PL181778B1 - Sposób wytwarzania naturalnej awermektyny PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania naturalnej awermektyny obejmujacy fermentacje Streptomyces avermitilis w warunkach i w pozywce fermentacyjnej do wytwarzania takiej naturalnej awer- mektyny, znamienny tym, ze zwieksza sie w drobnoustroju Streptomyces avermitilis liczbe kopii genów kodujacych kompleks dehydrogenazy alfa-ketokwasów o rozgalezionym lancuchu zawierajacych segment DNA kodujacy kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o roz- galezionym lancuchu i/lub równowazna mu czynnosciowa czesc tego segmentu DNA obej- mujaca sekwencje DNA oznaczona jako sekwencje o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO2, SEQ. ID NO3, SEQ. ID NO4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiane alleliczna takiej sekwencji, poddaje sie fermentacji ten mikroorganizm, w warunkach i w pozywce fermen- tacyjnej dla wytwarzania takiej naturalnej awermektyny Streptomyces avermitilis. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania naturalnej awermektyny. Sposób otrzymywania awermektyny realizowany jest na drodze poddania fermentacji zmodyfikowanego mikroorganizmu należącego do rodzaju Streptomyces.

Wiele produktów farmaceutycznych wytwarzanych jest przez drobnoustroje, wśród tych drobnoustrojów na szczególną uwagę zasługują organizmy należące do rodzaju Streptomyces - grupy Gram-dodatnich bakterii obecnych w glebie; wytwarzają one ponad 90% antybiotyków nadających się do zastosowania w lecznictwie. Drobnoustroje z rodzaju Streptomyces są przedmiotem intensywnych badań, w których stosuje się techniki klonowania rekombinacyjnego DNA w celu wyizolowania genów biosyntezy antybiotyków, wytwarzania nowych związków, stanowiących pochodne lub hybrydy, wyizolowania genów regulatorowych i zbadania mechanizmów regulacyjnych zarówno pierwotnego, jak i wtórnego metabolizmu.

S. avermitilis wytwarza osiem różnych, lecz blisko spokrewnionych związków poliketydowych o działaniu przeciwpasożytniczym, zwanych awermektynami. Kompleks awermektynowy, wytwarzany przez S. avermitilis, utworzony jest z czeterech składowych głównych,

181 778

Ala, A2a, B1a i B2a, oraz czterech składowych pobocznych, Alb, A2b, B1b i B2b. Strukturę tych składowych przedstawiono poniżej.

Awermektyna	R'	R2	X-Y
Ala	sec-butylowa	Me	CH=CH
Alb	izopropylowa	Me	CH=CH
A2a	sec-butylowa	Me	CH2-CH(OH)
A2b	izopropylowa	Me	CH2CH(OH)
B1a	sec-butylowa	H	CH=CH
B1b	izopropylowa	H	CH=CH
B2a	sec-butylowa	H	CHrCH(OH)
B2b	izopropylowa	H	CH2-CH(OH)

Poliketydowa struktura awermektyny pochodzi od siedmiu cząsteczek octanu, pięciu cząsteczek propionianu i jednej cząsteczki kwasu tłuszczowego o łańcuchu rozgałęzionym w pozycji alfa, który stanowi kwas S(+)-2-metylomasłowy lub kwas izomasłowy. Oznaczenia „A” i ,,Β” odnoszą się do awermektyn, w których podstawnik w pozycji 5 stanowi, odpowiednio, grupa metoksylowa lub hydroksylowa. Cyfra „1” odnosi się do awermektyn posiadających podwójne wiązanie w pozycjach 22-2Β, a cyfra „2” do awermektyn posiadających wodór w pozycji 22 i grupę hydroksylową w pozycji 2Β. Wreszcie, C-25 może mieć jeden z dwóch podstawników: podstawnik secbutylowy (pochodny L-izoleucyny) obecny jest w awermektynie serii „a”, a podstawnik izopropylowy (pochodny L-waliny) jest obecny w awermektynie serii „b” (por. Fisher M.H. i Mrozik H., 1984, „Macrolide Antibiotice”, Academic Press, rozdział 14).

Awermektynami „naturalnymi” w niniejszym opisie zwane są awermektyny wytwarzane przez S. avermitilis, w których podstawnik w pozycji 25 stanowi, jak to wspomniano powyżej, grupa izopropylowa lub sec-butylowa. Awermektyny, w których w pozycji 25 znajduje się grupa inna, niż izopropylowa lub sec-butylowa, zwane są w dalszym ciągu niniejszego opisu ,niowymi” lub nienaturalnymi” awermektynami.

Jednym ze szlaków metabolicznych dla wytworzenia kwasów tłuszczowych o łańcuchach rozgałęzionych w pozycji alfa, w postaci CoA, jest szlak poprzez reakcję transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i następnie reakcję dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (zamiast tego, pochodne tłuszczowych acylo-CoA o rozgałęzionym łańcuchu można uzyskać z alfa -ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, wytwarzanych poprzez syntezę de novo). Szlaki metaboliczne przedstawiono poniżej

CH,CHCH(NH„)COOH 3 I ²

CH,

CH,CH,CHCH(NH-)COOH J Z | Z

CH,

Walina

Izoleucyna

Transammaza aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu

CH-CHCOCOOH 3 i

CH,

Kwas

2-oksoizowalerianowy

Synteza de ηονο¹

Transaminaza

CH,CH-CHCOCOOH 3 2 i

CH.

Kwas

2-okso-3-metylcwaleriańowy

Kompleks dehydrogenazy Alfa-Ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu

CH,CHCO.SCoA ³ I ch₃

Izobutyrylo-CoA

Synteza 'de novo

CH,CH,CHCO.SCoA ^{3 2}1

CH,

2-Metylobutyrylo-CoA

Szlak degradacji (Propionylo-CoA, Metyloamalonylo-CoA)

Szlak degradacji (Acetylo-CoA, Propionylo-CoA Metylomalonylo-CoA)

Biosynteza

Awermektyny

CHCO.SCoA

CHCOOH

R.

Egzogenny kwas tłuszczowy o rozgałęzionym łańcuchu

1\

181 778

Uprzednio izolowany mutant 5. avermitilis, nie wykazywał wykrywalnej aktywności dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) w ostatnim z wymienionych enzymów (Hffiier i wsp., 1988, Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 88300353.5, publikacja nr 0284176). Mutant ten wyizolowano w wyniku standardowej mutagenezy chemicznej szczepu 5. avermitilis ATCC 31272, w ekranie, pozwalającym wykryć brak wytwarzania ¹⁴CO₂, substratu, który stanowił kwas 2-oksoizokapronowy (analog leucyny), znakowany ¹⁴C-1. Mutant ten jest zdolny do wytwarzania naturalnych awermektyn tylko pod warunkiem, że do pożywki, w której mutant fermentuje, doda się kwas tłuszczowy o łańcuchu rozgałęzionym w pozycji alfa lub prekursor zawierający grupę izopropylową lub sec-butylową (S-form). Mutant zdolny jest również do wytwarzania nowych, czyli nienaturalnych, awermektyn, jeżeli poddaje się go fermentacji w środowisku wodnym w warunkach tlenowych w pożywce zawierającej odpowiedni inny kwas karboksylowy, jak np. kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC), lub jego prekursor.

Klonowanie BCKDH S. avermitilis byłoby bardzo korzystne. Manipulacja tymi genami z zastosowaniem rekombinacyjnych technik DNA ułatwiłaby wytwarzania naturalnych i nowych awermektyn. U niektórych gatunków można oczekiwać zwiększenia miana naturalnych awermektyn poprzez zwiększanie liczby kopii genów BCKDH. Ponadto, wytworzenie nieodwracalnie zablokowanego szczepu bkd, w którym aktywność BCKDH byłaby trwale zniesiona lub zmodyfikowana poprzez podstawienie genowe, byłoby korzystniejsze, niż dostępny obecnie mutant bkd, uzyskiwany, jak to opisano powyżej, poprzez mutagenezę chemiczną.

Wieloenzymatyczne kompleksy dehydrogenazy alfa-ketonokwasów - kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH), kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) i kompleks dehydrogenazy alfa-ketoglutaranu (KGDH) katalizują dekarboksylację oksydatywną, odpowiednio, alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, pirogronianu i alfa-ketonoglutaranu, uwalniając CO₂ i wytwarzając odpowiednie acyloCoA i NADH (Perham, R.N., 1991, Biochemistry, 30:8501-8512). Każdy z kompleksów składa się z trzech różnych enzymów katalitycznych: dekarboksylazy (E1), acylotransferazy (transacylazy) kwasu dihydroliponowego (E2) i dehydrogenazy kwasu dihydroliponowego (E3).

Dehydrogenaza alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BGKDH) stanowi wieloenzymatyczny kompleks, złożony z trzech składowych funkcjonalnych, El, dekarboksylazy, E2, transacylazy i E3, dehydrogenazy kwasu dihydroliponowego. Oczyszczone kompleksy, pochodzące z Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa i Bacillus subtilis, składają się z czterech polipeptydów. Oczyszczone kompleksy, pochodzące od ssaków, również składają się z czterech polipeptydów, E1-alfa, E1-beta, E2 i E3. Z Bacillus subtilis wyizolowano kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów, wykazujący aktywność zarówno dehydrogenazy pirogronianowej, jak i dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Ten spełniający podwójną funkcję kompleks utlenia pirogronian i dostarcza kwasów tłuszczowych o rozgałęzionym łańcuchu do wytwarzania fosfolipidów błonowych.

Klonowanie prokariotycznych genów dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu opisywano dla Pseudomonas i Bacillus, lecz nie opisywano ich dla Streptomyces. W systemach tych stwierdzono, że geny kodujące BCKDH są zgrupowane w operonie. Dokonano klonowania genów kompleksu BCKDH Pseudomonas putida i określono sekwencję nukleotydową tego regionu (Sykes i wsp., 1987. J. Bacteriol. 169: 1619-1625, i Burns i wsp., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 165-169 i 176: 311-317). Masa cząsteczkowa E1-alfa wynosi 45289, E1-beta - 37138, E2 - 45134, a E3 - 48164. W sekwencji zgrupowane są cztery geny: E1-alfa, E1-beta, E2 i E3. Analiza sposobem Northern biot wskazuje, że ekspresja tych czterech genów zachodzi za pośrednictwem jednego mRNA, oraz że geny te tworzą operon. Stwierdza się obecność typowego prokariotycznego jednolitego promotora, bezpośrednio poprzedzającego początek regionu kodującego E1-alfa, który umożliwia konstytutywną ekspresję genów bkd Pseudomonas. Kodon inicjujący regionu kodującego E1-beta znajduje się zaledwie 40 nukleotydów za końcem otwartej ramki odczytu (ORF) E1-alfa. W przeciwieństwie do tego, między ORF E1-beta a E2 nie ma odstępu międzygenowego, jako że kodon

181 778 „stop: ORF E1-beta stanowi trójkę nukleotydów bezpośrednio poprzedzającą kodon inicjujący ORF E2. Odstęp międzygenowy między ORF E2 a E3 jest ograniczony do zalediwe dwóch nukleotydów. Tak więc geny bkd Pseudomonas są ściśle sprzężone. Podobnie, dokonano klonowania operonu kodującego podwójny kompleks BCKDH/PDH Bacillus subtilis (Hemila i wsp., 1990, J. Bacteriol 172:5052-5063). Operon ten zawiera cztery ORF, kodujące cztery białka, o ciężarze 42, 36, 48 i 50 kilodaltonów (kDa); wykazano, że są one w dużym stopniu homologiczne z podjednostkami E1-alfa, Ei-beta, E2 i E3 grupy genów bkd Pseudomonas. Ostatnio dokonano klonowania i sekwencjonowania genów kodujących podjednostki alfa i beta składowej El podwójnego kompleksu enzymatycznego BCKDH/PDH, pochodzącego z Bacillus stearothermophilus (szacunkowa masa cząsteczkowa podjednostek alfa i beta wynosi, odpowiednio, 41000 i 35000) (Hawkins i wsp., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346).

Ponadto opisywano sekwencję kilku eukariotycznych podjednostek BCKDH E1-alfa i beta (ludzkich, bydlęcych i szczurzych). Ostatnio dokonano porównania sekwencji aminokwasowej wszystkich opublikowanych sekwencji, zawierających zarówno składową E1-alfa, jak i E1-beta, kompleksów PDH i BCKDH pochodzących od różnych gatunków, poprzez analizę komputerową (Wexler i wsp., 1991, FEBS Letters, 282: 209-213). Co ciekawe, zidentyfikowano kilka regionów podjednostek alfa i beta, które są jednakowe nie tylko we wszystkich dotychczas opisanych PDH, ale również w kompleksach BCKDH, pochodzących zarówno od organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych.

Opisujemy klonowanie genów dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, pochodzących z drobnoustroju Streptomyces avermitilis. Klonowania nowych genów dokonano stosując kombinację dwóch technik genetyki molekularnej, polimerazowej reakcji łańcuchowej DNA (PCR) i sondowania homologicznego. Sondowanie homologiczne polega na przeglądaniu biblioteki cDAN lub biblioteki genomowej za pomocą znakowanych radioaktywnie syntetycznych sond oligonukleotydowych, odpowiadających sekwencjom aminokwasowym białka. Niestety, technika ta wykazuje pewne ograniczenia: jednym z nich jest dość ostre ograniczenie zależne od degeneracji stosowanego oligonukleotydu. Ponadto, hybrydyzacja, stosowana przy przeglądaniu biblioteki, dokonywana jest z niewielką swoistością, tak więc dosyć wysoki jest odsetek wyników fałszywie dodatnich. Dla uniknięcia niektórych spośród ograniczeń hybrydyzacji oligonukleotydowej opracowano ostatnio odmianę sondowania homologicznego, której jednym z etapów jest polimerazowa reakcja łańcucha DNA (PCR), w której możliwe jest zastosowanie jako sond wysoce zdegenerowanych oligonukleotydów. Sposób ten wymaga jedynie znajomości sekwencji aminokwasowej dwóch krótkich regionów (o długości około 7-10 aminokwasów) kodowanego białka. Jako primery tej reakcji stosuje się dwa oligonukleotydy, odpowiadające obu sekwencjom peptydowym. Każdy z primerów można stosować w postaci mieszaniny w pełni zdegenerowanych oligonukleotydów, zawierających wszelkie możliwe kombinacje kodonów, kodujące znane sekwencje aminokwasowe. Matryca do amplifikacji może pochodzić z dowolnego z kilku źródeł DNA, np. bibiotek DNA genomowego i podwójnie zwiniętych postaci plazmidów. W kilku opublikowanych ostatnio doniesieniach dowiedziono użyteczności łączenia polimerazowej reakcji łańcuchowej z sondowaniem homologicznym dla identyfikacji genu pochodzącego od różnych gatunków.

181 778

Słownik

Terminy techniczne, stosowane w niniejszym opisie, są znane specjalistom w zakresie genetyki molekularnej. Definicje tych terminów można znaleźć w licznych podręcznikach poświęconych biologii molekularnej, jak np. w „ Genes ”, wydanie II, autorstwa dr. Benjamina Lewin, 1985, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Poniżej zdefiniowano terminy często stosowane w niniejszym opisie:

Antybiotyk', środek chemiczny, hamujący wzrost komórek bakteryjnych. Stosowany do selekcji rekombinacyjnych komórek bakteryjnych.

Gen oporności na antybiotyk: sekwencja DNA, nadająca odporność na antybiotyk po wprowadzeniu jej do komórki - gospodarza, który jest naturalnie wrażliwy na ten konkretny antybiotyk. Znany również jako marker antybiotykowy.

Bakteriofagi: wirusy zakażające bakterie.

cDNA: RNA o pojedynczej spirali, komplementarny do DNA, wytwarzany z tego ostatniego poprzez transkrypcję in vitro.

Chromosom: oddzielna jednostka genomu, zawierająca wiele genów'.

Klon: duża liczba komórek lub cząsteczek, identyczna, jak ich jeden wspólny przodek.

Wektor klonujący: dowolny plazmid, do którego można wprowadzić obce DNA w celu klonowania tego DNA. Przenosi on obce DNA do komórki bakteryjnej - gospodarza w procesie transformacji.

CoA: koenzym A.

Sekwencja o lepkim końcu (cos) - sekwencja DNA pochodząca z bakteriofaga lambda, umożliwiająca upakowywanie in vitro.

Kosmid: plazmid, do którego włączono sekwencje cos, pochodzące z bakteriofaga lambda, w wyniku tego, DNA plazmidu (w którym znajdują się fragmenty obecnego DNA) można upakować in vitro do otoczki faga.

Dalton: powszechnie używana jednostka masy, związana z rozmiarami cząsteczkowymi odpowiadającymi jednemu atomowi wodoru.

Ligacja DNA: tworzenie wiązania chemicznego łączącego dwa fragmenty DNA.

Komórki eukariotyczne: komórki organizmów wyższych, zawierające jądro otoczone błoną.

Grupa genów: geny znajdujące się fizycznie blisko siebie na chromosomie.

Genom: pełny zestaw chromosomów.. Całość wszystkich genów osobnika.

Hybrydyzacja - hybrydyzacja kolonii: technika stosowana do identyfikacji kolonii bakteryjnych, zawierających wektory chimeryczne, których włączone DNA jest podobne do danej sekwencji.

kb: skrót na oznaczenie 1000 par zasad DNA lub RNA.

NADH: zredukowany dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy.

Linker: krótki syntetyczny dwuniciowy oligodezoksynukleotyd, zawierający miejsce docelowe dla jednego lub więcej enzymów restrykcyjnych. Dodaje się go do wektora dla wytworzenia nowego linkera wielokrotnego, czyli wielokrotnego miejsca klonującego (MCS).

Nukleotyd: „klocek”, czyli jednostka monomeryczna kwasów nukleinowych.

(Oligonukleotyd: krótki łańcuch nukleotydów.

Operon: pełna jednostka ekspresji i regulacji genów bakteryjnych, zawierająca geny struktury, geny regulatorowe i elementy kontrolne DNA, rozpoznawane przez produkt/produkty genów regulatorowych.

Plazmid: autonomiczne, samoreplikujące się, pozachromosomowe koliste DNA.

Liczba kopii plazmidu: liczba cząsteczek plazmidu, utrzymywana w bakterii na każdy chromosom gospodarza.

Primer: krótka sekwencja DNA lub RNA, komplementarna z jedną nicią DNA, posiadająca wolny koniec 3'-OH, od którego polimeraza DNA rozpoczyna syntezę łańcucha dezoksyrybonukleotydowego.

Komórkiprokariotyczne: małe, względnie proste komórki większości droboustrojów.

181 778

Promotor, region DNA odpowiedzialny za zapoczątkowanie transkrypcji.

Enzym restrykcyjny: enzym rozpoznający swoistą krótką sekwencję dNa i przecinający ją.

Sekwencja rozpoznawcza restrykcji: sekwencja DNA, swoiście rozpoznawana przez konkretny enzym restrykcyjny, znana również jako miejsce docelowe.

Wektor wahadłowy: pełniący podwójną rolę wektor klonujący zdolny do replikacji w jednym lub więcej alternatywnych organizmów - gospodarzy (np. E.coli i Streptomyces).

Southern blotting: sposób przenoszenia zdenaturowanego DNA z żelu agarozowego na filtr nitrocelulozowy, gdzie można dokonać jego hybrydyzacji z komplementarną sondą kwasu nukleinowego.

Subklonowanie: przenoszenie klonowania fragmentów DNA z wektora jednego typu na inny, np. z kosmidu rekombinacyjnego na plazmid. Nowy plazmid rekombinacyjny transformuje się następnie do odpowiedniej komórki - gospodarza dla wytworzenia szczepu - subklonu.

Transkrypcja: synteza RNA z matrycy DNA.

Transformacja komórek bekteryjnych: nabycie nowych markerów genetycznych poprzez włączenie dodanego DNA.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania naturalnej awermektyny obejmujący fermentację Streptomyces avernitilis w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiedniej do wytwarzania takiej naturalnej awermektyny, polegający na tym, że zwiększa się w drobnoustroju Streptomyces avermitilis liczbę kopii genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu zawierających segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub równoważną mu czynnościową część tego segmentu DNA obejmująca sekwencję DNA oznaczoną jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę alleliczną takiej sekwencji, poddaje się fermentacji ten mikroorganizm, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiedniej dla wytwarzania naturalnej awermektyny Streptomyces avermitilis.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się segment DNA, który obejmuje ponadto region DNA, regulujący ekspresję tego kompleksu dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.

W jeszcze bardziej korzystnej odmianie sposobu według wynalazku stosuje się segment DNA stanowiący DNA rekombinacyjne.

Segment DNA może być korzystnie dobrany z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DnA posiadają genomowąmapę restrykcyjną taką, jak przedstawiono na fig. 3.

W sposobie wytwarzania naturalnej awermektyny stosuje się korzystnie takie segmenty DNA, które zawierają region DNA regulujący transkrypcję lub translację sekwencji DNA oznaczonej jako SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji.

Można także stosować w sposobie według wynalazku część sekwencji DNA zgodnej z SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, która to sekwencja jest zdolna do hybrydyzacji, z odpowiednio, SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako sondę, lub do amplifikacji całości lub części takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako primer polimerazowej reakcji łańcuchowej.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym kolejne figury przedstawiają :

Figura 1: sekwencję nukleotydową primerów polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), stosowanych do klonowania fragmenty genu E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Wywiedzione sekwencje aminokwasowe, kodowane przez poszczególne oligodezoksynukleotydy, przedstawiono nad odpowiednimi sekwencjami DNA. Strzałki wskazują kierunek amplifikacji. fig. 1A przedstawia primer prawy, a fig. 1B przedstawia primer lewy.

181 778

Figura 2: porównanie sekwencji dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. „Wyprostowanie” wywiedzionych sekwencji aminokwasowych dla fragmentu genomowego CD-50B, klonowanego z zastosowaniem CPR, Streptomyces avermitilis (Sa), Bacillus stearothermophils (Bs), Pseudomonas putida (Pp) i Homo sapiens (Hs). Pionowe kreski wskazują aminokwasy identyczne. Wskazano umiejscowienie sekwencji odpowiadających prawemu i lewemu primerowi PCR, zastosowanych do klonowania (odpowiednio, u góry po stronie lewej i prawej).

Figura Β - genomowa mapa restrykcyjna, umiejscowienie i subklony dla skupienia genów bkd Streptomyces avermitilis. Czarny prostokąt pod mapą wskazuje umiejscowienie i orientację początkowego E1-alfa-swoistego fragmentu genomowego CD50B. S. avermitilis, klonowanego z zastosowaniem PCR. Wskazano subklony genomowe (pochodne pGEM-BZ). Przedstawiono również umiejscowienie i organizację genów strukturalnych bkd, kodujących podjednostki E1-alfa (E1a), E'-beta (E'b) i E2 BCKDH. Polarność zidentyfikowanych otwartych ramek odczytu (oznaczonych prostokątami) ma zwrot od strony lewej do prawej. Skróty: B, BamHI; E, EcoRI; K, KpnI; Bg, Bglll; S, SphI.

Figury 4A, 4B, 4C, 4D, 4E i 4F: sekwencję nukleotydową i wywiedzione produkty translacji 2728-bp fragmentu genomowego DNA S. avermitilis, zawierającego otwarte ramki odczytu (ORF) E1-alfa, E1-beta i E2 (częściowo) bkd. ORF E1-alfa rozciaga się od pozycji 40Β do 1548 sekwencji, ORF E1-beta rozciąga się od pozycji 1622 do 2626 sekwencji, a ORF E2 rozpoczyna się w pozycji 2626. Nukleotydy ponumerowano powyżej linii sekwencji. Kodony „stop” oznaczono gwiazdką (*). Podkreślono prawdopodobne rybosomowe sekwencje wiążące Shine-Dalgamo. Sekwencje rozpoznawcze restrykcji BamHI ujęto w prostokąt.

Figura 5: sekwencję nukleotydową i wywiedzione produkty translacji 0,8-kb fragmentu genomowego DNA Bglll-SphI S. avermitilis, (pCD5B9), zawierającego część ORF E2 bkd. 251 bp sekwencjonowano poczynając od miejsca Bglll (ujęte w prostokąt). Nukleotydy ponumerowano powyżej linii sekwencji.

Figura 6: sekwencję nukleotydową primerów mutagennego (po prawej) i uniwersalnego (po lewej) polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), zastosowanych do wytworzenia pochodnych pT7 dla heterologicznej ekspresji genów bkd S. avermitilie w E. coli. Primery PCR zastosowano w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego Ndel do kodonu „start” translacji ORF E1-alfa lub E1-beta bkd S. avermitilis (odpowiednio, para primerów 55:B1 i 56:Β0). Wywiedzione sekwencje aminokwasowe, kodowane przez poszczególne oligodezoksynukleotydy mutagenne, przedstawiono powyżej odpowiednich sekwencji DNA. Wskazano sekwencje rozpoznawcze restrykcji. Strzałki wskazują kierunek amplifikacji. Figura 6A przedstawia prawe primery mutagenne, a fig. 6B przedstawia lewe primery mutagenne.

Poniżej opisano nowe sposoby klonowania genów bkd S. avermitilis i określania pierwszorzędowej struktury genów kodujących wieloenzymatyczny kompleks BCKDH S. avermitilis. Najpierw, opierając się na regionach zachowawczych zidentyfikowanych poprzez wielokrotne wyprostowanie wywiedzionych sekwencji peptydów BCKDH E1-alfa, pochodzących od różnych gatunków zwierząt i opisanych w literaturze, wytworzono dwa primery PCR, zwane „prawym” i „lewym” (fig. 1). Stosując oba primery, prawy i lewy, poprzez amplifikację genomowego DNA S. avermitilis wytworzono produkt PCR, o długości około 0,2 kb. Ten amplifikowany za pomocą PCR fragment DNA klonowano następnie do wektora E. coli pGEM-BZ w celu wytworzenia rekombinacyjnego plazmidu pCD50B, po czym plazmid pCD50B transformowano do komórek kompetentnych DH5-alfa E.coli. Jeden z transformantów oznaczono jako szczep CD50B. Sekwencjonowanie DNA klonowanego fragmentu CD50B pozwoliło stwierdzić istnienie otwartej ramki odczytu o wywiedzionej sekwencji peptydów wysoce homologicznej z jednostką E1-alfa BCRDH (fig. 2). Klonowany fragment genomowego DNA CD50B zastosowano następnie jako sondę do przeglądania biblioteki chromosomowej S. avermitilis poprzez hybrydyzację kolonijną. Zidentyfikowano cztery kosmidy, a mianowicie CD518, CD519, CD520 i CD521. Analiza metodą restrykcji i metodą Southern biot wykazała, że cztery klony zawierały identyczne fragmenty genowe. Sekwencjonowanie

181 778

DNA ciągów delecji subklonowanych fragmentów genomowego DNA (jak to szczegółowo opisano w przykładzie 8) wykazało, że sekwencja CD503 stanowiła fragment pełnego skupienia genów bkd. Klonowane geny bkd S. avermitilis obejmują region chromosomu o długości około 15 kb (fig. 3). Analiza sekwencji DNA wykazała obecność próbnych sekwencji promotorowych transkrypcji i genów strukturalnych bkd, tworzących skupienie genów o następującej organizacji: sekwencja promotorowa, otwarte ramki odczytu E1-alfa, i E2 (fig. 4 i 5).

Na koniec klonowano całe skupienie genów bkd S. avermitilis, położone w kierunku końca 3' silnego promotora T7 Escherichia coli w celu uzyskania ekspresji w gospodarzu E. coli.. Podobnie, otwarte ramki odczytu (ORF) E1-alfa i E1-beta klonowano również, oddzielnie lub razem, w kierunku końca 3' promotora T7 i poszczególne produkty testowano co do ekspresji. Nowe primery mutagenne PCR,. zastosowane do włączenia unikalnego miejsca restrykcyjnego Ndel w miejscu translacji ATG ORF E1-alfa i E1-beta, opisano szczegółowo w przykładzie 9 (por. również fig. 6). Badanie podwójnego systemu ekspresji plazmidu T7 wykazało, że co najmniej dwie otwarte ramki odczytu skupienia genów bkd S. avermitilis, pochodzącego z CD503 (E1-alfa i E1-beta), mogą ulegać w całości translacji przy ekspresji w E. coli. Ponadto, testy enzymatyczne, w których analizowano swoiście składową W1 kompleksu BCKDH, ostatecznie potwierdziły, że dwa rekombinacyjne klony E. coli - jeden zawierający całe skupienie genów bkd i drugi, zawierający zarówno ORF E1- alfa, jak i ORF E1- beta, wykazywały aktywność enzymu E1-BCKDH-swoistego (tabela I).

Opisujemy izolowanie genu bkd z produkującego awermektynę Streptomyces avermitilis. Obszary genom Streptomyces (około 10⁴ kb) jest ponad dwukrotnie większy od genomu Escherichia coli. Genom Streptomyces utworzony jest z DNA o skrajnie wysokiej wartości guanozyny z cytozyną (G + C) )średnio do 73% , a w niektórych regionach > 90%), blisko górnej granicy obserwowanej w przyrodzie. Ta szczególna charakterystyka wymaga opracowania swoistych dla Streptomycetes technik rekombinacyjnych DNA. Przykłady takich prób można znaleźć w Zgłoszeniu Patentowym Stanów Zjednoczonych 08/048719, złożonym 16 kwietnia 1993, i w Zgłoszeniu Patentowym Stanów Zjednoczonych 08/032925, złożonym 18 marca 1993. Zgłoszenia te włącza się w całości, do niniejszego opisu przez przywołanie.

W części „Przykłady” szczegółowo opisano inne techniki, swoiście ulepszone dla osiągnięcia tego celu wynalazku, jak np. amplifikacja DNA genomowego z użyciem PCR, wytwarzanie ciągów delecji, sekwencjonowanie DNA i heterologiczna ekspresja genów bkd. S. avermitilis w E. coli..

Poniżej przedstawiono szczegółowy opis etapów eksperymentalnych klonowania genów bkd S. avermitilis i otrzymane wyniki:

a) Identyfikacja w pa djednosece Rl-alfa paptydu BCKDH regionów zachowawcach, które mogłyby służyć jako ewentualne miejsca przyłączenia primerów PCR.

W celu identyfikacji regionów zachowawczych, mogących ewentualnie służyć jako sekwencje do wytworzenia odpowiednich primerów PCR, wprostowano cztery sekwencje peptydów E1-alfa, BCKDH, uzyskane od człowieka (Fischer i wsp, 1989, J. Biol, Chem. 264:3448-3453), szczura (Zhang i wsp., 1987, J. Biol. Chem. 262:15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch i wsp., 1988, Eur. J. Biochem. 176: 311-317), i Bacillus sterothermophilus (Perham i wsp., 1990, Eur. J. Biochem. 191:337-346). Analizę komputerową w celu identyfikacji regionów podjednostki E1-alfa, które są wysokim stopniu identyczne zarówno w prokariotycznych, jak i w eukariotycznych kompleksach BCKDH, przeprowadzono z użyciem oprogramowania LineUp i Pretty z pakietu programowego do analizy sekwencji GCG (Madison, stan WI, Stany Zjednoczone). Wielokrotne wyprostowanie czterech peptydów BCKDH E1-alfa wykazało istnienie kilku regionów o zwiększonej homologii (por. Wexler I.D. i wsp., 1991, fEbS Letters 282:209-213). Motyw wiążący pirofosforan tiaminy (Perham i wsp., 1989, FEBS Letters 255: 77-82), umiejscowiony pomiędzy ludzkimi aminokwasami E1-alfa 182-229, i region zawierający miejsca fosforylacji 1 i 2, obejmujący aminokwasy 245-289, były szczególnie zachowawcze we wszystkich czterech analizowanych peptydach E1-alfa BCKDH. Obecny był również uprzednio opisywany region o wysokiej homologii, umiejscowiony

181 778 pomiędzy aminokwasami 291 a 307. Region ten wydaje się występować wyłącznie w dehydrogenazach alfa-ketonokwasów·', zawierających zarówno podjednostkę alfa, jak i beta, i nie jest on homologiczny z żadną sekwencją PCD E1 E. coli ani ze składowymi El kompleksów dehydrogenazy alfa-ketoglutaranów E. coli i drożdży, które stanowią dimery złożone z tylko pojedynczych polipeptydów E1. Z wyżej wymienionych przyczyn sugerowano, że ten ostatni region homologii odgrywa rolę w interakcji podjednostek (Patel i wsp., 1991, FEBS Letters 282:209-213). Regiony zachowawcze, dobrane do wytworzenia primerów PCR, kodują reszty aminokwasowe 192-20θ, i 370-376 ludzkiego białka E1-alfa BCKDH.

b) Wytworzenie nowych oligonukleotydów, pochodzących z regionów zachowawczych E1-alfa BCKDH, do zastosowania jako primery PCR.

Jak to omówiono powyżej, w wyniku badań z wielokrotnym wyprostowaniem struktury DNA, dobrano dwa regiony zachowawcze podjednostki E1-alfa BCKDH. Z regionu obejmującego aminokwasy 192-200 ludzkiej podjednostki E1-alfa BCKDH, którą zastosowano jako reprezentatywny model podjednostki., E1-alfa BCKDH, wytworzono prawy primer PCR (fig. 1). Aminokwasy te znajdują się wewnątrz motywu wiążącego pirofosforan tiaminy. Z regionu obejmującego aminokwasy 370-376 podjednostki E1-alfa BCKDH, wytworzono lewy primer PCR (fig. 1). Ta ostatnia sekwencja aminokwasów znajduje się w pobliżu C-końcowego regionu peptydu. Zastosowano oznaczenia kodonów genu Streptomyces (F. Wright i M.J. Bibb, 1992, Gene, 113:55-65). Na końcu 5' każdego z primerów znajduje się sekwencja rozpoznawcza enzymu restrykcyjnego (EcoRI w primerze prawym i Xbal w primerze lewym), dla ułatwienia klonowania produktów PCR. Pełna sekwencja prawego primera PCR jest następująca:

5' -GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3'

Pełna sekwencja lewego primera PCR jest następująca:

5' -TCTAGACCGCAGGJGGTC.CGGCATCTC-3'

Podkreślono sekwencje niehomologiczne z genami E1-alfa bkd, włączone do primerów w celu klonowania (por. również fig. 1).

c) Amplifikacja metodą PCR fragmentów genomowego DNA S. avermitilis

Dodano enzymatycznej amplifikacji genomowego DNA S. avermitilis, stosując warunki reakcji odpowiednie dla DNA o wysokiej zawartości GC tak, aby umożliwić skuteczną i swoistą amplifkację DNA Streptomycetes (por. przykład 2). PCR przeprowadzono z zastosowaniem powyżej opisanej kombinacji primerów (primer prawy 5' -GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' i primer lewy - 5' -TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'). Dokonano rozdzielenia produktów amplifikacji poprzez elektroforezę na żelu agarozowym. W wyżej opisanych warunkach PCR, stosując tę kombinację primerów, wykryto pojedynczy prążek DNA (o długości około 250 par zasad).

d) Klonowanie amplifikowanego fragmentu genomowego DNA do wektora klonującego Escherichia coli i następcza transformacja do gospodarza - E. coli.

Jak wspomniano uprzednio, miejsce restrykcyjne EcoRI włączono do prawego primera PCR, dla ułatwienia klonowania, a na końcu 5' primera lewego znajdowało się miejsce restrykcyjne XbaI. Jednakże nie udało się dokonać klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb z zastosowaniem ligacji, przy której zarówno wstawiony fragment, jak i wektor klonujący ulegają trawieniu przez EcoRI i Xbal. Zastosowano zatem inny sposób klonowania fermentu o długości PCR 0,25 kb, przy czym użyto fragmentu Klenow polimerazy I DNA dla wytworzenia tępych końców we fragmencie pCr. Po włączeniu fragmentu o tępych końcach do Smal-linearyzowanego wektora E. coli (pGEM-3Z[f+]) o tępych końcach dokonano regeneracji pojedynczego klonu rekombinacyjnego dla wytworzenia rekombinacyjnego plazmidu pCD503. Następnie pCD wprowadzono poprzez transformację do komórek kompetentnych DH5-alfa E. coli.. Dobrany transformant oznaczono jako szczep CD503. Analiza restrykcyjna potwierdziła, że plazmid pCD503, wyizolowano ze szczepu CD503. E. coli, istotnie zawierał wstawkę S. avermitihs o długości 0,25 kb.

181 778

d) Subklsuowotue wstawki DNA o długości0,2ć kb,ampl ifikowakej za pomocą PCR, do bakteriofaga M13, sekwencjonowanie DNA klonowanego fragmentu i identyfikacja sekwencji bkd swoistych

Wstawkę o długości 0,25 kb, znajdującą się w plazmidzie pCD503, suOklonowano do bakteriofaga M13. W tym celu najpierw uwolniono wstawkę z wektora E. coli poprzez trawienie pCD503 za pomocą EcoRI i Pstl, dwa enzymy restrykcyjne, których sekwencje rozpoznawcze znajdują się w miejscu wielokrotnego klonowania wektora pGEM po obu stronach klonowanej wstawki. Następnie fragment swoisty klonowano zarówno do wektora mp18, jak i mp19 M13. poddanego obróbce EcoRI i Pstl. Klonowanie do obu wektorów zapewnia możliwość wytworzenia jednąniciąwegą DNA obu nici wstawki DNA w celu jej sekwencjonowania. Jeden klon, zawierający swoistą wstawkę, dobrany z eksperymentu transfekcji mp18, nazwano szczepem CD505. Klon drugi, również zawierający swoistą wstawkę, ale dobrany z eksperymentu transfekcji mpl9, nazwano szczepem CD506. Sekwencjąsokania DNA dokonano stosując metodę terminacji łańcucha dwudezoksynukleotydowegą, z użyciem jako matrycy jednoniciowegą DNA i zestawu TagTrack (Promega). We wszystkich przypadkach dokonano sekwencjonąwania obu nici DNA - jednej pochodzącej z klonu CD505 i drugiej komplementarnej, pochodzącej z klonu CD506. Analiza preferencji kądąnów (pakiet programów do analizy sekwencji GCG, Madison, stan WI) danych z sekwencjonowania DNA otrzymanych klonów CD505 i CD506 wykazała istnienie otwartej ramki odczytu, zawierającej prawy kodon właściwy dla genu Streptomycetes.

Następnie dokonano translacji próbnej otwartej ramki odczytu do sekwencji aminokwasowej, stosując programy Seq i Translate oprogramowania IntellGenetics Suite (IntelliGenetics Inc., Mounyain View, stan Kalifornia), po czym przeprowadzono poszukiwanie podobieństwa w banku danych, stosując próbną sekwencję peptydową i program FASTDB z pakietu programów IntelliGenetics. Przeglądanie wszystkich banków danych, zarówno banków danych DNA (GenBank i EMBL), jak i banków danych białek (PIR i Swisi-Prot) wykazało jednoznacznie, że sekwencja pochodząca z klonu CD503 była wysoce homologiczna, lecz nowa i różna od wszystkich innych peptydów E1-alfa BCDKH, zarówno pochodzenia orokariotycznego, jak i eukariotycznego, notowanych w bankach danych. Wynik wielokrotnego wyprostowania sekwencji peptydowych E1-alfa BCKDH, pochodzących od człowieka, szczura, Pseudomonas putida i Bacillus stearothermophilus, jak również nową sekwencję oeptydąwą CD503 El-alfa BCKDH Streptomyces avermitilis, przedstawiono na fig. 2. Z danych tych można wyciągnąć wniosek, że produkt PCR, o długości 250 par zasad, genomu S. avermitilis, klonowany w szczepie CD503 E. coli, stanowi istotnie nowy fragment genowy E1-alfa bkd.

f) Klonowanie całego skupienia genów bkd S. avermitilis, analiza metodą restrykcji i metoda Southern biot i tworzenie mapy chromosomowej.

Fragment DNA BamHI/EcoRI o długości 0,25 kb, pochodzący z pCD503, zawierający E1-alfa-0kd-SkΌistą sekwencję DNA S. avermililis, zastosowano jako znakowaną radioaktywnie sondę do przeglądania biblioteki kosmidów genąmowego DNA S. avermitilis poprzez hybrydyzację kolonijną. Zidentyfikowano i regenerowano cztery klony (CD518, CD519, CD520, CD521). Analiza metodą restrykcji i hybrydyzacji metodą Southern blot wykazała, że te cztery klony zawierały identyczne sekwencje, pochodzące z tego samego regionu chromosomu. Ta sama sonda została następnie inkubąwana, z wysoką dokładnością, z produktami Southern biot strawionego DNA chromosoma^ego, pochodzącego z S. avermitilis ATCC 31272. Ta ostatnia analiza potwierdziła tożsamość klonów regenerowanych z bibioteki genomowej. Mapę restrykcyjną fragmentu genąmowego, zawierającego sekwencję CD503 S. avermitilis, przedstawionego na fig. 3.

g) Subklonąwanie fragmentu genomowegą DNA, pochodzącego z klonów CD518 i CD521, i sekwencjąnowanie DNA regionu chromąsomalnego S. avermitilis, zawierającego skupienie genów bkd

Fragmenty genomowe (o długości 1-2 kb), zawierające całość regionu bkd CD503 chromosomu S. avermitilis, subklonowaιną z klonów CD521 i CD518 biblioteki DNA do wektora

181 778

E. coli pGEM-3Z. Poniżej przedstawiono listę subklonów wytworzonych w wyniku tej operacji wraz z krótkim opisem poszczególnych plazmidów: 1, plazmid pCD528 zawiera fragment BamHI o długości 7 kb, subklonowany z pCD518; 2. plazmid pCD545 zawiera fragment SphI o długości 2,3 kb, subklonowany z pCD528; 3 plazmid pCD550 zawiera fragment Sphl o długości 6 kb, subklonowany z pCD521; 4. Plazmid pCD559 zawiera fragment BamHI o długości 7 kb, subklonowany z pCD521; 5, plazmid pCD574 zawiera fragment Sphl-BgIII o długości 4,2 kb, subklonowany z pCD550, a 6. plazmid pCD579 zawiera wstawkę o długości około 10,4 kb. Wstawka ta zawiera dwa przylegające fragmenty genomowe, które na powrót połączono: fragment SphI/Bglll o długości 4,2 kb, subklonowany z pCD550, i fargemnt Bglll/BamHI o długości 6,2 kb, subklonowany z pCD559. Mapowanie restrykcyjne plazmidu, hybrydyzacja metodą Southern i analiza PCR potwierdziły tożsamość poszczególnych subklonów Dla oznaczenia sekwencji nukleotydowej zastosowano metodą terminacji łańcuchów Sanger. W tym celu fragmenty genomowe S. avermitilis subklonowano następnie do bakteriofagów M13 mpl8 i M13 mpl9 dla określenia sekwencji obu nici DNA. Z wyżej wymienionych klonów, pochodzących z pGEM, wyizolowano kilka fragmentów restrykcyjnych DNA i dokonano ich ligacji do M13 mpl8 i M13 mpl9, uzyskując w wyniku następujące fagi rekombinacyjne:

CD 535: fragment DNA 5. avermitilis o długości 0,4 kb, klonowany metodą PCR zastosowaniem DNA pCD528 jako matrycy, primera swoistego 29-PCR-EX (5' -AaGAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-3') i primera uniwersalnego 31-PCR-BP (por. przykład 9 i fig. 6). Dokonano restrykcji amplifikowanego fragmentu, stosując EcoRI i Pstl, po czym wklonowano go do DNA M13 mp18, lineryzowanego za pomocąEcoRI/Pstl.

CD 536: fragment DNA, podobny do opisanego powyżej, klonowany do DNA M13 mpl9.

CD 537: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, zawierający sekwencję CD503, subklonowany z pCD528 do M13 mp 18.

CD 538: fragment DNA SaII pCD528 o długości 1,15 kb, (zlokalizowany w kierunku końca 5' od opisanego powyżej fragmentu SaII o długości 1,15 kb), klonowany do M13 mp18.

CD 539: fragment DNA BamHI/BaIII, o długości 1,5 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mpl8.

CD 541: fragment DNA SaII/BamHI o długości 0,35 kb, subklonowany z pCD528 do M13 mp18.

CD 542: fragment DNA SaII/BamHI o długości 0,35 kb, subklonowany z pCD528 do M13 mpl9.

CD 553: fragment DNA BamHI/BgIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mpl8.

CD 554: fragment DNA BamHI o długości 1,1 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp 18.

CD 555: fragment DNA, podobny do opisanego powyżej, klonowany w przeciwnej orientacji do M13 mp18.

CD 558: fragment DNA BamHI/HindIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD553 do M13 mpl9.

CD 561: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mpl8 (orientacja przeciwna, niż w CD 537).

CD 565: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mpl9.

CD 566: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mpl9 (orientacja przeciwna, niż w CD 565).

CD 567: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD538 do M13 mpl9.

CD 582: fragment DNA BamHI/BgIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mpl8 (orientacja przeciwna, niż w CD 553).

Wstawki genomowe S. avermitilis, zawarte w tych klonach, skrócono następnie poprzez traktowanie Egzonukleazą III w celu wytworzenia serii subklonów („ciąg delecji”, por. przykład 8).

181 778

H) Analiza komputerowa danych z sekwencjonowania DNA, uzyskanych z klonowanych fragmentów DNA, i identyfikacja ramek odczytu bkd E1-alfa, E1-beta i E2 S. avermitilis. Sekwencję nukleotydową regionu genomowego S. avermitilis, o długości 2,7 kb, zawierającego geny bkd, przedstawiono na fig. 4. Przesuwnej analizy składu zasad regionu genomowego, o długości 27 kb, zawierającego otwarte ramki odczytu (ORF) bkd E1-alfa, E1-beta i E2 (częściowo) S. avermitilis, dokonano z użyciem oprogramowania „DNA Inspector”. W analizie tej określa się profil bieżącej średniej zawartości G+C, stosując rozstaw wynoszący 30 zasad i przesunięcie wynoszące 20. Całkowita zawartość G+C, odpowiadająca temu regionowi chromosomu S. avermitilis, wynosiła 72%. Bezpośrednio powyżej otwartych ramek odczytu bkd zlokalizowano miejsce o niskiej zawartości G+C (zawartość G+C wynosząca około 50%) - co jest wskaźnikiem regionu promotorowego.

Analizowano również zawartość G+C w funkcji pozycji kodonu. Z zastosowaniem tabeli kodonówStreptomyces dla 64 genów (F. Wright i M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65) i oprogramowania „CodonPreference” (Genetics Computer Group, Madison, stan WI) wykryto otwarte ramki odczytu. Oprogramowanie „CodonPreference” jest swoistym względem ramek programem służącym do wyszukiwania genów, który rozpoznaje sekwencje kodujące białka poprzez ich podobieństwo do tabeli częstości kodonów lub poprzez odchylenie w ich składzie (zwykle GC) w pozycji trzeciej poszczególnych kodonów oRf przedstawiono w postaci prostokątów poniżej wykresu dla ich odpowiednich ramek odczytu. Wykryto również wszystkie kodony „start” (ATG) i „stop” (linie pionowe). Poniżej każdego wykresu ORF zaznaczono rzadkie kodony wykryte w poszczególnych ramkach odczytu. Zawartość G+C obliczono, stosując przesuwne „okno”, utworzone z 25 kodonów, tak więc oczekiwano opóźnienia wynoszącego około 25 kodonów przed ujawnieniem się pełnego wpływu regionu kodującego białko. Uzyskano następujące trzy profile: 1. pierwsza pozycja w trójce 2. druga pozycja w trójce 3. trzecia pozycja w trójce. W wyniku tej analizy zlokalizowano trzy ORF bkd, odpowiadające następującym podjednostkom BCKDH: E1-alfa, E1-beta, E2 (fig. 4 i 5).

Klonowane skupienie genów bkd Streptomyces avermitilis jest korzystne w ulepszaniu wytwarzania naturalnej awermektyny poprzez zwiększenie liczby kopii tych genów lub poprzez optymalizację ich ekspresji w wytwarzających szczepach.

Przykłady

W dalszym ciągu niniejszego opisu przedstawiono szczegółowe przykłady sposobów doświadczalnych, zastosowanych do klonowania i analizowania genów bkd pochodzących z S. avermitilis, które przedstawiono również na załączonych figurach. Dodatkowe szczegóły rutynowych technik, dobrze znane specjalistom w zakresie biologii molekularnej, i oznaczenia poszczególnych zastosowanych enzymów, przedstawiono np. w podręczniku laboratoryjnym „Molecular Cloning”, autor: Maniatis i wsp. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Przykład 1. Wytworzenie DNA genomowego S. avermitilis

Grzybnię S. avermitilis ATCC 31272 hodowano w postaci zlewającej się murawy na pożywce agarowej YPD-2 przez 7 dni w temperaturze 29°C. Pożywka zawierała:

Wyciąg z drożdży Difco 10 g

Bacto-pepton Difco 10 g

Dekstrozę 5 g

Agar Difco Bacto 20 g

Octan sodowy 2 g

MOPS 10 g pH doprowadzono do wartości 7,0.

Objętość końcowa: 1 1.

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 25 minut w temperaturze 121°C.

Wyhodowaną grzybnię posiano na 30 ml pożywki AS-7 (por. Hafner i wsp., Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 88300-353.5, publikacja nr 0 284 176) w kolbie z przegrodą o pojemności 300 ml, którą utrzymywano, ciągle mieszając, w temperaturze 29°C przez 24 godziny.

181 778

Pożywka zawierała:

Rozcieńczoną skrobię ¹ 20 g

Ardaminę pH2 5 g

Pharmamedia³ 115 g

Węglan wapniowy (CaCO3) 2 g pH doprowadzono do wartości 7,2, stosując wodorotlenek sodowy (NaOH).

Objętość końcowa 1 1.

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 25 minut w temperaturze 121°C.

- wytworzono przez hydrolizę skrobi alfa-amylazę pochodzącą z Bacillus licheniformis, do równoważnika dekstrozy wynoszącego około 40% ² - uzyskano z Yeast Products, Inc., Clifton, stan NJ, 07012

- uzyskano z Traders Protem, Memphis, TN, 38108.

Około 0,3 ml powyższej hodowli posiano do kolejnej kolby z przegrodą o pojemności 300 ml, zawierającej 30 ml modyfikowanej płynnej pożywki Yeast Extract Malt Extract (YEME) (Bibb, M.J., Freeman, R. F., i D.A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155-166). Modyfikowana pożywka YEMR zawierała w przeliczeniu na litr pożywki)

Wyciąg glaco Yeast 3 g

Pepton Diaco Bacto 5 g

Wyciąg Oxoid Malt 3 g

Sacharozę 300 g

Glukozę Dg

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 40 minut w temperaturze 121 °C.

Po wyjałowieniu dodano 2 ml 2,5 M sześclowcdzlanu chlorku magnezowego (MgCl2 · 6 H₂O).

Końcową objętość doprowadzono do 1 1.

Hodowle prowadzono przez 48-72 godzin w temperaturze 29°C. Grzybnie regenerowano poprzez odwirowanie, po czym wytworzono DNA genomowe według sposobu opisanego w „Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrlaugatlon: Procedure 2”, jak to opisano w podręczniku „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, The John Innes Fcundatloa, Norwich, Wielka Brytania, 1985, autor: dr. D. A. Hopwood i wsp. Grudki DNA zawieszono ponownie w 3 ml bufora TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1mM EDTA).

Przykład 2. Ampllalkacja DNA geaomowego S. avermitilis z zastosowaniem polimerazowej reakcji łańcuchowej

Genomowe DNA S. avermitilis amplifikowano enzymatycznie, stosując urządzenie do przeprowadzania cyklu obróbki cieplnej typu Perkin-Elmer Cetus. Reakcję PCR przeprowadzono stosując polimerazę Taq (Perkin-Elmer Cetus) i bufor dostarczony przez producenta, w obecności 200 pM dNTP, 15% glicerolu, po 0,5 pM każdego z primerów, 50 ng matrycy DNA (w tym przypadku matrycę stanowiło genomowe DNA S. avermitilis), i 2,5 jednostek enzymu, w końcowej objętości 100 pl, przez 30 cykli. Profil cieplny pierwszego cyklu był następujący: 95°C przez 3 minuty (etap deaaturacjl), 55°C przez 2 minuty (etap wyżarzania) i 72°C przez 2 minuty (etap wydłużania). Kolejnych 29 cykli miało podobny profil cieplny z tym wyjątkiem, że etap deaaturacjl skrócono do 1,5 minuty. Primery DNA uzyskano z Genosys Biotechnologies, Inc. (stan Teksas).

Sekwencja prawego primera PCR (fig. 1) była następująca: 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3', a sekwencja primera lewego: 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'. Produkty ampllaikacjl rozdzielono za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. Elektroforezy próbki PCR dokonano w poziomym 1,5% żelu agarozowym w buforze 1X TBE (90 mM Tris-HCl, pH 8,5,90 mM kwasu borowego, 2,5 mM kwasu ktyleacdwuaminoczterooctowkgo (EDTA) przez 1,5 godziny, przy napięciu wynoszącym 100 V, jak to opisał Maniatis i wsp. Rozdzielone odcinki DNA, stanowiące produkt PCR, zlokalizowano na żelu, stosując barwienie bromkiem etydyny i uwidocznienie prążków fluoryzujących w świetle ultrafioletowym o długości fali 365 nm. W opisanych powyżej warunkach PCR przy zastosowaniu tej kombinacj i primerów wykrywano poj edynczy prążek DNA (o długości 250 par zasad).

181 778

Przykład 3. Klonowanie amplifikowanego przy użyciu PCR fragmentu genomowego DNA o długości 0,25 kb do wektora E. coli, i transformacja do gospodarza E. coli

A. Regeneracja produktu PCR o długości 0,25 kb

Jak to wspomniano powyżej, fragment DNA o długości 0,25 kb amplifikowano w PCR, stosując genomowe DNA S. avermitilis jako matrycę i kombinację primerów lewego i prawego. Jak to przedstawiono na fig. 1, primer prawy posiada miejsce rozpoznawcze EcoRI, umiejscowione na końcu 5', a primer lewy posiada miejsce rozpoznawcze XbaI, umiejscowione na końcu 5'. Jednakże próby klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb z zastosowaniem ligacji, przy których zarówno wstawka, jak i wektor kodujący były trawione przez EcoRI i Xbal, nie powiodły się. więc inne rozwiązanie klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb, w którym zastosowano fragmenty Klenow polimerazy I DNA dla wytworzenia tępych końców we fragmencie PCR. Po amplifikacji, (jak to opisano w przykładzie 2), dokonano dwukrotnej ekstrakcji około 80 (J produktów reakcji PCR, stosując mieszaninę fenol-chloroform, następnie dwukrotnie ekstrahowano eterem, po czym fragment DNA, stanowiący produkt PCR, strącono z użyciem etanolu, jak to opisywano uprzednio. DNA ponownie zawieszono w 18,5 jl H₂O; następnie dodano 2,5 μΐ 10 x buforu Nick-translation (0,5 m Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M siarczanu magnezowego (MgSO₄), ImM ditiotreitu, 500 jg/ml bydlęcej albuminy osoczowej) (Maniatis i wsp., 1989) i 20 jednostek fragmentu Klenow polimerazy I DNA E. coli (Boehringer Mannheim Biochemicals) i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut. Następnie dodano 1 jl 2 mM dNTP (po 2 mM każdego z 4 dNTP) i mieszaninę dalej inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Reakcje naprawy DNA zahamowano, dodając 1 jL 0,5 M EDTA, pH 8,0 i całkowitą zawartość mieszaniny reakcyjnej przeniesiono na 1,5% żel agarozowy i podano elektroforezie. Fragment DNA o długości 0,25kb uwidoczniono sposobem opisanym powyżej i regenerowano poprzez elektroelucję, przeprowadzoną w następujący sposób: prążek DNA o długości 0,25 kb usunięto żyletką i dokonano regeneracji DNA z żelu agarozowego poprzez elektroelucję przez 35 minut przy napięciu 80 V w zagłębieniu o kształcie litery V, napełnionym 10mM octanu amonowego, stosując urządzenie do elektroelucji jednokierunkowej (International Biotechnology Inc., New Haven, stan CT). Następnie dokonano strącenia DNA z użyciem etanolu, mieszaninę poddano granulacji, a na koniec ponownie rozpuszczono w 20 jl bufora DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM chlorku sodowego (NaCl), 0,1 mM EDTA; pH 7,5).

B. Trawienie za pomocą SmaI i defosforylacja wektora plazmidowego pGEM-3Z

Około 1 jg plazmidu pGEM-3Zf(+) (Promega Corp., Madison, stan WI) i 2 jednostki enzymu restrykcyjnego SmaI (wszystkie enzymy restrykcyjne nabyto w firmie Boehringer Mannheim Biochemicals) inkubowano w buforze testowym, wskazanym przez producenta, w temperaturze 25° przez 3,5 godziny, przy czym całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 40 mikrolitrów (jl) dla wytworzenia linearnych cząsteczek o tępych końcach. Następnie, linearyzowany za pomocą Smal wektor poddano defosforylacji z zastosowaniem cielęcej jelitowej fosfatazy zasadowej (CIAP) (nabytej w Promega Corp., Madison, stan WI), według zaleceń producenta. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 35 minut w temperaturze 37°C, po czym dokonano dwukrotnej ekstrakcji DNA, stosując równą objętość mieszaniny fenolu i chloroformu, dwukrotnie ekstrahowano równą objętością eteru, a na koniec dokonano strącenia DNA poprzez dodanie dwukrotnej objętości absolutnego etanolu. Strącone DNA regenerowano poprzez odwirowanie (10000 x G) przez 10 minut, i wysuszono pod próżnią. Uzyskaną grudkę rozpuszczono w 20 jl buforu DNA.

C. Ligacja dla wytworzenia pCD503

Około 9 jl poddanego obróbce fragmentem Klenow DNA, stanowiącego produkt PCR, o długości 0,25 kb, i około 1 jl linearyzowanego za pomocą SmaI, defosforylowanego z użyciem CIAP pGEM-3Zf(+) o tępych końcach inkubowano przez noc z jedną jednostką ligazy (New England BioLabs, IC, Beverly, stan MA) w warunkach wskazanych przez producenta w temperaturze 14°C, przy czym całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 20 μΐ.

181 778

Reakcję zakończono, umieszczając mikroprobówkę testową na lodzie, po czym 15 pl mieszaniny reakcyjnej zastosowano do transformacji kompetentnych komórek JM 109 E. coli według rutynowego sposobu, jak to opisał Maniatis i wsp., 1989. Uzyskano liczne transformanty oporne na ampicylinę. Wektor plazmidowy pGEM-BZf(+) zawiera fragment DNA pochodzący z operonu lac Escherichia coli, kodującego fragment aminokońcowy beta-galaktozydazy (Yamsch-Perron, C., Vieira, J., i J. Messing, 1985, Gene, BB, 10B). Fragment ten, którego syntezę można indukować stosując izopropylotio-beta-D-galaktozyd (IPTG) zdolny jest do wewnątrzallelicznej (alfa) komplementacji z ułomną formą beta-galaktozydazy, kodowaną przez gospodarza. Komórki E. coli, wystawione na działanie induktora IPTG, syntetyzują oba fragmenty enzymu, tworząc niebieskie kolonie po wysianiu ich na pożywki zawierające substrat chromogenny 5-bromo-4-chloro-B-indolilo β-D-galaktozyd (X-gal). Insercja obcego DNA do poliklonującego miejsca plazmidu powoduje inaktywację beta-galaktozydazowego fragmentu aminokońcowego i znosi alfa-komplementację. Tak więc, bakterie zawierające plazmidy rekombinacyjne tworzą kolonie białe. W tym doświadczeniu transformacji uzyskano liczne białe kolonie. Kolonie te powinny zawierać plazmid pCD50B. Zostało to potwierdzone poprzez dobranie jednej kolonii, oznaczonej jako szczep CD50B, i jej dalszą analizę. Pojedynczą kolonię bakteryjną szczepu E. coli CD50B posiano do płynnej pożywki Luria-Bertani (LB), zawierającej 50 (g/ml ampicyliny, według rutynowych sposobów stosowanych w mikrobiologii. Pożywka LB zawierała:

Bacto-trypton 10 g

Wyciąg Bacto z drożdży 5 g

NaCl 10g pH doprowadzono do wartości 7,0, stosując 5 N wodorotlenek sodowy (NaOH). Końcową objętość roztworu doprowadzono do 1 1.

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 20 minut w temperaturze 121 °C.

Hodowlę inkubowano przez noc w temperaturze B5°C. Następnego dnia rano komórki bakteryjne zebrano poprzez odwirowanie z prędkością 10000 obr./min. przez 5 minut w temperaturze 4°C. Wektor plazmidowy wyizolowano ze świeżo zebranych komórek Escherichia coli CD50B, stosując modyfikację sposobu opisanego przez Bimboim i Doly (Nucleic Acid Res., 1979, 7: 151B), jak to opisał Denoya i wsp., 1985, Microbios Lett., 29: 87. Wyizolowany plazmid DNA rozpuszczono na koniec w buforze DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5) dla wytworzenia stężenia wynoszącego około 1 pg pCD50B na 10 pl bufora. Potwierdzająca analiza restrykcyjna z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Pstl wykazała, jak tego oczekiwano, że pCD50B zawierał wstawkę DNA o długości 0,25 kb.

Przykład 4. wyzaareanie znakowhiych radtowinywnie sond DNA i RNA

A. Wytwaratwajedno j icia znakowanych dwuniciowych sond DNA

Dwuniciowe sondy DNA wytworzono przez translację typu oick (ogólny opis tej techniki - por. Maoiatis i wsp., 1989). W pierwszym etapie, zawierający sekwencję docelową swoisty fragment DNA wytworzono poprzez odpowiednie trawienie enzymami restrykcyjnymi i oczyszczenie poprzez elektroelucję w zasadzie tak, jak to opisano w przykładzie 1. Oznakowano około 1 pg DNA, stosując w każdym przypadku [alfa^P] dCTP (znakowaną [alfa-³2P] sól dezoksycytydynową 5'-trójfosforanu cztero(trójetolo)kmooowego, którą uzyskano z NEN-Dupont, oraz BRL Nick Trkoslation System, uzyskany z BRL Life Technologies Inc., zgodnie ze wskazówkami producenta. Typową reakcję przeprowadzono w objętości wynoszącej 50 pl. Po dodaniu 5 pl buforu Stop, (jak to opisano we wskazówkach BRL), rozdzielono oznakowane DNA od nukleotydów oiewłączonych, stosując kolumnę przyciskową Stratagene według instrukcji obsługi dostarczonej przez producenta. W wyniku zastosowania powyższego sposobu uzyskano DNA znakowane ³2P o swoistej aktywności znacznie przekraczającej 10⁸cpm/pg.

181 778

B. Wytwarzanie znakowanych jednoniciowych sond RNA

Sondy RNA, znakowane ³²P, wytworzono poprzez transkrypcję in vitro, stosując system transkrypcyjny Riboprobe Gemini (Promega). Oczyszczony fragment docelowego DNA klonowano do wektora transkrypcyjnego pGEM-3Z, stosując rutynowe sposoby. Wytwarzanie matrycowego DNA plazmidowego do reakcji transkrypcji in vitro przeprowadzono tak, jak to opisano w przykładzie 3, jednakże włączając etap strącania glikolem polietylenowym (PEG) w celu wybiórczego usunięcia nukleotydów o małych rozmiarach, które mogłyby zanieczyszczać te preparaty. Etap ten przeprowadzono w następujący sposób: po etapie strącania etanolem grudkę ponownie zawieszono w 520 μΐ wody, po czym dodano 100 μΐ 5 M NaCl i 620 μΐ 13% PEG (MW 6000-8000). Po zmieszaniu rurkę inkubowano na lodzie przez 1 godzinę, po czym dokonano granulacji DNA w temperaturze 4°C przy 10000 x G przez 15 minut. Grudkę przepłukano jednokrotnie z użyciem 500 μ! 80% zimnego etanolu, po czym w rutynowy sposób ponownie zawieszono. Około 1 ^ig matrycowego plazmidowego DNA poddano linearyzacji z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych SacI lub HindIII, a następnie dokonano ich transkrypcji in vitro z zastosowaniem DNA-zależnej polimerazy RNA, odpowiednio, bakteriofaga SP6 i T7. W reakcji tej zastosowano [alfa- 3²P] sól cytydynową 5'-trójfosforanu cztero(trójetylo)amonowego (CTP), którą uzyskano zNEN-Dupont. Zastosowano warunki reakcji zalecane przez producenta. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną potraktowano 1 jednostką RQl-DNazy (Promega) w celu degradacji matrycy DNA, ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenolchloroform, po czym strącono etanolem według rutynowych sposobów. Grudkę wysuszono i zawieszono ponownie w 20 pl wody pozbawionej RNazy (Promega). Dokonano analizy próbki o małej objętości znakowanego transkryptu RNA, stosując elektroforezę na żelu poliakrylamidowo-agarozowym, jak to opisał Denoya i wsp., 1987, J. Bacteriol 169: 3857-3860. W wyżej opisanych warunkach uzyskano rutynowo znakowane transkrypty o pełnej długości.

Przykład 5. Analiza DNA genomowego S.avermitilis poprzez hybrydyzację metodą Southern

Około 10 ig oczyszczonego DNA genomowego S.avermitilis poddawano trawieniu dwoma jednostkami enzymu restrykcyjnego BamHI w temperaturze 37°C przez co najmniej 2 godziny. Pod koniec trawienia fragmenty DNA rozdzielono poprzez elektroforezę na 1% żelu agarozowym (por. przykład 1A), i przeniesiono przez noc na błonę nylonową (średnica porów 0,45 im) (błony Schleicher i Schuell Nytran), stosując metodę przenoszenia kapilarnego (Southern E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503). Następnego dnia błony nylonowe opakowano w folię plastykową i stronę zawierającą DNA każdej błony wystawiono na działanie promieniowania ultrafioletowego (302 nm) w celu przytwierdzenia DNA do błony. Przeprowadzono hybrydyzację znakowanych radioaktywnie sond RNA lub DNA do DNA unieruchomionego na błonach nylonowych, stosując sposób opisany przez Maniatis i wsp., 1989. Prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono w temperaturze 42°C. Roztwór hybrydyzacyjny zawierał: 6 x SSC (1x: 0,15 M chlorku sodowego (NaCl), 15 mM cytrynianu sodowego, pH 7,0), 10 x odczynnik Denhardta [lx:0,02% fikolu, 0,02% poliwinylopirolidonu, 0,02% bydlęcej albuminy osoczowej], 1% SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu), 100 (g/ml zdenaturowanego, rozfragmentowanego DNA spermy łososiowej, 100 (g/ml tRNA E. coli i 50% formamidu (Fluka). Po hybrydyzacji przez noc błony przepłukano w następujący sposób: dwukrotne płukanie 1 x SSC 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 15 minut i dwukrotne płukanie 0,1 x SSC 0,1% SDS w temperaturze 42°C przez 15 minut. W niektórych doświadczeniach hybrydyzację przeprowadzano w temperaturze 65°C w nieobecności formamidu, stosując zamiast SSC - SSpE (1x : 0,18 M NaCl, 10 mM fosforanu sodowego (NaPO₄), pH 7,7, 1 mM EDTA. Na koniec błony poddano ekspozycji z kliszą RTG w celu uzyskania obrazu autoradiograficznego.

181 778

Przykład 6. Klonowanie fragmentu gkaomowego DNA S.avermitilis CD503 o długości 0,25 kb do bakteriofaga M13 i skkwencjoaowαnie DNA

Fragment genomowy DNA S.avermitilis CD503 o długości 0,25 kb klonowano do bakteriofagów M13 mp 18 i M13 mpl9 w celu wytworzenia jednoniciowego rekombinacyjnego DNA, które stosowano następnie jako matryce w metodzie dwudezoksyskkwencSonowaaia, opisanej przez Sangera (Sanger i wsp., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 74: 5463-5467). Około 2 pg plazmidu pCD503, wytworzonego skróconym sposobem opisanym powyżej, poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pstl w celu uwolnienia wstawki genomowej S.avermitilis o długości 0,25 kb. Uprzednia analiza restrykcyjna wykazała, że pCD503, poddane trawieniu tylko EcoRI lub tylko Pstl, miało strukturę liniową. Niniejsza analiza wykazała, że wstawka o długości 0,25 kb nie zawierała miejsc rozpoznawczych EcoRI ani Pstl. Mieszaninę, powstałą po procesie trawienia, poddano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym, po czym dokonano elkktroelucJl i strącenia fragmentu o długości 0,25 kb, jak to opisano powyżej. Ponadto, po około 1 pg każdej z oczyszczonych dwuniciowych form replikacyjnych ( RF) DNA M13 mpl8 i M13 mpl9 poddano podwójnemu trawieniu EcoRI i Pstl, deaosforylacjl cielęcą jelitową fosfatazą zasadową (CIAP) (uzyskaną z Promega Corp., Madison, stan WI) i na koniec ligacji z fragmentem DNA o długości 0,25 kb, jak to opisano uprzednio. Oczyszczone wektory klonowane RF Ml3 uzyskano z New England BioLabs. Powstałe po ligacji mieszaniny zastosowano do transfekcji kompetentnych komórek JM109 E. coli. Dobrano pojedynczą białą łysinkę pochodzącą z transfe^i mpl8 i pojedynczą łysinkę pochodzącą z trαnsaekcji mpl9, a następnie przeprowadzono hodowlę faga z wytworzeniem Skdnoaiciowkgo DNA, jak to opisano w literaturze (Maniatis i wsp., 1989). Dokonano skkweacjcnowania DNA poszczególnych jedaoniclowych matryc DNA, stosując M13-swoisty-40 primer skkwencjonujący (New England BioLabs, nr katal. 1212), [3⁵S]5'-[alfa-tio]trójfosforan dezcksyadeaozyny NEN-Dupont i zestaw do sekweacScacwania TaqTrack (Promega), stosując się do wskazówek producenta (Promega). Dane z sekwencjonowania fragmentu gkacmcwkgo S.avermitilis pCD503 przedstawiono na fig. 4.

Przykład 7. Klonowanie całego skupienia genów bkd S. avermitilis i tworzenie mapy chromosomowej

Około 5 pg oczyszczonego pCD503 poddano podwójnej restrykcji, stosując zarówno enzym restrykcyjny BamHI, jak i EcoRI; fragmenty DNA rozdzielono poprzez elektroforezę na 1,2% żelu agarozowym, po czym fragment DNA o długości około 0,25 kb, zawierający sekwencję swoistą dla genu E1-alfa bkd S.avermitilis, regenerowano przez klektroklucję i wyznakowano przez translację typu nick w zasadzie tak, jak to opisano powyżej. Fragment DNA oznakowany p²P] zastosowano następnie jako sondę do przeglądania biblioteki kosmidów genomowych S.avermitilis. Szczegółowy opis tworzenia bibliotek genomowych można znaleźć w: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, autor: Maniatis i wsp., 1989. Pełny opis tworzenia biblioteki chromosomowej Streptomycetes przedstawiono w: „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, autor: Hopwood i wsp., 1985. Opis wektora kosmidowego można znaleźć w: „Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic dnA Cloning”, autor: Denoya C.D., Zgłoszenie Patentowe Stanów Zjednoczonych 08/048719, złożone 16 kwietnia 1993. Po przejrzeniu ponad 2200 rekombinacyjnych klonów biblioteki zidentyfikowano cztery klony. Te cztery hybrydyzująck klony (oznaczone jako klony E. coli CD518, CD519, CD520 i CD521) hodowano w pożywce lB, zawierającej ampicylinę jako czynnik selekcjonujący. Z poszczególnych hodowli wytworzono plazmidy, jak to opisano powyżej. Analiza metodą restrykcji i hybrydyzacji metodą Southern biot wykazała, że te cztery klony były spokrewnione, ponieważ zawierały identyczne regiony chromosomowe. Stosując następujące rutynowe sposoby uzyskano gkaomowąmapę restrykcyjną S.avermitilis. pokrywającą cały region chromosomowy, w tym sekwencję CD503. Mapę tę przedstawia fig. 3.

181 778

Przykład 8. Wytwarzanie ciągów mutantów delecyjnych w celu ukierunkowanego sekwencjonowania DNA regionu chromosomowego S.avermitilis, zawierającego skupienie genów bkd

Stosując egzonukleazę III wytworzono ciągi mutantów delecyjnych , pozbawionych kolejno coraz większej liczby nukleotydów, poczynając od jednego lub od drugiego końca docelowego DNA bkd S.avermitilis, w zasadzie według sposobu opisanego przez Henikoff S. (1987, Methods Enzymol. 155: 156). W celu wytworzenia jednokierunkowych mutantów delecyjnych dokonano trawienia dwuniciowego DNA replikacyjnych form DNA, pochodzących z poszczególnych rekombinacyjnych bakteriofagów Ml3, stosując dwa enz.ymy restrykcyjne, przy czym miejsca cięcia obu tych enzymów restrykcyjnych znajdowały się pomiędzy jednym końcem docelowego DNA a miejscem wiążącym się z primerem. Enzym restrykcyjny, tnący bliżej sekwencji docelowych, wytwarzał koniec tępy, czyli wgłębiony koniec 3'; drugi enzym wytwarzał wystający koniec 3'. Egzonukleaza III katalizuje stopniowe usuwanie 5'-mononukleotydu z wgłębionych, czyli tępych końców 3'-hydroksylowych dwuniciowego DNA. Jednakże, wystające końce 3' są całkowicie oporne na działanie tego enzymu. Tak więc tylko jeden koniec uzyskanego liniowego DNA był podatny na działanie egzonukleazy III, zatem trawienie postępowało w jednym kierunku od miejsca cięcia ku docelowym sekwencjom DNA.

Poniżej tytułem przykładu opisano wytwarzanie ciągu delecji pCD565. Plazmid pCD565 stanowi pochodną RF M13 mpl9, zawierającą fragment Sali o długości 1,15 kb, którego część stanowi otwarta ramka odczytu E1-alfa bkd S.avermililis. Plazmid pCD565 oczyszczono przez odwirowanie równowagowe w gradientach chlorku cezowego i bromku etydyny, jak to opisał Maniatis i wsp., (1989). Egzonukleaza III zdolna jest do inicjacji trawienia z jednoniciowych „wgłębień” - („nicks”), tak więc istotne jest stosowanie mieszanin zawierających poniżej 10% relaksowanych cząsteczek kolistych. Około 10 pg plazmidu pCD565 (por. rozdział „Szczegółowy opis wynalazku”) poddano podwójnemu trawieniu, stosując enzymy restrykcyjne SacI i Xbal w temperaturze 37°C przez 4 godziny, następnie ekstrakcji fenolem-chloroformem i eterem i strąceniu etanolem, jak to opisano powyżej. Grudkę zawieszono ponownie w 60 pl bufora reakcyjnego egzonukleazy III (10 x bufor egzonukleazy III: 0,66 M Tris-HCl, pH 8,0, 66 mM chlorku magnezowego (MgCl₂). Roztwór DNA inkubowano następnie w temperaturze 37°C w obecności 300jednostek egzonukleazy III (Ambion Inc.) i w odstępach 30-sekundowych pobierano próbki o objętości 2,5 pl. Próbki indukowano następnie z nukleazą S1, po czym z nich z kolei pobierano próbki, które analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Próbki inkubowano zawierające fragmenty DNA o pożądanych rozmiarach łączono, dokonywano naprawy DNA, stosując fragmenty Klenowpolimerazy I DNA, poddawano przez noc ligacji i transfekowano do kompetentnych komórek JM109 E. coli. Wielkość wstawek w regenerowanych klonach analizowano metodą restrykcji EcoRI/HindIII i elektroforezy na żelu agarozowym. Do sekwencjonowania dobrano pięć klonów: 565-D19 (o długości 1,1 kb), 565-D7 (o długości 0,88 kb), 565-d24 (o długości 0,77 kb), 565-D1 (o długości 0,51 kb) i 565-D16 (o długości 0,36 kb). Z poszczególnych klonów wytworzono jednoniciowe DNA, które poddano sekwencjonowaniu, jak to opisano powyżej.

Przykład 9. Wytwarzanie plazmidów pCD670 , pCD666, pCD736 i pCD685 w celu zastosowania do ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli

Dokonano ekspresji genów bkd S .avermitilis w E. coli stosując podwójny system plazmidowy polimerazy RNA/promotora T7, w zasadzie według opisu S. Tabor (1990), w: Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley - Interscience, New York).

A. Wytwarzanie pCD670, zawierającego ORF E1-alfa bkd S.avermitilis

Do genu E1-alfa bkd S.avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne Ndel, zawierające kodon „start” ATG, stosując sposób oparty na PCR. Matrycę dla PCR stanowił plazmid pCD 528, pochodna pGEM-3Z, zawierająca wstawkę genomową S.avermitilis o długości 7 kb,

181 778 w skład której wchodziła aminokońcowa połowa ORF E1-alfa. W reakcji PCR jako primery zastosowano dwa ołigonukleotydy (por. fig. 6):

1. Lewy primer uniwersalny (wektorowy) 31-PCR-BP (5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTAACGCCA-3'), umiej scowiony w kierunku końca 3' od miejsca HindIII MCS pGEM-3Z (pozycja 91-114). Na końcu 5' tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i dwa miejsca restrykcyjne (BamHI i Pstl), dla ułatwienia klonowania produktów PCR.

2. Primer mutagenny 55-PCR (5'-AAGAGATCTCATAATGCGGTCATGGAGCAGCGG-3'). Na końcu 5' tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i jedna cząsteczka guaniny oraz dwa miejsca restrykcyjne (BgIII i NdeI). Miejsce Ndel zachodzi na kodon inicjujący ATG otwartej ramki odczytu E1-alfa. Polimerazową reakcję łańcuchową przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Produkty reakcji analizowano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Amplifikowany za pomocą PCR fragment DNA o właściwych rozmiarach (o długości około 1,1 kb) poddano elektroelucji, trawieniu enzymami restrykcyjnymi NdeI i BamHI i subklonowaniu do linearyzowanego za pomocą NdeI/BamHI plazmidu pT7-7 dla wytworzenia plazmidu pCD663 w czasie ligacji i transformacji do komórek DH5-alfa E. coli. Około 1 pg plazmidu pCD663 (wytworzonego ze szczepu CD663 E. coli z zastosowaniem skróconego sposobu wytwarzania plazmidów) poddano linearyzacji za pomocą BamHI, defosforylacji i na koniec ligacji w obecności około 0,5 pg elektroeluowanego oczyszczonego fragmentu BamHI o długości 1,1 kb, izolowanego z trawienia za pomocą BamHI plazmidu pCD550, dla wytworzenia plazmidu pCD670. Prawidłową orientację fragmentu BamHI o długości 1,1 kb w tym ostatnim produkcie określono przez mapowanie miejsc SaII obecnych we wstawce. Na koniec dokonano włączenia plazmidu pCD670 do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2 (przy czym plazmid zawierał gen polimerazy RNA T7) (por. Tabor 1990). Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD676.

B. Wytwarzanie pCD666, zawierającego ORF E1-beta bkd S.avermitilis

Do genu E1-beta bkd S.avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne NdeI, zawierające kodon „start” ATG, stosując sposób oparty na PCR. Matrycę dla PCR stanowił plazmid pCD574, pochodna pGEM-3Z, zawierająca wstawkę genomową S.avermitilis o długości 4,5kb, w skład której wchodziła ORF E1-beta. W reakcji PCR jako primery zastosowano dwa ołigonukleotydy (por. fig. 6):

1. Lewy primer uniwersalny (wektorowy) 30-PCR-BP (5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3'), umiejscowiony w kierunku końca 5' od miejsca EcoRI MCS pGEM-3Z (pozycja 2689-2712). Na końcu 5' tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i dwa miejsca restrykcyjne (BamHI i PstI), dla ułatwienia klonowania produktów PCR.

2. Primer mutagenny 56-PCR (5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3'). Na końcu 5' tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i jedna cząsteczka guaniny oraz dwa miejsca restrykcyjne (BgIII i NdeI). Miejsce Ndel zachodzi na kodon inicjujący ATG otwartej ramki odczytu E1-beta. Polimerazową reakcję łańcuchową przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Produkty reakcji analizowano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Amplifikowany za pomocą PCR fragment DNA o właściwych rozmiarach (o długości około 1,9 kb) poddano elektroelucji, trawieniu enzymami restrykcyjnymi NdeI i EcoRI i subklonowaniu do linearyzowanego za pomocą NdeI/EcoRI plazmidu pT7-7 dla wytworzenia plazmidu pCD666 w czasie ligacji i transformacji do komórek DH5-alfa E. coli. Na koniec dokonano włączenia plazmidu pCD666 do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2 (przy czym plazmid zawierał gen polimerazy RNA T7) (por. Tabor 1990). Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD673.

181 778

C. Wytwarzanie pCD736, zawierającego ORF bkd E1-alfa i E1-beta S.avermitilis

Około 2 ig plazmidu pCD670 linearyzowano przez częściowe trawienie za pomocą BamHI.

W celu uzyskania formy liniowej plazmidu pCD670 próbki mieszaniny poddawanej trawieniu BamHI pobierano w następujących punktach czasowych: po 1, 3, 5, 10 i 20 minutach. Próbki przepuszczano przez 0,8% żel agarozowy. Formę liniową (o długości około 4,3 kb) regenerowano przez elektroelucję i poddawano defosforylacji z zastosowaniem CIAP (jak to opisano uprzednio). Następnie połowę defosforylowanej formy liniowej plazmidu pCD670 poddano ligacji z fragmentem BamHI/BgIII o długości 0,8 kb, wyizolowanym z plazmidu pCD577. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5-alfa E. coli. Regenerowano dziesięć klonów i plazmidowe DNA, wytworzone sposobem skróconym, poddano analizie restrykcyjnej. Jeden klon, oznaczony jako szczep CD736, zawierał prawidłowo odtworzony plazmid pCD736. Na koniec plazmid pCD736 włączono do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2. Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD737. Inny klon, oznaczony jako szczep CD705, zawierał plazmid pCD705, w którym znajdował się fragment BamHI/Bglll o długości 1,8 kb w nieprawidłowej orientacji. pCD705 zastosowano jako kontrolę ujemną w doświadczeniach dotyczących ekspresji.

D. Wytwarzanie pCD685, zawierającego skupienie genów bkd S.avermititis

Pozostałą połowę defosforylowanej postaci plazmidu pCD670 uzyskanego, jak to opisano powyżej, przez częściowe trawienie enzymem restrykcyjnym BamHI, poddano ligacji z fragmentem BamHI o długości 7 kb, wyizolowanym z plazmidu pCD577. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5-alfa E. coli. Regenerowano wiele klonów; szesnaście z nich dobrano do dalszych analiz. Ekstrahowano plazmidowe DNA i poddano je analizie restrykcyjnej. Jeden klon, oznaczony jako szczep CD685, zawierał prawidłowo odtworzony plazmid (pCD685). Na koniec plazmid pCD685 włączono do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2. Po dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD687.

Przykład 10. Ekspresja genów bkd S.avermitilis w E. coli z zastosowaniem podwójnego systemu plazmidowego T7

Pochodne E. coli C600 (pGP-1), zawierające różne produkty pT7-7 (szczepy CD676, CD673, CD737 i CD687), hodowano w 5 ml pożywki LB, zawierającej zarówno kanamycynę (60 ig/ml), jak i ampicylinę (60 fg/m.l), przez noc w temperaturze 30°C. Hodowlę rozcieńczono następnie w stosunku 1:40 (0,25 : 10,0 ml) do hodowli w rurkach (o wymiarach 25 x 150 mm), zawierających świeżą pożywkę LB/ampicylinOkanamycyna i hodowano z napowietrzaniem wstrząsowym w temperaturze 30°C do uzyskania zmierzonej gęstości optycznej (OD₅₉₀) wynoszącej około 0,4. Poprzez podniesienie temperatury do 42°C przez 30 minut dokonano indukcji genu kodującego polimerazę RNA T7, co z kolei spowodowało indukcję genów pozostających pod kontrolą promotora T7, jak to opisał S. Tabor (1990). Następnie temperaturę obniżono do 37°C i komórki hodowano, wstrząsając, jeszcze przez 90 minut. Nieindukowane hodowle kontrolne utrzymywano w temperaturze 30°C. Dokonano analizy białek, stosując elektroforezę na żelu poliakrylamidowym z użyciem soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), jak to opisał C.D. Denoya i wsp., 1986, J. Bacteriol. 168: 1133-1141. Aktywność enzymatyczną poddano analizie, jak to opisano w przykładzie 11.

Przykład 11. Oznaczanie aktywności BCKDH E1 S^ermitilis w nieoczyszczonych wyciągach rekombinacyjny ch szczepów E. coli

A. Wytworzenie lizatu komórek

Komórki (pochodzące z 8 ml hodowli) zebrano przez odwirowanie (5 minut przy 5000 obr./min. - 3000 x g - stosując rotor Sorvall SS-34, schłodzony do temperatury 4°C), po czym ponownie zawieszono je w 5 ml bufora „rozrywającego” (0,05 M bufora fosforanu potasowego, pH 7,0, zawierającego 3% Triton Χ-100, 15% glicerolu, 3 mM ditiotreitu, 1mg/ml inhibitora trypsyny z białka jaja indyczego, 5 mM EDTA i 0,04 mM TPP [pirofosforanu tiaminy]).

181 778

Ponownie zawieszone komórki przenoszono do tłoczni typu Freoch, gdzie komórki ulegały pękaniu po jednym przejściu przy 5000 x psi. Następnie próbki o objętości po 1,5 ml produktu tłoczenia w tłoczni typu French przenoszono do rurki do mikrood^iro^waoia i klarowano przez B0 sekundowe odwirowanie przy 14000 obr./mio. Do każdego testu enzymatycznego stosowano próbkę o objętości 100 pl z każdego supematantu. Stężenie białka oznaczano, stosując test białkowy BioRad (BioRad Laboratories, Richmond, stan Kalifornia), oparty aa sposobie wiązania barwnika, opisanym przez Bradforda (Bradford M., Aaal. Blochem., 72: 248, 1976).

B. Test nakoma lc^o^s sldado’k'<a -Cl dehy alaa-ketonokwasóah a rcwgałęzionym łańcuchu (BCKDH) S.avermitilis

Aktywność BCKDH E1 ozoaczono stosując zmodyfikowaną wersję uprzedeio opisywanego testu radiochemicznego (Chuang, D.T., 1988, Methods Enzymol., 166: 146-154, i Hafeer, E.W. i wsp., 1991, J. Antibiotics 44:B49). Na dno szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 15 ml dodaoo: 0,148 ml 0,25 M bufora fosforanu potasowego o pH 6,5; 0,002 ml 0,1 M kwasu etylenodwuamieoczterooctowego (EDTA, sól dwusodowa); 0,004 ml 0,1 M MgCl2; 0,02 ml B,7 mM pirofosforaou tiamiey (TPP); 0,02 ml B7 mM NaAsO2; 0,01 ml B7 mM 2,6-dwuehloirofenoloiodofenolu (sól sodowa, Sigma D-1878); 0,008 ml roztworu podstawowego alfa-[1-'⁴C]ketoizokaproniaou (wytworzonego jak to opisano poeiżej); 0,058 ml wody i 0,1 ml sklarowanego bezkomórkowego wyciągu. Wylot fiolki natychmiast zatkano papierem typu Whatman 4 CHR (nr katalogu Whatmana B004614), który następnie impregnowano z użyciem Solvable (środek zwiększający rozpuszczalność tkanek i żelu, nabyty w firmie NEN-Dupoot).

Na fiolce umieszczono zatyczkę plastykową; zatyczkę i górną połowę fiolki oblano parafiną i poddano inkubacji, delikatnie wstrząsając przez 2 godziny w temperaturze B0°C. Po zakończeaiu inkubacji papier filtracyjny przeniesiono do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 7 ml, zawierającej 4 ml płyooej mieszaniny scyntylacyjnej „Ready Safe” (Becamee) dla oznaczenia radioeatywnzści. Roztwór podstawowy alfa-[1-¹⁴C]ketoizokaproeiaou wytworzono, mieszając 5,6 mikrolitra 20 mM alfa-aetoizoaaprooiaou (sól sodowa, Sigma K-0629), 50 mikrolitrów elfa-[1-¹⁴C]ketoizokαprooiaou (55 mCi/mmol, 50 pCi/ml, Amersham) i dostateczną ilość wody dla uzyskania końcowej objętości 1 ml. Swoistą aktywność składowej El dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu wyrażono w pikomolach dwutlenku węgla uwaleiaeego na minutę na miligram białka, jak to przedstawiono w poniższej tabeli I.

181 778

Tabela I

Aktywność dehydrogenazy E1 alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu Streptomyces avermitilis w nieoczyszczonych wyciągach rekombinacyjnych komórek E coli

Produkt	Plazmid	Szczep	Indukcja	Aktywność swoista E1 BCKDH12
Bez wstawki	pT7-7	CD677	+	0,9
E1-a	pCD670	CD676	-	0,6
+	0,8
E1-b	pCD666	CD673	-	0,5
+	0,7
E1-[a+b]	pCD736	CD737	-	2,0
+	13,7
E1-[a+b]3	pCD705	CD705	-	0,9
+	0,5
E1-[a+b]-E2-E3	pCD685	CD687	-	2,9
+	6,0

Swoistą aktywność składowej E1 dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu wyrażono w pikomolach dwutlenku węgla uwalnianego na minutę na miligram białka.

Wyniki stanowią średnią z dwóch pomiarów.

Produkt ten zawierał część C-końcową otwartej ramki odczytu E1-beta umiejscowioną w niewłaściwej orientacji i był stosowany jako kontrola ujemna.

181 778

Opis specyfikacji sekwencji („SEQUENCE ID”)

SEQUENCE ID NR 1 przedstawia sekwencję DNA, kodującą pcdjedaostkę E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 403-1548.

SEQUENCE ID NR 2 przedstawia sekwencję DNA, kodującą podjednostkę E1-beta BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 1622-2626.

SEQUENCE ID NR 3 przedstawia sekwencję DNA, rozpoczynającą otwartą ramkę odczytu, kodującą region aminokońcowy podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 2626-2727.

SEQUENCE ID NR 4 przedstawia sekwencję DNA, odpowiadającą zasadom 3-251 pCD539. Stanowi ona wewnętrzną część sekwencji genu kodującego podjednostkę E2 BCKDH S. avermitilis . Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 5.

SEQUENCE ID NR 5 przedstawia 2728 par zasad fragmentu genomowego DNA. S. avermitilis, przedstawionego na fig. 4 zawierającego otwarte ramki odczytu pod-jednostek E1-alfa, E1-beta i E2 (część) BCKDH S. avermitilis.

SEQUENCE ID NR 6 przedstawia sekwencję aminokwasową podjednostki E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasowa jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 1.

SEQUENCE ID NR 7 przedstawia sekwencję ammokwasową podjednostki E1-beta BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasowa jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 2.

SEQUENCE ID NR 8 przedstawia sekwencję aminokwasową części aminokońcowcj podjkdnostki E2 BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasowa jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 3.

SEQUENCE ID NR 9 przedstawia sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA odpowiadającą zasadom 3-251 pCD539 (SEQUENCE iD NR 4). Ta sekwencja aminckwasowa odpowiada wewnętrznemu fragmentowi peptydowemu podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis.

181 778

181 778 co -1 co -i cnja

-Z cnσ COCOΟ

LJ_

coco -J

CO—¹ ε

o tn

O ε

o u

JZ a

>1

C

O i—H ja ω

ao	m		o	σ>	Γ—
CM		Γ-	in	ιο	Γ-
in	un	ιο	in	LO	ΙΟ
Q	Q	Q	a	a	ca
O	O	U	o	υ	u
a	a	a	a	a	a

u

JO τ-H ω

Π3 Jj ·—ł 5 ω g

181 778

FIG. 4A

10	20	30	40	50	60	70
GTCGACGCGG	GCTCCGAAAC	CGCGGATCAC	GCCGTCGTCG	ATGAGCCGGT	TGATTCGCGC	GTAGGCATTG
80	90	100	110	120	130	140
GCACCCGACA	CGTGGGCGCG	CTCGGCCACG	GACCGTATCG	AGGCGCGGCC	GTCCGCCTGG	AGCATCTGGA
150	160	170	180	190	200	210
GGATGTCCTG	ATCGATGGCG	TCCAGCGGGC	GGGCGGGCGG	CAGGGGTACC	CCGGGCTCCG	CTCCCTCGGC
220	230	240	250	260	270	280
CATTTGTTCA	GGTGCCATGT	CCTCCGGCCT	CCTTACCATG	GACGTAGTGC	GTTCATTCCA	GGCTGTGGAG
290	300	310	320	330	340	350
AACCGTTTGT	CCACAGCCTG	ACGGTGCCTG	TAGCCAAAAT	GTGCCGACGA	CCGAACAATC	GGTAGGTGAG
360	370	380	390	400	411
GCGCCTCACA	CCCGTGGCGC	GCCCAAAGCC	GCTCCCACGA	GGAGGTGCCG	TC ATG ACG	GTC
					Μ T	V

420 429 438 447 456 465

ATG GAG CAG CGG GGC GCT TAC CGG CCC ACA CCG CCG CCC GCC TGG CAG CCC CGC

MEQRGAYRPTPPPAWQPR

474 483 492 501 510 519

ACC GAC CCC GCG CCA CTG CTG CCC GAC CCG CTG CCC CAC CGC GTC CTG GGC ACC

TDPAPLLPDALPHRVLGT

528 537 546 555 564 573

GAG GCG GCC GCG GAG GCC GAC CCG CTA CTG CTG CCC CGC CTG TAC GCG GAG CTG

EAAAEADPLLLRRLYAEL

582 591 600 609 618 627

GTG CCC GGC CGC CGC TAC AAC ACG CAG GCC ACG GCT CTC ACC AAG CAG GGC CGG

VRGRRYNTQATALTKQGR

181 778

FI

CTC GCC

636 GTC TAC

645 CĆG TĆG

AGC ACG

654 GGC CAG

663

672 GTC V 726

GCC GCC

681 GCG A 735

GAG GCC

TGC C

GAG Ξ

1

A

V 690

V

?

S 699

S

T

G 708

Q

r·

A 717

A

A

CTC

GTG

CTG

GAG

GAG

CGC

GAC

TGG

CTC

TTC

CCC

AGC

TAC

CGG

GAC

ACC

CTC

GCC

L

V

L

E

E

R

D

W

L

F

p

S

Y

R

D

T

L

A

744

753

762

771

780

789

GCC

GTC

GCC

CGC

GGC

CTC

GAT

CCC

GTC

CAG

GCG

CTC

ACC

CTC

CTG

CGC

GGC

GAC

A

V

A

R

G

L

D

P

V

Q

A

L

T

L

L

R

G

D

798

807

816

825

834

843

TGG

CAC

ACC

GGG

TAC

GAC

CCC

CGT

GAG

CAC

CGC

ATC

GCG

CCC

CTG

TGC

ACC

CCT

W

H

T

G

Y

D

P

R

E

H

R

I

A

P

L

C

T

P

852

861

870

879

888

897

CTC

GCG

ACC

CAG

CTC

CCG

CAC

GCC

GTC

GGC

CTC

GCG

CAC

GCC

GCC

CGC

CTC

AAG

L

A

T

Q

L

P

H

A

V

G

L

A

H

A

A

R

L

K

906

915

924

933

942

951

GGC GAC GAC GTG GTC GCG CTC GCC CTG GTC GGC GAC GGC GGC ACC AGC GAG GGC

G

D

D

V

V

A

L

A

L

V

G

D

G

G

T

s

c.

G

960

969

978

987

996

1005

GAC

TTC

CAC

GAG

GCA

CTG

AAC

TTC

GCC

GCC

GTC

TGG

CAG

GCG

CCG

GTC

GTC

TTC

D

F

H

E

A

L

N

F

A

A

V

W

Q

A

P

V

V

F

	1014	1023	1032	1041	1050	1059
_				„ _			_ _	_	_
CTC	GTG CAG	AAC	AAC GGC	TTC	GCC ATC	TCC	GTC CCG	CTC	GCC AAG	CAG	ACC GCC
L	V Q	N	N G	F	A I	s	V P	L	A K	Q	T A

181 778

FIG, 4C

1063

1077

1086

1095

1104

1113

GCC

CCC·

TCG

CGG

GCC CAC

AAG

GCC

GTC

GGC

TAC

GGG

ATG

CGG

GGC

CGC

CTG GTC

A

0

3

L

A H

K

A

V

G

V

G

M

?

G

R

L V

1122

1131

1140

1149

1158

1167

GAC

r*/-' r* Ugjct

AAC

GAC

GCG GCG

GCC

GTG

CAC

GAG

GTC

CTC

AGC

GAC

GCC

GTG

GCC CAC

D

G

N

D

A A

A

V

H

E

V

L

S

D

A

V

A H

1176

1185

1194

1203

1212

1221

GCG

CGC

GCG

GGA

GGG GGG

CCG

ACG

CTC

GTG

GAG

GCG

GTG

ACC

TAC

CGC

ATC GAC

A

R

A

G

G G

P

T

L

V

E

A

V

T

Y

R

I D

1230

1239

1248

1257

1266

1275

GCC

CAC

ACC

AAC

GCC GAC

GAC

GCG

ACG

CGC

TAC

CGG

GGG

GAC

TCC

GAG

GTG GAG

A

9

T

N

A D

D

A

T

R

Y

R

G

D

S

E

V E

1284

1293

1302

1311

1320

1329

___ ,

-

-

_____

______

___

_

. _

_

_

_

- _

GCC

TGG

CGC

GCG

CAC GAC

CCG

ATC

GCG

CTC

CTG

GAG

CAC

GAG

TTG

ACC

GAA CGC

A

W

R

A

H D

P

ł

A

L

L

E

H

F

L

T

E R

GGG CTG

1338 CTC L

GAC D

1347

1356

1365 GCC CGC A R

1374 GAG GAC GCC

1383 GAG GCG ATG

GAG E

GAC D

GGC G

ATC r

CGG R

GGC A

G

L

E

D A

E

A

M

1392

1401

1410

1419

1428

1437

GCC

GCG

GAC

CTG

CGC

GCA

CGC

ATG

AAC

CAjG GAT CCjG

GCC

CTG GAC

CCC

ATG

GAC

A

A

D

L

R

A

R

M

N

Q

D P

A

L D

P

M

D

1446

1455

1464

1473

1482

1491

- _

- _____

-

_

- -

_____

_ _

CTG

TTC

GCC

CAT

GTG

TAT

GCC

GAG

ccc

ACC

CCC CAG

CTG

CGG GAG

CAG

GAA

GCC

L

F

A

H

V

Y

A

Ξ

P

T

? Q

L

R E

Q

c* u,

A

181 778

FIG. 4D

1500 1509 1518 1527 1536 1545

CAG TTC CGG GCC GAG CTG GCA GGG GAG GCC GAC GGG CCC CAA GGA GTC GGC CGA qlraelaaeadgpqgvgr

1558 1568 1578 1588 1598 1608

TGA AGAGAGTTGA CCATCGGGCC CCGAGAAGCG GGCCGATGAC CTCCGTTGGC CTTTGGCCGG

1618 1627 1636 1645 1654 1663

AAGGAGCCGG GCG ATG ACC ACC GTT GCC CTC AAG CCG GCC ACC ATG GCG CAG GCA

MTTVALKPATMAQA

1672 1681 1690 1699 1708 1717

CTC ACA CGC GCG TTG CGT GAC GCC ATG GCC GCC GAC CCC GCC GTC CAC GTG ATG LTRAL RDAMAADPAVHVM

1726 1735 1744 1753 1762 1771

GGC GAG GAC GTC GGC ACG CTC GGC GGG GTC TTC ĆGG GTC ACC GAC GGG .CTG GCC GcDVGTLGGVFRVTDGLA

1780 1789 1798 1807 1816 1825

AAG GAG TTC GGC GAG GAC CGC TGC ACG GAC ACG CCG CTC GCC GAG GCA GGC ATC KEFGEDRCTDTPLAEAGI

1834 1843 1852 1861 1870 1879

CTC GGC ACG GCC GTC GGC ATG GCG ATG TAC GGG CTG CGG CCG GTC GTC GAG ATG

LGTSVGMAMYGLRPVVEM

1888 1897 1906 1915 1924 1933

CAG TTC GAC GCG TTC GCG TAC CCG GCG TTC GAG CAG CTC ATC AGC CAT GTC GCG

QFDAFAYPAFEQLISKVA

181 778

FIG. 4E

1942

1951

1960

1969

1978

1987

CGG

GAT

GCG

CAA

CGC ACC

CGC

GGG GCG

ATG

CCG CTG

CCG

ATC ACC

ATC

CGT GTC

D

A

Q

R T

R

G A

M

P L

D

i T

I

R V

1996

2005

2014

2023

2032

2041

ccc

TAC

GGC

GGC

GGA ATC

GGC

GGA GTC

GAA

CAC CAC

AGC

GAC TCC

TCC

GAG GCG

?

Y

G

G

G I

G

G V

E

Η H

S

D S

S

E A

2050

2059

2068

2077

2086

2095

TAC

TAC

ATG

GCG

ACT CCG

GGG

CTC CAT

GTC

GTC ACG

CCC

GCC ACG

GTC

GCC GAC

Y

Y

M

A

T P

G

L H

V

V T

P

A T

V

A D

2104

2113

2122

2131

2140

2149

_

_

__

.

_____

- _

__

_

_ _

GCG

TAC

GGG

CTG

CTG CGC

GCC

GCC ATC

GCC

TCC GAC

GAC

CCG GTC

GTC

TTC CTG

A

V

G

L

L R

A

A I

A

S D

D

P V

V

F L

2158

2167

2176

2185

2194

2203

______

_______

_____

_________

_____

_

GAG

ccc

AAG

CGG

CTG TAC

TGG

TCG AAG

GAC

TCC TGG

AAC

CCG GAC

GAG

CCG GGG

Ξ

?

K

R

L Y

W

S K

D

S W

N

P D

E

P G

2212

2221

2230

2239

2248

2257

ACC

GTT

GAA

CCG

ATA GGC

CGC

GCG GTG

GTG

CGG CGC

TCG

GGC CGG

AGC

GCC ACG

T

V

E

P

I G

R

A V

V

R R

S

G R

S

A T

2266

2275

2284

2293

2302

2311

_____

_____

. ,

_______

____ _____

-

_

CTC

ATC

ACG

TAC

GGG CCT

TCC

CTG CCC

GTC

TGC CTG

GAG

GCG GCC

GAG

GCG GCC

L

I

T

Y

G P

s

L P

V

C L

E

A A

E

A A

2320

2329

2338

2347

2356

2365

- -

____

GAT CTG

CGG

GCC

GAG

GGC

TC-G GAC

CTC

GAA GTC

GTC

GCG

TCC CTG

GTG

CCC TTC

R

A

G

W D

L

E V

V

D L

R

S L

V

? F

181 778

FIG. 4F

2374 2383 2392 2401 2410 2419

GAĆ GAĆ GAG ACG GTT GTG CGC GTC GGT ĆĆĆ CGG AĆĆ GGA ĆĆĆ ĆĆĆ GTC GTC GTG

QDETVVRVGARTGRAVVV

2428 2437 2446 2455 2464 2473

ĆAĆ GAĆ TCG GGT GGT TAC ĆĆĆ GGC ĆĆĆ GGC GGG GAG ATC ĆĆĆ GCG GGC ATĆ AĆĆ

HESGGYGGPGGEIAAGIT

2482 2491 2500 2509 2518 2527

GAG ĆĆĆ TGC TTC ĆAĆ CAT ĆTĆ GAG GCG ĆĆĆ GTG CTG ĆĆĆ ĆTĆ ĆĆĆ GGG TTC GAĆ

ERCFHHLEAPVLRVAGFD

2536 2545 2554 2563 2572 2581

ATC CCG TAT CCG CCG CCG ATG CTG GAG CGC CAT CAT CTG CCC GGT GTC GAC C£G I?YPPPMLERHHLPGVDR

2590 2599 2608 2617 2628

ATC CITG GAC GCG GTG GGG CGG CTT CAG TGG GAG GCG GGG AGC TG ATG GCC CAG ILDAVGRLQWEAGS’MAQ

2637 2646 2655 2664 2673 2682

GTG ĆTĆ GAG TTC AAG ĆTĆ ĆĆĆ GAĆ ĆTĆ GGG GAG GGC ĆTĆ AĆĆ GAG GĆĆ GAG ATĆ

VLEFKLPDLGEGLTEAEI

2691 2700 2709 2718 2727 _____________>

GTC CGC TGG CTG GTG CAG GTC GGC GAC GTC GTG GCG ATC G VRWLVQVGDVVAI

181 778

FIG. 5

20 29 38 47

AG ATĆ DCC ĆTĆ ATC GCG ĆTG ĆTĆ GĆC AGG ATC TGĆ AĆĆ GĆC GCA ĆTG GĆC ĆGĆ

ISLIALLARICTAALAR

65 74 83 92 101

TTC ĆĆĆ GAG CTC AAC TCC AĆĆ CTC GAC ATG GAC GCĆ CGC GAG CTC GTA CGG CTC

F PELNSTVDMDAREVVRL

110 119 128 137 146 155

GAC CAG GTG CAC CTG GGC TTC GCĆ GCG ĆAG AĆĆ GAA CGG GGG CTC GTC GTC ĆĆG

DQVHLGFAAQTERGLVVP

164 173 182 191 200 209

CTC CTG CGG GAC GCG CAC GĆG CGG GAĆ GCĆ GAG TĆG ĆTĆ AGC GĆC GAG TTC ĆĆG vvrdahardaeslsa eea

218 227 236 245

CGG CTG ACC GAG GCC GCC CGG ACC GGC ACC CTC ACA RLTEAARTGTLT

181 778

Μ Τ V Μ E Q R #55 -PCR [> 5' -AAGAGATCTCATATGACGGTĆATGGAGĆAGCGG-3 '

Balii Ndel

Μ Τ Τ V A L K # 5 6 - PCR 5' -AAGAGATCTCATATGACĆAĆĆGTTGĆĆCTGAAG - 3 *

Balii Ndel

FIG. 6B #30-BP-PCR 3 ’-AGCAAAATGTTGCAGCACTGACCGACGTCCTAGGAA-5 * <]

Pstl BąmHI #31-BP-PCR 3 ’ -ACCGCATTAGTACCAGTATCGACAGACGTCCTAGGAA-5 '<]

Pstl BąmHI

181 778

FIG. 1A

GDGATSEGD O 5-gaattcggcgacggcgccagctccgagggĆgać-3

EcoRI

FIG. 1B

Ε Μ P D H L R 5'-GAGATGCCGGACCACCTGCGG-3' ' -CTCTACGGCCTGGTGGACGCCAGATCT-5¹

XŁ>aI

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania naturalnej awermektyny obejmujący fermentację Streptomyces avermitilis w warunkach i w pożywce fermentacyjnej do wytwarzania takiej naturalnej awermektyny, znamienny tym, że zwiększa się w drobnoustroju Streptomyces avermitilis liczbę kopii genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu zawierających segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub równoważna mu czynnościowa część tego segmentu DNA obejmująca sekwencję DNA oznaczoną jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID N02, SEQ. ID N03, SEQ. ID N04 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę alleliczną takiej sekwencji, poddaje się fermentacji ten mikroorganizm, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej dla wytwarzania takiej naturalnej awermektyny Streptomyces avermitilis.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się segment DNA, który obejmuje ponadto region DNA, regulujący ekspresję tego kompleksu dehydrogenazy alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się segment DNA stanowiący DNA rekombinacyjne.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się segment DNA dobrany z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DNA posiadają genomową mapę restrykcyjną taką, jak przedstawiono na fig. 3.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się segment DNA zawierający region DNA regulujący transkrypcję lub translację sekwencji DNA oznaczonej jako SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się część sekwencji DNA zgodnej z SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, która to sekwencja jest zdolna do hybrydyzacji, z sekwencjami odpowiednio, SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiana alleliczna takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako sondę, lub do amplifikacji całości lub części takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako primer polimerazowej reakcji łańcuchowej.