔ Ｂ￥ ５、
￥ａｍｙ Ｅ￥、および￥ｓａｃ Ａ￥ ３２１を有す
るバチルス・ズブチリスの菌株の作製方法。 - （６）バチルス・ズブチリス１Ｓ３０株からのＤＮＡを
バチルス・ズブチリスＢ１−２０株のコンビテント細胞
に導入し、添加したメチオニンのない状態で生育し、α
−アミラーゼ酵素を産生せず、そして９０℃で１０分間
の熱ショク処理したとき芽胞を形成しない細胞を分離す
ることよりなる、遺伝標識：￥ｓｐｏ IIＡ￥１２、￥
ａｍｙ Ｅ￥、および￥ｓａｃ Ａ ￥３２１を有する
バチルス・ズブチリスの菌株の作製方法。 - （７）バチルス・ズブチリスＢ１−１０９のコンビテン
ト細胞に所望の遺伝物質を含有するプラスミドを導入し
、プラスミドを含有する細胞をプラスミドが細胞内に維
持されるような条件下で培養することよりなる、宿主−
ベクター系における宿主としてバチルス・ズブチリスＢ
１−１０９を使用する方法。 - （８）バチルス・ズブチリスＢ１−２０のコンビテント
細胞に所望の遺伝物質を含有するプラスミドを導入し、
プラスミドを含有する細胞をプラスミドが細胞内に維持
されるような条件下で培養することよりなる、宿主−ベ
クター系における宿主としてバチルス・ズブチリスＢ１
−２０を使用する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61787484A | 1984-06-06 | 1984-06-06 | |
| US617874 | 1984-06-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611381A true JPS611381A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH0579308B2 JPH0579308B2 (ja) | 1993-11-02 |
Family
ID=24475397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60121627A Granted JPS611381A (ja) | 1984-06-06 | 1985-06-06 | 宿主‐ベクタ‐系における宿主として有用なバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生、無芽胞性突然変異株 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0164117B1 (ja) |
| JP (1) | JPS611381A (ja) |
| AT (1) | ATE64755T1 (ja) |
| AU (1) | AU4308685A (ja) |
| BR (1) | BR8502586A (ja) |
| CA (1) | CA1288710C (ja) |
| DE (1) | DE3583310D1 (ja) |
| DK (1) | DK251385A (ja) |
| ES (1) | ES8606486A1 (ja) |
| FI (1) | FI81380C (ja) |
| GB (1) | GB2182042B (ja) |
| IE (1) | IE58099B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007043327A1 (ja) | 2005-10-13 | 2007-04-19 | Kao Corporation | 新規枯草菌変異株 |
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