JPS611381A - 宿主‐ベクタ‐系における宿主として有用なバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生、無芽胞性突然変異株 - Google Patents
宿主‐ベクタ‐系における宿主として有用なバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生、無芽胞性突然変異株Info
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- JPS611381A JPS611381A JP60121627A JP12162785A JPS611381A JP S611381 A JPS611381 A JP S611381A JP 60121627 A JP60121627 A JP 60121627A JP 12162785 A JP12162785 A JP 12162785A JP S611381 A JPS611381 A JP S611381A
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はDNAの組み換え技術を用いてアミラーゼのコ
ードはれた遺伝子を有するベクターが導入される宿主と
して有用なバチルス・ズブチリス(Bacillus
5ubtil工S)の新規なアミラーゼ非産生突然変異
株に関する。
ードはれた遺伝子を有するベクターが導入される宿主と
して有用なバチルス・ズブチリス(Bacillus
5ubtil工S)の新規なアミラーゼ非産生突然変異
株に関する。
細菌の遺伝物質の大部分は、細胞中の染色体に巨大なり
NA分子として存在している。ある量の遺伝物質は、プ
ラスミドとし、て知られる、よセ小さな環の閉じたDN
A分子の形で存在する場合もある。特異な遺伝的性質に
関連したDNA分子の部分を遺伝子と呼称する。
NA分子として存在している。ある量の遺伝物質は、プ
ラスミドとし、て知られる、よセ小さな環の閉じたDN
A分子の形で存在する場合もある。特異な遺伝的性質に
関連したDNA分子の部分を遺伝子と呼称する。
遺伝子工学に関連する技術によって、特別な蛋白質をそ
の産生物質としてコードしている遺伝子を、一つの微生
物から他の微生物へと移すことが可能である。新しい遺
伝物質を受容する微生物を宿主と呼称する。多くの研究
渚は、これらの技術を用いて、ある特別な蛋白η例えば
酵素などを産生ずることにすぐれた微生物を供給してき
た。
の産生物質としてコードしている遺伝子を、一つの微生
物から他の微生物へと移すことが可能である。新しい遺
伝物質を受容する微生物を宿主と呼称する。多くの研究
渚は、これらの技術を用いて、ある特別な蛋白η例えば
酵素などを産生ずることにすぐれた微生物を供給してき
た。
連続した遺伝子が環状の形に連鎖しているプラスミドは
、ある微生物の細胞からの移動と他の微生物の細胞への
導入が比較的容易になさtうろことが発見されている。
、ある微生物の細胞からの移動と他の微生物の細胞への
導入が比較的容易になさtうろことが発見されている。
また、プラスミドi+1、prシい遺伝物質全宿主体に
導入するベクターと12でも使用可能である。このこと
は制限酵素とjで知C・ノする、環状DNAを開裂させ
る酵素によるプラスミドの最初の切断によシ遂行される
。楯望の遺伝子を含イ1するJ’+’FJDNh鎖はD
NA環の切断きハた部分に挿入される。環状構迄はD
N、 Aリガーゼによる処理で再構成される。新しい環
状DNA分子である再構成されたフシスミトリ、元のプ
ラスミドの遺伝子に加えて、押入されたDNAの小銃で
ある新しい遺伝子を含有(7ている。このプラスミドは
宿主微生物体中に導入されうる。ついで新しい遺伝子を
含むプラスミドは、宿主微生物体中で複製され、その遺
伝物質の一部となる。
導入するベクターと12でも使用可能である。このこと
は制限酵素とjで知C・ノする、環状DNAを開裂させ
る酵素によるプラスミドの最初の切断によシ遂行される
。楯望の遺伝子を含イ1するJ’+’FJDNh鎖はD
NA環の切断きハた部分に挿入される。環状構迄はD
N、 Aリガーゼによる処理で再構成される。新しい環
状DNA分子である再構成されたフシスミトリ、元のプ
ラスミドの遺伝子に加えて、押入されたDNAの小銃で
ある新しい遺伝子を含有(7ている。このプラスミドは
宿主微生物体中に導入されうる。ついで新しい遺伝子を
含むプラスミドは、宿主微生物体中で複製され、その遺
伝物質の一部となる。
遺伝子工学で適切な宿主微生物体として用いられるため
には、新しいDNAの導入が可能でなければならない。
には、新しいDNAの導入が可能でなければならない。
さらに、新らたに挿入された遺伝子にコードされた遺伝
的性質を発現することが実行可Rヒな微生物が得られ力
ければならない。有用な量の蛋白質を産生ずる微生物で
あるには、その微生物はまた工業規模で生育できるもの
でなければならない。
的性質を発現することが実行可Rヒな微生物が得られ力
ければならない。有用な量の蛋白質を産生ずる微生物で
あるには、その微生物はまた工業規模で生育できるもの
でなければならない。
新しいDNA組み換え技術を用いた実験から、新しい遺
伝物質を導入された微生物は、ヒト、動物および植物に
有害な物りj′lK:産生する可能性があるとみなされ
ている。この判断から、1978年にナショナル・イン
ステイテユート・メブ・ヘルス(NIH)は「DNA分
子組み換えに伴う実験の手引き」を発行した。この手引
招には、遺伝子工学実験が行なわれる実験室における物
理的封じ込めのための種々の基準が規定されている。ま
た、紹み換えDNAを含有する微生物の生物学的封じ込
めの基準もそこに確立されている。
伝物質を導入された微生物は、ヒト、動物および植物に
有害な物りj′lK:産生する可能性があるとみなされ
ている。この判断から、1978年にナショナル・イン
ステイテユート・メブ・ヘルス(NIH)は「DNA分
子組み換えに伴う実験の手引き」を発行した。この手引
招には、遺伝子工学実験が行なわれる実験室における物
理的封じ込めのための種々の基準が規定されている。ま
た、紹み換えDNAを含有する微生物の生物学的封じ込
めの基準もそこに確立されている。
宿主細胞とベクターの使用に関する生物学的封じ込めは
、それらが実験室から自然環境の中へ逃げ出した時の生
存可能性の限定として規定されている。そのような限定
された生育可能性を有する微生物細胞は、芽胞を形成し
ないものである(例えば、無゛芽胞性の微生物)。
、それらが実験室から自然環境の中へ逃げ出した時の生
存可能性の限定として規定されている。そのような限定
された生育可能性を有する微生物細胞は、芽胞を形成し
ないものである(例えば、無゛芽胞性の微生物)。
本発明は室生−ベクター系の宿主として有用な新しい無
芽胞性突然変異株バチルス・ズブチリス(R,5ubt
il土s) B 1−109である。この宿主は、アミ
ラーゼ非産生突然変異株であるというざらにつけ加える
べき有効性も有する。この突然変異株は、熱安定性のα
−アミラーゼなどの特異なアミラーゼ産生能をコードさ
れた遺伝子を含む組み換えプラスミドの宿主として用い
る揚台には特に適している。これらのアミラーゼは、デ
ンプン加水分解物、グルコース、および高フルクトース
シロップを製造する方法に使用するのに対し商業的に1
砂である。
芽胞性突然変異株バチルス・ズブチリス(R,5ubt
il土s) B 1−109である。この宿主は、アミ
ラーゼ非産生突然変異株であるというざらにつけ加える
べき有効性も有する。この突然変異株は、熱安定性のα
−アミラーゼなどの特異なアミラーゼ産生能をコードさ
れた遺伝子を含む組み換えプラスミドの宿主として用い
る揚台には特に適している。これらのアミラーゼは、デ
ンプン加水分解物、グルコース、および高フルクトース
シロップを製造する方法に使用するのに対し商業的に1
砂である。
本発明の突然変異株には熱安定性α−アミラーゼ遺伝子
を含むプラスミドがたやすく導入される。得らf+だ微
生物は、熱安定性α−アミラーゼ酵素の産生能において
、1983年10月26日に発行きれた公開ヨーロッパ
特許出願扁092235に発表されたATOC39,0
96のようなバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生
株よシ、宿主−ベクター系用として優れている。
を含むプラスミドがたやすく導入される。得らf+だ微
生物は、熱安定性α−アミラーゼ酵素の産生能において
、1983年10月26日に発行きれた公開ヨーロッパ
特許出願扁092235に発表されたATOC39,0
96のようなバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生
株よシ、宿主−ベクター系用として優れている。
本発明によれば、アミラーゼをコードした遺伝子を含ま
ず、好気的条件下の生育で約10−7未満の芽胞形成株
への復帰頻度をもち、以下の321を有することを特徴
とする、宿主−ベクター系における宿主としての使用に
適する無芽胞性バチルス・ズブチリスB1−109の培
養株が提供される。これらの特性をもつバチルス・ズブ
チリスの菌株は、ATCC39,701としてアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてい
る。
ず、好気的条件下の生育で約10−7未満の芽胞形成株
への復帰頻度をもち、以下の321を有することを特徴
とする、宿主−ベクター系における宿主としての使用に
適する無芽胞性バチルス・ズブチリスB1−109の培
養株が提供される。これらの特性をもつバチルス・ズブ
チリスの菌株は、ATCC39,701としてアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてい
る。
はらに、以下の遺伝様R:mθtB5、amy E、お
よびsac A 321を有することを特徴とする、宿
主−ベクター系における宿主としての使用に適し、そし
て宿主−ベクター系の他のアミラーゼ非産生宿主作製の
中間体として有用であるアミラーゼ非産生バチルス・ズ
ブチリスB1−20の培養株が提供される。これらの特
性をもつバチルス・丈う゛チリスの菌株はATCC;
39,706としてアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄7if;されている。
よびsac A 321を有することを特徴とする、宿
主−ベクター系における宿主としての使用に適し、そし
て宿主−ベクター系の他のアミラーゼ非産生宿主作製の
中間体として有用であるアミラーゼ非産生バチルス・ズ
ブチリスB1−20の培養株が提供される。これらの特
性をもつバチルス・丈う゛チリスの菌株はATCC;
39,706としてアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄7if;されている。
また、本発明によれば、バチルス・ズブチリス1A22
1株からのDNA1バチルス・ズブチリス1A289株
のコンビテント細胞に導入し、α−アミラーゼ酵素を産
住し々い細胞を分離することよシなる。遺伝標識: m
at B 5、any E 、およびSac A 52
iを有するノくチルス・ズブチリスの菌株の作製方法
が提供される。
1株からのDNA1バチルス・ズブチリス1A289株
のコンビテント細胞に導入し、α−アミラーゼ酵素を産
住し々い細胞を分離することよシなる。遺伝標識: m
at B 5、any E 、およびSac A 52
iを有するノくチルス・ズブチリスの菌株の作製方法
が提供される。
さらに、本発明によれば、バチルス・ズブチリスl83
0株からのDNAをバチルス°ズブチリスB1−20株
のコンビテント細胞に導入し、添加したメチオニンの々
い状態で生育し、α−アミラーゼ酵素を産生せず、そし
て90Cで10分間の熱シヨツク処理したとき芽胞を形
成しない細胞を分離することよりなる、遺伝様を有する
バチルス・ズブチリスの菌株の作製方法が提供される。
0株からのDNAをバチルス°ズブチリスB1−20株
のコンビテント細胞に導入し、添加したメチオニンの々
い状態で生育し、α−アミラーゼ酵素を産生せず、そし
て90Cで10分間の熱シヨツク処理したとき芽胞を形
成しない細胞を分離することよりなる、遺伝様を有する
バチルス・ズブチリスの菌株の作製方法が提供される。
最後に、バチltス・ズブチリスの菌株の1つのコンビ
テント細胞に、所望の遺伝物質を含有するプラスミドを
導入し、プラスミドが細胞内に維持されるような条件下
で該細胞を培養するととよシなる、宿主−ベクター系に
おける宿主としてバチルス・ズブチリスB1−109お
よびB1−20株を使用する方法が提供される。
テント細胞に、所望の遺伝物質を含有するプラスミドを
導入し、プラスミドが細胞内に維持されるような条件下
で該細胞を培養するととよシなる、宿主−ベクター系に
おける宿主としてバチルス・ズブチリスB1−109お
よびB1−20株を使用する方法が提供される。
本明細書に明らかにされ、特許請求の範囲に記載された
バチルス・ズブチリスの菌株は、バチルス・ズブチリス
の他の菌株から遺伝物ell導入することによシ作製さ
れた。標識: aro l906、met B 5、s
ac A 321、およびamyEを有する、アミラー
ゼ非産生株バチルス・ズブチリスI A 289 (A
TCC39,711)は、バチルス・ズブチリス1A2
2’1株(ATCC39,086)よJD NAの一部
を導入されることによってもはや芳香族アミノ酸を要求
しない菌株へ変換された。
バチルス・ズブチリスの菌株は、バチルス・ズブチリス
の他の菌株から遺伝物ell導入することによシ作製さ
れた。標識: aro l906、met B 5、s
ac A 321、およびamyEを有する、アミラー
ゼ非産生株バチルス・ズブチリスI A 289 (A
TCC39,711)は、バチルス・ズブチリス1A2
2’1株(ATCC39,086)よJD NAの一部
を導入されることによってもはや芳香族アミノ酸を要求
しない菌株へ変換された。
1A289株は、Mo1.Gen、Genet、、 1
48巻。
48巻。
281−285頁(1976年) KSteinmot
zらにより報督1〜1ryt=ている。これは、ATC
C59,711とし、でメリーランド州、ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、より
入手可能である。1A221株は、Proc、Natl
、Aca、d、Sci、、U、S、A、、 65巻、9
6−105頁(1q70年)にDubnauとSm1t
h によシ報告されている。これは、ATOC3?、0
86としてメリーランド州、ロックビルのアメリカン・
タイプ・コレクションよシ入手可能である。
zらにより報督1〜1ryt=ている。これは、ATC
C59,711とし、でメリーランド州、ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、より
入手可能である。1A221株は、Proc、Natl
、Aca、d、Sci、、U、S、A、、 65巻、9
6−105頁(1q70年)にDubnauとSm1t
h によシ報告されている。これは、ATOC3?、0
86としてメリーランド州、ロックビルのアメリカン・
タイプ・コレクションよシ入手可能である。
B1−20と表示される、得られた導入産物は以下の標
識を含む: met B 5、amyE、および5ac
A321oこれは、ATCC39,706としてアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手′r
jJ能でを・る。このアミラーゼ非産生株は、宿主−ベ
クター系でのアミラーゼ非産生宿主の作製に際しての中
間体として有用である。この株に1、芽胞形成宿主の使
用が容認されるφ件)では、それ自身また宿主として用
いられる。
識を含む: met B 5、amyE、および5ac
A321oこれは、ATCC39,706としてアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手′r
jJ能でを・る。このアミラーゼ非産生株は、宿主−ベ
クター系でのアミラーゼ非産生宿主の作製に際しての中
間体として有用である。この株に1、芽胞形成宿主の使
用が容認されるφ件)では、それ自身また宿主として用
いられる。
バチルス・ズブチリスの無芽胞性株のDNAの一部は、
新しいB1−109株を作製するためB1−20株に導
入された。そのDNA供与体として用いた無芽胞株は、
オハイオ州、コロンブスのバチルス・ジェネテック・ス
トック・センターの微生物部門よシ得たl530′T:
あった。標識spo II A 12 f持つこの菌株
は、1uascbおよび5chaefferによt)
Ann、In5t、Pa5tour。
新しいB1−109株を作製するためB1−20株に導
入された。そのDNA供与体として用いた無芽胞株は、
オハイオ州、コロンブスのバチルス・ジェネテック・ス
トック・センターの微生物部門よシ得たl530′T:
あった。標識spo II A 12 f持つこの菌株
は、1uascbおよび5chaefferによt)
Ann、In5t、Pa5tour。
Paris 、 114巻、1−9(1968年)に発
表されている。これは、ATGC39,712として、
メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ−カ
ルチャー・コレクションよシ入手できる。
表されている。これは、ATGC39,712として、
メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ−カ
ルチャー・コレクションよシ入手できる。
本発明の無芽胞性アミラーゼ非産生株B1−109は、
約10−7未満の芽胞題生菌への復帰頻度を示す。工業
的条件での午前はrxJ能で、また高価な生育に心太な
添加物ケ要求しない。自然または逃亡した場合の像境下
での生き残る率は低く、また自然発生的遺伝子移動によ
る他の菌体へのプラスミドの導出傾向は大変低い。標準
的遺伝子導入法に用いた場合、この菌株は晶いプラスミ
ド取り込み頻度を示す。このコンビテント細胞を遺伝う
一導入操作に用いた場合、卓越した遺伝子導入効果が得
られる。この菌株は種々のプラスミドベクターの宿主と
して良好に機能シ、バチルス・ズブチリス宿主−ベクタ
ー糸の宿主とし5て有用性が高い。アミラーゼ非産生で
あるので、この菌株はアミラーゼ産生能をコードされた
遺伝子を含む組み換え型プラスミドの宿主として用いる
際、特に適する。
約10−7未満の芽胞題生菌への復帰頻度を示す。工業
的条件での午前はrxJ能で、また高価な生育に心太な
添加物ケ要求しない。自然または逃亡した場合の像境下
での生き残る率は低く、また自然発生的遺伝子移動によ
る他の菌体へのプラスミドの導出傾向は大変低い。標準
的遺伝子導入法に用いた場合、この菌株は晶いプラスミ
ド取り込み頻度を示す。このコンビテント細胞を遺伝う
一導入操作に用いた場合、卓越した遺伝子導入効果が得
られる。この菌株は種々のプラスミドベクターの宿主と
して良好に機能シ、バチルス・ズブチリス宿主−ベクタ
ー糸の宿主とし5て有用性が高い。アミラーゼ非産生で
あるので、この菌株はアミラーゼ産生能をコードされた
遺伝子を含む組み換え型プラスミドの宿主として用いる
際、特に適する。
バチルス・ズブチリスの染色体の詳細な遺伝子地図は、
l旧nnarおよびHochによシ、Microbio
logical、 Reviews 、 44巻、 5
7−82頁(1980年)に発表されている。
l旧nnarおよびHochによシ、Microbio
logical、 Reviews 、 44巻、 5
7−82頁(1980年)に発表されている。
本発明の記載中に述べられる遺伝標識の簡潔な記述は以
下の通シである: (IJ spa M A 12 :これは、芽胞形成の
最も初期の段階におりる障害を起こす欠損突然変異であ
る。この突然変異はバチルスの芽胞形成能を消滅略せる
。この芽胞は熱、紫外線、化学物質および乾燥に曝尽れ
た時の自然状態における菌の正常な生き残少の形である
。
下の通シである: (IJ spa M A 12 :これは、芽胞形成の
最も初期の段階におりる障害を起こす欠損突然変異であ
る。この突然変異はバチルスの芽胞形成能を消滅略せる
。この芽胞は熱、紫外線、化学物質および乾燥に曝尽れ
た時の自然状態における菌の正常な生き残少の形である
。
(21aroI906:フェニルアラニン、チロシン、
およびトリプトファン袈求性全起こす突然変異である。
およびトリプトファン袈求性全起こす突然変異である。
これらのアミノ酸が欠損した時、この突然変異株の生育
は止まる。
は止まる。
(31amyE:この標識は、α−アミラーゼ全産生す
る構造遺伝子の欠損に関連している。この突然変異は、
非常に低い復帰頻度によシ特徴づけられる。
る構造遺伝子の欠損に関連している。この突然変異は、
非常に低い復帰頻度によシ特徴づけられる。
(4)lin2:この遺伝様Rを持つ菌株は、適当なア
ミノ酸および100μ17rntの濃度のリンコミシン
(lincomyoin) f添加した最小培地を含有
する平板で生育する。この標識を持たない菌株は、その
ような平板上では生育できない。
ミノ酸および100μ17rntの濃度のリンコミシン
(lincomyoin) f添加した最小培地を含有
する平板で生育する。この標識を持たない菌株は、その
ような平板上では生育できない。
(51metB5 :この突然変異は、メチオニン要求
性を引き起こす。このアミノ酸が欠1−jA t、た場
合、この突然変異をもつ菌株は生育を止める。
性を引き起こす。このアミノ酸が欠1−jA t、た場
合、この突然変異をもつ菌株は生育を止める。
(6) 5acA321 :これは、微生物によるショ
糖の代謝に必須な酵素の産生を失わせる突然変異である
。炭素源としてショ糖を含む培地での宿主の生育は妨げ
られる。
糖の代謝に必須な酵素の産生を失わせる突然変異である
。炭素源としてショ糖を含む培地での宿主の生育は妨げ
られる。
以下に例″を′示して本発明を具体的に説明する。
特記される以外は、すべての比率およびパーセントはT
((さを基礎に算出されたものである。
((さを基礎に算出されたものである。
ATCCナンバーを冠せられたすべての菌株は。
メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから入手できる。これらの菌株
は、%許目的のための微生物の寄託についでのブタペス
ト条約の規定のもとに寄託されたものである。ディフコ
社商品名を冠されたすべての試薬は、ミシガン州、デト
ロイトのディフコ研究所より人手できる。
ルチャー・コレクションから入手できる。これらの菌株
は、%許目的のための微生物の寄託についでのブタペス
ト条約の規定のもとに寄託されたものである。ディフコ
社商品名を冠されたすべての試薬は、ミシガン州、デト
ロイトのディフコ研究所より人手できる。
例
バチルス會ズブチリス1A2B9株(ATCC59,7
/! /・)の、生育に芳香族アミノ酸を要求しない菌
株への形質転換は、バチルス・ズブチリス1A221株
(ATCC59,086)から得たDNAを導入するこ
とで実現された。その方法は以下の通りである。
/! /・)の、生育に芳香族アミノ酸を要求しない菌
株への形質転換は、バチルス・ズブチリス1A221株
(ATCC59,086)から得たDNAを導入するこ
とで実現された。その方法は以下の通りである。
バチルス曇ズブチリスI A 2 B 9株(ATCC
59,711)の細胞は、トリプトース・血液・寒天・
培養基(−ディフコ)を含む平板培地上で一晩生育され
た。この平板培地上の細胞は、ペナセイ・プロス(ディ
フコ)に接種され%57℃で20 Orpmの振盪下で
一晩生育された。この細胞は遠心操作で分離され、5倍
容量の増殖培養液に懸濁された。増殖培養液の組成は。
59,711)の細胞は、トリプトース・血液・寒天・
培養基(−ディフコ)を含む平板培地上で一晩生育され
た。この平板培地上の細胞は、ペナセイ・プロス(ディ
フコ)に接種され%57℃で20 Orpmの振盪下で
一晩生育された。この細胞は遠心操作で分離され、5倍
容量の増殖培養液に懸濁された。増殖培養液の組成は。
0.5%グルコース、ロ、6%リン酸−カリウム。
1.4%リン酸二カリウム、0.1%クエン酸ナトリウ
ム、0.2%硫安および0.07%硫酸マグネシウムを
含み、50μ97−の濃度になるようにロイシン、イン
ロイシン、メチオニンを刃口え。
ム、0.2%硫安および0.07%硫酸マグネシウムを
含み、50μ97−の濃度になるようにロイシン、イン
ロイシン、メチオニンを刃口え。
25μll/mlの濃度となるようにヒスチジン、トリ
プトファン、アルギニン、バリン、リジン。
プトファン、アルギニン、バリン、リジン。
スレオニン、グリシン、アスパラギン酸をカロえたもの
である。分光光度計を用い、培養液の波長620 nm
における吸光度の増加が計測された。培養細胞が対数
増殖期から定常増殖期に転換する時点で(15分で吸光
度変化が5%よシ小となる)、この培養細胞はDNA導
入に用いられた。
である。分光光度計を用い、培養液の波長620 nm
における吸光度の増加が計測された。培養細胞が対数
増殖期から定常増殖期に転換する時点で(15分で吸光
度変化が5%よシ小となる)、この培養細胞はDNA導
入に用いられた。
供給されるD N Aは、バチルス・ズブチリス1A2
21株(ATCC39,086)から以下の操作で得ら
れた。
21株(ATCC39,086)から以下の操作で得ら
れた。
1A221株は、100−のペナセイ・プロス(ディフ
コ)中で生育された。培養細胞は。
コ)中で生育された。培養細胞は。
37℃で、波長660ナノメーターの吸光度が0.6に
なるまで培養された。この細胞は、遠心操作で集め、0
゜005Mエチレンシアばン四酢酸(EDTA)および
0.05 M塩化ナトリウムを含み、2〜のリゾチーム
を含む溶液1Mに再懸濁された。細胞がこわれ始めた時
、ドライアイス−アセトン槽中に容器を沈め凍結させた
。次いで、0.03Mトリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン−1S,0、0,005MEDTA を含む
緩衝m液が凍結+1fll胞に加えられ、この混合液は
2回凍結融解をく夛返えされた。これに同量のフェノー
ルを加え、この混合液は4℃で70分間振盪された。沈
殿した蛋白質は遠心操作で除去された。DNAを沈殿さ
せるために、透明な上清に0.12mの3M酢酸ナトリ
ウム(pH8゜0)およびo、/i”Kmjのイングロ
バノールが、溶液1−当りに加えられた。沈殿したDN
Aはガラス棒でかき回して集められ、さらにイングロパ
ノールで洗浄された。DNAは、0.015M塩化ナト
リウムおよび0.0015酢酸ナトリウムを含むpH7
の溶液に再溶解され、導入操作に用いるまで4℃で保存
された。
なるまで培養された。この細胞は、遠心操作で集め、0
゜005Mエチレンシアばン四酢酸(EDTA)および
0.05 M塩化ナトリウムを含み、2〜のリゾチーム
を含む溶液1Mに再懸濁された。細胞がこわれ始めた時
、ドライアイス−アセトン槽中に容器を沈め凍結させた
。次いで、0.03Mトリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン−1S,0、0,005MEDTA を含む
緩衝m液が凍結+1fll胞に加えられ、この混合液は
2回凍結融解をく夛返えされた。これに同量のフェノー
ルを加え、この混合液は4℃で70分間振盪された。沈
殿した蛋白質は遠心操作で除去された。DNAを沈殿さ
せるために、透明な上清に0.12mの3M酢酸ナトリ
ウム(pH8゜0)およびo、/i”Kmjのイングロ
バノールが、溶液1−当りに加えられた。沈殿したDN
Aはガラス棒でかき回して集められ、さらにイングロパ
ノールで洗浄された。DNAは、0.015M塩化ナト
リウムおよび0.0015酢酸ナトリウムを含むpH7
の溶液に再溶解され、導入操作に用いるまで4℃で保存
された。
上記の方法で調製されたバチルス・ズブチリス1A2B
9株(1,Od)のコンビテント細胞は最終混合物の濃
度10μl/atでDNAと混合され、培養液は37℃
で30分温和な振盪(1o o rpm )下に置かれ
た。この培養液は。
9株(1,Od)のコンビテント細胞は最終混合物の濃
度10μl/atでDNAと混合され、培養液は37℃
で30分温和な振盪(1o o rpm )下に置かれ
た。この培養液は。
2mjのペナセー・プロス(ディフコ)で希釈され、更
に67℃で90分間培養が行なわれた。
に67℃で90分間培養が行なわれた。
この細胞は遠゛心操作によシ集められ、蒸留水で1度洗
浄され、当初の容量の培地に再I@濁され。
浄され、当初の容量の培地に再I@濁され。
スビジジエン(Spizizen) の最小培地にメ
チオニン(5μ97a)を加えた平板培地の上に広けら
れた。スビジジエン最小培地の組成は、(a)硫安0.
2%:(b)リン酸カリウム(2*基) −1,4%;
fcl lへ↓酸カリウム(1塩基) −0,6%;
(d)クエン酸ツートリウム−0,1%;および(θ)
慌酸マグ洋シウノ、−[1,02%を含み−7,4に調
整した溶液である。0.5m)の細胞懸濁液を加えた時
に、2つのコロニーが生育し、その内の1つはアミラー
ゼ非産生である。このものは、芳香族アミノ酸欠損条件
下での生育可能性によシ選択され。
チオニン(5μ97a)を加えた平板培地の上に広けら
れた。スビジジエン最小培地の組成は、(a)硫安0.
2%:(b)リン酸カリウム(2*基) −1,4%;
fcl lへ↓酸カリウム(1塩基) −0,6%;
(d)クエン酸ツートリウム−0,1%;および(θ)
慌酸マグ洋シウノ、−[1,02%を含み−7,4に調
整した溶液である。0.5m)の細胞懸濁液を加えた時
に、2つのコロニーが生育し、その内の1つはアミラー
ゼ非産生である。このものは、芳香族アミノ酸欠損条件
下での生育可能性によシ選択され。
B1−20と表示される。このものは以下の標識:μす
〜県5、amy E 、およびシ四J321をもつ。
〜県5、amy E 、およびシ四J321をもつ。
この生物学的に純粋な培養株は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにATCC39,706とし
て寄託されている。
カルチャー・コレクションにATCC39,706とし
て寄託されている。
B1−20株(肌す5.とび、μピA321)は、供給
法I S 50 (ATCO59,712)からI’)
NAを導入され、無芽胞性株B1−109に転換させら
れた。導入はB1−20細胞を用いて行′なわれた。
法I S 50 (ATCO59,712)からI’)
NAを導入され、無芽胞性株B1−109に転換させら
れた。導入はB1−20細胞を用いて行′なわれた。
供給されるDNAは、バチルス・ズブチリス1S30株
(AT(C: 5 ?、712 )より以下のノミ法
で得らitた。細胞の培養は、57℃で100m1のグ
ルコース操加トリプティク・ンイ(TSG)培地(ディ
フコ)中で、−晩方なわhた。次いで、40rn9のり
ゾチームを加え、との涜合液は60℃で30分保温され
た。スフェロプラスト(spheroplast)は4
500 rpmで10分の遠心操作で分離され、0.1
5MtJi化ナトリウムおよび0.1 M ED’FA
を含むPFilo、2+7)M液4oNに懸濁された。
(AT(C: 5 ?、712 )より以下のノミ法
で得らitた。細胞の培養は、57℃で100m1のグ
ルコース操加トリプティク・ンイ(TSG)培地(ディ
フコ)中で、−晩方なわhた。次いで、40rn9のり
ゾチームを加え、との涜合液は60℃で30分保温され
た。スフェロプラスト(spheroplast)は4
500 rpmで10分の遠心操作で分離され、0.1
5MtJi化ナトリウムおよび0.1 M ED’FA
を含むPFilo、2+7)M液4oNに懸濁された。
5 mlの25%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えた
後、この混合液は70℃に保温し1時間置かれ友。0.
05 M塩化ナトリウムおよび0.005 Mクエン酸
ナトリウムを含み。
後、この混合液は70℃に保温し1時間置かれ友。0.
05 M塩化ナトリウムおよび0.005 Mクエン酸
ナトリウムを含み。
フェノールで飽和したpH7の溶液を加えることによシ
2回蛋白質を沈殿させた。この上清に54の3M酢酸ナ
トリウム溶液が加えられた。この溶液にインプロパツー
ル層が加えられた。二層間に存在するDNAはガラス棒
で巻き取られた。ガラス棒上のDNAは、冷イングロパ
ノールで2度洗浄され、 0.05 M塩化ナトリウ
ムおよびo、ooxMクエン酸ナトリウムを含むpF1
7の溶液に溶解された。0.015 M塩化ナトリウム
および0.915 Mクエン酸ナトリウムを含むpH7
の入谷賞溶液に対し、上記の得られた溶液をT′j5析
し、透析外液は3度交換し、24時間透析した。この結
果借られた透析内液を遺伝子導入に用いた。
2回蛋白質を沈殿させた。この上清に54の3M酢酸ナ
トリウム溶液が加えられた。この溶液にインプロパツー
ル層が加えられた。二層間に存在するDNAはガラス棒
で巻き取られた。ガラス棒上のDNAは、冷イングロパ
ノールで2度洗浄され、 0.05 M塩化ナトリウ
ムおよびo、ooxMクエン酸ナトリウムを含むpF1
7の溶液に溶解された。0.015 M塩化ナトリウム
および0.915 Mクエン酸ナトリウムを含むpH7
の入谷賞溶液に対し、上記の得られた溶液をT′j5析
し、透析外液は3度交換し、24時間透析した。この結
果借られた透析内液を遺伝子導入に用いた。
バチルス・ズブチリスB1−20株の細胞ハ。
トリプトース・血液・寒天・培黄基(ディフコ)を含む
一甲板1′?i地上で、−晩57℃で培養された。
一甲板1′?i地上で、−晩57℃で培養された。
平板培地上からの細胞は、小量の増殖培養液に’M濁さ
り、5o omtのエルシンマイヤーフラスコ中の60
m6の増殖培養液に接種され友。この混合液は33−3
7℃で振盪培養された。増殖培養液は以下の成分を含有
した=0.5%グルコース、0.6%リン酸−カリウム
、1.4%リン酸二カリウム、0.1%クエン酸ナトリ
ウム、0.2%硫安、0.01%硫酸マグネシウム、0
.02%カサミノ酸(ディフコ)、0.1%イーストエ
クストラクト(ディフコ)、および0.02%L−トリ
グトファン。生育は620 nm の吸光度により監
視された。培養細胞が対数増殖期から定常増殖期に転換
する時(15分で吸光度変化が5%より小となる)、こ
の培養細胞はD N A 4人に用いられた。細胞懸濁
液は2倍容量の導入用培地によυ希釈された。この導入
用培地は。
り、5o omtのエルシンマイヤーフラスコ中の60
m6の増殖培養液に接種され友。この混合液は33−3
7℃で振盪培養された。増殖培養液は以下の成分を含有
した=0.5%グルコース、0.6%リン酸−カリウム
、1.4%リン酸二カリウム、0.1%クエン酸ナトリ
ウム、0.2%硫安、0.01%硫酸マグネシウム、0
.02%カサミノ酸(ディフコ)、0.1%イーストエ
クストラクト(ディフコ)、および0.02%L−トリ
グトファン。生育は620 nm の吸光度により監
視された。培養細胞が対数増殖期から定常増殖期に転換
する時(15分で吸光度変化が5%より小となる)、こ
の培養細胞はD N A 4人に用いられた。細胞懸濁
液は2倍容量の導入用培地によυ希釈された。この導入
用培地は。
2%の0.1M塩化マグネシウムおよび1%の0.05
M塩化カルシウムが追加的に加えられている以外は、
増殖培養液と同じ組成である。希釈は55−57℃にあ
らかじめ保温しである導入用培地に加えることにより行
なわれ念。この混合液は、同温度で90分間、30Dr
pmで振盪された。振盪終了5分前に、最終濃度1 m
lJとなるように20 mMエチレングリコール−ビス
(β−アミンエチルエーテル) −N、N、N’、N’
−四酢酸が加えられ友。
M塩化カルシウムが追加的に加えられている以外は、
増殖培養液と同じ組成である。希釈は55−57℃にあ
らかじめ保温しである導入用培地に加えることにより行
なわれ念。この混合液は、同温度で90分間、30Dr
pmで振盪された。振盪終了5分前に、最終濃度1 m
lJとなるように20 mMエチレングリコール−ビス
(β−アミンエチルエーテル) −N、N、N’、N’
−四酢酸が加えられ友。
1S30株から上記の方法で分離された20μlのDN
Aと上記の81−20株のコンビテント細胞0.5属を
混合することにより導入を行なった。この混合液は、5
0−57℃で90分間25 Orpmで振盪された。得
られた細胞は、滅菌水で希釈後、寒天平板培地上にまか
れた。メチオン産生、アεラーゼ非産生の特性をもつ細
胞は、この寒天平板培地上で生育する培養株としてto
l(択された。この寒天平板培地の組成は。
Aと上記の81−20株のコンビテント細胞0.5属を
混合することにより導入を行なった。この混合液は、5
0−57℃で90分間25 Orpmで振盪された。得
られた細胞は、滅菌水で希釈後、寒天平板培地上にまか
れた。メチオン産生、アεラーゼ非産生の特性をもつ細
胞は、この寒天平板培地上で生育する培養株としてto
l(択された。この寒天平板培地の組成は。
スビジジエンf]λ小培地にトリプトファン(5μg/
m6)および1%リンドナー(Lir、tner)デン
粉を力nえたものである。90℃で10分の熱ショクに
よる無芽胞特性選別のため、600のコロニーがスクリ
ーニングされた。その結果、1つのコロニー、81−1
09が無芽胞性でbつた。
m6)および1%リンドナー(Lir、tner)デン
粉を力nえたものである。90℃で10分の熱ショクに
よる無芽胞特性選別のため、600のコロニーがスクリ
ーニングされた。その結果、1つのコロニー、81−1
09が無芽胞性でbつた。
このものは遺伝柳識: spo I A 12 、
amyE 、および5acA321を有する。この生物
学的に純粋な培養株は、ATCO59,701としてア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。
amyE 、および5acA321を有する。この生物
学的に純粋な培養株は、ATCO59,701としてア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。
B1−10?株は、生育のためにアンモニウム、カリウ
ム、リン酸、およびナトリウムイオンを含む無機塩を要
求する。この株は、グルコースを含むJjii々の炭素
源を利用する。以下の試、17’(jlで1はめられる
ように、芽用形成株への逆行はなイo #tl1Mll
L、 57℃でDSM(ディフコ)培地を含む寒天斤板
上で生育された。24時間後。
ム、リン酸、およびナトリウムイオンを含む無機塩を要
求する。この株は、グルコースを含むJjii々の炭素
源を利用する。以下の試、17’(jlで1はめられる
ように、芽用形成株への逆行はなイo #tl1Mll
L、 57℃でDSM(ディフコ)培地を含む寒天斤板
上で生育された。24時間後。
この細胞は0.1%グルコースを含むトリグテイク・ン
イ培地中に懸濁され、90℃で10分間加熱された。次
いでこの細@は、トリプトース・血液・寒天・培養基(
ディフコ)を含む平板培地上に滴下された。これら平板
培地上でのコロニー形成単位として、生存可能な総細胞
数が決定された。非加熱検体を滴下して、平板培地上に
展開する1ミリリツトル当シのコロニー形成単位数が比
較された。非加熱検体は、1m7当り1.27 X・0
コロニー形成単位を含有するに対し、加熱された!胞
は単に1 rnl当シ5コロニー形成単位しか含有しな
かった。このことは。
イ培地中に懸濁され、90℃で10分間加熱された。次
いでこの細@は、トリプトース・血液・寒天・培養基(
ディフコ)を含む平板培地上に滴下された。これら平板
培地上でのコロニー形成単位として、生存可能な総細胞
数が決定された。非加熱検体を滴下して、平板培地上に
展開する1ミリリツトル当シのコロニー形成単位数が比
較された。非加熱検体は、1m7当り1.27 X・0
コロニー形成単位を含有するに対し、加熱された!胞
は単に1 rnl当シ5コロニー形成単位しか含有しな
かった。このことは。
この株は好気的条件下の生育で約10 未満の芽胞形成
株への復帰頻度をもつことを示す。
株への復帰頻度をもつことを示す。
B1−20および81−109の雨林は、標準的導入方
法において高頻度でのプラスミド導入を示す。このベク
ターを含有するこれら宿主が45℃という高温で生育さ
れる場合でも、グラスミド・ベクターはこれら宿主中に
保持され本明細′ル(にBj、5載された研究は、すべ
てNIHの手引きに4K >eされた物理的および生物
学的危険封じ込めに関する要求項目に合致して行われた
ものである。
法において高頻度でのプラスミド導入を示す。このベク
ターを含有するこれら宿主が45℃という高温で生育さ
れる場合でも、グラスミド・ベクターはこれら宿主中に
保持され本明細′ル(にBj、5載された研究は、すべ
てNIHの手引きに4K >eされた物理的および生物
学的危険封じ込めに関する要求項目に合致して行われた
ものである。
Claims (8)
- (1)アミラーゼをコードした遺伝子を含まず、好気的
条件下の生育で約10^−^7未満の芽胞形成株への復
帰頻度をもち、以下の遺伝標識:¥spo II A¥
12、¥amy E¥、および¥sac A¥ 321
を有することを特徴とする、宿主−ベクター系における
宿主としての使用に適する無芽胞性バチルス・ズブチリ
ス(Bacillus subtilis)B1−10
9の培養株。 - (2)ATCCNo.39,701を有する特許請求の
範囲第1項記載のバチルス・ズブチリスの培養株。 - (3)以下の遺伝標識:¥met B¥ 5、¥amy
E¥、および¥sac A¥ 321を有することを
特徴とする、宿主−ベクター系における宿主としての使
用に適し、そして宿主−ベクター系の他のアミラーゼ非
産生宿主作製の中間体として有用であるアミラーゼ非産
生バチルス・ズブチリスB1−20の培養株。 - (4)ATCCNo.39,706を有する特許請求の
範囲第3項記載のバチルス・ズブチリスの培養株。 - (5)バチルス・ズブチリス1A221株からのDNA
をバチルス、ズブチリス1A289株のコンビテント細
胞に導入し、α−アミラーゼ酵素を産生しない細胞を分
離することよりなる、遺伝標識:¥met B¥ 5、
¥amy E¥、および¥sac A¥ 321を有す
るバチルス・ズブチリスの菌株の作製方法。 - (6)バチルス・ズブチリス1S30株からのDNAを
バチルス・ズブチリスB1−20株のコンビテント細胞
に導入し、添加したメチオニンのない状態で生育し、α
−アミラーゼ酵素を産生せず、そして90℃で10分間
の熱ショク処理したとき芽胞を形成しない細胞を分離す
ることよりなる、遺伝標識:¥spo IIA¥12、¥
amy E¥、および¥sac A ¥321を有する
バチルス・ズブチリスの菌株の作製方法。 - (7)バチルス・ズブチリスB1−109のコンビテン
ト細胞に所望の遺伝物質を含有するプラスミドを導入し
、プラスミドを含有する細胞をプラスミドが細胞内に維
持されるような条件下で培養することよりなる、宿主−
ベクター系における宿主としてバチルス・ズブチリスB
1−109を使用する方法。 - (8)バチルス・ズブチリスB1−20のコンビテント
細胞に所望の遺伝物質を含有するプラスミドを導入し、
プラスミドを含有する細胞をプラスミドが細胞内に維持
されるような条件下で培養することよりなる、宿主−ベ
クター系における宿主としてバチルス・ズブチリスB1
−20を使用する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61787484A | 1984-06-06 | 1984-06-06 | |
US617874 | 1984-06-06 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS611381A true JPS611381A (ja) | 1986-01-07 |
JPH0579308B2 JPH0579308B2 (ja) | 1993-11-02 |
Family
ID=24475397
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60121627A Granted JPS611381A (ja) | 1984-06-06 | 1985-06-06 | 宿主‐ベクタ‐系における宿主として有用なバチルス・ズブチリスのアミラーゼ非産生、無芽胞性突然変異株 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0164117B1 (ja) |
JP (1) | JPS611381A (ja) |
AT (1) | ATE64755T1 (ja) |
AU (1) | AU4308685A (ja) |
BR (1) | BR8502586A (ja) |
CA (1) | CA1288710C (ja) |
DE (1) | DE3583310D1 (ja) |
DK (1) | DK251385A (ja) |
ES (1) | ES8606486A1 (ja) |
FI (1) | FI81380C (ja) |
GB (1) | GB2182042B (ja) |
IE (1) | IE58099B1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007043327A1 (ja) | 2005-10-13 | 2007-04-19 | Kao Corporation | 新規枯草菌変異株 |
JP2013252069A (ja) * | 2012-06-05 | 2013-12-19 | Ikeda Shokken Kk | 発酵調味料の製造方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1244477B (it) * | 1990-12-21 | 1994-07-15 | Eniricerche Spa | Ceppo asporigeno di bacillus subtilis e suo impiego come ospite per la preparazione di prodotti eterologhi |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4465773A (en) * | 1982-04-21 | 1984-08-14 | Cpc International Inc. | Amylase-negative, asporogenous mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
US4450235A (en) * | 1982-04-21 | 1984-05-22 | Cpc International Inc. | Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
US4450236A (en) * | 1982-04-21 | 1984-05-22 | Cpc International Inc. | Asporogenic mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
EP0134048B2 (en) * | 1983-07-06 | 1996-08-14 | Gist-Brocades N.V. | Molecular cloning and expression in industrial microorganism species |
-
1985
- 1985-04-30 IE IE109385A patent/IE58099B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 CA CA000481232A patent/CA1288710C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-22 FI FI852038A patent/FI81380C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-29 AU AU43086/85A patent/AU4308685A/en not_active Abandoned
- 1985-05-30 BR BR8502586A patent/BR8502586A/pt unknown
- 1985-06-04 DK DK251385A patent/DK251385A/da not_active Application Discontinuation
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