ES2204914T3 - Genes que codifican el complejo alfa cetoacido deshidrogenasa de cadena ramificada de streptomyces avermitilis. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN PARA EL COMPLEJO DE DEHIDROGENASA ALFA-QUETOACIDO DE CADENA RAMIFICADA DE UN ORGANISMO QUE PERTENECE AL GENERO ESTREPTOMICES Y A POLIPEPTIDOS PRODUCIDOS POR LA EXPRESION DE TALES SECUENCIAS. TAMBIEN SE REFIERE A METODOS PARA REFORZAR LA PRODUCCION DE LA AVERMECTINA NATURAL Y PARA PRODUCIR AVERMECTINA MEDIANTE FERMENTACION.

Description

Genes que codifican el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de Streptomyces avermitilis.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN nuevas que codifican el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de un organismo que pertenece al género Streptomyces y a nuevos polipéptidos producidos por la expresión de dichas secuencias. Se refiere también a nuevos procedimientos para aumentar la producción de avermectina natural y para producir nuevas avermectinas a través de la fermentación.

Numerosos productos farmacéuticos son producidos por microorganismos. Entre estos microorganismos, miembros del género Streptomyces -un grupo de bacteria de tierra gram-positiva- han recibido atención notable habiendo producido más del 90% de los antibióticos útiles terapéuticamente. Los Estreptomicetos son el centro de investigación intensiva que aplica técnicas de clonaje de ADN recombinantes para aislar genes biosintéticos antibióticos, generar nuevos derivados o compuestos híbridos, aislar genes reguladores, e investigar los mecanismos reguladores implicados tanto en el metabolismo primario como en el secundario.

La S. avermitilis produce ocho compuestos policetido antiparasitarios distintos aunque muy relacionados llamados avermectinas. El complejo de avermectinas producido por S. avermitilis tiene cuatro componentes principales, A1a, A2a, B1a, y B2a, y cuatro componentes secundarios, A1b, A2b, B1b, y B2b. La estructura de los diversos componentes se describe a continuación.

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Avermectina	R'	R^{2}	X-Y
A1a	Sec-butilo	Me	CH=CH
A1b	Isopropilo	Me	CH=CH
A2a	Sec-butilo	Me	CH_{2}-CH(OH)
A2b	Isopropilo	Me	CH_{2}-CH(OH)
B1a	Sec-butilo	H	CH=CH
B1b	Isopropilo	H	CH=CH
B2a	Sec-butilo	H	CH_{2}-CH(OH)
B2b	isopropilo	H	CH_{2}-CH(OH)

La estructura policetido de avermectina se deriva de siete moléculas de acetato, cinco de propionato, y de una molécula de ácido graso de cadena ramificada alfa, que es o bien ácido S(+)-2-metilbutírico o ácido isobutírico. Las denominaciones "A" y "B" se refieren a avermectinas en las que el sustituyente 5 es metoxi o hidroxi, respectivamente. El número "1" se refiere a avermectinas en las que está presente un doble enlace en la posición 22-23, y el número "2" a avermectinas con un hidrógeno en la posición 22 e hidroxi en la posición 23. Por último, el C-25 tiene dos posibles sustituyentes: el sustituyente sec-butilo (derivado de L-isoleucina) está presente en las series "a" de avermectina, y el sustituyente isopropilo (derivado de L-valina) está presente en las series "b" de avermectina (para su examen, véase Fisher, M.H. y Mrozik, H., 1984, "Macrolide Antibiotics", Academic Press, capítulo 14).

Se entiende por avermectinas "naturales" aquellas avermectinas producidas por S. avermitilis en las que el sustituyente en la posición 25 es, como se menciona anteriormente, o bien isopropilo o sec-butilo. Las avermectinas en las que el grupo de la posición 25 es diferente a isopropilo o sec-butilo se denominan en la presente invención como avermectinas nuevas o no naturales.

Una ruta metabólica para estos ácidos grasos de cadena ramificada alfa en su forma CoA va a través de una reacción de una aminoácido transaminasa de cadena ramificada seguida por una reacción de alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada. (Alternativamente, los derivados grasos de acil-CoA de cadena ramificada pueden surgir de alfa-cetoácidos de cadena ramificada producidos por síntesis de novo). Estas rutas metabólicas se describen a continuación.

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Se aisló previamente un mutante de S. avermitilis con actividad alfa- cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKDH) no detectable en la enzima última mencionada (Hafner y col, 1988, Solicitud de Patente Europea Nº 88300353.5. publicación Nº 0284176). El mutante se aisló siguiendo mutagénesis química patrón de la cepa ATCC 31272 de S. avermitilis en una búsqueda por selección por ausencia de producción de ^{14}CO_{2} a partir del sustrato ácido 2-oxolsocaproico marcado con ^{14}C (análogo de leucina). El mutante es incapaz de sintetizar avermectinas naturales excepto cuando se añade el ácido graso de cadena ramificada alfa o un precursor que contiene el grupo isopropilo o sec-butilo (forma S) al medio en el que se fermentan los mutantes. El mutante también es capaz de producir avermectinas nuevas o no naturales cuando se fermenta bajo condiciones aeróbicas acuosas en un medio de nutrientes que contiene un ácido carboxílico alternativo apropiado, como ácido carboxílico de ciclohexano (CHC), o un precursor del mismo.

Es muy deseable clonar la BCKDH de S. avermitilis. La manipulación de estos genes a través de técnicas de ADN recombinantes debería facilitar la producción de avermectina natural y nueva. Para ciertas cepas, el aumento de la valoración de avermectinas naturales se anticiparía aumentando el número de copias de los genes de BCKDH. Además, la generación de una cepa bkd bloqueada irreversiblemente, con actividad BCKDH permanentemente eliminada o modificada por reemplazo del gen, sería una alternativa mejorada a la actual bkd mutante que se obtuvo, como se menciona anteriormente, por mutagénesis química.

Los complejos de multienzima alfa-cetoácido deshidrogenasa - el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKDH), el complejo piruvato deshidrogenasa (PDH), y el complejo alfa-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDH) catalizan las descarboxilaciones oxidativas de alfa cetoácidos de cadena ramificada, piruvato, y alfa-cetoglutarato, respectivamente, liberando CO_{2} y generando el correspondiente Acil-CoA y NADH (Perham, R. N., 1991. Biochemistry, 30: 8501-8512). Cada complejo consiste en tres enzimas catalíticas diferentes: descarboxilasa (E1), dihidrolipoamida aciltransferasa transacilasa (E2), y dihidrolipoamida deshidrogenasa (E3).

La alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKDH) es un complejo multienzima compuesto por tres componentes funcionales, E1, la descarboxilasa, E2, la transacilasa, y E3, la lipoamida deshidrogenasa. Los complejos purificados de Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, y Bacilus subtilis, están compuestos por cuatro polipéptidos. Los complejos de mamífero purificados también consisten en cuatro polipéptidos, E1alfa, E1beta, E2, y E3. Se ha aislado un complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de Bacilus subtilis que tiene actividad tanto piruvato como alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada. Este complejo de función doble oxida el piruvato y proporciona ácidos grasos de cadena ramificada para fosfolípidos de membrana.

Se ha informado el clonaje de genes de alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada procariótica para Pseudomonas y Bacilus, pero no para Streptomyces. En estos sistemas se encontró que los genes que codifican la BCKDH estaban agrupados en un operón. Los genes del complejo BCKDH de Pseudomonas putida se habían clonado y se había determinado la secuencia de nucleótidos de esta región (Sykes y col., 1987, J. Bacterial., 169: 1619-1625, y Burns y col., 1988, Eur. J. Biochem, 176:165-169, y 176:311-317). El peso molecular de E1alfa es 45289, de E1beta es 37138, de E2 es 45134, y de E3 es 48164. Los cuatro genes se agrupan en la secuencia: E1alfa, E1beta, E2 y E3. Los análisis de transferencia Northern indicaron que la expresión de estos cuatro genes tiene lugar a partir de un ARNm único y que estos genes constituyen un operón. Existe un promotor consenso procariótico típico inmediatamente precediendo al inicio de la región que codifica E1alfa que permite la expresión constitutiva de los genes bkd de Pseudomonas. El codon iniciador para la región que codifica E1beta se sitúa solo a 40 nucleótidos en la parte 3' del final de la fase de lectura abierta (ORF) de E1alfa. Por contraste, no hay espacio intergénico entre las ORF de E1beta y E2 ya que el codon de parada para la ORF de E1beta es el triplete inmediato precedente al codon iniciador de la ORF de E2. El espacio intergénico entre la ORF de E2 y la de E3 se reduce a solo 2 nucleótidos. Por lo tanto, los genes bkd de Pseudomonas están unidos estrechamente. De forma similar, se ha clonado el operón que codifica el complejo doble BCKDH/PDH de Bacilus subtilis (Hemila y col., 1990, J. Bacterial., 172:5062-5063). Este operón contiene cuatro ORFs que codifican cuatro proteínas de 42, 36, 48, y 60 kilodaltons (kDa) de tamaño, que muestran ser muy homólogas a las subunidades E1alfa, E1beta, E2, y E3 de la agrupación bkd de Pseudomonas. Recientemente, se clonaron también y secuenciaron los genes que codifican las subunidades alfa y beta del componente E1 del complejo multienzima BCKDH/PDH doble de Bacilus estearotermofilus (los pesos moleculares estimados de las subunidades alfa y beta son aproximadamente 41.000 y 35.000, respectivamente) (Hawkins y col., 1990, Eur. J. Biochem., 191:337-346).

Adicionalmente, se ha descrito la secuencia de varias subunidades E1 alfa y beta de BCKDH (humana, bovina, y rata). Recientemente, se llevó a cabo una comparación de secuencia de aminoácidos de todas las secuencias publicadas conocidas tanto para los componentes de E1alfa como para los de E1beta de los complejos PDH y BCKDH de múltiples especies por análisis informático (Wexier y col., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). De manera interesante, se identificaron varias regiones de las subunidades alfa y beta que están muy conservadas no solamente en todas las PDH descritas hasta ahora, sino también tanto en los complejos BCKDH procarióticos como en los eucarióticos.

Describimos el clonaje de genes de alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de Streptomyces avermitilis. Los genes nuevos se clonaron usando una combinación de dos técnicas de genética molecular, la reacción en cadena de la polimerasa de ADN (PCR) y sondeo de homología. El sondeo de homología implica el cribado de bibliotecas de ADNc o genómico con sondas de oligonucleótidos sintéticos marcados radiactivamente que corresponden a secuencias de aminoácidos de las proteínas. Desafortunadamente, esta técnica tiene ciertas limitaciones, una de las cuales es la restricción bastante severa sobre la degeneración del oligonucleótido que puede usarse. Además, la hibridación por cribado se lleva a cabo a baja rigurosidad, por lo que el número de falsos positivos es a menudo elevado. Para superar algunas de las limitaciones de la hibridación de oligonucleótidos, se desarrolló recientemente una variación en el sondeo de homología que implica la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) y permite el uso de oligonucleótidos muy degenerados como sondas. Este procedimiento requiere solo un conocimiento de la secuencia de aminoácidos de dos regiones cortas (aproximadamente 7-10 aminoácidos de largo) de la proteína codificada. Dos oligonucleótidos que corresponden a cada secuencia de péptido se usan como cebadores en la reacción. Cada cebador se puede usar como una mezcla de oligonucleótidos completamente degenerados que contienen todas las combinaciones de codones posibles que podían codificar las secuencias de aminoácidos conocidas. La plantilla para la amplificación puede ser cualquiera de las varias fuentes de ADN, incluyendo el ADN genómico y formas superenrrolladas de bibliotecas de plásmidos. Varios informes, recientemente publicados en la bibliografía, han demostrado la utilidad de combinar la reacción en cadena de la polimerasa con el sondeo de homología para la identificación de un gen de múltiples especies.

Glosario

Los términos técnicos usados a lo largo de esta solicitud son bien conocidos por aquellos expertos en la materia de la genética molecular. Las definiciones de estos términos se encuentran en muchos libros de texto dedicados al campo de la biología molecular, como "Genes", Segunda Edición, por Dr. Benjamín Lewin, 1985, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York. Los términos usados frecuentemente en este documento se definen a continuación:

Antibiótico: Un agente químico que inhibe el crecimiento de células bacterianas. Usado para seleccionar células bacterianas recombinantes.

Gen de Resistencia al Antibiótico: Secuencia de ADN que confiere resistencia al antibiótico cuando se introduce en una célula huésped que es naturalmente sensible a este antibiótico particular. También conocido como marcador antibiótico.

Bacteriófagos: Virus que infectan bacterias.

ARNc: ARN de una sola banda complementario a ADN, sintetizado a partir del último por transcripción in vitro.

Cromosoma: Unidad discreta del genoma portadora de muchos genes.

Clon: Gran número de células o moléculas idénticas con un único ancestro.

Vector de Clonaje: Cualquier plásmido en el que se puede insertar un ADN foráneo para ser clonado. Transporta el ADN foráneo a una célula bacteriana huésped bajo transformación.

CoA: Coenzima A.

Secuencia Final Cohesiva (Cos): Secuencia de ADN derivada del bacteriófago lambda que permite compactación in vitro.

Cósmido: Plásmido en el que se han insertado sitios cos del bacteriófago lambda; como resultado, el ADN plásmido (portador de inserciones de ADN foráneo) se puede compactar in vitro en la cápside del fago.

Dalton: unidad de masa usada comúnmente en relación con dimensiones moleculares que corresponden a un átomo de hidrógeno.

Ligación de ADN: La formación de un enlace químico que une dos fragmentos de ADN.

Células Eucarióticas: Células de organismos superiores que contienen un núcleo rodeado por una membrana.

Agrupación de Genes: Un grupo de genes físicamente cercanos en el cromosoma.

Genoma: Conjunto de todos los cromosomas. La suma total de todos los genes de un individuo.

Hibridación. Hibridación de Colonias: Técnica usada para identificar colonias bacterianas que transportan vectores quiméricos cuyos ADN insertados son similares a alguna secuencia particular.

Kb: Abreviatura para 1.000 pares de bases de ADN o ARN.

NADH: Dinucleótido adenina nicotinamida reducido.

Conector: oligodesoxinucleótido hibridado sintético corto que contiene el sitio diana para una o más enzimas de restricción. Se añade a un vector para crear un nuevo policonector o un sitio de clonaje múltiple (MCS).

Nucleótido: bloque de construcción, o unidad monomérica, de ácidos nucleicos.

Oligonucleótido: Una cadena corta de nucleótidos.

Operón: Una unidad completa de expresión y regulación de genes bacterianos, que incluye genes estructurales, genes reguladores, y elementos de control en ADN reconocido por producto(s) de genes reguladores.

Plásmido: ADN autónomo, auto-replicante, extracromosómico circular.

Número de copias de plásmido: Número de moléculas de plásmido mantenidas en bacterias para cada cromosoma huésped.

Cebador: Secuencia corta de ADN o ARN que se aparea con una banda de ADN y proporciona un extremo 3'-OH libre en la que una ADN polimerasa comienza la síntesis de una cadena de desoxiribonucleótidos.

Células Procarióticas: Las células pequeñas, relativamente sencillas que comprenden la mayoría de los microorganismos.

Promotor: Región de ADN responsable de la iniciación de la transcripción.

Enzima de Restricción: Enzima que reconoce una secuencia corta específica de ADN y la rompe.

Secuencia de Reconocimiento de Restricción: Secuencia de ADN reconocida específicamente por una enzima de restricción particular. También conocida como sitio diana.

Vector de Transporte: Vector de Clonaje Bifuncional capaz de replicar en uno o más huéspedes alternativos (por ej., E. coli y Streptomyces).

Técnica de Hibridación tipo Southern: El procedimiento para transferir ADN desnaturalizado desde un gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa donde se puede hibridar con una sonda de ácido nucleico complementario.

Subclonaje: Transferencia de fragmentos clonados de ADN desde un tipo de vector a otro, por ejemplo, desde un cósmido recombinante a un plásmido. El nuevo plásmido recombinante se transforma después en una célula huésped apropiada para producir una cepa de subclones.

Transcripción: Síntesis de ARN a partir de un molde de ADN.

Transformación de Células Bacterianas: Describe la adquisición de nuevos marcadores genéticos por incorporación de ADN añadido.

Resumen de la invención

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un segmento de ADN aislado que codifica el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de un organismo que pertenece al género Streptomyces, comprendiendo dicho segmento de ADN la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID. NO.1, SECUENCIA ID NO.2, SECUENCIA ID NO.3, SECUENCIA ID NO.4 o la SECUENCIA ID NO.5, o una variación alélica de dichas secuencias.

Preferiblemente, dicho segmento de ADN aislado codifica el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de Streptomyces avermitilis. Más preferiblemente, dicho segmento de ADN aislado además comprende una región de ADN que regula la expresión de dicho complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada.

Preferiblemente, dicho segmento de ADN aislado según el primer aspecto de la invención además comprende una región de ADN que regula la expresión de dicho complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada.

Según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ADN recombinante que comprende un segmento de ADN como se describe anteriormente. La presente invención también proporciona una célula huésped en la que se ha incorporado dicho ADN recombinante. La presente invención también proporciona un plásmido que comprende dicho ADN recombinante.

Según un tercer aspecto, la presente invención proporciona un segmento de ADN que se selecciona de un grupo que consiste en pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 y pCD577, teniendo dichos segmentos de ADN el mapa de restricción genético mostrado en la Figura 3. La presente invención también proporciona una célula huésped en la que se ha incorporado un segmento de ADN según el tercer aspecto de la invención.

Según un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un segmento de ADN según el primer aspecto de la invención que comprende una región de ADN que regula la transcripción o traducción de la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID. NO.1, SECUENCIA ID NO.2, SECUENCIA ID NO.3, SECUENCIA ID NO.4 o la SECUENCIA ID NO.5, o una variación alélica de dichas secuencias.

Según un quinto aspecto, la presente invención proporciona los genes para el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada contenidos en un segmento de ADN según el tercer aspecto de la invención.

Según un sexto aspecto, la presente invención proporciona un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que es un subconjunto de la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID. NO.1, SECUENCIA ID NO.2, SECUENCIA ID NO.3, SECUENCIA ID NO.4 o la SECUENCIA ID NO.5, y que es capaz de hibridar con, respectivamente, la SECUENCIA ID. NO.1, SECUENCIA ID NO.2, SECUENCIA ID NO.3, SECUENCIA ID NO.4 o la SECUENCIA ID NO.5, o una variación alélica de las mismas.

Según un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado substancialmente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA ID. NO.6, SECUENCIA ID NO.7, SECUENCIA ID NO.8, o la SECUENCIA ID NO.9.

También se describe en la presente invención un procedimiento para producir una avermectina natural que comprende fermentar, bajo condiciones y en un medio de fermentación adecuado para producir dicha avermectina natural, E. avermitilis en el que el número de copias de los genes que codifican el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada se ha aumentado.

También se describe en la presente invención un procedimiento para producir una avermectina natural que comprende fermentar, bajo condiciones y en un medio de fermentación adecuado para producir dicha avermectina natural, S. avermitilis en el que la expresión de los genes que codifican el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada se ha potenciado por manipulación o reemplazo de los genes responsables de regular dicha expresión.

También se describe en la presente invención un procedimiento para producir una avermectina natural que comprende fermentar, bajo condiciones y en un medio de fermentación adecuado para producir dicha avermectina natural, S. avermitilis en el que la expresión del complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada se ha disminuido o eliminado, por ejemplo por manipulación (por ej., deleción, inactivación, o reemplazo) de los genes responsables de dicha expresión.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La secuencia de nucleótidos de los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usados para clonar un fragmento del gen E1-alfa de BCKDH de S. avermitilis. Las secuencias de aminoácidos deducidas codificadas por cada oligodesoxinucleótido se muestran encima de las secuencias de ADN correspondientes. Las flechas indican la dirección de la amplificación. La Figura 1A es un cebador hacia la derecha, y la figura 1B es un cebador hacia la izquierda.

Figura 2: Comparación de la secuencia de alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos deducidas para el fragmento genómico CD503 clonado por PCR de Streptomyces avermitilis (Sa), Bacilus estearotermofilus (Bs), Pseudomonas putida (Pp), y Homo sapiens (Hs). Las marcas verticales indican identidades de aminoácidos. Se indica la ubicación de las secuencias que corresponden a los cebadores de la PCR hacia la derecha y hacia la izquierda usados para el clonaje (arriba a la izquierda y derecha, respectivamente).

Figura 3: El mapa de restricción genómico, la ubicación y los subclones de la agrupación de genes bkd de
Streptomyces avermitilis. La caja negra debajo del mapa indica la ubicación y orientación del fragmento genómico CD503 de S. avermitilis E1-alfa-específico inicial clonado usando PCR. Se indican los subclones genómicos (derivados de pGEM-3Z). Se indican también la ubicación y organización de los genes estructurales de bkd que codifican las subunidades E1-alfa (E1a), E1-beta (E1b) y E2 de BCKDH. La polaridad de las fases de lectura abierta identificadas (indicadas por cajas) es de izquierda a derecha. Abreviaturas: B, BamH1; E, EcoR1; K, KpnI; Bg, BglII; y S, SphI.

Figuras 4A, 4B, 4C, 4D, 4E y 4F: Secuencia de nucleótidos y productos de la traducción deducidos del fragmento de ADN genómico de S. avermitilis de 2.728 pb que contiene las fases de lectura abierta (ORF's) de bkd del E1-alfa, E1-beta y E2 (parcial). La ORF de E1-alfa se extiende desde la posición 403 hasta la 1546 de la secuencia, la ORF de la E1-beta se extiende desde las posiciones 1622-2626, y la ORF de la E2 comienza en la posición 2626. Los nucleótidos se numeran en la parte superior de las líneas de secuencias. Los codones de parada se indican por un asterisco (*). Se subrayan las secuencias de unión de ribosoma Shine-Dalgarno probables. Las secuencias de reconocimiento de restricción de BamH1 están recuadradas.

Figura 5: Secuencia de nucleótidos y productos de traducción deducidos del fragmento de ADN genómico de S. avermitilis BglII-SphI de 0,8-kb (pCD539) que contiene parte de la ORF de bkd de E2. Se secuenciaron 251 pb empezando desde el sitio BglII (recuadrado). Los nucleótidos se numeran en la parte superior de las líneas de secuencias.

Figura 6: La secuencia de nucleótidos de los cebadores mutagénicos (hacia la derecha) y universales (hacia la izquierda) de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usados para construir derivados pT7 para expresión heteróloga de genes bkd de S. avermitilis en E. coli. Se usaron cebadores de PCR para introducir un sitio de restricción NdeI en el codon de inicio de la traducción de las ORFs de bkd E1-alfa o E1-beta de S. avermitilis (par cebador 55:31 y 56:30 respectivamente). Las secuencias de aminoácidos deducidas codificadas por cada oligodesoxinucleótido mutagénico se muestran encima de las secuencias de ADN correspondientes. Se indican las secuencias de reconocimiento de la restricción. Las flechas indican la dirección de la amplificación. La Figura 6A son cebadores mutagénicos hacia la derecha y la Figura 6B son cebadores mutagénicos hacia la izquierda.

Descripción detallada de la invención

Los nuevos procedimientos para clonar genes bkd de S. avermitilis y la determinación de la estructura primaria de los genes que codifican el complejo multienzima BCKDH de S. avermitilis se describen a continuación.

Primero, se diseñaron 2 cebadores de PCR, denominados "Hacia la derecha" y "Hacia la izquierda" (Figura 1), sobre regiones conservadas identificadas de un alineamiento múltiple de secuencias de péptido E1-alfa de BCKDH deducidas de varias especies y accesibles a partir de la bibliografía. Se detectó un producto de la PCR, aproximadamente de 0,2 kb de largo, por amplificación del ADN genómico de S. avermitilis usando tanto el cebador hacia la derecha como el hacia la izquierda. Este fragmento de ADN amplificado por PCR se clonó posteriormente en el vector de E. coli pGEM-3Z para producir el plásmido recombinante pCD503. Posteriormente, el plásmido pCD503 se transformó en células competentes DH5-alfa de E. coli. Se designó un transformante como cepa CD503. La secuenciación de ADN del fragmento de ADN clonado CD503 mostró la existencia de una fase de lectura abierta con un péptido deducido muy homólogo a la subunidad E1-alfa de BCKDH (Figura 2). El fragmento de ADN genómico clonado CD503 se usó después como sonda para cribar una biblioteca cromosómica de S. avermitilis por hibridación de colonias. Se identificaron cuatro cósmidos, denominados CD518, CD519, CD520, y CD521. Los análisis de restricción y de transferencia Southern mostraron que los cuatro clones llevaban fragmentos genómicos coincidentes. La secuenciación de ADN de las deleciones anidadas de fragmentos de ADN genómico subclonado (como se describe completamente en el Ejemplo Nº 8) demostró que la secuencia CD503 era parte de una agrupación de genes bkd completa. Los genes bkd de S. avermitilis clonados abarcan una región del cromosoma de aproximadamente 15 kilobases de longitud (Figura 3). El análisis de la secuencia de ADN mostró la presencia de secuencias de promotores transcripcionales putativos y genes estructurales bkd dispuestos como una agrupación organizada como sigue: secuencia de promotor, fases de lectura abierta de E1-alfa, E1-beta, y E2 (Figuras 4 y 5).

Por último, la agrupación de genes bkd de S. avermitilis completa, se clonó en el extremo 3' del promotor de T7 fuerte de Escherichia coli para la expresión en un huésped E. coli. De manera similar, las fases de lectura abierta (ORFs) de E1-alfa y E1-beta se clonaron también o bien separadamente o juntas en el extremo 3' del promotor de T7 y se probó la expresión de cada construcción. Los cebadores mutagénicos de PCR nuevos, usados para introducir el sitio de restricción NdeI único en el inicio traduccional ATG de las ORFs de E1-alfa y E1-beta, se describen completamente en el Ejemplo Nº 9 (véase también Figura 6). El estudio del sistema de expresión del plásmido doble de T7 demostró que al menos dos fases de lectura abierta de la agrupación de genes bkd de S. avermitilis derivadas de CD503 (E1-alfa y E1-beta) son traducibles completamente cuando se expresan en E. coli. Además, los ensayos enzimáticos dirigidos a analizar específicamente el componente E1 del complejo BCKDH confirmaron concluyentemente que dos de los clones de E. coli recombinantes- uno que porta la agrupación de genes bkd completa, y otro que porta las ORFs de E1-alfa y E1-beta juntas, contenían actividad de la enzima específica E1 de BCKDH (Tabla 1).

Describimos el aislamiento de los genes bkd del productor de avermectina Streptomyces avermitilis. El genoma de Streptomyces extenso (aproximadamente 10^{4} kb) es más de dos veces el de Escherichia coli. El genoma de
Streptomyces está compuesto por ADN de contenido extremadamente alto en guanosina más citosina (G+C) (haciendo un promedio de hasta 73%, con algunas regiones de > 90%), cercano al límite superior observado en la naturaleza. Estas características particulares hacen necesario el desarrollo de técnicas de ADN recombinantes específicos de estreptomicetos. Ejemplos de estos esfuerzos se pueden encontrar en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 08/048,719, presentada el 16 de abril de 1993 y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 08/032,925, presentada el 18 de marzo de 1993.

En la sección de Ejemplos se describen con todo detalle otras técnicas específicamente optimizadas para el objeto de esta invención, como la amplificación de ADN genómico por PCR, producción de deleciones anidadas, la secuenciación de ADN, y la expresión heteróloga de los genes bkd de S. avermitilis en E. coli.

Una descripción completa de las etapas experimentales implicadas en el clonaje de los genes bkd de S. avermitilis, y los resultados obtenidos, se dan a continuación:

(a) Identificación de regiones conservadas en la subunidad E1-alfa del péptido BCKDH que podrían servir como sitios candidato para la unión de cebadores de PCR

Se alinearon cuatro secuencias del péptido E1-alfa de BCKDH de humano (Fisher y col., 1988, J. Biol. Chem. 264:3448-3463), rata (Zhang y col., 1987, J. Biol. Chem., 262:15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch y col., 1988, Eur. J. Biochem., 176:311-317), y Bacilus estearotermofilus (Perham y col., 1990, Eur. J. Biochem., 191:337-346) para identificar regiones conservadas que pudieran servir como secuencias candidato para diseñar los cebadores de PCR correspondientes. Se hizo el análisis informático para identificar regiones de la subunidad E1-alfa que son muy conservadas tanto en complejos BCKDH procarióticos y eucarióticos usando los programas UneUp y Pretty del paquete de software de análisis de secuencia GCG (Madison, WI). El alineamiento múltiple de los cuatro péptidos E1-alfa de BCKDH mostró varias regiones de homología extendida (Véase Wexler, I.D. y col., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). El motivo de unión de pirofosfato de tiamina (Perham y col., 1989, FEBS Letters, 255: 77-82) situado entre los aminoácidos 182-229 de E1-alfa humano, y una región que abarca los sitios de fosforilación 1 y 2, que se extienden de los aminoácidos 245-289 estaban notablemente conservados en los cuatro péptidos E1-alfa de BCKDH analizados. También estaba presente una región descrita previamente de alta homología situada entre los aminoácidos 291-307. Esta región parece que es única para la alfa-cetoácido deshidrogenasa que tiene tanto la subunidad alfa como la beta, y no es homóloga a ninguna secuencia E1 de PDH de E. coli o los componentes E1 de los complejos alfa-cetoglutarato deshidrogenasa, de E. coli y levadura, que son dímeros compuestos de solo un único polipéptido E1. Por las razones mencionadas anteriormente, se ha sugerido que la última región de homología juega un papel en la interacción de subunidades (Patel y col., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). Las regiones conservadas elegidas para el diseño del cebador de PCR codificaban residuos aminoácidos 192 a 200, y 370 a 376 de la proteína E1-alfa de BCKDH humana.

(b) Diseño de nuevos oligonucleótidos derivados de aquellas regiones conservadas de E1-alfa de BCKDH que se van a usar como cebadores de PCR

Como previamente se trata, se seleccionaron dos regiones conservadas de la subunidad E1-alfa de BCKDH del estudio de alineamiento múltiple. El cebador de PCR hacia la derecha (Figura 1) se diseñó sobre una región que abarca los aminoácidos 192-200 de la subunidad E1-alfa de BCKDH humana- que se usó como un modelo representativo de una subunidad E1-alfa de BCKDH. Estos aminoácidos se sitúan dentro del motivo de unión de pirofosfato de tiamina. El cebador de PCR hacia la izquierda (Figura 1) se diseñó sobre una región que abarca los aminoácidos 370-376 de la subunidad E1-alfa de BCKDH. La última secuencia de aminoácidos se sitúa cerca de la región C-terminal del péptido. Se usaron las asignaciones de codones de genes de Streptomyces (F. Wright y M.J. Viv., 1992, Gene, 113:65-66). En el extremo 5' de cada cebador hay una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción (EcoRI en el cebador hacia la derecha, y XbaI en el cebador hacia la izquierda) para facilitar el clonaje de los productos de la PCR. La secuencia completa del cebador de la PCR hacia la derecha es: 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3'.

La secuencia completa del cebador de la PCR hacia la izquierda es: 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCT- C-3'.

Se subrayan las secuencias no homólogas a los genes bkd de E1-alfa e incorporadas en los cebadores con fines de clonaje (véase también Figura 1).

(c) Amplificación PCR de fragmentos de ADN genómico de S. avermitilis

El ADN genómico de S. avermitilis se amplificó enzimáticamente usando condiciones de reacción apropiadas para ADN con un alto contenido en GC, permitiendo una amplificación eficaz y específica de ADN de Streptomyces (véase Ejemplo 2). La PCR se llevó a cabo usando la combinación de cebadores descrita anteriormente (cebador hacia la derecha, 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC- 3', y el cebador hacia la izquierda, 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'). Los productos de amplificación se fraccionaron en tamaños por electroforesis en gel de agarosa. Bajo las condiciones de PCR descritas anteriormente, se detectó una banda de ADN sencilla (aproximadamente 250 pares de bases de largo) al usar esta combinación de cebadores.

(d) Clonaje del fragmento de ADN genómico amplificado en el vector de clonaje de Escherichia coli, y posterior transformación en el huésped de E. coli

Como se menciona anteriormente, se incorporó un sitio de restricción EcoRI en el cebador de la PCR hacia la derecha por conveniencia para el clonaje, y estaba presente un sitio de restricción XbaI en el extremo 5' del cebador hacia la izquierda. Sin embargo, los intentos para clonar el fragmento de la PCR de 0,25 kb usando un procedimiento de ligación en el que tanto la inserción como el vector de clonaje se digirieran con EcoRI y XbaI no fueron satisfactorios. Por lo tanto, se exploró un enfoque alternativo para clonar el fragmento de PCR de 0,25 kb, que implicaba el uso del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para producir extremos romos en el fragmento de la PCR. Se recuperó un único clon recombinante después de insertar el fragmento con extremo romo en un vector de E. coli linealizado con SmaI de extremo romo (pGEM-3Z[1+]), para producir el plásmido recombinante pCD503. Posteriormente, se introdujo el pCD503 en las células DH5-alfa competentes de E. coli por transformación. El transformante seleccionado se designó como cepa CD503. El análisis de restricción confirmante mostró que el plásmido pCD503- aislado de la cepa de E. coli CD503- en efecto contenía la inserción de 0,25 kb de S. avermitilis.

(e) Subclonaje de la inserción de ADN amplificada por PCR de 0,25 kb en el bacteriófago M13, secuenciación de ADN del fragmento clonado, e identificación de las secuencias bkd-específicas

La inserción de 0,25 kb presente en el plásmido pCD503 se subclonó en el bacteriófago M13. Para llevar a cabo esto, primero se liberó la inserción del vector de E. coli digiriendo pCD503 con EcoRI y PstI, dos enzimas de restricción cuyas secuencias de reconocimiento estaban presentes en el sitio de clonaje múltiple del vector pGEM a ambos lados de la inserción clonada. El fragmento específico se clonó después en vectores mp18 y mp19 de M13 tratados tanto con EcoRI como con PstI. El clonaje en ambos vectores asegura la posibilidad de producir ADN de banda sencilla de ambas bandas del ADN de la inserción para secuenciación. Un clon, que contenía la inserción específica, seleccionado del experimento de transfección del mp18 se denominó cepa CD505. Otro clon, que contenía también la inserción específica, pero seleccionado del experimento de transfección del mp19, se denominó CD506. La secuenciación de ADN se llevó a cabo por el procedimiento de terminación de la cadena de didesoxinucleótido, con una plantilla de ADN de banda sencilla y el kit TaqTrack (Promega). En todos los casos se secuenciaron ambas bandas de ADN-una derivada del clon CD505, la banda complementaria derivada del clon CD506-. El análisis de preferencia de codones (paquete de software de análisis de secuencia GCG, Madison, WI) de los datos de secuenciación del ADN obtenidos de los clones CD505 y CD506 mostraron la existencia de una fase de lectura abierta con el uso de codon correcto para un gen de Streptomyces.

Después, la fase de lectura abierta putativa se tradujo en una secuencia de aminoácidos usando los programas Seq y Translate del software IntelliGenetics Suite (IntelliGenetics Inc., Mountain View, California). En último lugar, se ejecutaron búsquedas de similaridad de bancos de datos con la secuencia del péptido interrogante usando el programa FASTDB del software de Intelligenetics. Todas las búsquedas de bancos de datos, ya sea la búsqueda de bancos de datos de ADN (Genbank y EMBL) o de bancos de datos de proteínas (PIR y Swiss-Prot), mostraron inequívocamente que la secuencia derivada del clon CD503 era muy homóloga pero nueva y distinta a todas las otras de los péptidos E1-alfa de BCKDH enumeradas en los bancos de datos, de origen tanto procariótico como eucariótico. Un alineamiento múltiple de las secuencias del péptido E1-alfa de BCKDH de humano, rata, Pseudomonas Putida y Bacilus estearotermofilus, y que incluye la nueva secuencia del péptido de CD503 E1-alfa de BCKDH de Streptomyces avermitilis se muestra en la Figura 2. De estos datos, se puede concluir que el producto de PCR genómico de 250 pb de S. avermitilis clonado en la cepa CD503 de E. coli representa sin duda un fragmento de gen bkd de E1-alfa nuevo.

(f) Clonaje de la agrupación de genes bkd de S. avermitilis completa, análisis por restricción y transferencia Southern, y construcción del mapa cromosómico

Un fragmento de ADN de BamHI/EcoRI de aproximadamente 0,25 kb de largo del pCD503, que porta la secuencia de ADN de S. avermitilis específica de bkd de E1-alfa se usó como una sonda marcada radiactivamente para cribar una biblioteca de cósmidos de ADN genómico de S. avermitilis por hibridación de colonias. Se identificaron y recuperaron cuatro clones (CD518, CD519, CD520, y CD521). Los análisis por restricción y transferencia Southern mostraron que los cuatro clones contienen secuencias coincidentes originadas a partir de la misma región cromosómica. La misma sonda se usó a alta restricción en transferencias Southern de ADN cromosómico digerido ATCC 31272 de S. avermitilis. El último análisis confirmó la identidad de los clones recuperados de la biblioteca genómica. En la Figura 3 Se muestra un mapa de restricción de la región genómica que contiene la secuencia de CD603 de S. avermitilis.

(g) Subclonaje de fragmentos de ADN genómico derivados de los clones CD518 y CD521, y secuenciación de ADN de la región cromosómica de S. avermitilis que porta la agrupación de genes bkd

Los fragmentos genómicos (1-2 kb de longitud) que cubren la región bkd de CD503 completa del cromosoma de S. avermitilis se subclonaron a partir de clones de biblioteca de ADN de CD521 y CD518) en el vector de E. coli pGEM-3Z. A continuación, se da una lista de los subclones construidos durante este trabajo, incluyendo una breve descripción de cada plásmido: 1. El plásmido pCD528 contiene un fragmento de BamHI de 7 kb subclonado a partir de pCD518; 2. El plásmido pCD545 contiene un fragmento de SphI de 2,3 kb subclonado a partir de pCD528; 3. El plásmido pCD550 contiene un fragmento de SphI de 6 kb subclonado a partir del pCD521; 4. El plásmido pCD559 contiene un fragmento de BamHI de 7 kb subclonado a partir del pCD521; 5. El plásmido pCD574 contiene un fragmento de SphI-BglII de 4,2 kb subclonado a partir del pCD560; y 6. El plásmido pCD577 contiene una inserción de aproximadamente 10,4 kb. Esta inserción contiene 2 fragmentos genómicos adyacentes unidos por detrás: un fragmento de SphI/BglII de 4,2 kb subclonado a partir de pCD550, y un fragmento de BglII/BamHI subclonado a partir de pCD559. El mapeo de restricción del plásmido, la hibridación de tipo Southern, y el análisis de PCR confirmaron la identidad de cada subclon. Se usó el procedimiento de terminación de cadena Sanger para la determinación de la secuencia de nucleótidos. Para este fin, fragmentos genómicos de S. avermitilis se subclonaron posteriormente en bacteriófagos M13mp18 y M13mp19 para determinar la secuencia de ambas bandas de ADN. Se aislaron varios fragmentos de restricción de ADN de los clones derivados de pGEM mencionados anteriormente y se ligaron en M13mp18 y M13mp19, y resultaron los siguientes fagos recombinantes:

CD535: fragmento de ADN de S. avermitilis de 0,4 kb clonado por PCR usando como plantilla ADN de pCD528, el cebador específico 29-PCR-EX (5'-AAGAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-3') Y el cebador Universal 31-PCR-BP (véase Ejemplo Nº 9 y Figura 6). Se restringió el fragmento amplificado con EcoRI y PstI y se clonó en ADN de M13mp18 linealizado con EcoRI/PstI.

CD536: Fragmento de ADN similar al descrito anteriormente clonado en ADN de M13mp19.

CD537: Fragmento de ADN de SalI de 1,16 kb que porta la secuencia CD503 subclonado a partir de pCD528 en M13mp18.

CD538: fragmento de ADN de SalI de 1,15 kb (situado en el extremo 5' del fragmento de SalI de 1,16 kb descrito anteriormente) clonado en M13mp18.

CD539: fragmento de ADN de BamH1/BglII de 1,5 kb subclonado a partir de pCD550 en M13mp18.

CD540: fragmento de ADN similar al descrito anteriormente clonado en la orientación opuesta en M13mp18.

CD541: fragmento de ADN de SalI/BamHI de 0,35 kb subclonado a partir de pCD528 en M13mp18.

CD542: fragmento de ADN de SalI/BamHI de 0,35 kb subclonado a partir de pCD528 en M13mp19.

CD553: fragmento de ADN de BamHI/BglII de 0,8 kb subclonado a partir de pCD550 en M13mp18.

CD554: fragmento de ADN de BamHI de 1,1 kb subclonado a partir de pCD550 en M13mp18.

CD555: fragmento de ADN similar al descrito anteriormente clonado en la orientación opuesta en M13mp18.

CD558: fragmento de ADN de BamHI/HindIII de 0,8 kb subclonado a partir de pCD553 en M13mp19.

CD561: fragmento de ADN de SalI de 1,15 kb subclonado a partir de pCD537 en M13mp18 (orientación opuesta a la presente al construir CD537).

CD565: fragmento de ADN de SalI de 1,15 kb subclonado a partir de pCD537 en M13mp19.

CD566: fragmento de ADN de SalI de 1,16 kb subclonado a partir de pCD537 en M13mp19 (orientación opuesta a la presente al construir CD565).

CD567: fragmento de ADN de SalI de 1,15 kb subclonado a partir de pCD538 en M13mp19.

CD582: fragmento de ADN de BamHI/BglII de 0,8 kb subclonado a partir de pCD550 en M13mp18 (orientación opuesta a la presente en CD553).

Las inserciones genómicas de S. avermitilis que portan estos clones se acortaron posteriormente por tratamiento con Exonucleasa III para proporcionar una serie de subclones ("deleciones anidadas", véase Ejemplo Nº 8).

(h) Análisis informático de los datos de secuenciación de ADN obtenidos a partir de fragmentos de ADN clonados e identificación de las fases de lectura abierta de bkd de E1-alfa, E1-beta, y E2 de S. avermitilis

La secuencia de nucleótidos de la región genómica de S. avermitilis de 2,7 kb que contiene los genes bkd se muestra en la Figura 4. El análisis de la composición base corrediza de la región genómica de 2,7 kb que contiene las fases de lectura abierta (ORFs) de bkd de E1-alfa, E1-beta y E2 (parcial) se llevó a cabo usando el software "DNA inspector". Este análisis proporcionó un perfil de la media procesada del contenido en G+C usando una longitud de alargamiento de 30 bases y un valor de desviación de 20. El contenido total en G+C correspondiente a esta región del cromosoma de S. avermitilis era del 72%. Un valle de G+C bajo (contenido en G+C aproximadamente 50%)-indicativo de una región promotora- se situaba inmediatamente en el extremo 5' de las Fases de Lectura Abierta de bkd.

Se analizó también el contenido en G+C como función de la posición del codon. Se detectaron las fases de lectura abierta usando el programa "CodonPreference" (Genetics Computer Group, Madison, WI) con una tabla de uso del codon de Streptomyces para 64 genes (F. Wright y M. J. Bibb., 1992, Gene, 113:55-65). El programa CodonPreference es un buscador de genes específico de fase que intenta reconocer secuencias de codificación de proteínas en virtud de su similitud con una tabla de frecuencia de codones o por la tendencia de su composición (normalmente GC) en la tercera posición de cada codon. Las ORFs se mostraron como cajas debajo del trazado de sus respectivas fases de lectura abierta. Se detectaron también todos los codones de inicio (ATG) y de terminación (líneas verticales). Los codones raros encontrados en cada fase de lectura se marcaron debajo de cada trazado de la ORF. El contenido en G+C se calculó usando una ventana corrediza de 25 codones, por lo que se esperaba un retraso de aproximadamente 25 codones antes del impacto total de una región codificante de proteína. Se obtuvieron tres perfiles, como sigue: 1, Primera posición en triplete; 2, segunda posición en triplete; 3, tercera posición en triplete. Como resultado de este análisis, se localizaron tres ORFs de bkd, correspondientes a las siguientes subunidades de BCKDH: E1-alfa, E1-beta, E2 (Figuras 4 y 5).

(i) Diseño de nuevos nucleótidos para usarlos como cebadores de la mutagénesis dirigida basada en PCR

La mutagénesis dirigida basada en el conector o PCR se usó para introducir un sitio de restricción NdeI en el sitio de inicio traduccional ATG de las ORFs de E1-alfa y E1-beta. Se diseñaron los siguientes oligonucleótidos nuevos (véase también Ejemplo Nº 9 y Figura 6):

Cebadores universales (Vector) hacia la izquierda:

30-PCR-BP: 5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3'

31-PCR-BP: 5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3'

Cebadores mutagénicos hacia la derecha

55-PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3'

55-PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3'

(j) Mutagénesis dirigida de genes bkd de S. avermitilis para crear un nuevo sitio de restricción NdeI en el extremo 5' de una fase de lectura abierta

Los plásmidos de expresión eran derivados del plásmido pT7-7 (véase S. Tabor, 1990. en Current Protocols in Molecular Biology, Págs. 16.2.1-16.211. Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York) que porta ORFs de E1-alfa, E1-beta, E1-alfa más E1-beta, o la agrupación de genes bkd de S. avermitilis completa. Se crearon sitios de restricción NdeI por mutagénesis dirigida basada en PCR. Se construyeron cinco plásmidos de expresión para este estudio como sigue:

Plásmido pCD670: Derivado de pT7-7 que porta la fase de lectura abierta (ORF1) de bkd de E1-alfa de S. avermitilis. Se introdujo un sitio de restricción NdeI que abarcaba el codon de inicio ATG en el gen bkd de E1-alfa de S. avermitilis por amplificación y mutagénesis concomitante usando el cebador mutagénico de PCR 55-PCR (véase Ejemplo Nº 9 y Figura 6).

Plásmido pCD666: Derivado de pT7-7 que porta la fase de lectura abierta (ORF2) de bkd de E1-beta de S. avermitilis. Se introdujo un sitio de restricción NdeI que abarcaba el codon de inicio ATG en el gen bkd de E1-beta de S. avermitilis por amplificación y mutagénesis concomitante usando el cebador mutagénico de PCR 56-PCR (véase Ejemplo Nº 9 y Figura 6). Para lograr una expresión óptima de esta ORF, se cambió la tercera posición del codon 7 de C a G para producir un sinónimo del codon que se pareciese a la utilización del codon de E. coli. La secuencia del péptido E1-beta no se afectó por este cambio.

Plásmido pCD736: Derivado de pT7-7 que porta juntas las ORFs tanto de E1-alfa(ORF1) como de E1-beta (ORF2) bajo el control del promotor de T7.

Plásmido pCD705: Similar al pCD736 pero con la mitad 3' de la ORF de E1-beta situada en la orientación incorrecta. Esta construcción se usó como control negativo en experimentos de expresión.

Plásmido pCD685: Derivado de pT7-7 que porta la agrupación de genes bkd completa de S. avermitilis.

(k) Expresión de las fases de lectura abierta de bkd de S. avermitilis en E. coli usando el sistema de expresión del plásmido doble T7

La expresión de los genes bkd de S. avermitilis en E. coli se consiguió usando el sistema de plásmido doble ARN polimerasa/promotor de T7 esencialmente como describe S. Tabor (1990, en Current Protocols in Molecular Biology, pp. 16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Se analizaron derivados de C600 (pGP-1) de E. coli que contenían las diferentes construcciones de pT7-7. Se usó electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para controlar la expresión de las ORFs de S. avermitilis en el huésped E. coli después de la inducción de calor. El análisis SDS-PAGE del perfil de proteína bajo inducción mostró una sobreexpresión de péptidos inducidos con un tamaño similar al valor predicho (como se deduce de la secuencia de ADN correspondiente) para las ORFs de E1-alfa y E1-beta, como sigue:

	Tamaño previsto (Da)	Tamaño observado (Da)
ORF1 (E1-alfa)	41.000	41.000
ORF2 (E1-beta)	35.000	34.000

(l) Detección de la actividad E1 de BCKDH de S. avermitilis por ensayo específico en extracto crudo de clon de E. coli recombinante

La Tabla I, (ejemplo 11) dada a continuación, resume estos resultados. Los ensayos de BCKDH específicos de E1 llevados a cabo en extractos crudos de células de E. coli que portan pCD735 mostraron actividad E1 significativa bajo inducción del promotor de T7. Un cultivo similar portador de una construcción con parte de la inserción situada en la orientación incorrecta (pCD705), mostró un nivel de actividad fondo.

Además, los ensayos enzimáticos indicaron que los extractos crudos de la cepa de E. coli que contenían el plásmido pCD685 también tienen una actividad E1 de BCKDH significativa (>10 veces el nivel del fondo). Se analizó también un cultivo no inducido de este clon y mostró un nivel de actividad basal 2 veces por encima del fondo. El último resultado se espera ya que se conoce que el sistema T7 permite un bajo nivel de expresión constitutiva de los genes clonados incluso bajo condiciones de no inducción.

La agrupación de genes bkd de Streptomyces avermitilis clonada es útil para mejorar la producción de avermectina natural aumentando el número de copias de esos genes u optimizando su expresión en cepas de producción. Un posible enfoque para conseguir una expresión eficaz de los genes bkd clonados implica la inserción de estos genes en un vector de transferencia E. coli/Streptomyces multicopia (por ej., plásmido pCD262, Denoyn C. D., 1993, "Novel Bacterial Plasmids Shuttle Vectors for Streptomyces and Escherichia coli", Solicitud de Patente de Estados Unidos 08/032,925, presentada el 18 de marzo de 1993) de tal manera que los genes se transcriben a partir de un promotor más fuerte. Este procedimiento asegurará la transcripción eficaz de los genes. Además, se pueden crear ciertas estrategias para garantizar una expresión eficaz. Éstas incluyen (a) la fortaleza del promotor; (b) la estabilidad del ARNm; (c) la presencia o ausencia de factores reguladores; (d) la inducibilidad; y (e) la mutagénesis dirigida para mejorar el reconocimiento de ribosomas y las señales de iniciación de la traducción. La expresión de los genes bkd puede también optimizarse reemplazando el promotor de tipo salvaje y las regiones reguladoras con diferentes promotores por técnicas de reemplazo de genes. Existen muchos ejemplos de promotores útiles en la bibliografía que se podrían emplear para optimizar la expresión de los nuevos genes bkd de S. avermitilis descritos aquí. Por ej., el promotor fuerte ermE (Hopwood y col., 1985, "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, U.K.) y el promotor tipA inducible por tiostreptona (Murakami y col., 1989, J. Bacterial, 171, 1459-1468). Adicionalmente, la inactivación de los genes bkd, y la ausencia concomitante de actividad BCKDH, por deleción o mutagénesis dirigida usando técnicas de reemplazo de genes desarrollará cepas bkd bloqueadas irreversiblemente de Streptomyces avermitilis que son útiles en la producción de nuevas avermectinas.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos detallados de los procedimientos experimentales usados para clonar y analizar los genes bkd de Streptomyces avermitilis, que se ilustran también en las Figuras que los acompañan. Los detalles adicionales de técnicas patrón, que son bien conocidas por aquellos expertos en biología molecular, y la denominación de las enzimas particulares usadas, se describen, por ejemplo, en el manual de laboratorio "Molecular Cloning by Maniatis" y col (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Ejemplo 1 Preparación de ADN genómico de S. avermitilis

El micelo ATCC 31272 de S. avermitilis se cultivó como un césped confluente sobre medio de agar YPD-2 durante 7 días a 29ºC. El medio comprendía:

Extracto de Levadura Difco	10 gramos
Bacto-peptona Difco	10 gramos
Dextrosa	5 gramos
Bacto agar Difco	20 gramos
Acetato de sodio	2 gramos
MOPS	10 gramos
pH ajustado a 7,0.
Volumen final: 1 L
Autoclavado durante 25 minutos a 121ºC.

El micelo cultivado se usó después para inocular 30 ml de medio AS-7 (véase Hafner y col., 1988, Solicitud de Patente Europea Nº 88300353.5, publicación Nº 0284176) en un matraz aforado de 300 ml, que se mantuvo con agitación (230 rpm) a 29ºC durante 24 horas. El medio comprendía:

Almidón afinado^{1}	20 gramos
pH Ardamina^{2}	5 gramos
Pharmamedia^{3}	15 gramos
Carbonato de calcio (CaCO_{3})	2 gramos
pH ajustado a 7,2 con hidróxido de sodio (NaOH).
Volumen final: 1 L
Autoclavado durante 25 minutos a 121ºC.
^{1} Preparado por hidrólisis de almidón por alfa-amilasa de Bacilus liqueniformis a equivalente de
dextrosa de aproximadamente 40%.
^{2} De Yeast Products, Inc, Clifton, NJ 07012.
^{3} De Traders Protein, Memphis, TN 38108.

Se usaron Aproximadamente 0,3 ml del cultivo anterior para inocular otro matraz aforado de 300 ml que contenía 30 ml de medio líquido modificado Yeast Extract Malt Extract (YEME) (Viv., M.J., Freeman, R.F., y D.A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154:155-166). El medio YEME modificado contenía por litro:

Extracto de levadura Difco	3 gramos
Bacto-peptona Difco	5 gramos
Extracto de Malta oxoide	3 gramos
Sacarosa	300 gramos
Glucosa	10 gramos
Autoclavado durante 40 minutos a 121ºC.

Se añadieron 2 ml de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl_{2}\cdot6H_{2}O) 2,5 M después del autoclavado.

Volumen final ajustado a 1 L.

Se crecieron cultivos durante 48-72 horas a 29ºC. Se recuperó el micelo por centrifugación y se preparó el ADN genómico siguiendo el protocolo "Aislamiento de ADN total de Streptomyces por Centrifugación en Gradiente de Cloruro de Cesio: Procedimiento 2" como se encontró en el libro de texto "Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985, escrito por Dr. D. A. Hopwood y col. Los sedimentos se resuspendieron en 3 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).

Ejemplo 2 Amplificación de ADN genómico de S. avermitilis por reacción en cadena de la polimerasa

El ADN genómico de S. avermitilis se amplificó enzimáticamente usando un Ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus. La reacción PCR se llevó a cabo con polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus) y el tampón suministrados por el fabricante en presencia de dNTP 200 \muM, glicerol 15%, 0,5 \muM de cada cebador, 50 ng de ADN plantilla (en este caso, ADN genómico de S. avermitilis), y 2,5 unidades de enzima en un volumen final de 100 \mul durante 30 ciclos. El perfil térmico del primer ciclo fue: 95ºC durante 3 min (etapa de desnaturalización), 55ºC durante 2 min (etapa de alineamiento), y 72ºC durante 2 min (etapa de extensión). Los 29 ciclos posteriores tenían un perfil térmico similar excepto que la etapa de desnaturalización se acortó a 1,5 min. Los cebadores de ADN los suministró Genocys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador hacia la derecha (Figura 1) era 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC- 3', y el cebador hacia la izquierda (Figura 1) era 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'. Los productos de amplificación se fraccionaron en tamaños por electroforesis en gel de agarosa. A la muestra de PCR se le hizo electroforesis en un gel de agarosa al 1,6% horizontal en tampón 1X TBE (Tris-HCl 90 mM, pH 8,5, ácido bórico 90 mM ácido etilendiamentetraacético 2,5 mM (EDTA) durante 1,5 horas a 100 V como describe Maniatis y col. Los productos de ADN de la PCR separados se localizaron en el gel por tinte con bromuro de etidio y visualización de bandas fluorescentes con una luz ultravioleta de 365 nm. Bajo las condiciones de PCR descritas anteriormente, cuando se usó esta combinación de cebadores se detectó una banda de ADN sencilla (aproximadamente 250 pares de bases de largo).

Ejemplo 3 Clonaje de un fragmento de ADN genómico de S. avermitilis de 0,25 kb amplificado por PCR en el vector de E. coli, y posterior transformación en el huésped E. coli A. Recuperación del producto de PCR de 0,25 kb

Como se menciona anteriormente, el fragmento de ADN de 0,25 kb se amplificó por PCR usando ADN genómico de S. avermitilis como plantilla y la combinación del cebador hacia la derecha más el hacia la izquierda. Como se muestra en la Figura 1 el cebador hacia la derecha tiene un sitio de reconocimiento de EcoRI situado en el extremo 5' y el cebador hacia la izquierda tiene un sitio de reconocimiento de XbaI en el extremo 5'. Sin embargo, no tuvieron éxito los intentos para clonar el fragmento de PCR de 2,5 kb usando un procedimiento de ligación en el que tanto la inserción como el vector de clonaje estaban digeridos con EcoRI y XbaI. Por lo tanto, se exploró un enfoque alternativo para el clonaje del fragmento de PCR de 0,25 kb, que implica el uso del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para producir extremos romos en el fragmento de PCR. Siguiendo la amplificación (como se describe en el Ejemplo 2), aproximadamente 80 \mul de la reacción PCR se extrajeron dos veces con fenol-cloroformo, dos veces con éter, y después, el producto de ADN de la PCR se precipitó con etanol como se describe previamente. El ADN se resuspendió en 18,5 \mul de H_{2}O. Después, se añadieron 2,5 \mul de tampón de traducción Nick 10 x (Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2, sulfato de magnesio (MgSO4) 0,1 M, ditiotreitol 1 mM, albúmina de suero bovino 500 \mug/ml) (Maniatis y col., 1989) y 20 unidades del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (Boehringer Mannheim Biochemicals) y se incubó la mezcla a 37ºC durante 5 minutos. Después se añadió 1 \mul de dNTP 2 mM (2 mM cada uno de los dNTP) y la reacción se incubó además a temperatura ambiente durante 15 minutos. La reacción de reparación se paró añadiendo 1 \mul de EDTA 0,5 M, pH 8,0, y el contenido total de la mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa al 1,5% y se hizo electroforesis. El fragmento de ADN de 0,25 kb se visualizó como se describe anteriormente y se recuperó por electroelución como sigue: la banda de ADN de 0,25 kb se retiró con una cuchilla de afeitar y el ADN se recuperó del gel de agarosa por electroelución durante 35 min a 80 V en un pocillo en forma de V cargado con acetato de amonio 10 M usando un electroeluyente unidireccional (International Biotechnology Inc., New Haven, CT). El ADN se precipitó después con etanol, se sedimentó y por último se redisolvió en 20 \mul de tampón de ADN (Tris-HCl 10 mM, cloruro de sodio (NaCl) 4mM, EDTA 0,1 mM; pH 7,5).

B. Digestión con SmaI y defosforilación del vector del plásmido pGEM-3Z

Se incubaron aproximadamente 1 \mug del plásmido pGEM-3Z(+) (Promega Corp., Madison, WI) y 2 unidades de la enzima de restricción SmaI (todas las enzimas de restricción se compraron a Boehringer Mannheim Biochemicals) en el tampón de ensayo especificado por el suministrador, a 25ºC durante 3,5 horas, en un volumen de reacción total de 40 microlitros (\mul) para producir moléculas de extremos romos lineales. Después, el vector linealizado con SmaI se defosforiló usando fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP) (comprada a Promega Corp., Madison, WI) siguiendo las instrucciones obtenidas del suministrador. La mezcla de reacción se incubó durante 35 min, a 37ºC, y el ADN se extrajo después dos veces con un volumen igual de fenol-cloroformo, dos veces con un volumen igual de éter, y por último se precipitó el ADN añadiendo 2 volúmenes de etanol absoluto. El ADN precipitado se recuperó por centrifugación a 10.000 x G durante 10 min, y se secó bajo vacío. El sedimento final se redisolvió en 20 \mul de tampón de ADN.

C. Ligación para producir pCD503

Se incubaron aproximadamente 9 \mul del producto de ADN de PCR de 0,25 kb tratado con Klenow, y aproximadamente 1 \mul del pGEM-3z(+) linealizado con SmaI, defosforilado con CIAP, con los extremos romos durante la noche con 1 unidad de ligasa (New England Biolabs, IC, Beverly, MA) bajo las condiciones especificadas por el suministrador a 14ºC en un volumen de reacción total de 20 \mul. La reacción se terminó colocando el microtubo de ensayo en hielo y entonces se usaron 15 \mul de la mezcla de reacción para transformar células JM109 competentes de E. coli siguiendo el procedimiento patrón como describe Maniatis y col, 1989. Se recuperaron muchos transformantes resistentes a ampicilina. El vector del plásmido pGEM-3Z(+) contiene un segmento de ADN derivado del operón lec de Escherichia coli que codifica el fragmento amino terminal de la beta-galactosidasa (Yanisch-Perron.C., Vieira, J. Messing, 1985, Gene, 33, 103). Este fragmento, cuya síntesis puede inducirse por isopropiltio-beta-D-galactosidasa (IPTG), es capaz de la complementación intra-alélica (alfa) con una forma defectuosa de la beta-galactosidasa codificada por el huésped. Las células de E. coli expuestas al inductor IPTG sintetizan ambos fragmentos de la enzima y forman colonias azules cuando se siembran en placas en medio que contiene el substrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactosidasa (X-gal). La inserción de ADN foráneo en el sitio de policlonaje del plásmido inactiva el fragmento amino terminal de la beta-galactosidasa y suprime la complementación alfa. Por lo tanto, las bacterias que portan los plásmidos recombinantes producen la aparición de colonias blancas. Se recuperaron numerosas colonias blancas de este experimento de transformación. Estas colonias deberían contener el plásmido pCD503. Esto se confirmó seleccionando una colonia, denominada como cepa CD503, y analizándola adicionalmente. Se inoculó una única colonia bacteriana de la cepa CD503 de E. coli en medio líquido Luria-Bertani que contenía 50 \mug/ml de ampicilina siguiendo los procedimientos microbiológicos patrón. El medio LB comprendía:

Bacto-triptona	10 gramos
Extracto de Bacto-levadura	5 gramos
NaCl	10 gramos
pH ajustado a 7,0 con hidróxido de sodio (NaOH) 5N.
Volumen final de la solución ajustado a 1 L.
Esterilizado por autoclave durante 20 min a 121ºC.

El cultivo se incubó a 35ºC durante la noche. La siguiente mañana, las células bacterianas se recogieron por centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min. a 4ºC. El vector plásmido se aisló de células CD503 de E. coli recién recogidas usando una modificación del procedimiento de Birnboim y Doly (Nucleic Acids Res., 1979, 7:1513), como describe Denoya y col. 1985, Microblos Lett., 29:87. El ADN plásmido aislado se disolvió por último en tampón de ADN (Tris-HCl 10 mM, NaCl 4 mM, EDTA 0,1 mM; pH 7,5) para producir una concentración de aproximadamente 1 \mug de pCD503 por 10 \mul de tampón. Confirmando los análisis de restricción, el usar enzimas de restricción EcoRI y PstI, mostró que, como se esperaba, el pCD503 portaba la inserción de ADN de 0,25 kb.

Ejemplo 4 Preparación de sondas de ADN y ARN marcadas radiactivamente A. Preparación de sondas de ADN de doble banda marcadas uniformemente

Las sondas de ADN de doble banda se prepararon por traducción nick (véase Maniatis y col., 1989, para una descripción general de esta técnica). Primero, se preparó un fragmento de ADN específico que portaba la secuencia diana por digestión de restricción apropiada y purificación por electroelución esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Aproximadamente 1 \mug de ADN se marcó en cada caso usando [alfa-^{32}P]dCTP (sal de desoxicitidina 5'-trifosfato, tetra(trietilamonio), [alfa-^{32}P]-) comprado a NEN-Dupont, y el Sistema de Traducción BRL Nick comprado a BRL Life Technologies, Inc., siguiendo las instrucciones obtenidas del suministrador. Una reacción típica se llevaba a cabo en un volumen de 50 \mul. Después de la adición de 5 \mul de tampón Stop (como se describe en el procedimiento recomendado de BRL), el ADN marcado se separó de nucleótidos no incorporados usando la columna de presión de Stratagen siguiendo el manual de instrucciones obtenido del suministrador. El ADN marcado con ^{32}P con una actividad específica en gran exceso de 10^{8} cpm/\mug se obtuvo rutinariamente siguiendo estos procedimientos.

B. Preparación de sondas de ARN de banda sencilla marcadas

Las sondas de ARN marcadas con ^{32}P se prepararon por transcripción in vitro usando el sistema de transcripción Riboprobe Gemini (Promega). Un fragmento purificado del ADN diana se clonó en el vector transcripcional pGEM-3Z usando procedimientos patrón. La preparación del ADN plásmido plantilla para reacciones de transcripción in vitro se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 3, pero incluyendo una etapa de precipitación con polietilenglicol (PEG) para retirar selectivamente nucleótidos pequeños que pueden contaminar estas preparaciones, como sigue: después de la etapa de precipitación con etanol, se resuspendió el sedimento en 520 \mul de agua. Después se añadieron 100 \mul de NaCl 5 M y 620 \mul de PEG al 13% (PM 6.000-8.000). Después de la mezcla, el tubo se incubó en hielo durante 1 hora y se sedimentó el ADN a 4ºC a 10.000 x G durante 15 min. El sedimento se lavó una vez con 500 \mul de etanol frío al 80% y se resuspendió como de costumbre. Se linealizó aproximadamente 1 \mug de ADN plásmido plantilla usando las enzimas de restricción o bien SacI o HindIII, y posteriormente se transcribió in vitro usando la ARN polimerasa dependiente de ADN del bacteriófago SP6 o T7, respectivamente. En esta reacción se usó sal de Histidina 5'-trifosfato tetra(trietilamonio), [alfa-^{32}P] comprada a NEN-Dupont. Las condiciones de reacción se siguieron como el suministrador recomendó. Después de la incubación, la mezcla de reacción se trató con una unidad de ADNasa-RQ1 (Promega) para degradar la plantilla de ADN, se extrajo dos veces con fenol-cloroformo, y después se precipitó con etanol siguiendo procedimientos patrón. El sedimento se secó y se resuspendió en 20 \mul de agua libre de ARNasa (Promega). Una alícuota pequeña del tránscrito de ARN marcado se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida-agarosa como describe Denoya y col., 1987, J. Bacterial., 169:3857-3860. Bajo las condiciones descritas aquí, los transcritos de longitud completa marcados se obtuvieron de forma rutinaria.

Ejemplo 5 Análisis de ADN genómico de S. avermitilis por hibridación Southern

Aproximadamente 10 \mug de ADN genómico de S. avermitilis purificado se digirió con 2 unidades de la enzima de restricción BamH1 a 37ºC durante un mínimo de 2 horas. Al final de la digestión, los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% (véase Ejemplo 1A), y se transfirieron durante la noche a una membrana de nylon (tamaño de poro 0,45 \mum) (membranas Schleicher y Schuell Nutran) usando el procedimiento de transferencia por capilaridad (Southern, E.M.., 1975, J. Mol. Biol., 98:503). Al día siguiente, las membranas de nylon se envolvieron en una envoltura de plástico y el lado de ADN de cada membrana se expuso a una fuente de irradiación ultravioleta (302 nm) para fijar el ADN a la membrana. La hibridación de las sondas de ARN o ADN marcadas radiactivamente con ADN inmovilizado en membranas de nylon se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito en Maniatis y col. (1989). La prehibridación y la hibridación se llevaron a cabo a 42ºC. La solución de hibridación contenía: 8 x SSC (1x: cloruro de sodio (NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,0), 10 x reactivo Denhardt's [1x:ficol 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, albúmina de suero bovino 0,02%], SDS 1% (sodio dodecil sulfato), ADN de esperma de salmón desnaturalizado, fragmentado 100 \mug/ml, ARNt de E. coli 100 \mug/ml, y formamida al 50% (Fluka). Después de la hibridación durante la noche, las membranas se lavaron como sigue: dos lavados con 1 xSSC, SDS 0,1%, a temperatura ambiente durante 15 minutos, y dos lavados con 0,1 x SSC, SDS 0,1% a 42ºC durante 15 minutos. En algunos experimentos la hibridación se llevó a cabo a 65ºC en ausencia de formamida, y se usó SSPE (1x: NaCl 0,18 M, fosfato de sodio (NaPO_{4}) 10 mM, pH 7,7, EDTA 1 mM) en lugar de SSC. Por último, las membranas se expusieron a película de rayos X para obtener una imagen autoradiográfica.

Ejemplo 6 Clonaje del fragmento genómico de CD503 de S. avermitilis de 0,25 kb en el bacteriófago M13 y secuenciación de ADN

El fragmento de ADN de CD503 de S. avermitilis de 0,25 kb se clonó en los bacteriófagos M13mp18 y M13mp19 para la preparación de un ADN recombinante de banda sencilla para usarlos como plantillas en el procedimiento de secuenciación dideoxi de Sanger (Sanger y col., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467). Aproximadamente 2 \mug de plásmido pCD503, preparado siguiendo un procedimiento miniprep como se describe anteriormente, se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y PstI para liberar la inserción genómica de S. avermitilis de 0,25 kb. Previamente, los análisis de restricción mostraron que el pCD503 digerido con EcoRI o con PstI solo era lineal. Este análisis demostró que la inserción de 0,25 kb no contenía sitios de reconocimiento ni de EcoRI ni de PstI. A la mezcla de digestión se le hizo electroforesis en gel de agarosa al 1,2%, y el fragmento de 0,25 kb se electroeluyó y se precipitó como se describe anteriormente. Además, aproximadamente 1 \mug de cada uno de los ADN de formas replicativas (RF) de doble banda purificados de M13mp18 y M13mp19 se digirieron doblemente con EcoRI y PstI, se defosforilaron con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP) (comprada a Promega Corp., Madison, WI), y por último se ligaron al fragmento de ADN de 0,25 kb como se describe previamente. Los vectores de clonaje RF M13 purificados se compraron a New England Biolabs. Las mezclas de ligación se usaron para transfectar células JM109 competentes de E. coli. Se seleccionaron una única placa blanca de la transfección de mp18, y una única de la transfección de mp19, se crecieron en fago y se preparó ADN de banda sencilla como se describe (Maniatis y col., 1989). La secuenciación de ADN de cada plantilla de ADN de banda sencilla se llevó a cabo usando el cebador de secuenciación M13-específico 40 (New England Biolabs, catálogo Nº 1212), desoxiadenosina 5'-[alfa-tio]trifosfato, [^{35}S] (NEN-Dupont), y el kit de secuenciación TaqTrack (promega), siguiendo las instrucciones proporcionadas por el suministrador (Promega). Los datos de secuenciación de ADN del fragmento genómico de pCD503 de S. avermitilis se muestran en la Figura 4.

Ejemplo 7 Clonaje de la agrupación de genes de S. avermitilis bkd completa y construcción del mapa cromosómico

Aproximadamente 5 \mug de pCD503 purificado se restringieron doblemente usando las enzimas de restricción tanto BamHI como EcoRI, los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2%, un fragmento de ADN de aproximadamente 0,25 kb de largo que porta la secuencia específica para el gen bkd de E1-alfa de S. avermitilis se recuperó por electroelución, y se marcó por traducción nick esencialmente como se describe anteriormente. El fragmento de ADN marcado con [^{32}P] se usó después como sonda para cribar una biblioteca de cósmidos genómicos de S. avermitilis. Se puede encontrar una descripción detallada de la preparación de bibliotecas genómicas en general en Molecular Cloning A Laboratory Manual por Maniatis y col. (1989). Se presenta una descripción completa de la preparación de la biblioteca cromosómica de Estreptomicetos en Genetic Manipulation of Streptomyces- A Laboratory Manual por Hopwood y col. (1985). Se encuentra una descripción del vector cósmido en "Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning" de Denoya C.D., Solicitud de Patente de Estados Unidos 08/048,719. presentada el 16 de abril de 1993. Se identificaron cuatro clones después de cribar más de 2200 clones de biblioteca recombinantes. Los cuatro clones hibridantes (registrados como clones de E. coli CD518, CD519, CD520, y CD521) se crecieron en medio LB bajo presión selectiva de ampicilina. El plásmido se preparó a partir de cada cultivo como se describe anteriormente. Los análisis de restricción y de hibridación por transferencia de tipo Southern mostraron que los cuatro clones estaban relacionados, con regiones cromosómicas coincidentes. Se obtuvo un mapa de restricción genómico de S. avermitilis, que cubre la región cromosómica completa incluyendo la secuencia CD503, siguiendo procedimientos patrón, y se presenta en la Figura 3.

Ejemplo 8 Generación de conjuntos anidados de mutantes de deleción para secuenciación de ADN dirigida de la región cromosómica de S. avermitilis que porta la agrupación de genes bkd

Se generaron Conjuntos Anidados de mutantes de deleción que carecen progresivamente de más nucleótidos de un extremo o del otro de los ADN diana bkd de S. avermitilis usando Exonucleasa III siguiendo procedimientos esencialmente similares a los descritos por Henikoff, S. (1987, Methods Enzymol., 156:158). Para crear mutantes de deleción unidireccionales, el ADN de doble banda de cada ADN de la forma replicativa del bacteriófago M13 recombinante se digirió con dos enzimas de restricción, ambas con sitios de fragmentación entre un extremo del ADN diana y el sitio de unión al cebador. La encima de restricción que fragmentó más cerca de la secuencia diana generó un extremo romo o un extremo 3' recombinado; la otra enzima generó un extremo 3' prominente. La exonucleasa III cataliza la retirada en etapas de los mononucleótidos de 5' a partir de un extremo 3'-hidroxilo recombinado o romo de ADN de doble banda. Sin embargo, las terminaciones 3' protuberantes son completamente resistentes a la actividad de la enzima. Por lo tanto, solo un extremo del ADN lineal resultante era susceptible a la exonucleasa III y la digestión tuvo lugar unidireccional lejos del sitio de fragmentación en las secuencias de ADN diana.

Como ejemplo, a continuación se da la descripción de la preparación de deleciones anidadas de pCD565. El plásmido pCD565 es un derivado RF de M13 mp19 que porta un fragmento SalI de 1,15 kb que contiene parte de la fase de lectura abierta de bkd de E1-alfa de S. avermitilis. El plásmido pCD565 se purificó por centrifugación de equilibrio en gradientes de cloruro de cesio y bromuro de etidio como describe Maniatis y col. (1989). La exonucleasa III es capaz de iniciar la digestión a partir de sitios nick de banda sencilla, por lo que es importante usar una preparación que contenga menos del 10% de moléculas circulares relajadas. Aproximadamente 10 \mug del plásmido pCD565 (véase sección "Descripción detallada de la Invención") se digirieron doblemente con las enzimas de restricción SacI y XhaI a 37ºC durante 4 horas, después se extrajeron con fenol-cloroformo y éter, y se precipitaron con etanol como se describe anteriormente. El sedimento se resuspendió en 60 \mul de tampón de reacción de exonucleasa III (10 x tampón de exonucleasa III: Tris-HCl 0,66 M, pH 8,0, cloruro de magnesio (MgCl_{2}) 56 mM. La solución de ADN se incubó después a 37ºC en presencia de 300 unidades de exonucleasa III (Ambion Inc.), y se retiraron alícuotas de 2,5 \mul a intervalos de 30 segundos. Las muestras se incubaron después con nucleasa S1 y se analizaron alícuotas de cada una de las muestras por electroforesis en gel de agarosa. Las muestras que contenían fragmentos de ADN del tamaño deseado se juntaron. El ADN se reparó usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, se ligó durante la noche, y se transfectó a células JM109 competentes de E. coli. Los tamaños de las inserciones en clones recuperados se analizaron por restricción con EcoRI/HindIII y electroforesis en gel de agarosa. Se seleccionaron cinco genes para secuenciación: 565-D19 (1,1 kb), 565-D7 (0,88 kb), 565-d24 (0,77 kb), 565-D1 (0,61 kb), y 565-D16 (0,36 kb). Se preparó ADN de banda sencilla a partir de cada uno de estos clones y se secuenció como se describe anteriormente.

Ejemplo 9 Construcción de los plásmidos pCD670, pCD666, pCD736, y pcD685 para usarlos en la expresión de los genes bkd de S. avermitilis en E. coli

La expresión de los genes bkd de S. avermitilis en E. coli se consiguió usando el sistema de plásmido dual ARN polimerasa/promotor de T7 esencialmente como describe S. Tabor (1990. en Current Protocols in Molecular biology, págs. 16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Willey-Interscience, Nueva York).

A. Construcción de pCD670 que porta la ORF de bkd de E1-alfa de S. avermitilis

Se introdujo un sitio de restricción NdeI que abarcaba el codon de inicio ATG en el gen bkd de E1-alfa de S. avermitilis usando un procedimiento basado en PCR. La plantilla para la PCR fue el plásmido pCD528, un derivado de pGEM-3Z que porta una inserción genómica de S. avermitilis de 7 kb que contiene la mitad amino terminal de la ORF de E1-alfa. Se usaron dos oligonucleótidos como cebadores en la reacción PCR (véase Figura 6):

1. Cebador Universal hacia la izquierda (Vector) 31-PCR-BP (5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3') que mapea en el extremo 3' del sitio HindIII del pGEM-3Z MCS (posición 91-114). En el extremo 5' de este cebador hay dos As, y dos sitios de restricción (BamHI y PstI) para facilitar el clonaje de los productos de la PCR.

2. Cebador mutagénico 55-PCR (5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3'). En el extremo 5' de este cebador hay dos As, una G, y dos sitios de restricción (BglII y NdeI). El sitio NdeI coincide con el codon iniciador ATG de la fase de lectura abierta de E1-alfa.

La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo como se describe anteriormente. Los productos de reacción se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Un fragmento de ADN amplificado por PCR del tamaño correcto (aproximadamente 1,1 kb de largo) se electroeluyó, se digirió con las enzimas de restricción NdeI y BamHI, y se subclonó en el plásmido pT7-7 linealizado con NdeI/BamHI para dar el plásmido pCD683 bajo ligación y transformación en células DH5-alfa de E. coli. Aproximadamente 1 \mug del plásmido pCD663 (preparado a partir de la cepa CD663 de E. coli usando el procedimiento miniprep de plásmido) se linealizó con BamHI, se defosforiló, y por último se ligó en presencia de aproximadamente 0,5 \mug del fragmento BamHI de 1,1 kb electroeluído purificado aislado de una digestión BamH1 del plásmido pCD550, para dar el plásmido pCD670. La orientación correcta del fragmento BamH1 de 1,1 kb en la última construcción se determinó mapeando sitios SalI presentes en la inserción. Por último, el plásmido pCD670 se introdujo en la cepa C600 de E. coli que porta el plásmido pGP1-2 (el plásmido que contiene el gen de la ARN polimerasa de T7). Se seleccionó un transformante para un trabajo adicional y se registró como cepa CD676.

B. Construcción de pCD666 que porta la ORF de bkd de E1-beta de S. avermitilis

Se introdujo un sitio de restricción NdeI que abarcaba el codon de inicio ATG en el gen bkd de E1-beta de S. avermitilis usando un procedimiento basado en la PCR. La plantilla para la PCR fue el plásmido pCD574, un derivado de pGEM-3Z que porta una inserción genómica de S. avermitilis de 4,6 kb que contiene la ORF de E1-beta. Se usaron dos oligonucleótidos como cebadores en la reacción PCR (véase también Figura 6):

1. Cebador universal hacia la izquierda (vector) 30-PCR-BP

(5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3') mapea en el extremo 5' del sitio EcoRI del pGEM-3Z MCS (posición 2689-2712). En el extremo 5' de este cebador hay dos As, y dos sitios de restricción (BamHI y PstI) para facilitar el clonaje de los productos de la PCR.

2. Cebador mutagénico hacia la derecha 56-PCR

(5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3'). En el extremo 5' de este cebador hay dos Aes, una G, y dos sitios de restricción (BglII y NdeI). El sitio NdeI coincide con el codon iniciador ATG de la fase de lectura abierta de E1-beta.

La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo como se describe anteriormente. Los productos de reacción se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Un fragmento de ADN amplificado por PCR del tamaño correcto (aproximadamente 1,9 kb de largo) se electroeluyó, se digirió con las enzimas de restricción NdeI y EcoRI, y se subclonó en el plásmido pT7-7 linealizado con NdeI/EcoRI para dar el plásmido pCD666 bajo ligación y transformación en células DH5-alfa de E. coli. Por último, el plásmido pCD666 se introdujo en la cepa C600 de E. coli que portaba el plásmido pGP1-2 (el plásmido que contiene el gen de la ARN polimerasa de T7) (véase Tabor, 1990). Se seleccionó un transformante para trabajo adicional y se registró como cepa CD673.

C. Construcción de pCD736 que porta las ORFs de bkd de E1-alfa y E1-beta de S. avermitilis

Aproximadamente 2 \mug de plásmido pCD670 se linealizaron por una digestión parcial con BamHI. Para obtener la forma lineal del plásmido pCD670 se tomaron alícuotas de la mezcla de digestión BamHI en los siguientes puntos de tiempo: 1, 3, 5, 10, y 20 minutos. Las alícuotas se separaron a través de un gel de agarosa al 0,8%. La forma lineal (aproximadamente 4,3 kb de largo) se recuperó por electroelución y se defosforiló usando CIAP (como se describe anteriormente). Después la mitad de la forma lineal defosforilada del plásmido pCD670 se ligó con un fragmento de BamHI/BglII de 0,8 kb aislado del plásmido pCD577. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH5-alfa competentes de E. coli. Se recuperaron 10 clones y se analizaron por análisis de restricción del ADN plásmido preparado por el procedimiento miniprep. Un clon, registrado como cepa CD736, contenía el plásmido pCD736 correctamente unido). Por último, el plásmido pCD736 se introdujo en la cepa C600 de E. coli que portaba el plásmido pGP1-2. Se seleccionó un transformante para trabajo adicional y se registró como cepa CD737. Otro clon, registrado como cepa CD705, contenía el plásmido pCD705, que portaba el fragmento de BamHI/BglII de 0,8 kb en la orientación incorrecta. La construcción pCD705 se usó como control negativo en experimentos de expresión.

D. Construcción del pCD685 que porta la agrupación de genes bkd de S. avermitilis

La mitad restante de la forma lineal defosforilada del plásmido pCD670 obtenido, como se describe anteriormente, por una digestión parcial con la enzima de restricción BamHI, se ligó con un fragmento de BamHI de 7 kb aislado del plásmido pCD677. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH5-alfa de E. coli. Se recuperaron muchos clones y 16 de ellos se seleccionaron para análisis adicional. Los ADN plásmidos se extrajeron y se analizaron por análisis de restricción. Un clon, registrado como cepa CD685, contenía el plásmido correctamente unido (pCD685). Por último, el plásmido pCD685 se introdujo en la cepa C600 de E. coli que portaba el plásmido pGP1-2. Se seleccionó un transformante para trabajo adicional y se registró como cepa CD687.

Ejemplo 10 Expresión en Escherichia coli de los genes bkd de S. avermitilis usando el sistema de plásmido dual de T7

Se crecieron derivados de C600 de E. coli (pGP-1) que contenían las diferentes construcciones de pT7-7 (cepas CD576, CD673, CD737, y CD 687) en 5 ml de medio LB que contenía tanto kanamicina (60 \mug/ml) como ampicilina (60 \mug/ml) durante la noche a 30ºC. Los cultivos de la noche se diluyeron después 1:40 (0,25:10,00 ml) en un tubo de cultivo (25 x 150 mm) que contenía medio fresco LB/ampicilina/kanamicina y se crecieron con aireación agitadora a 30ºC hasta una densidad óptica medida (OD_{590}) de aproximadamente 0,4. El gen para la ARN polimerasa de T7 se indujo aumentando la temperatura a 42ºC durante 30 minutos, lo que a su vez indujo el/los gen(es) bajo el control del promotor de T7 (como describe S. Tabor, 1990). Por último, la temperatura se redujo a 37ºC y las células se crecieron durante 90 minutos adicionales con agitación. Los cultivos control no inducidos se mantuvieron siempre a 30ºC. Las proteínas se analizaron por electroforesis en gel de Sodio Dodecil sulfato (SDS) poliacrilamida como describe C. D. Denoya y col., 1986, J. Bacterial., 168: 1133-1141. La actividad enzimática se analizó como se describe en el Ejemplo 11.

Ejemplo 11 Determinación de la actividad E1 de BCKDH de S. avermitilis en extractos crudos de cepas de E. coli recombinantes A. Preparación del lisado celular

Las células (derivadas de cultivos de 8 ml) se recogieron por centrifugación (5 min a 5.000 rpm -3.000 x g-. usando un rotor Sorvall SS-34 refrigerado a 4ºC), y se resuspendieron en 5 ml de "tampón rompedor" (tampón fosfato de potasio 0,05 M, pH 7,0, que contenía Triton X-100 3%, glicerol 15%, ditiotreitol 3 mM, inhibidor de tripsina de clara de huevo de pavo 1 mg/ml, EDTA 5 mM, y TPP [tiamin pirofosfato] 0,04 mM. Las células resuspendidas se transfirieron a prensas francesas y las células se rompieron por un pase a 34.000 kPa. Una alícuota de 1,5 ml del prensado francés se transfirió después a un tubo de microcentrífuga y se aclaró durante 30 segundos de centrifugación a 14.000 rpm. Se usaron alícuotas de 100 \mul de cada sobrenadante por ensayo de enzima. La concentración de proteína se determinó usando el ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California), que se basa en el procedimiento de unión a tinte (Bradford, M., Anal. Biochem., 72:248, 1976).

B. Ensayo para el componente E1 del complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKDH) de S. avermitilis

Se determinó la actividad E1 de BCKDH por una versión modificada del ensayo radioquímico descrito previamente (Chuang, D.T., 1988, Methods Enzymol., 166:146-154; y Hafner, E. W. y col, 1991, J. Antibiotics, 44:349). Se añadieron al fondo de un vial de centelleo de cristal: 0,148 ml de tampón fosfato de potasio 0,25 M, pH 6,5; 0,002 ml de ácido etilendiamintetraacético 0,1 M (EDTA, sal disodio); 0,004 ml de MgCl_{2} 0,1 M; 0,02 ml de tiamin pirofosfato (TPP) 3,7 mM; 0,02 ml de NaAsO_{2} 37 mM; 0,01 ml de 2,6-diclorofenolindofenol (sal de sodio, Sigma D-1878) 37 mM; 0,008 ml de solución stock de alfa-[1-^{14}C] cetoisocaproato (preparada como se describe más adelante); 0,058 ml de agua; y 0,1 ml de extracto libre de células aclarado. La boca del vial se cubrió inmediatamente con papel Whatman 4CHR (número de catálogo Whatman 3004614) que se había impregnado con Solvable (un tejido y gel solubilizante comprado a NEN-Dupont). Después se colocó una tapa de plástico firmemente en el vial, tanto la tapa como la mitad superior del vial se envolvieron con parafilm, y se incubaron con agitación suave durante 2 horas a 30ºC. Cuando se completó la incubación, el papel de filtro se transfirió a un vial de centelleo de cristal de 7 ml que contenía 4 ml de cóctel de centelleo líquido "Ready Safe" (Beckman) para determinar la radiactividad. La solución stock de alfa-[1-^{14}C] cetoisocaproato se preparó mezclando 5,6 microlitros de alfa-cetoisocaproato 20 mM (sal de sodio, Sigma K-0629), 50 microlitros de alfa-[1-^{14}C] cetoisocaproato (55 mCi/mmol, 60 \muCi/ml, Amersham), y agua suficiente hasta un volumen final de 1 ml. La actividad específica del componente E1 de la alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada es de picomoles de dióxido de carbono desprendidos por miligramo de proteína como se muestra en la Tabla 1, dada a continuación.

TABLA 1 Actividad E1 de alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de Streptomyces avermitilis en extractos crudos de células de E. coli recombinantes

3

^{1} La actividad específica del componente E1 de la alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada es picomoles de CO_{2} desprendidos por minuto por miligramo de proteína.

^{2} Los resultados son las medias de determinaciones duplicadas.

^{3} Esta construcción porta la parte C-terminal de la fase de lectura abierta de E1-beta en la orientación incorrecta y se usó como control negativo.

Descripción de las secuencias ID

SECUENCIA ID NO.1 representa la secuencia de ADN que codifica la subunidad E1-alfa de BCKDH de S. avermitilis. Esta secuencia se representa también en la Figura 4 como bases 403-1548.

SECUENCIA ID NO. 2 representa la secuencia de ADN que codifica la subunidad E1-beta de BCKDH de S. avermitilis. Esta secuencia se representa también en la Figura 4 como bases 1522-2626.

SECUENCIA ID NO. 3 representa la secuencia de ADN que comienza la fase de lectura abierta que codifica la región amino terminal de la subunidad E2 de BCKDH de S. avermitilis. Esta secuencia se representa también en la Figura 4 como bases 2626-2727.

SECUENCIA ID NO. 4 es una secuencia de ADN que representa las bases 3-251 de pCD539. Es una secuencia interna parcial del gen que codifica la subunidad E2 de la BCKDH de S. avermitilis. Esta secuencia se representa también en la Figura 5.

SECUENCIA ID NO. 5 representa los 2728 pares de bases del fragmento de ADN genómico de S. avermitilis que se representa en la figura 4 y contiene fases de lectura abierta de las subunidades E1-alfa, E1-beta y E2 (parcial) de BCKDH de S. avermitilis.

SECUENCIA ID NO. 6 representa la secuencia de aminoácidos de la subunidad E1-alfa de BCKDH de S. avermitilis. Esta secuencia de aminoácidos está codificada por la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID NO. 1.

SECUENCIA ID NO. 7 representa la secuencia de aminoácidos de la subunidad E1-beta de BCKDH de S. avermitilis. Esta secuencia de aminoácidos está codificada por la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID NO. 2.

\newpage

SECUENCIA ID NO. 8 representa la secuencia de aminoácidos de la parte amino terminal de la subunidad E2 de la BCKDH de S. avermitilis. Esta secuencia de aminoácidos está codificada por la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID NO. 3.

SECUENCIA ID NO. 9 representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN representada por las bases 3-251 de pCD539 (SECUENCIA ID NO. 4). Esta secuencia de aminoácidos representa un fragmento de péptido interno de la subunidad E2 de BCKDH de S. avermitilis.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE (todos los estados indicados excepto los Estados Unidos de América):

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(A)

NOMBRE: Pfizer Inc.

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(B)

CALLE: 235 East 42nd Street, piso 20

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(C)

CIUDAD: Nueva York

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(D)

ESTADO: Nueva York

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 10017-5755

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(ii)

SOLICITANTE (a objeto de los Estados Unidos de América solo):

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(A)

CLAUDIO D. DENOYA

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(B)

CALLE: 8 Spyglass Circle

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(C)

CIUDAD: Groton

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(D)

ESTADO: Connecticut

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 06340

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(iii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Genes que codifican el Complejo Alfa-Cetoácido Deshidrogenasa de Cadena Ramificada de Streptomyces avermitilis

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(iv)

DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Meter C. Richardson

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(B)

CALLE: Pfizer Inc., 235 East 42nd Street, Piso 20

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(C)

CIUDAD: Nueva York

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(D)

ESTADO: Nueva York

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 10017-5755

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUALES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/100,518

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de julio de 1993

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/100,518

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de julio de 1993

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Sheyke, Robert F.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.304

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: PC6346

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (212)573-1189

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (212)573-1939

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TELEX: N/A

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

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(x)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1146 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1005 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 249 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2728 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

+(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:

8

9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 381 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:

10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 334 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:

12

13

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:

15

Claims (13)

1. Un segmento de ADN aislado que codifica el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de un organismo que pertenece al género Streptomyces, comprendiendo dicho segmento de ADN la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID NO. 1, SECUENCIA ID NO. 2, SECUENCIA ID NO. 3, SECUENCIA ID NO. 4 o la SECUENCIA ID NO. 5, o una variación alélica de dichas secuencias.

2. Un segmento de ADN aislado según la reivindicación 1 que codifica el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada de Streptomyces avermitilis.

3. Un segmento de ADN aislado según la reivindicación 1, que además comprende una región de ADN que regula la expresión de dicho complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada.

4. Un segmento de ADN aislado según la reivindicación 2, que además comprende una región de ADN que regula la expresión de dicho complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada.

5. ADN recombinante que comprende un segmento de ADN según la reivindicación 1.

6. Una célula huésped en la que se ha incorporado ADN recombinante según la reivindicación 5.

7. Un plásmido que comprende el ADN recombinante según la reivindicación 5.

8. Un segmento de ADN que se selecciona del grupo constituido por pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 y pCD577, teniendo dichos segmentos de ADN el mapa de restricción genética mostrado en la Figura 3.

9. Una célula huésped en la que se ha incorporado un segmento de ADN según la reivindicación 8.

10. Un segmento de ADN según la reivindicación 1 que comprende una región de ADN que regula la transcripción o la traducción de la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID NO. 1, SECUENCIA ID NO. 2, SECUENCIA ID NO.3, SECUENCIA ID NO.4 o la SECUENCIA ID NO. 5, o variación alélica de dichas secuencias.

11. Los genes para el complejo alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada contenidos en un segmento de ADN según la reivindicación 8.

12. Un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que es un subconjunto de la secuencia de ADN de la SECUENCIA ID NO.1, SECUENCIA ID NO. 2, SECUENCIA ID NO. 3, SECUENCIA ID NO. 4 o SECUENCIA ID NO. 5, y que es capaz de hibridarse con, respectivamente, la SECUENCIA ID NO. 1, SECUENCIA ID NO. 2, SECUENCIA ID NO. 3, SECUENCIA ID NO. 4 o la SECUENCIA ID NO. 5, o una variación alélica de las mismas.

13. Un polipéptido purificado sustancialmente que comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA ID NO. 6, SECUENCIA ID NO. 7, SECUENCIA ID NO. 8 O SECUENCIA ID NO. 9.