PL177922B1 - Segment DNA, plazmid, komórka gospodarza, geny kodujące kompleks dehydrogenazy, oczyszczony polipeptyd - Google Patents

Abstract

1. Segment DNA kodujacy kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgale- zionym lancuchu drobnoustroju Streptomyces avermitilis i/lub równowazna mu czynno- sciowa czesc tego segmentu DNA obejmujaca sekwencje DNA oznaczona jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiane alleliczna takiej sekwencji. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu pochodzący z drobnoustroju Streptomyces avermitilis, należącego do rodzaju Streptomyces. Przez ekspresję sekwencji zawartych w tym segmencie DNA wytwarzane są nowe polipeptydy. Przedmiotem wynalazku jest także plazmid, komórka gospodarza, geny kodujące kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów i oczyszczony polipeptyd.

W oparciu o odpowiednio zmodyfikowane drobnoustroje za pomocą segmentów DNA według wynalazku możliwe jest skonstruowanie nowych sposobów zwiększania wytwarzania naturalnej awermektyny oraz wytwarzania nowych pochodnych awermektyny poprzez fermentację.

Wiele produktów farmaceutycznych wytwarzanych jest przez drobnoustroje. Wśród tych drobnoustrojów na szczególną uwagę zasługują organizmy należące do rodzaju Streptomyces - grupy Gram-dodatnich bakterii obecnych w glebie; wytwarzają one ponad 90% antybiotyków nadających się do zastosowania w lecznictwie. Drobnoustroje z rodzaju Streptomyces są przedmiotem intensywnych badań, w których stosuje się techniki klonowania rekombinacyjnego DNA w celu wyizolowania genów biosyntezy antybiotyków, wytwarzania nowych związków, stanowiących pochodne lub hybrydy, wyizolowania genów regulatorowych i zbadania mechanizmów regulacyjnych zarówno pierwotnego, jak i wtórnego metabolizmu.

S. avermitilis wytwarza osiem różnych, lecz blisko spokrewnionych związków poliketydowych o działaniu przeciwpasożytniczym, zwanych awermektynami. Kompleks awermektynowy, wytwarzany przez S. avermitilis, utworzony jest z czterech składowych głównych, Ala, A2a, B1a i B2a oraz czterech składowych pobocznych, A1b, A2b, Bib i B2b. Strukturę tych składowych przedstawiono poniżej.

177 922

Awermektyna	R1	R2	X-Y
Ala	sec-butylowa	Me	CH=CH
Alb	izopropylowa	Me	CH=CH
A2a	sec-butylowa	Me	CH2-CH(OH)
A2b	izopropylowa	Me	CH2-CH(OH)
B1a	sec-butylowa	H	CH=CH
B1b	izopropylowa	H	CH=CH
B2a	sec-butylowa	H	CH2-CH(OH)
B2b	izopropylowa	H	CH2-CH(OH)

Poliketydowa struktura awermektyny pochodzi od siedmiu cząsteczek octanu, pięciu cząsteczek propionianu i jednej cząsteczki kwasu tłuszczowego o łańcuchu rozgałęzionym w pozycji alfa, który stanowi kwas S(+)-2-metylomasłowy lub kwas izomasłowy. Oznaczenia „A” i „B” odnoszą się do awermektyn, w których podstawnik w pozycji 5 stanowi, odpowiednio, grupa metoksylowa lub hydroksylowa. Cyfra „1” odnosi się do awermektyn posiadających podwójne wiązanie w pozycjach 22-23, a cyfra „2” - do awermektyn posiadających wodór w pozycji 22 i grupę hydroksylową w pozycji 23. Wreszcie, C-25 może mieć jeden z dwóch podstawników: podstawnik secbutylowy (pochodny L-izoleucyny) obecny jest w awermektynie serii „a”, a podstawnik izopropylowy (pochodny L-waliny) jest obecny w awermektynie serii „b” (por. Fisher, M.H. i Mrozik, H., 1984, „Macrolide Antybiotice”, Academic Press, rozdział 14).

Awermektynami „naturalnymi” w niniejszym opisie zwane są awermektyny wytwarzane przez S. avermitilis, w których podstawnik w pozycji 25 stanowi, jak to wspomniano powyżej, grupa izopropylowa lub sec-butylowa. Awermektyny, w których w pozycji 25 znajduje się grupa inna niż izopropylowa lub sec-butylowa, zwane są w dalszym ciągu niniejszego opisu „nowymi” lub „nienaturalnymi” awermektynami.

Jednym ze szlaków metabolicznych dla wytworzenia kwasów tłuszczowych o łańcuchach rozgałęzionych w pozycji alfa, w postaci CoA, jest szlak poprzez reakcję transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i następnie reakcję dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (zamiast tego, pochodne tłuszczowych acylo-CoA o rozgałęzionym łańcuchu można uzyskać z alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, wytwarzanych poprzez syntezę de novo). Szlaki metaboliczne przedstawiono poniżej.

177 922

CH-.CHCH(NH_)COOH 3 I ^{2 CH}3

Walina ch₃ch₂chch(nh₂)COOH CH.,

Izoleucyna

Transaminaza aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu

CH^CHCOCOOH 3 I

CH„

Kwas

2-oksoizowa-lerianowy

Synteza de novo°

Transaminaza

CH-.CH-CHCOCOOH 3 ² |

CH,

Kwas

2-okso-3-metyIowa-lerianowy

Kompleks dehydrogenazy Alfa-Ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu

Synteza de novo

CH-.CHCO. SCoA ³ I

CH-,

CH-.CH_CHCO.SCoA 3 2 j

CH_

Izobutyrylo-CoA

2-Metylobutyrylo-CoA

Szlak degradacji (Propionylo-CoA, Metyloamalonylo-CoA)

Szlak degradacji (Acetylo-CoA, Propionylo-CoA Metylomalonylo-CoA)

Biosynteza

Awermekt^nfe

CHCO.SCoA .CHCOOH

Egzogenny kwas tłuszczowy o rozgałęzionym łańcuchu

177 922

Uprzednio izolowano mutant S. avermitilis, nie wykazujący wykrywalnej aktywności dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) w ostatnim z wymienionych enzymów (Hafner i wsp., 1988, Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 88300353.5, publikacja nr 0284176). Mutant ten wyizolowano w wyniku standardowej mutagenezy chemicznej szczepu S. avermitilis ATCC 31272, w ekranie, pozwalającym wykryć brak wytwarzania ^l4CO2, substratu, który stanowił kwas 2-oksoizokapronowy (analog leucyny), znakowany ¹⁴C-1. Mutant ten jest zdolny do wytwarzania naturalnych awermektyn tylko pod warunkiem, że do pożywki, w której mutant fermentuje, doda się kwas tłuszczowy o łańcuchu rozgałęzionym w pozycji alfa lub prekursor zawierający grupę izopropylową lub sec-butylową (S-form). Mutant zdolny jest również do wytwarzania nowych, czyli nienaturalnych, awermektyn, jeżeli poddaje się go fermentacji w środowisku wodnym w warunkach tlenowych w pożywce zawierającej odpowiedni inny kwas karboksylowy, jak np. kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC) lub jego prekursor.

Klonowanie BCKDH S. avermitilis byłoby bardzo korzystne. Manipulacja tymi genami z zastosowaniem rekombinacyjnych technik DNA ułatwiłaby wytwarzanie naturalnych i nowych awermektyn. U niektórych gatunków można by oczekiwać zwiększenia miana naturalnych awermektyn poprzez zwiększanie liczby kopii genów BCKDH. Ponadto, wytworzenie nieodwracalnie zablokowanego szczepu bkd, w którym aktywność BCKDH byłaby trwale zniesiona lub zmodyfikowana poprzez podstawienie genowe, byłoby korzystniejsze niż dostępny obecnie mutant bkd, uzyskiwany jak to opisano powyżej, poprzez mutagenezę chemiczną.

Wieloenzymatyczne kompleksy dehydrogenazy alfa-ketonokwasów - kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH), kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) i kompleks dehydrogenazy alfa-ketoglutaranu (KGDH) katalizują dekarboksylację oksydatywną, odpowiednio, alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, pirogronianu i alfaketoglutaranu, uwalniając CO2 i wytwarzając odpowiednie acylo-CoA iNADH (Perham, R.N., 1991, Biochemistry, 30: 8501-8512). Każdy z kompleksów składa się z trzech różnych enzymów katalitycznych: dekarboksylazy (El), acylotransferazy (transacylazy) kwasu dihydroliponowego (E2) i dehydrogenazy kwasu dihydroliponowego (E3).

Dehydrogenaza alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BGKDH) stanowi wieloenzymatyczny kompleks, złożony z trzech składowych funkcjonalnych, E1, dekarboksylazy, E2, transacylazy i E3, dehydrogenazy kwasu dihydroliponowego. Oczyszczone kompleksy, pochodzące z Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa i Bacillus subtilis, składają się z czterech polipeptydów. Oczyszczone kompleksy, pochodzące od ssaków, również składają się z czterech polipeptydów, Eł-alfa, E1-beta, E2 i E3. Z Bacillus eubtilis wyizolowano kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów, wykazujący aktywność zarówno dehydrogenazy pirogronianowej, jak i dehydrogenazy alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Ten spełniający podwójną rolę kompleks utlenia pirogronian i dostarcza kwasów tłuszczowych o rozgałęzionym łańcuchu do wytwarzania fosfolipidów błonowych.

Klonowanie prokariotycznych genów dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu opisywano dla Pseudomonas i Bacillus, lecz nie opisywano ich dla Streptomyces. W systemach tych stwierdzono, że geny kodujące BCKDH są zgrupowane w operonie. Dokonano klonowania genów kompleksu BCKDH Pseudomonas putida i określono sekwencję nukleotydową tego regionu (Sykes i wsp., 1987, J. Bacteriol., 169: 1619-1625 i Burns i wsp., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 165-169 i 176: 311-317). Masa cząsteczkowa E1-alfa wynosi 45289, E1-beta - 37138, E2 - 45134, a E3 - 48164. W sekwencji zgrupowane są cztery geny: E1-alfa, E1-beta, E2 i E3. Analiza sposobem Northern blot wskazuje, że ekspresja tych czterech genów zachodzi za pośrednictwem jednego mRNA oraz że geny te tworzą operon. Stwierdza się obecność typowego prokariotycznego jednolitego promotora, bezpośrednio poprzedzającego początek regionu kodującego E1-alfa, który umożliwia konstytutywną ekspresję genów bkd Pseudomonas. Kodon inicjujący regionu kodującego E1-beta znajduje się zaledwie 40 nukleotydów za końcem otwartej ramki odczytu (ORF) E1-alfa. W przeciwieństwie do tego, między ORF E1-beta a E2 nie ma odstępu międzygenowego, jako że kodon „stop” między ORF E1-beta stanowi trójkę nukleotydów bezpośrednio poprzedzającą kodon inicju177 922 jący ORF E2. Odstęp międzygenowy między ORF E2 a E3 jest ograniczony do zaledwie 2 nukleotydów. Tak więc geny bkd Pseudomonas są ściśle sprzężone. Podobnie, dokonano klonowania operonu kodującego podwójny kompleks BCKDH/PDH Bacillus subtilis (Hemila i wsp., 1990, J. Bacteriol., 172: 5052-5063). Operon ten zawiera cztery ORF, kodujące cztery białka o ciężarze 42, 36, 48 i 50 kilodaltonów (kDa); wykazano, że są one w dużym stopniu homologiczne z podjednostkami E1-alfa, E1-beta, E2 i E3 grupy genów bkd Pseudomonas. Ostatnio dokonano klonowania i sekwencjonowania genów kodujących podjednostki alfa i beta składowej El podwójnego kompleksu enzymatycznego BCKDH/PDH, pochodzącego z Bacillus stearothermophilus (szacunkowa masa cząsteczkowa podjednostek alfa i beta wynosi, odpowiednio, 41000 i 35000) (Hawkins i wsp., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346).

Ponadto opisywano sekwencję kilku eukariotycznych podjednostek BCKDH E1-alfa i beta (ludzkich, bydlęcych i szczurzych). Ostatnio dokonano porównania sekwencji aminokwasowej wszystkich opublikowanych sekwencji, zawierających zarówno składową E1-alfa, jak i E1-beta, kompleksów PDH i BCKDH pochodzących od różnych gatunków, poprzez analizę komputerową (Wexler i wsp., 1991, FEBS Letters, 282: 209-213). Co ciekawe, zidentyfikowano kilka regionów podjednostek alfa i beta, które są jednakowe nie tylko we wszystkich dotychczas opisanych PDH, ale również w kompleksach BCKDH, pochodzących zarówno od organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych.

Opisujemy klonowanie genów dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, pochodzących z drobnoustroju Streptomyces avermitilis. Klonowania nowych genów dokonano stosując kombinację dwóch technik genetyki molekularnej, polimerazowej reakcji łańcuchowej DNA (PCR) i sondowania homologicznego. Sondowanie homologiczne polega na przeglądaniu biblioteki cDNA lub biblioteki genomowej za pomocą znakowanych radioaktywnie syntetycznych sond oligonukleotydowych, odpowiadających sekwencjom aminokwasowym białka. Niestety, technika ta wykazuje pewne ograniczenia: jednym z nich jest dość ostre ograniczenie zależne od degeneracji stosowanego oligonukleotydu. Ponadto, hybrydyzacja, stosowana przy przeglądaniu biblioteki, dokonywana jest z niewielką swoistością, tak więc dosyć wysoki jest odsetek wyników fałszywie dodatnich. Dla uniknięcia niektórych spośród ograniczeń hybrydyzacji oligonukleotydowej opracowano ostatnio odmianę sondowania homologicznego, której jednym z etapów jest polimerazowa reakcja łańcuchowa DNA (PCR), w której możliwe jest zastosowanie jako sond wysoce zdegenerowanych oligonukleotydów. Sposób ten wymaga jedynie znajomości sekwencji aminokwasowej dwóch krótkich regionów (o długości około 7-10 aminokwasów) kodowanego białka. Jako primery tej reakcji stosuje się dwa oligonukleotydy, odpowiadające obu sekwencjom peptydowym. Każdy z primerów można stosować w postaci mieszaniny w pełni zdegenerowanych oligonukleotydów, zawierających wszelkie możliwe kombinacje kodonów, kodujące znane sekwencje aminokwasowe. Matryca do amplifikacji może pochodzić z dowolnego z kilku źródeł DNA, np. bibliotek DNA genomowego i podwójnie zwiniętych postaci plazmidów. W kilku opublikowanych ostatnio doniesieniach dowiedziono użyteczności łączenia polimerazowej reakcji łańcuchowej z sondowaniem homologicznym dla identyfikacji genu pochodzącego od różnych gatunków.

Terminy techniczne, stosowane w niniejszym opisie, są znane specjalistom w zakresie genetyki molekularnej. Definicje tych terminów można znaleźć w licznych podręcznikach poświęconych biologii molekularnej, jak np. w „Genes”, wydanie II, autorstwa dr Benjamina Lewin, 1985, John Wiley & Sons, Inc., New York. Poniżej zdefiniowano terminy często stosowane w niniejszym opisie.

Antybiotyk: środek chemiczny, hamujący wzrost komórek bakteryjnych. Stosowany do selekcji rekombinacyjnych komórek bakteryjnych.

Gen odporności na antybiotyk: sekwencja DNA, nadająca odporność na antybiotyk po wprowadzeniu jej do komórki - gospodarza, który jest naturalnie wrażliwy na ten konkretny antybiotyk. Znany również jako marker antybiotykowy.

Bakteriofagi: wirusy zakażające bakterie.

cRNA: RNA o pojedynczej spirali, komplementarny do DNA, wytwarzany z tego ostatniego poprzez transkrypcję in vitro.

177 922

Chromosom: oddzielna jednostka genomu, zawierająca wiele genów.

Klon: duża liczba komórek lub cząsteczek, identyczna, jak ich jeden wspólny przodek.

Wektor klonujący: dowolny plazmid, do którego można wprowadzić obce DNA w celu klonowania tego DNA. Przenosi on obce DNA do komórki bakteryjnej - gospodarza w procesie transformacji.

CoA: koenzym A.

Sekwencja o lepkim końcu (cos) - sekwencja DNA pochodząca z bakteriofaga lambda, umożliwiająca upakowywanie in vitro.

Kosmid: plazmid, do którego włączono sekwencje cos, pochodzące z bakteriofaga lambda; w wyniku tego, DNA plazmidu (w którym znajdują się fragmenty obcego DNA) można upakować in vitro do otoczki faga.

Dalton: powszechnie używana jednostka masy, związana z rozmiarami cząsteczkowymi odpowiadającymi jednemu atomowi wodoru.

Ligacja DNA: tworzenie wiązania chemicznego łączącego dwa fragmenty DNA.

Komórki eukariotyczne: komórki organizmów wyższych, zawierające jądro otoczone błoną.

Grupa genów: geny znajdujące się fizycznie blisko siebie na chromosomie.

Genom: pełen zestaw chromosomów. Całość wszystkich genów osobnika.

Hybrydyzacja, hybrydyzacja kolonii: technika stosowana do identyfikacji kolonii bakteryjnych, zawierających wektory chimeryczne, których włączone DNA jest podobne do danej sekwencji.

kb: skrót na oznaczenie 100 par zasad DNA lub RNA.

NADH: zredukowany dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy.

Linker: krótki syntetyczny dwuniciowy oligodezoksynukleotyd, zawierający miejsce docelowe dla jednego lub więcej enzymów restrykcyjnych. Dodaje się go do wektora dla wytworzenia nowego linkera wielokrotnego, czyli wielokrotnego miejsca klonującego (MCS).

Nukleotyd: „klocek”, czyli jednostka monomeryczna kwasów nukleinowych.

Oligonukleotyd: krótki łańcuch nukleotydów.

Operon: pełna jednostka ekspresji i regulacji genów bakteryjnych, zawierająca geny struktury, geny regulatorowe i elementy kontrolne DNA, rozpoznawane przez produkt/produkty genów regulatorowych.

Plazmid: autonomiczne, samoreplikujące się, pozachromosomowe koliste DNA.

Liczba kopii plazmidu: liczba cząsteczek plazmidu, utrzymywana w bakterii na każdy chromosom gospodarza.

Primer: krótka sekwencja DNA lub RNA, komplementarna z jedną nicią DNA, posiadająca wolny koniec 3’-OH, od którego polimeraza DNA rozpoczyna syntezę łańcucha dezoksyrybonukleotydowego.

Komórki prokariotyczne: małe, względnie proste komórki większości drobnoustrojów.

Promotor: region DNA odpowiedzialny za zapoczątkowanie transkrypcji.

Enzym restrykcyjny: enzym rozpoznający swoistą krótką sekwencję DNA i przecinający ją.

Sekwencja rozpoznawcza restrykcji: sekwencja DNA, swoiście rozpoznawana przez konkretny enzym restrykcyjny, znana również jako miejsce docelowe.

Wektor wahadłowy: pełniący podwójną rolę wektor klonujący, zdolny do replikacji w jednym lub więcej alternatywnych organizmów - gospodarzy (np. E. coli i Streptomyces).

Southern blotting: sposób przenoszenia zdenaturowanego DNA z żelu agarozowego na filtr nitrocelulozowy, gdzie można dokonać jego hybrydyzacji z komplementarną sondą kwasu nukleinowego.

Subklonowanie: przenoszenie klonowanych fragmentów DNA z wektora jednego typu na inny, np. z kosmidu rekombinacyjnego na plazmid. Nowy plazmid rekombinacyjny transformuje się następnie do odpowiedniej komórki - gospodarza dla wytworzenia szczepu - subklonu.

177 922

Transkrypcja: synteza RNA z matrycy DNA.

Transformacja komórek bakteryjnych: nabycie nowych markerów genetycznych poprzez włączenie dodanego DNA.

Przedmiotem wynalazku jest segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu drobnoustroju Streptomyces avermitilis i/lub równoważna mu czynnościowa część tego segmentu DNA obejmująca sekwencję DNA oznaczoną jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę alleliczną takiej sekwencji.

Korzystnie ten segment DNA zawiera również region DNA regulujący ekspresję takiego kompleksu dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera SEQUENCE ID NO 1, SEQUENCE ID NO 2, SEQUENCE ID NO 3, SEQUENCE ID NO 4 lub SEQUENCE ID NO 5, lub odmianę allelicznąjedoej z tych sekwencji.

Korzystnie segment DNA według wynalazku stanowi DNA ęekombioacyjoe zawierające sekwencje DNA, przedstawione w SEQUENCE ID NO 1, SEQUENCE ID NO 2, SEQUENCE ID NO 3, SEQUENCE ID NO 4 lub SEQUENCE ID NO 5, lub odmianę allelicznąjednej z tych sekwencji.

Przedmiotem wynalazku jest także plazmid zawierający rekombinacyjne DNA obejmujące SEQUENCE ID NO 1, SEQUENCE ID NO 2, SEQUENCE ID NO 3, SEQUENCE ID NO 4 lub SEQUENCE ID No 5, lub odmianę allelicznąjedoej z tych sekwencji.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza z włączonym rekombinacyjnym DNA obejmującym SEQUENCE ID NO 1, SEQUENCE ID NO 2, SEQUENCE ID NO 3, SEQUENCE ID NO 4 lub SEQUENCE ID NO 5, lub odmianę allelicznąjednej z tych sekwencji.

W korzystnym wykonaniu wynalazku segment DNA charakteryzuje się tym, że dobrany jest z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DNA posiadają genomową mapę restrykcyjną taką, jak przedstawiono na fig. 3.

Przedmiotem wynalazku są również geny kodujące kompleks dehydrogenazy alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, zawierające segment DNA, dobrany z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, dokładnie scharakteryzowane genomową mapą restrykcyjnąjak przedstawiono na fig. 3.

Korzystnie segment DNA stanowi część sekwencji DNA, przedstawionej w SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej jednej z tych sekwencji, zdolny do hybrydyzacji, odpowiednio, SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej jednej z tych sekwencji, kiedy używany jest jako sonda, lub do amplifikacji całej lub części jednej z tych sekwencji, kiedy stosowany jest jako primer polimerazowej reakcji łańcuchowej.

Przedmiotem wynalazku jest również oczyszczony polipeptyd, zawierający sekwencję aminokwasowi przedstawioną w SEQ. ID NO 6, SEQ. ID NO 7, SeQ. ID NO 8 lub SEQ. ID NO 9.

W oparciu o niniejszy wynalazek możliwa jest realizacja metody wytwarzania naturalnej awermektyny, polegającej na poddaniu fermentacji, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiednich do wytworzenia takiej naturalnej awermektyny, S. avermitilis, w którym to drobnoustroju zwiększono liczbę kopii genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Awermektynę można otrzymywać także na drodze fermentacji, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiednich do wytworzenia takiej naturalnej awermektyny, S. avermitilis, w którym ekspresja genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu została zwiększona poprzez manipulację lub zastąpienie genów odpowiedzialnych za regulację takiej ekspresji.

Na innej nieco drodze można otrzymać nową awermektynę. Jest ona uzyskiwana także na drodze fermentacji, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiednich do wytworzenia takiej nowej awermektyny, S. avermitilis, w którym ekspresję genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu zmniejsza się lub znosi

177 922 poprzez manipulację (np. delecję, inaktywację lub zastąpienie) genów odpowiedzialnych za regulację takiej ekspresji.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym:

figura 1: sekwencja nukleotydowa primerów polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), stosowanych do klonowania fragmentu genu E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Wywiedzione sekwencje aminokwasowe, kodowane przez poszczególne oligodezoksynukleotydy, przedstawiono nad odpowiednimi sekwencjami DNA. Strzałki wskazują kierunek amplifikacji. Fig. 1A przedstawia primer prawy, a fig. 1B przedstawia primer lewy;

figura 2: porównanie sekwencji dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. „Wyprostowanie” wywiedzionych sekwencji aminokwasowych dla fragmentu genomowego CD-503, klonowanego z zastosowaniem PCR, Streptomyces avermitilis (Sa), Bacillus stearothermophilus (Bs), Pseudomonas putida (Pp) i Homo sapiens (Hs). Pionowe kreski wskazują aminokwasy identyczne. Wskazano umiejscowienie sekwencji odpowiadających prawemu i lewemu primerowi PCR, zastosowanych do klonowania (odpowiednio, u góry po stronie lewej i prawej);

figura 3: genomowa mapa restrykcyjna, umiejscowienie i subklony dla skupienia genów bkd Streptomyces avermitilis. Czarny prostokąt pod mapą wskazuje umiejscowienie i orientację początkowego E1-alfa-swoistego fragmentu genomowego CD503 S. avermitilis, klonowanego z zastosowaniem PCR. Wskazano subklony genomowe (pochodne pGEM-3Z). Przedstawiono również umiejscowienie i organizację genów strukturalnych bkd, kodujących podjednostki E1-alfa (E1a), E1-beta (Elb) i E2 BCKDH. Polamość zidentyfikowanych otwartych ramek odczytu (oznaczonych prostokątami) ma zwrot od strony lewej do prawej. Skróty: B, BamHI, E, EcoRI, K, KpnI, Bg, BgIII, S, SphI;

figury 4A, 4B, 4C, 4D, 4E i 4F: sekwencja nukleotydowa i wywiedzione produkty translacji 2728-bp fragmentu genomowego DNA S. avermitilis, zawierającego otwarte ramki odczytu (ORF) E1-alfa, E1-beta i E2 (częściowo) bkd. ORF E1-alfa rozciąga się od pozycji 403 do 1548 sekwencji, ORF E1-beta rozciąga się od pozycji 1622 do 2626 sekwencji, a ORF E2 rozpoczyna się w pozycji 2626. Nukleotydy ponumerowano powyżej linii sekwencji. Kodony „stop” oznaczono gwiazdką (*). Podkreślono prawdopodobne rybosomowe sekwencje wiążące Shine-Dalgamo. Sekwencje rozpoznawcze restrykcji BamHI ujęto w prostokąt;

figura 5: sekwencja nukleotydowa i wywiedzione produkty translacji 0,8-kb fragmentu genomowego DNA BgIII-SphI S. avermitilis (pCD539), zawierającego część ORF E2 bkd. 251 bp sekwencjonowano poczynając od miejsca BgIII (ujęte w prostokąt). Nukleotydy ponumerowano powyżej linii sekwencji;

figura 6: sekwencja nukleotydowa primerów mutagennego (po prawej) i uniwersalnego (po lewej) polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), zastosowanych do wytworzenia pochodnych pT7 dla heterologicznej ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli. Primery PCR zastosowano w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego NdeI do kodonu „start” translacji ORF E1-alfa lub E1-beta bkd S. avermitilis (odpowiednio, para primerów 55:31 i 56:30). Wywiedzione sekwencje aminokwasowe, kodowane przez poszczególne oligodezoksynukleotydy mutagenne, przedstawiono powyżej odpowiednich sekwencji DNA. Wskazano sekwencje rozpoznawcze restrykcji. Strzałki wskazują kierunek amplifikacji. Fig. 6A przedstawia prawe primery mutagenne, a fig. 6B przedstawia lewe primery mutagenne.

Poniżej opisano nowe sposoby klonowania genów bkd S. avermitilis i określania pierwszorzędowej struktury genów kodujących wieloenzymatyczny kompleks BCKDH S. avermitilis. Najpierw, opierając się na regionach zachowawczych zidentyfikowanych poprzez wielokrotne wyprostowanie wywiedzionych sekwencji peptydów BCKDH E1-alfa, pochodzących od różnych gatunków zwierząt i opisanych w literaturze, wytworzono dwa primery PCR, zwane „prawym” i „lewym” (fig. 1). Stosując oba primery, prawy i lewy, poprzez amplifikację genomowego DNA S. avermitilis wytworzono produkt PCR, o długości około 0,2 kb. Ten amplifikowany za pomocą PCR fragment DNA klonowano następnie do wektora E. coli pGEM-3Z w celu wytworzenia rekombinacyjnego plazmidu pCD503, po czym plazmid pCD503 transformowano do komórek kompetentnych DH5-alfa E. coli. Jeden z transformantów oznaczono jako szczep CD503. Sekwencjonowanie DNA klonowanego fragmentu

177 922

CD503 pozwoliło stwierdzić istnienie otwartej ramki odczytu o wywiedzionej sekwencji peptydów wysoce homologicznej z jednostką E1-alfa BCKDH (fig. 2). Klonowany fragment genomowego DNA CD503 zastosowano następnie jako sondę do przeglądania biblioteki chromosomowej S. avermitilis poprzez hybrydyzację kolonijną. Zidentyfikowano cztery kosmidy, a mianowicie CD518, CD519, CD520 i CD521. Analiza metodą restrykcji i metodą Southern blot wykazała, że cztery klony zawierały identyczne fragmenty genomowe. Sekwencjonowanie DNA ciągów delecji subklonowanych fragmentów genomowego DNA (jak to szczegółowo opisano w przykładzie 8) wykazało, że sekwencja CD503 stanowiła fragment pełnego skupienia genów bkd. Klonowane geny bkd S. avermitilis obejmują region chromosomu o długości około 15 kb (fig. 3). Analiza sekwencji DNA wykazała obecność próbnych sekwencji promotorowych transkrypcji i genów strukturalnych bkd, tworzących skupienie genów o następującej organizacji: sekwencja promotorowa, otwarte ramki odczytu E1-alfa, E1-beta i E2 (fig. 4 i 5).

Na koniec klonowano całe skupienie genów bkd S. avermitilis, położone w kierunku końca 3’ silnego promotora T7 Escherichia coli w celu uzyskania ekspresji w gospodarzu E. coli. Podobnie, otwarte ramki odczytu (ORF) E1-alfa i E1-beta klonowano również, oddzielnie lub razem, w kierunku końca 3’ promotora T7 i poszczególne produkty testowano co do ekspresji. Nowe primery mutagenne PCR, zastosowane do włączenia unikalnego miejsca restrykcyjnego Ndel w miejscu translacji ATG ORF E1-alfa i E1-beta, opisano szczegółowo w przykładzie 9 (por. również fig. 6). Badanie podwójnego systemu ekspresji plazmidu T7 wykazało, że co najmniej dwie otwarte ramki odczytu skupienia genów bkd S. avermitilis, pochodzącego z CD503 (E1-alfa i E1-beta), mogą ulegać w całości translacji przy ekspresji wE. coli. Ponadto, testy enzymatyczne, w których analizowano swoiście składową El kompleksu BCKDH, ostatecznie potwierdziły, że dwa rekombinacyjne klony E. coli - jeden zawierający całe skupienie genów bkd i drugi, zawierający zarówno ORF E1-alfa, jak i ORF E1-beta, wykazywały aktywność enzymu E1-BCKDH-swoistego (tabela I).

Opisujemy izolowanie genu bkd z produkującego awermektynę Streptomyces avermitilis. Obszerny genom Streptomycetes (około 10⁴ kb) jest ponad dwukrotnie większy od genomu Escherichia coli. Genom Streptomycetes utworzony jest z DNA o skrajnie wysokiej zawartości guanozyny z cytozyną (G + C) (średnio do 73%, a w niektórych regionach > 90%), blisko górnej granicy obserwowanej w przyrodzie. Ta szczególna charakterystyka wymaga opracowania swoistych dla Streptomycetes technik rekombinacyjnych DNA. Przykłady takich prób można znaleźć w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/048719, złożonym 16 kwietnia 1993 i w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/032925, złożonym 18 marca 1993. Zgłoszenia te włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie.

W części „Przykłady” szczegółowo opisano inne techniki, swoiście ulepszone dla osiągnięcia tego celu wynalazku, jak np. amplifikacja DNA genomowego z użyciem PCR, wytwarzanie ciągów delecji, sekwencjonowanie DNA i heterologiczna ekspresja genów bkd S. avermitilis w E. coli.

Poniżej przedstawiono szczegółowy opis etapów eksperymentalnych klonowania genów bkd S. avermitilis i otrzymane wyniki:

(a) Identyfikacjf w pa djednosece El-alfa peptydu BCKDH regionów zachowawczych, które mogłyby służyć jako ewentualne miejsca przyłączenia primerów PCR.

W celu identyfikacji regionów zachowawczych, mogących ewentualnie służyć jako sekwencje do wytworzenia odpowiednich primerów PCR, wyprostowano cztery sekwencje peptydów E1-alfa BCKDH, uzyskane od człowieka (Fisher i wsp., 1989, J. Biol. Chem., 264: 3448-3453), szczura (Zhang i wsp., 1987, J. Biol. Chem., 262: 15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch i wsp., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 311-317) i Bacillus sCkrcthermophilus (Perham i wsp., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346). Analizę komputerową w celu identyfikacji regionów podjednostki al-alfe, które są w wysokim stopniu identyczne zarówno w prokariotycznych, jak i w eukariotycznych kompleksach BCKDH, przeprowadzono z użyciem oprogramowania LineUp i Pretty z pakietu programowego do analizy sekwencji GCG (Madison, stan WI, Stany Zjednoczone Ameryki). Wielokrotne wyprostowanie czterech pep12

177 922 tydów BCKDH E1-alfa wykazało istnienie kilku regionów o zwiększonej homologii (por. Wexler, I.D. i wsp., 1991, FEBS Letters 282: 209-213). Motyw wiążący pirofosforan tiaminy (Perham i wsp., 1989, FEBS Letters 255: 77-82), umiejscowiony pomiędzy ludzkimi aminokwasami E1-alfa 182-229 i region zawierający miejsca fosforylacji 1 i 2, obejmujący aminokwasy 245-289, były szczególnie zachowawcze we wszystkich czterech peptydach E1-alfa BCKDH. Obecny był również uprzednio opisywany region o wysokiej homologii, umiejscowiony pomiędzy aminokwasami 291 a 307. Region ten wydaje się występować wyłącznie w dehydrogenazach alfa-ketonokwasów, zawierających zarówno podjednostkę alfa, jak i beta i nie jest on homologiczny z żadną sekwencją PDC El E. coli, ani ze składowymi E1 kompleksów dehydrogenazy alfa-ketoglutaranów E. coli i drożdży, które stanowią. dimery złożone z tylko pojedynczych polipeptydów E1. Z wyżej wymienionych przyczyn sugerowano, że ten ostatni region homologii odgrywa rolę w interakcji podjednostek (Patel i wsp., 1991, FEBS Letters 282: 209-213). Regiony zachowawcze, dobrane do wytworzenia primerów PCR, kodująreszty aminokwasowe 192-200 i 370-376 ludzkiego białka E1-alfa BCKDH.

(b) Wytworzenie nowych oligonukleotydów, pochodzących z regionów zachowawczych E1-alfa BCKDH, do zastosowania jako primery PCR.

Jak to omówiono powyżej, w wyniku badań z wielokrotnym wyprostowaniem struktury DNA, dobrano dwa regiony zachowawcze podjednostki E1-alfa BCKDH. Z regionu obejmującego aminokwasy 192-200 ludzkiej podjednostki E1-alfa BCKDH, którą zastosowano jako reprezentatywny model podjednostki E1-alfa BCKDH, wytworzono prawy primer PCR (fig. 1). Aminokwasy te znajdują się wewnątrz motywu wiążącego pirofosforan tiaminy. Z regionu obejmującego aminokwasy 370-376 podjednostki E1-alfa BCKDH, wytworzono lewy primer PcR (fig. 1). Ta ostatnia sekwencja aminokwasów znajduje się w pobliżu C-końcowego regionu peptydu. Zastosowano oznaczenia kodonów genu Streptomyces (F. Wright i M.J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65). Na końcu 5’ każdego z primerów znajduje się sekwencja rozpoznawcza enzymu restrykcyjnego (EcoRI w primerze prawym i XbaI w primerze lewym), dla ułatwienia klonowania produktów PCR. Pełna sekwencja prawego primera PCR jest następująca:

5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3’

Pełna sekwencja lewego primera PCR jest następująca:

5’-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3 ’

Podkreślono sekwencje niehomologiczne z genami E1-alfa bkd, włączone do primerów w celu klonowania (por. również fig. 1).

(c) Amplifikacja metodą PCR fragmentów genomowego DNA S. avermitilis.

Dokonano enzymatycznej amplifikacji genomowego DNA S. avermitilis, stosując warunki reakcji odpowiednie dla DNA o wysokiej zawartości GC tak, aby umożliwić skuteczną i swoistą amplifikację DNA Streptomycetes (por. przykład 2). PCR przeprowadzono z zastosowaniem powyżej opisanej kombinacji primerów (primer prawy - 5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3 ’ i primer lewy - 5 ’-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’). Dokonano rozdzielenia produktów amplifikacji poprzez elektroforezę na żelu agarozowym. W wyżej opisanych warunkach PCR, stosując tę kombinację primerów, wykryto pojedynczy prążek DNA (o długości około 250 par zasad).

(d) Klonowanie amplifikowanego fragmentu genomowego DNA do wektora klonującego Escherichia coli i następcza transformacja do gospodarza - E. coli.

Jak wspomniano uprzednio, miejsce restrykcyjne EcoRI włączono do prawego primera PCR, dla ułatwienia klonowania, a na końcu 5’ primera lewego znajdowało się miejsce restrykcyjne Xbal. Jednakże nie udało się dokonać klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 z zastosowaniem ligacji, przy której zarówno wstawiony fragment, jak i wektor klonujący ulegają trawieniu przez EcoRI i Xbal. Zastosowano zatem inny sposób klonowania fragmentu o długości PCR 0,25 kb, przy czym użyto fragmentu Klenow polimerazy I DNA dla wytworzenia tępych końców we fragmencie PCR. Po włączeniu fragmentu o tępych końcach do SamI-linearyzowanego wektora E. coli (pGEM-3Z[f+]) o tępych końcach dokonano regeneracji pojedynczego klonu rekombinacyjnego dla wytworzenia rekombinacyjnego plazmidu

177 922 pCD503. Następnie pCD wprowadzono poprzez transformację do komórek kompetentnych DH5-alfa E. coli. Dobrany transformant oznaczono jako szczep CD503. Analiza restrykcyjna potwierdziła, że plazmid pCD503, wyizolowany ze szczepu CD503 E. coli, istotnie zawierał wstawkę S. avermitilis o długości 0,25 kb.

(e) Subklonowanie wstawki DNA o długości 0,25 kb, amplifikowanej za pomocą PCR, do bakteriofaga M13, sekwencjonowanie DNA klonowanego fragmentu i identyfikacja sekwencji bkd-swoistych.

Wstawkę o długości 0,25 kb, znajdującą się w plazmidzie pCD503, subklonowano do bakteriofaga M13. W tym celu najpierw uwolniono wstawkę z wektora E. coli poprzez trawienie pCD503 za pomocą EcoRI i Pstl, dwa enzymy restrykcyjne, których sekwencje rozpoznawcze znajdują się w miejscu wielokrotnego klonowania wektora pGEM po obu stronach klonowanej wstawki. Następnie fragment swoisty klonowano zarówno do wektora mp18, jak i mp19 M13, poddanego obróbce EcoRI i Pstl. Klonowanie do obu wektorów zapewnia możliwość wytworzenia jednoniciowego DNA obu nici wstawki DNA w celu jej sekwencjonowania. Jeden klon, zawierający swoistą wstawkę, dobrany z eksperymentu transfekcji mp18, nazwano szczepem CD505. Klon drugi, również zawierający swoistą wstawkę, ale dobrany z eksperymentu transfekcji mp19, nazwano szczepem CD506. Sekwencjonowania DNA dokonano stosując metodę terminacji łańcucha dwudezoksynukleotydowego, z użyciem jako matrycy jednoniciowego DNA i zestawu TaqTrack (Promega). We wszystkich przypadkach dokonano sekwencjonowania obu nici DNA - jednej pochodzącej z klonu CD505 i drugiej komplementarnej, pochodzącej z klonu CD506. Analiza preferencji kodonów (pakiet programów do analizy sekwencji GCG, Madison, stan WI) danych z sekwencjonowania DNA otrzymanych klonów CD505 i CD506 wykazała istnienie otwartej ramki odczytu, zawierającej prawy kodon właściwy dla genu Streptomycetes. Następnie dokonano translacji próbnej otwartej ramki odczytu do sekwencji aminokwasowej stosując programy Seq i Translate oprogramowania IntelliGenetics Suite (IntelliGenetics Inc., Mountain View, stan Kalifornia), po czym przeprowadzono poszukiwanie podobieństwa w banku danych, stosując próbną sekwencję peptydową i program FASTDB z pakietu programów IntelliGenetics. Przeglądanie wszystkich banków danych, zarówno banków danych DNA (GenBank i EMBL), jak i banków danych białek (PIR i Swiss-Prot) wykazało jednoznacznie, że sekwencja pochodząca z klonu CD503 była wysoce homologiczna, lecz nowa i różna od wszystkich innych peptydów E1-alfa BCKDH, zarówno pochodzenia prokariotycznego, jak i eukariotycznego, notowanych w bankach danych. Wynik wielokrotnego wyprostowania sekwencji peptydowych E1-alfa BCKDH, pochodzących od człowieka, szczura, Pseudomonas putida i Bacillus stearothermophilus, jak również nową sekwencję peptydową CD503 E1-alfa BCKDH Streptomyces avermitilis, przedstawiono na fig. 2. Z danych tych można wyciągnąć wniosek, że produkt PCR, o długości 250 par zasad, genomu S. avermitilis, klonowany w szczepie CD503 E. coli, stanowi istotnie nowy fragment genowy E1-alfa bkd.

(f) Klonowanie całego skupienia genów bkd S. avermitilis, analiza metodą restrykcji i metodą Southern blot i tworzenie mapy chromosomowej.

Fragment DNA BamHI/EcoRI o długości 0,25 kb, pochodzący z pCD503, zawierający E1-alfa-bkd-swoistą sekwencję DNA S. avermitilis, zastosowano jako znakowaną radioaktywnie sondę do przeglądania biblioteki kosmidów genomowego dNa S. avermitilis poprzez hybrydyzację kolonijną. Zidentyfikowano i regenerowano cztery klony (CD518, CD519, CD520, CD521). Analiza metodą restrykcji i hybrydyzacji metodą Southern blot wykazała, że te cztery klony zawierały identyczne sekwencje, pochodzące z tego samego regionu chromosomu. Ta sama sonda została następnie inkubowana, z wysoką dokładnością, z produktami Southern blot strawionego DNA chromosomalnego, pochodzącego z S. avermitilis ATCC 31272. Ta ostatnia analiza potwierdziła tożsamość klonów regenerowanych z biblioteki genomowej. Mapę restrykcyjną fragmentu genomowego, zawierającego sekwencję CD503 S. avermitilis, przedstawiono na fig. 3.

(g) Subklonowanie fragmentu genomowego DNA, pochodzącego z klonów CD518 iCD521 i sekwencjonowanie DNA regionu chromosomalnego S. avermitilis, zawierającego skupienie genów bkd.

177 922

Fragmenty genomowe (o długości 1-2 kb), zawierające całość regionu bkd CD503 chromosomu S. avermitilis, subklonowano z klonów CD521 i CD518 biblioteki DNA do wektora E. coli pGEM-3Z. Poniżej przedstawiono listę subklonów wytworzonych w wyniku tej operacji wraz z krótkim opisem poszczególnych plazmidów: 1) plazmid pCD528 zawiera fragment BamHI o długości 7 kb, subklonowany z pCD518; 2) plazmid pCD545 zawiera fragment SphI o długości 2,3 kb, subklonowany z pCD528; 3) plazmid pCD550 zawiera fragment SphI o długości 6 kb, subklonowany z pCD521; 4) plazmid pCD559 zawiera fragment BamHI o długości 7 kb, subklonowany z pCD521; 5) plazmid pCD574 zawiera fragment Sphl-BgIII o długości 4,2 kb, subklonowany z pCD550; 6) plazmid pCD579 zawiera wstawkę o długości około 10,4 kb. Wstawka ta zawiera dwa przylegające fragmenty genomowe, które na powrót połączono: fragment Sphl/BgIII o długości 4,2 kb, subklonowany z pCD550 i fragment BgIII/BamHI o długości 6,2 kb, subklonowany z pCD559. Mapowanie restrykcyjne plazmidu, hybrydyzacja metodą Southern i analiza PCR potwierdziły tożsamość poszczególnych subklonów. Dla oznaczenia sekwencji nukleotydowej zastosowano metodę terminacji łańcuchów Sanger. W tym celu fragmenty genomowe S. avermitilis subklonowano następnie do bakteriofagów M13 mp18 i M13 mp19 dla określenia sekwencji obu nici DNA. Z wyżej wymienionych klonów, pochodzących z pGEM, wyizolowano kilka fragmentów restrykcyjnych DNA i dokonano ich ligacji do M13 mp18 i M13 mp19, uzyskując w wyniku następujące fagi rekombinacyjne:

CD 535: fragment DNA S. avermitilis o długości 0,4 kb, klonowany metodą PCR z zastosowaniem DNA pCD528 jako matrycy, primera swoistego 29-PCR-EX (5’-AAGAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-3’) i primera uniwersalnego 31PCR-BP (por. przykłada 9 i fig. 6). Dokonano restrykcji amplifikowanego fragmentu, stosując EcoRI i Pstl, po czym wklonowano go do DNA M13 mpl8, lineryzowanego za pomocą EcoRI/Pstl;

CD 536: fragment DNA, podobny do opisanego powyżej, klonowany do DNA M13 mp19;

CD 537: fragment DNA Sali o długości 1,15 kb, zawierający sekwencję CD503, subklonowany z pCD528 do M13 mp18;

CD 538: fragment DNA Sali pCD528 o długości 1,15 kb (zlokalizowany w kierunku końca 5’ od opisanego powyżej fragmentu SaII o długości 1,15 kb), klonowany do M13 mp18;

CD 539: fragment DNA BamHI/BgIII, o długości 1,5 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp18;

CD 541: fragment DNA SaII/BamHI o długości 0,35 kb, subklonowany z pCD528 do M13 mp18;

CD 542: fragment DNA SaII/BamHI o długości 0,35 kb, subklonowany z pCD528 do M13 mp19;

CD 553: fragment DNA BamHI/BgIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp18;

CD 554: fragment DNA BamHI, o długości 1,1 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp18; CD 555: fragment DNA, podobny do opisanego powyżej, klonowany w przeciwnej orientacji do M13 mp18;

CD 558: fragment DNA BamHI/HindIII BgIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD553 do M13 mpl9;

CD 561: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mpl8 (orientacja przeciwna niż w CD 537);

Cd 565: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mpl9;

CD 566: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mp19 (orientacja przeciwna niż w CD 565);

Cd 567: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD538 do M13 mp19;

CD 582: fragment DNA BamHI/BglU o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp18 (orientacja przeciwna niż w CD 553).

Wstawki genomowe S. avermitilis, zawarte w tych klonach, skrócono następnie poprzez traktowanie Egzonukleazą III w celu wytworzenia serii subklonów („ciągi delecji”, por. przykład 8).

177 922 (h) Analiza komputerowa danych z sekwencjonowania DNA, uzyskanych z klonowanych fragmentów DNA i identyfikacja ramek odczytu bkd E1-alfa, E1-beta i E2 S. avermitilis.

Sekwencję nukleotydową regionu genomowego S. avermitilis, o długości 2,7 kb, zawierającego geny bkd, przedstawiono na fig. 4. Przesuwnej analizy składu zasad regionu genomowego, o długości 27 kb, zawierającego otwarte ramki odczytu (ORF) bkd E1-alfa, E1-beta i E2 (częściowo) S. avermitilis, dokonano z użyciem oprogramowania „DNA Inspector”. W analizie tej określa się profil bieżącej średniej zawartości G + C, stosując rozstaw wynoszący 30 zasad i przesunięcie wynoszące 20. Całkowita zawartość G + C, odpowiadająca temu regionowi chromosomu S. avermitilis, wynosiła 72%. Bezpośrednio powyżej otwartych ramek odczytu bkd zlokalizowano miejsce o niskiej zawartości G + C (zawartość G + C wynosząca około 50%) - co jest wskaźnikiem regionu promotorowego.

Analizowano również zawartość G + C w funkcji pozycji kodonu. Z zastosowaniem tabeli kodonów Streptomyces dla 64 genów (F. Wright i MJ. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65) i oprogramowania „CodonPreference” (Genetics Computer Group, Madison, stan WI) wykryto otwarte ramki odczytu. Oprogramowanie „CodonPreference” jest swoistym względem ramek programem służącym do wyszukiwania genów, który rozpoznaje sekwencje kodujące białka poprzez ich podobieństwo do tabeli częstości kodonów lub poprzez odchylenie w ich składzie (zwykle GC) w pozycji trzeciej poszczególnych kodonów. ORF przedstawiono w postaci prostokątów poniżej wykresu dla ich odpowiednich ramek odczytu. Wykryto również wszystkie kodony „start” (ATG) i „stop” (linie pionowe). Poniżej każdego wykresu ORF zaznaczono rzadkie kodony wykryte w poszczególnych ramkach odczytu. Zawartość G + C obliczono, stosując przesuwne „okno”, utworzone z 25 kodonów, tak więc oczekiwano opóźnienia wynoszącego około 25 kodonów przed ujawnieniem się pełnego wpływu regionu kodującego białko. Uzyskano następujące trzy profile: 1) pierwsza pozycja w trójce, 2) druga pozycja w trójce, 3) trzecia pozycja w trójce. W wyniku tej analizy zlokalizowano trzy ORF bkd, odpowiadające następującym podjednostkom BCKDH: E1-alfa, E1-beta, E2 (fig. 4 i 5).

(i) Skład nowych oligonukleotydów, które można stosować jako primery w opartej na PCR mutagenezie ukierunkowanej.

Dla wprowadzenia miejsca restrykcyjnego Ndel do miejsca ATG początku translacji ORF E1-alfa i E1-beta zastosowano mutagenezę ukierunkowaną opartą na linkerach lub reakcji PCR. Wytworzono następujące nowe oligonukleotydy (por. również przykład 9 i fig. 6):

Lewe primery uniwersalne (wektorowe):

30- PCR-BP: 5 ’ -AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3 ’

31- PCR-BP: 5 ’ -AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA -3’

Prawe primery mutagenne:

55- PCR: 5’-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3 ’

56- PCR: 5’-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3’ (j) Mutageneza ukierunkowana genów bkd S. avermitilis w celu wytworzenia nowego miejsca restrykcyjnego Ndel powyżej otwartej ramki odczytu.

Plazmidy ekspresyjne stanowiły pochodne elementu pT7-7 (por. S. Tabor, 1990, w: Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York), zawierające ORF E1-alfa, E1-beta, E1-alfa + E1-beta lub pełne skupienie genów bkd S. avermitilis. Miejsce restrykcyjne Ndel wytworzono poprzez opartą na PCR mutagenezę ukierunkowaną. Do tych badań wytworzono następujących pięć plazmidów ekspresyjnych:

plazmid pCD 670: pochodna pT7-7, zawierająca otwartą ramkę odczytu (ORF 1) bkd E1-alfa S. avermitilis. Do genu bkd ' E1-alfa S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne Ndel, obejmujące kodon „start” ATG, poprzez amplifikację i jednoczesną mutagenezę z zastosowaniem primera mutagennego PCR 55-PCR (por. przykład 9 i fig. 6);

plazmid pCD 666: pochodna pT7-7, zawierająca otwartą ramkę odczytu (ORF 2) bkd E1-beta S. avermitilis. Do genu bkd E1-beta S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne Ndel, obejmujące kodon „start” ATG, poprzez amplifikację i jednoczesną mutagenezę z zastosowaniem primera mutagennego PCR 56-PCR (por. przykład 9 i fig. 6). Dla osiągnięcia optymalnej ekspresji tego ORF pozycję trzecią kodonu 7 zmieniono z C na G dla wytworze16

177 922 nia kodonu synonimowego, przypominającego kodon E. coli. Sekwencja peptydowa E1-beta nie zmieniła się wskutek tego podstawienia;

plazmid pCD 736: pochodna pT7-7, zawierająca zarówno ORF E1-alfa (ORF 1), jak i ORF E1-beta (ORF 2) pod kontrolą promotora T7;

plazmid pCD 705: podobny do pCD 736, ale zawierający połowę 3’ ORF E1-beta, ustawioną w niewłaściwej orientacji. Plazmid ten stosowano jako kontrolę ujemną w eksperymentach dotyczących ekspresji;

plazmid pCD 685: pochodna pT7-7, zawierająca całość skupienia genów bkd S. avermitilis.

(k) Ekspresja otwartych ramek odczytu genów bkd S. avermitilis w E. coli z zastosowaniem podwójnego plazmidowego systemu ekspresji T7.

Dokonano ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli, stosując podwójny plazmidowy system ekspresji T7 polimerazy RNA/promotora, w zasadzie w sposób opisany przez . S. Tabor (1990, w Current Protocols in Molecular Biolngy, str. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York). Analizowano pochodne E. coli C600 (pGP-1), zawierające różne produkty pT7-7. Do monitorowania ekspresji ORF S. avermitilis po indukcji cieplnej w gospodarzu - E. coli, stosowano elektroforezę na żelu pnliakęylamidowym z zastosowaniem soli sodowej siarczanu dodecylowego (SDS-PAGE). Analiza SDS-PAGe profilu białek w czasie indukcji wykazała nadmierną ekspresję indukowanych peptydów o rozmiarach podobnych do wartości przewidywanej (wywiedzionej z odpowiedniej sekwencji DNA), dla ORF E1-alfa i ORF E1-beta, jak to przedstawiono poniżej:

Wielkość przewidywana (Da) Wielkość rzeczywista (Da) ORF (E1-alfa) 41000 41000

ORF (E1-beta) 35000 34000 (l) Wykrywanie aktywności BCKDH S. avermitilis z zastosowaniem testu swoistego w nieoczyszczonym wyciągu rekombrnacyjnego klonu E. coli.

Wyniki te podsumowuje poniższa tabela 1 (przykład 11). Testy na wykrywanie BCKDH swoistego względem E1, przeprowadzone w nieoczyszczonym wyciągu z komórek E. coli, zawierających pCD736, wykazały istnienie znaczącej aktywności El po indukcji promotora T7. Hodowla w podobnych warunkach komórek, w których część wstawki była ustawiona w niewłaściwej orientacji (pCD705), wykazała poziom aktywności równy poziomowi tła.

W testach enzymatycznych stwierdzono ponadto, że nieoczyszczony wyciąg ze szczepu E. coli, zawierającego plazmid pCD685, również wykazywał znaczącą aktywność BCKDH E1 (>10-krotną wartość tła). Analizowano również niemdukowaną hodowlę tego klonu i stwierdzano podstawowy poziom aktywności dwukrotnie przewyzszający tło. Ten ostatni wynik był do przewidzenia, jako że wiadomo, że system T7 umożliwia niski poziom ekspresji konstytutywnej klonowanych genów, nawet w warunkach braku indukcji.

Klonowane skupienie genów bkd Streptomyces avermitilis jest korzystne w ulepszaniu wytwarzania naturalnej awermektyny poprzez zwiększanie liczby kopii tych genów lub poprzez optymalizację ich ekspresji w wytwarzających szczepach. Jedno z możliwych rozwiązań dla uzyskania skutecznej ekspresji klonowanych genów bkd polega na msercji tych genów do zawierającego liczne kopie genów wektora wahadłowego E. cnli/Streptomycetes (np. plazmid pCD262, Denoya C.D., 1993, „Novel Bacterial Plasmids Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli”, zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/032925, złożone 18 marca 1993), przy czym geny ulegają transkrypcji z silnego promotora. Sposób ten zapewnia skuteczną transkrypcję genów. Istnieje kilka innych sposobów osiągnięcia skutecznej ekspresji. Należy do nich zapewnienie: (a) siły promotora, (b) stabilności mRNA, (c) obecności lub nieobecności czynników regulacyjnych, (d) indukowalności i (e) mutageneza ukierunkowana w celu poprawy rozpoznawania rybosomu i sygnałów początku translacji.

Ekspresję genów bkd można również ulepszyć, zastępując promotor i regiony regulacyjne typu dzikiego różnymi innymi promotorami poprzez techniki zastąpienia genów. W literaturze opisano liczne przykłady korzystnych promotorów, które można zastosować dla

177 922 optymalizacji ekspresji opisywanych w niniejszym zgłoszeniu nowych genów bkd S. avermitilis, np. silny promotor ermE (Hopwood i wsp., 1985, „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, The John Innes Foundation, Norwich, Wielka Brytania) i indukowany tiostreptonem promotor tipA (Murakami i wsp., 1989, J. Bacteriol, 171, 1459-1466). Ponadto, w wyniku inaktywacji genów bkd przy jednoczesnym braku aktywności BCKDH poprzez delecję lub mutagenezę ukierunkowaną z zastosowaniem technik zastąpienia genów można wytworzyć ulepszone, nieodwracalnie zablokowane szczepy bkd Streptomyces avermitilis, korzystne dla wytwarzania nowych awermektyn.

W dalszym ciągu niniejszego opisu przedstawiono szczegółowe przykłady sposobów doświadczalnych, zastosowanych do klonowania i analizowania genów bkd pochodzących z S. avermitilis, które przedstawiono również na załączonych figurach. Dodatkowe szczegóły rutynowych technik, dobrze znane specjalistom w zakresie biologii molekularnej i oznaczenia poszczególnych zastosowanych enzymów, przedstawiono np. w podręczniku laboratoryjnym „Molecular Cloning”, autor: Maniatis i wsp., (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Przykład 1. Wytwarzanie DNA genomowego S. avermitilis.

Grzybnię S. avermitilis ATCC 31272 hodowano w postaci zlewającej się murawy na

pożywce agarowej YPD-2 przez 7 dni w temperaturze 29°C. Pożywka zawierała:
Wyciąg z drożdży Difco	10g
Bacto-pepton Difco	10 g
Dekstrozę	5 g
Agar Difco Bacto	20 g
Octan sodowy	2g
MOPS	10 g

Rozcieńczoną skrobię 1 Ardaminę pH² Pharmamedia³ Węglan wapniowy (CaCO3) pH doprowadzono do wartości 7,0. Objętość końcowa: 1 1. Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 25 minut w temperaturze 121 °C.

Wyhodowaną grzybnię posiano na 30 ml pożywki AS-7 (por. Hffoer i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe nr 88300353.5, publikacja nr 0 284 176) w kolbie z przegrodą o pojemności 300 ml, którą utrzymywano, ciągle mieszając, w temperaturze 29°C przez 24 godziny. Pożywka zawierała:

g 5 g 15 g 2g pH doprowadzono do wartości 7,2, stosując wodorotlenek sodowy (NaOH). Objętość końcowa: 1 1. Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 25 minut w temperaturze 121°C.

- wytworzono przez hydrolizę skrobi alfa-amylazą, pochodzącą z Bacillus licheniformis, do równoważnika dekstrozy wynoszącego około 40%.

² - uzyskano z Yeast Products, Inc., Clifton, stan NJ, 07012.

³ - uzyskano z Traders Protein, Memphis, Tn, 38108.

Około 0,3 ml powyższej hodowli posiano do kolejnej kolby z przegrodą o pojemności 300 ml, zawierającej 30 ml modyfikowanej płynnej pożywki Yeast Extract Malt Extract (YEME) (Bibb, M.J., Freeman, R.F. i Hopwood, D.A., 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155166). Modyfikowana pożywka YEME zawierała (w przeliczeniu na litr pożywki):

Wyciąg Difco Yeast Pepton Difco Bacto Wyciąg Oxoid Malt Sacharozę Glukozę g 5 g 3 g 300 g g

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 40 minut w temperaturze 121 °C. Po wyjałowieniu dodano 2 ml 2,5 M sześciowodzianu chlorku magnezowego (MgCE · 6H2O). Końcową objętość doprowadzono do 1 l.

Hodowle prowadzono przez 48-72 godzin w temperaturze 29°C. Grzybnie regenerowano poprzez odwirowanie, po czym wytworzono DNA genomowe według sposobu opisanego w „Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Pro18

177 922 cedure 2”, jak to opisano w podręczniku „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, The John Innes Foundation, Norwich, Wielka Brytania, 1985, autor: dr D.A. Hopwood i wsp. Grudki DNA zawieszono ponownie w 3 ml bufora TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0,1 mM EDTA).

Przykład 2. Amplifikacja DNA genomowego S. avermitilis z zastosowaniem polimerazowej reakcji łańcuchowej.

Genomowe DNA S. avermitilis amplifikowano enzymatycznie, stosując urządzenie do przeprowadzania cyklu obróbki cieplnej typu Perkin-Elmer Cetus. Reakcję PCR przeprowadzono stosując polimerazę Taq (Perkin-Elmer Cetus) i bufor dostarczony przez producenta, w obecności 200 μΜ dNTP, 15% glierrolu, po 0,5 μΜ kaźdcoo z primrrów, 50 ng matrccy DNA (w tym przypadku matrycę stanowiło genomowe DNA S. avermitilis) i 2,5 jednostek enzymu, w końcowej objętości 100 pl, przez 30 cykli. Profil cieplny pierwszego cyklu był następujący: 95°C przez 3 minuty (etap denaturacji), 55°C przez 2 minuty (etap wyżarzania)

72°C przez 2 minuty (etap wydłużania). Kolejnych 29 cykli miało podobny profil cieplny, z tym wyjątkiem, że etap denaturacji skrócono do 1,5 minuty. Primery DNA uzyskano z Genosys Biotechnologies, Inc. (stan Teksas). Sekwencja prawego primera PCR (fig. 1) była następująca: 5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3’, a sekwencja primera lewego: 5’-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’. Produkty amplifikacji rozdzielono za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. Elektroforezy próbki PCR dokonano w poziomym 1,5% żelu agarozowym w buforze IX TBE (90 mM Tris-HCl, pH 8,5, 90 mM kwasu borowego, 2,5 mM kwasu etclenodwuaminpczterooctpwego (EDTA) przez 1,5 godziny, przy napięciu wynoszącym 100 V, jak to opisał Maniatis i wsp. Rozdzielone odcinki DNA, stanowiące produkt PCR, zlokalizowano na żelu, stosując barwienie bromkiem etydowym i uwidocznienie prążków fluoryzujących w świetle ultrafioletowym o długości fali 365 nm. W opisanych powyżej warunkach PCR przy stosowaniu tej kombinacji primerów wykrywano pojedynczy prążek DNA (o długości 250 par zasad).

Przykład 3. Klonowanie amplifikowanego przy użyciu PCR fragmentu genomowego DNA o długości 0,25 kb do wektora E. coli i transformacja do gospodarza E. coli.

A. Regeneracja produktu PCR o długości 0,25 kb.

Jak to wspomniano powyżej, fragment DNA o długości 0,25 kb amplifikowano w PCR, stosując genomowe DNA S. avermitilis jako matrycę i kombinację primerów lewego i prawego. Jak to przedstawiono na fig. 1, primer prawy posiada miejsce rozpoznawcze EcoRI, umiejscowione na końcu 5’, a primer lewy posiada miejsce rozpoznawcze XbaI, umiejscowione na końcu 5’. Jednakże próby klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb z zastosowaniem ligacji, przy których zarówno wstawka, jak i wektor kodujący były trawione przez EcoRI i Xbal, nie powiodły się. Zastosowano więc inne rozwiązanie klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb, w którym zastosowano fragmenty Klenow polimerazy I DNA dla wytworzenia tępych końców we fragmencie PCR. Po amplifikacji (jak to opisano w przykładzie 2), dokonano dwukrotnej ekstrakcji około 80 μΐ produktów reakcji PCR, stosując mieszaninę fenol-chloroform, następnie dwukrotnie ekstrahowano eterem, po czym fragment DNA, stanowiący produkt PCR, strącono z użyciem etanolu, jak to opisywano uprzednio. DNA ponownie zawieszono w 18,5 pl H₂O, następnie dodano 2,5 μ1 10 x bufora Nicktranslation (0,5 m Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M siarczanu magnezowego (MgSOą), 1 mM ditiotreitu, 500 pg/ml bydlęcej albuminy osoczowej) (Maniatis i wsp., 1989) i 20 jednostek fragmentu Klenow polimerazy I DNA E. coli (Boehringer Mannheim Biochemicals) i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut. Następnie dodano 1 pl 2 mM dNTP (po mM każdego z 4 dNTP) i mieszaninę dalej inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Reakcje naprawy DNA zahamowano, dodając 1 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0 i całkowitą zawartość mieszaniny reakcyjnej przeniesiono na 1,5% żel agarozowy i poddano elektroforezie. Fragment DNA o długości 0,25 kb uwidoczniono sposobem opisanym powyżej i regenerowano poprzez elektroelucję, przeprowadzoną w następujący sposób: prążek DNA o długości 0,25 kb usunięto żyletką i dokonano regeneracji DNA z żelu agarozowego poprzez elektroelucję przez 35 minut przy napięciu 80 V w zagłębieniu w kształcie litery V, napełnionym 10 mM octanu amonowego, stosując urządzenie do elektroelucji jednokierunkowej (In177 922 temational Biotechnology Inc., New Haven, stan CT). Następnie dokonano strącenia DNA zużyciem etanolu, mieszaninę poddano granulacji, a na koniec ponownie rozpuszczono w 20 pl bufora DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM chlorku sodowego (NaCl), 0,1 mM EDTA; pH 7,5).

B. Trawienie za pomocą SmaI i defosforylacja wektora plazmidowego pGEM-3Z.

Około 1 pg plazmidu pGEM-3Zf(+) (Promega Corp., Madison, stan WI) i 2 jednostki enzymu restrykcyjnego Smal (wszystkie enzymy restrykcyjne nabyto w firmie Boehringer Mannheim Biochemicals) inkubowano w buforze testowym, wskazanym przez producenta, w temperaturze 25°C przez 3,5 godziny, przy czym całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 40 mikrolitrów (pl) dla wytworzenia linearnych cząsteczek o tępych końcach. Następnie, linearyzowany za pomocą Smal wektor poddano defosforylacji z zastosowaniem cielęcej jelitowej fosfatazy zasadowej (CIAP) (nabytej w Promega Corp., Madison, stan WI), według zaleceń producenta. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 35 minut w temperaturze 37°C, po czym dokonano dwukrotnej ekstrakcji DNA, stosując równą objętość mieszaniny fenolu i chloroformu, dwukrotnie ekstrahowano równą objętością eteru, a na koniec dokonano strącenia DNA poprzez dodanie dwukrotnej objętości absolutnego etanolu. Strącone DNA regenerowano poprzez odwirowanie (10000 x G) przez 10 minut i wysuszono pod próżnią. Uzyskaną grudkę rozpuszczono w 20 (p bufora DNA.

C. Ligacja dla wytworzenia pCD503.

Około 9 pil poddanego obróbce fragmentem Klenow DNA, stanowiącego produkt PCR, o długości 0,25 kb i około 1 pl linearyzowanego za pomocą SmaI, defosforylowanego z użyciem CIAP pGEM-3Zf(+) o tępych końcach inkubowano przez noc z jedną jednostką ligazy (New England BioLabs, Beverly, stan MA) w warunkach wskazanych przez producenta w temperaturze 14°C, przy czym całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 20 pl. Reakcję zakończono, umieszczając mikroprobówkę testową na lodzie, po czym 15 pl mieszaniny reakcyjnej zastosowano do transformacji kompetentnych komórek JM 109 E. coli według rutynowego sposobu, jak to opisał Maniatis i wsp., 1989. Uzyskano liczne transformanty oporne na ampicylinę. Wektor plazmidowy pGEM-3Zf(+) zawiera fragment DNA pochodzący z operonu lac Escherichia coli, kodującego fragment aminokońcowy beta-galaktozydazy (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. i Messing, J., 1985, Gene, 33, 103). Fragment ten, którego syntezę można indukować stosując izopropylotio-beta-D-galaktozyd (IPTG) zdolny jest do wewnątrzallelicznej (alfa) komplementacji z ułomną formą beta-galaktozydazy, kodowaną przez gospodarza. Komórki E. coli, wystawione na działanie induktora IPTG, syntetyzują oba fragmenty enzymu, tworząc niebieskie kolonie po wysianiu ich na pożywki zawierające substrat chromogenny 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-beta-D-galaktozyd (X-gal). Insercja obcego DNA do poliklonującego miejsca plazmidu powoduje inaktywację beta-galaktozydazowego fragmentu aminokońcowego i znosi alfa-komplementację. Tak więc, bakterie zawierające plazmidy rekombinacyjne tworzą kolonie białe. W tym doświadczeniu transformacji uzyskano liczne białe kolonie. Kolonie te powinny zawierać plazmid pCD503. Zostało to potwierdzone poprzez dobranie jednej kolonii, oznaczonej jako szczep CD503 i jej dalszą analizę. Pojedynczą kolonię bakteryjną szczepu E. coli CD503 posiano do płynnej pożywki Luria-Bertani (LB), zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, według rutynowych sposobów stosowanych w mikrobiologii. Pożywka LB zawierała:

Bacto-trypton 10 g

Wyciąg Bacto z drożdży 5 g

NaCl 10 g pH doprowadzono do wartości 7,0, stosując 5 N wodorotlenek sodowy (NaOH). Końcową objętość roztworu doprowadzono do 1 1. Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 20 minut w temperaturze 121 °C.

Hodowlę inkubowano przez noc w temperaturze 35°C. Następnego dnia rano komórki bakteryjne zebrano poprzez odwirowywanie z prędkością 10000 obr./min. przez 5 minut w temperaturze 4°C. Wektor plazmidowy wyizolowano ze świeżo zebranych komórek Escherichia coli CD503, stosując modyfikację sposobu opisanego przez Bimboim i Doły (Nucleic Acid Res., 1979, 7: 1513), jak to opisał Denoya i wsp., 1985, Microbios Lett., 29: 87. Wy20

177 922 izolowany plazmid DNA rozpuszczono na koniec w buforze DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5) dla wytworzenia stężenia wynoszącego około 1 pg pCD503 na 10 pl bufora. Potwierdzająca analiza restrykcyjna z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Pstl wykazała, jak tego oczekiwano, że pCD503 zawierał wstawkę DNA o długości 0,25 kb.

Przykład 4. Wytwarzanie znakowanych radioaktywnie sond DNA i RNA.

A. Wytwarzanie jednolicie znakowanych dwuaicicwych sond DNA.

Dwuniciowe sondy DNA wytworzono przez translację typu nick (ogólny opis tej techniki - por. Maniatis i wsp., 1989). W pierwszym etapie, zawierający sekwencję docelową swoisty fragment DNA Wytworzono poprzez odpowiednie trawienie enzymami restrykcyjnymi i oczyszczenie poprzez elektroelucję w zasadzie, tak jak opisano w przykładzie 1. Oznakowano około 1pg DNA, stosując w każdym przypadku [alfa^P] dCTP (znakowaną [alfa-³^] sól dezoksycytydynową 5’-trójfcsfcreau czterc(Crójetylc)emonowegc, którą uzyskano z NEN-Dupont oraz BRL Nick Trensletlon System, uzyskany z BRL Life Technologies Inc., zgodnie ze wskazówkami producenta. Typową reakcję przeprowadzono w objętości wynoszącej 50 pl. Po dodaniu 5 pl bufora Stop (jak to opisano we wskazówkach BRL), rozdzielono oznakowane DNA od nukleotydćw niewłączonych, stosując kolumnę przyciskową Stratagene według instrukcji obsługi dostarczonej przez producenta. W wyniku zastosowania powyższego sposobu uzyskano DNA znakowane 3²P o swoistej aktywności znacznie przekraczającej 10^rcpm/pg.

B. Wytwarzanie znakowanych jedacaicicwych sond RNA.

Sondy RNA, znakowane 3²P, wytworzono przez transkrypcję in vitro, stosując system trenskrypcyjny Riboprobe Gemini (Promega). Oczyszczony fragment docelowego DNA klonowano do wektora transkrypcyjnego pGEM-3Z, stosując rutynowe sposoby. Wytwarzanie matrycowego DNA plazmidowego do reakcji transkrypcji in vitro przeprowadzono tak, jak to opisano w przykładzie 3, jednakże włączając etap strącania glikolem polietylenowym (PEG) w celu wybiórczego usunięcia nukleotydów o małych rozmiarach, który mogłyby zanieczyszczać te preparaty. Etap ten przeprowadzono w następujący sposób: po etapie strącania etanolem grudkę ponownie zawieszono w 520 pl wody, po czym dodano 100 pl 5 M NaCl i 620 μΐ 13% PEG (MW 6000-8000). Po zmieszaniu rurkę iuk^owano na lodzie przez 1 godzinę, po czym dokonano granulacji DNA w temperaturze 4°C przy 10000 x G przez 15 minut. Grudkę przepłukano jednokrotnie z użyciem 500 (ił 80% zimnego etanolu, po czym w rutynowy sposób ponownie zawieszono.

Około 1 pg matrycowego plazmidowego DNA poddano lineeryzecji z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych SacI lub HindIII, a następnie dokonano ich transkrypcji in vitro z zastosowaniem DNA-zależnej polimerazy RNA, odpowiednio, bakteriofaga SP6 i T7. W reakcji tej zastosowano [alfa-’²!’] sól cytydynową 5’-trójfosfcranu cztero(trójetylo)amonowego (CTP), którą uzyskano z NEN-Dupont. Zastosowano warunki reakcji zalecane przez producenta. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną potraktowano 1 jednostką RQ1-DNazy (Promega) w celu degradacji matrycy DNA, ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol-chloroform, po czym strącono etanolem według rutynowych sposobów. Grudkę wysuszono i zawieszono ponownie w 20 pl wody pozbawionej RNazy (Promega). Dokonano analizy próbki o małej objętości znakowanego transkryptu RNA, stosując elektroforezę na żelu poliekrylamidowo-egarozowym, jak to opisał Deacya i wsp., 1987, J. Bacteriol 169: 3857-3860. W wyżej opisanych warunkach uzyskano rutynowo znakowane transkrypty o pełnej długości.

Przykład 5. Analiza DNA geacmowegc S. avermitilis poprzez hybrydyzację metodą Southern.

Około 10 pg oczyszczonego DNA geacmcwego S. avermitilis poddawano trawieniu dwoma jednostkami enzymu restrykcyjnego BamHI w temperaturze 37°C przez co najmniej 2 godziny. Pod koniec trawienia fragmenty DNA rozdzielono poprzez elektroforezę na 1% żelu agerozcwym (por. przykład 1A) i przeniesiono przez noc na błonę nylonową (średnica porów 0,45 pm) (błony Schleicher i Schuell Nytran), stosując metodę przenoszenia kapilarnego (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol., 98: 503). Następnego dnia błony nylonowe opakowano w folię plastykową i stronę zawierającą DNA każdej błony wystawiono na działanie

177 922 promieniowania ultrafioletowego (302 nm) w celu przytwierdzenia DNA do błony. Przeprowadzono hybrydyzację znakowanych radioaktywnie sond RNA lub DNA do DNA unieruchomionego na błonach nylonowych, stosując sposób opisany przez Maniatis i wsp., 1989. Prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono w temperaturze 42°C. Roztwór hybrydyzacyjny zawierał: 6 x SSC [1x: 0,15 M chlorku sodowego (NaCl), 15 mM cytrynianu sodowego, pH 7,0], 10 x odczynnik Denhardta [1x: 0,02% fikolu, 0,02% poliwinylopirolidonu, 0,02% bydlęcej albuminy osoczowej], 1% SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu), 100 pg/ml zdenaturowanego, rozfragmentowanego DNA spermy łososiowej, 10 0 pg/ml RINNA E. coli i 50% formamidu (Fluka). Po hybrydyzacji przez noc błony przepłukano w następujący sposób: dwukrotne płukanie 1 x SSC 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 15 minut i dwukrotne płukanie 0,1 x SSC 0,1% SDS w temperaturze 42°C przez 15 minut. W niektórych doświadczeniach hybrydyzację przeprowadzano w temperaturze 65°C w nieobecności formamidu, stosując zamiast SSC - SSPE [1x: 0,18 M NaCl, 10 mM fosforanu sodowego (NaPOą), pH 7,7, 1 mM EDTA]. Na koniec błony poddano ekspozycji z kliszą RTG w celu uzyskania obrazu autoradiograficznego.

Przykład 6. Klonowanie fragmentu genomowego DNA S. avermitilis CD503 o długości 0,25 kb do bakteriofaga M13 i sekwencjonowanie DNA.

Fragment genomowy DNA S. avermitilis CD503 o długości 0,25 kb klonowano do bakteriofagów M13 mp18 i M13 mp19 w celu wytworzenia jednoniciowego rekombinacyjnego DNA, które stosowano następnie jako matryce w metodzie dwudezoksy sekwencjonowania, opisanej przez Sangera (Sanger i wsp., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74: 54635467). Około 2 pg plazmidu pCD503, wytworzonego skróconym sposobem opisanym powyżej, poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pstl w celu uwolnienia wstawki genomowej S. avermitilis o długości 0,25 kb. Uprzednia analiza restrykcyjna wykazała, że pCD503, poddane trawieniu tylko EcoRI lub tylko Pstl, miało strukturę liniową. Niniejsza analiza wykazała, że wstawka o długości 0,25 kb nie zawierała miejsc rozpoznawczych EcoRI ani Pstl. Mieszaninę, powstałą po procesie trawienia, poddano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym, po czym dokonano elektroelucji i strącenia fragmentu o długości 0,25 kb, jak to opisano powyżej. Ponadto, po około 1 pg każdej z oczyszczonych dwuniciowych form replikacyjnych (RF) DNA M13 mp18 i M13 mpl9 poddano podwójnemu trawieniu EcoRI i Pstl, defosforylacji cielęcą jelitową fosfatazą zasadową (CIAP) (uzyskaną z Promega Corp., Madison, stan WI) i na koniec ligacji z fragmentem DNA o długości 0,25 kb, jak to opisano uprzednio. Oczyszczone wektory klonowane RF M13 uzyskano z New England BioLabs. Powstałe po ligacji mieszaniny zastosowano do transfekcji kompetentnych komórek JM109 E. coli. Dobrano pojedynczą białą łysinkę pochodzącą z transfekcji mp18 i pojedynczą łysinkę pochodzącą z transfekcji mp19, a następnie przeprowadzono hodowlę faga z wytworzeniem jednoniciowego DNA, jak to opisano w literaturze (Maniatis i wsp., 1989). Dokonano sekwencjonowania DNA poszczególnych jednoniciowych matryc DNA, stosując M13swoisty-40 primer sekwencjcnujący (New England BioLabs, nr katal. 1212) [³⁵S] 5’-[alfa-tio] trójfosforan dezoksyadenozyny NEN-Dupont i zestaw do sekwencjonowania TaqTrack (Promega), stosując się do wskazówek producenta (Promega). Dane z sekwencjonowania fragmentu genomowego S. avermitilis pCD503 przedstawiono na fig. 4.

Przykład 7. Klonowanie całego skupienia genów bkd S. avermitilis i tworzenie mapy chromosomowej.

Około 5 pg oczyszczonego pCD503 poddano podwójnej restrykcji, stosując zarówno enzym restrykcyjny BamHI, jak i EcoRI; fragmenty DNA rozdzielono poprzez elektroforezę na 1,2% żelu agarozowym, po czym fragment DNA o długości około 0,25 kb, zawierający sekwencję swoistą dla genu E1-alfa bkd S. avermitilis, regenerowano przez elektroelucję i wyznakowano przez translację typu nick w zasadzie tak, jak to opisano powyżej. Fragment DNA oznakowany [32P] zastosowano następnie jako sondę do przeglądania biblioteki kosmidów genomowych S. avermitilis. Szczegółowy opis tworzenia bibliotek genomowych można znaleźć w „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, autor: Maniatis i wsp., 1989. Pełny opis tworzenia biblioteki chromosomowej Streptomycetes przedstawiono w: Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, autor: Hopwood i wsp., 1985. Opis wektora

177 922 kosmidowego można znaleźć w: „Cosmid Vectors for Streptomyces Genomie DNA Cloning”, autor: Denoya, C.D., zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/048719, złożone 16 kwietnia 1993. Po przejrzeniu ponad 2200 rekombinacyjnych klonów biblioteki zidentyfikowano cztery klony. Te cztery hybrydyzujące klony (oznaczone jako klony E. coli CD518, CD519, CD520 i CD521) hodowano w pożywce LB, zawierającej ampicylinę jako czynnik selekcjonujący. Z poszczególnych hodowli wytworzono plazmidy, jak to opisano powyżej. Analiza metodą restrykcji i hybrydyzacji metodą Southern biot wykazała, że te cztery klony były spokrewnione, ponieważ zawierały identyczne regiony chromosomowe. Stosując następujące rutynowe sposoby uzyskano genomową mapę restrykcyjną S. avermitilis, pokrywającą cały region chromosomowy, w tym sekwencję CD503. Mapę tę przedstawia fig. 3.

Przykład 8. Wytwarzanie ciągów mutantów delecyjnych w celu ukierunkowanego sekwencjonowania DNA regionu chromosomowego S. avermitilis, zawierającego skupienie genów bkd.

Stosując egzonukleazę III wytworzono ciągi mutantów delecyjnych, pozbawionych kolejno coraz większej liczby nukleotydów, poczynając od jednego lub od drugiego końca docelowego DNA bkd S. avermitilis, w zasadzie według sposobu opisanego przez Henikoff, S. (1987, Methods Enzymol., 155: 156). W celu wytworzenia jednokierunkowych mutantów delecyjnych dokonano trawienia dwuniciowego DNA replikacyjnych form DNA, pochodzących z poszczególnych rekombinacyjnych bakteriofagów M13, stosując dwa enzymy restrykcyjne, przy czym miejsca cięcia obu tych enzymów restrykcyjnych znajdowały się pomiędzy jednym końcem docelowego DNA a miejscem wiążącym się z primerem. Enzym restrykcyjny, tnący bliżej sekwencji docelowych, wytwarzał koniec tępy, czyli wgłębiony koniec 3’; drugi enzym wytwarzał wystający koniec 3’. Egzonukleaza III katalizuje stopniowe usuwanie 5’-mononukleotydu z wgłębionych, czyli tępych końców 3’-hydroksylowych dwuniciowego DNA. Jednakże, wystające końce 3’ są całkowicie oporne na działanie tego enzymu. Tak więc tylko jeden koniec uzyskanego liniowego DNA był podatny na działanie egzonukleazy III, zatem trawienie postępowało w jednym kierunku od miejsca cięcia ku docelowym sekwencjom DNA.

Poniżej tytułem przykładu opisano wytwarzanie ciągu delecji pCD565. Plazmid pCD565 stanowi pochodną RF M13 mp19, zawierającą fragment SaII o długości 1,15 kb, którego część stanowi otwarta ramka odczytu E1-alfa bkd S. avermitilis. Plazmid pCD565 oczyszczono przez odwirowanie równowagowe w gradientach chlorku cezowego i bromku etydowego, jak to opisał Maniatis i wsp. (1989). Egzonukleaza III zdolna jest do inicjacji trawienia z jednoniciowych „wgłębień” - („nicks”), tak więc istotne jest stosowanie mieszanin zawierających poniżej 10% relaksowanych cząsteczek kolistych. Około 10 pg plazmidu pCD565 (por. rozdział „Szczegółowy opis wynalazku”) poddano podwójnemu trawieniu, stosując enzymy restrykcyjne SacI i Xbal w temperaturze 37°C przez 4 godziny, następnie ekstrakcji fenolem-chloroformem i eterem i strąceniu etanolem, jak to opisano powyżej. Grudkę zawieszono ponownie w 60 pl bufora reakcyjnego egzonukleazy III (10 x bufor egzonukleazy III: 0,66 M Tris-HCl, pH 8,0, 66 mM chlorku magnezowego (MgCfi). Roztwór DNA inkubowano następnie w temperaturze 37°C w obecności 300 jednostek egzonukleazy III (Ambion Inc.) i w odstępach 30-sekundowych pobierano próbki o objętości 2,5 pl. Próbki inkubowano następnie z nukleazą S1, po czym z nich z kolei pobierano próbki, które analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Próbki zawierające fragmenty DNA o pożądanych rozmiarach łączono, dokonywano naprawy DNA, stosując fragmenty Klenow polimerazy I DNA, poddawano przez noc ligacji i transfekowano do kompetentnych komórek JM109 E. coli. Wielkość wstawek w regenerowanych klonach analizowano metodą restryfikacji EcoRI/HindIII i elektroforezy na żelu agarozowym. Do sekwencjonowania dobrano pięć klonów: 565-D19 (o długości 1,1 kb), 565-D7 (o długości 0,88kb), 565-d24 (o długości 0,77 kb), 565-D1 (o długości 0,51 kb) i 565-D16 (o długości 0,36 kb). Z poszczególnych klonów wytworzono jednoniciowe DNA, które poddano sekwencjonowaniu, jak to opisano powyżej.

177 922

Przykład 9. Wytwarzanie plazmidów pCD670, pCD666, pCD736 i pCD685 w celu zastosowania do ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli.

Dokonano ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli stosując podwójny system plazmidowy polimerazy RNA/promotora T7, w zasadzie według opisu S. Tabor (1990) w: Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley - Interscience, New York).

A. Wytwarzanie pCD670, zawierającego ORF E1-alfa bkd S. avermitilis.

Do genu E1-alfa bkd S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne Ndel, zawierające kodon „start” ATG, stosując sposób oparty na PCR. Matrycę dla PCR stanowił plazmid pCD528, pochodna pGEM-3Z, zawierająca wstawkę genomową S. avermitilis o długości 7kb, w skład której wchodziła amino-końcowa połowa ORF E1-alfa. W reakcji PCR jako primery zastosowano dwa oligonukleotydy (por. fig. 6):

1. Lewy primer uniwersalny (wektorowy) 31-PCR-BP (5’-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTAACGCCA -3’), umiejscowiony w kierunku końca 3’ od miejsca HindIII MCS pGEM-3Z (pozycja 91-114). Na końcu 5’ tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i dwa miejsca restrykcyjne (BamHI i Pstl), dla ułatwienia klonowania produktów PCR.

2. Primer mutagenny 55-PCR (5 ’ -AAGAGATCTCATAATGCGGTCATGGAGCAGCGG-3’). Na końcu 5’ tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i jedna cząsteczka guaniny oraz dwa miejsca restrykcyjne (BgIII i Ndel). Miejsce Ndel zachodzi na kodon inicjujący ATG otwartej ramki odczytu E1-alfa.

Polimerazową reakcję łańcuchową przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Produkty reakcji analizowano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Amplifikowany za pomocą PCR fragment DNa o właściwych rozmiarach (o długości koło 1,1 kb) poddano elektroelucji, trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ndel i BamHI i subklonowaniu do linearyzowanego za pomocą Ndel/BamHI plazmidu pT7-7 dla wytworzenia plazmidu pCD663 w czasie ligacji i transformacji do komórek DH5-alfa E. coli.

Około 1 pg plazmidu pCD663 (wytworzonego ze szczepu CD663 E. coli z zastosowaniem skróconego sposobu wytwarzania plazmidów) poddano linearyzacji za pomocą BamHI, defosforylacji i na koniec ligacji w obecności około 0,5 pg elektroeluowanego oczyszczonego fragmentu BamHI o długości 1,1 kb, izolowanego z trawienia za pomocą BamHI plazmidu pCD550, dla wytworzenia plazmidu pCD670. Prawidłową orientację fragmentu BamHI o długości 1,1 kb w tym ostatnim produkcie określono przez mapowanie miejsc SaI'I obecnych we wstawce. Na koniec dokonano włączenia plazmidu pCD670 do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2 (przy czym plazmid zawierał gen polimerazy RNA T7) (por. Tabor, 1990). Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD676.

B. Wytwarzanie pCD666, zawierającego ORF E1-alfa bkd S. avermitilis.

Do genu E1-alfa bkd S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne Ndel, zawierające kodon „start” ATG, stosując sposób oparty na PCR. Matrycę dla PCR stanowił plazmid pCD574, pochodna pGEM-3Z, zawierająca wstawkę genomową S. avermitilis o długości 4,5 kb, w skład której wchodziła ORF E1-beta. W reakcji PCR jako primery zastosowano dwa oligonukleotydy (por. fig. 6):

1. Lewy primer uniwersalny (wektorowy) 30-PCR-BP: (5’-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3’), umiejscowiony w kierunku końca 5’ od miejsca EcoRI MCS pGEM-3Z (pozycja 2689-2712). Na końcu 5’ tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i dwa miejsca restrykcyjne (BamHI i Pstl), dla ułatwienia klonowania produktów PCR.

2. Primer mutagenny 56-PCR (5 ’ -AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3’). Na końcu 5’ tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i jedna cząsteczka guaniny oraz dwa miejsca restrykcyjne (BgIII i Ndel). Miejsce Ndel zachodzi na kodon inicjujący ATG otwartej ramki odczytu E1-beta.

Polimerazową reakcję łańcuchową przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Produkty reakcji analizowano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Amplifikowany za

177 922 pomocą PCR fragment DNA o właściwych rozmiarach (o długości koło 1,9 kb) poddano elektroelucji, trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ndel i EcoRI i subkloonwaniu do linearyznwaoegn za pomocą Ndel/EcoRI plazmidu pT7-7 dla wytworzenia plazmidu pCD666 w czasie ligacji i transformacji do komórek DH5-alfa E. coli. Na koniec dokonano włączenia plazmidu pCD666 do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2 (przy czym plazmid zawierał gen polimerazy RNA T7) (por. Tabor, 1990). Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformanE oznaczając go jako szczep CD673.

C. Wytwarzanie pCD736, zawierającego ORF bkd E1-alfa i E1-beta S. aveęmitilis.

Około 2 ug plazmidu pCD670 lioeaęyzowaon przez częściowe trawienie za pomocą

BamHI. W celu uzyskania formy liniowej plazmidu pCD670 próbki mieszaniny poddawanej trawieniu BamHI pobierano w następujących punktach czasowych: po 1, 3, 5, 10 i 20 minutach. Próbki przepuszczano przez 0,8% żel agarozowy. Formę liniową (o długości około 4,3 kb) regenerowano przez elektroelucję i poddawano defosforylacji z zastosowaniem CIAP (jak to opisano uprzednio). Następnie połowę defosforylowanej formy liniowej plazmidu pCD670 poddano ligacji z fragmentem BamHI/BgIII o długości 0,8 kb wyizolowanym z plazmidu pCD577. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5-alfa E. coli. Regenerowano dziesięć klonów i plazmidowe DNA, wytworzone sposobem skróconym, poddano analizie restrykcyjnej. Jeden klon, oznaczony jako szczep CD736, zawierał prawidłowo odtworzony plazmid pCD736. Na koniec plazmid pCD736 włączono do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2. Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD737. Inny klon, oznaczony jako szczep CD705, zawierał plazmid pCD705, w którym znajdował się fragment BamHI/BgIII o długości 1,8 kb w nieprawidłowej orientacji. pCD705 zastosowano jako kontrolę ujemną w doświadczeniach dotyczących ekspresji.

D. Wytwarzanie pCD685, zawierającego skupienie genów bkd S. avermitilis.

Pozostałą połowę defosfor^dowanej postaci plazmidu pCD670 uzyskanego, jak to opisano powyżej, przez częściowe trawienie enzymem restrykcyjnym BamHI podano ligacji z fragmentem BamHI o długości 7 kb, wyizolowanym z plazmidu pCD577. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5-alfa E. coli. Regenerowano wiele klonów; szesnaście z nich dobrano do dalszych analiz. Ekstrahowano plazmidowe DNA i poddano je analizie restrykcyjnej. Jeden klon, oznaczony jako szczep CD685, zawierał prawidłowo odtworzony plazmid (pCD685). Na koniec plazmid pCD685 włączono do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2. Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD687.

Przykład 10. Ekspresja genów bkd S. avermitilis w E. coli z zastosowaniem podwójnego systemu plazmidowego T7.

Pochodne E. coli C600 (pGP-1), zawierające różne produkty pT7-7 (szczepy CD676, CD673, CD737 i CD687), hodowano w 5 ml pożywki LB, zawierającej zarówno kanamycynę (60 ug/ml), jak i ampicylinę (60 ug/ml), przez noc w temperaturze 30°C. Hodowlę rozcieńczono następnie w stosunku 1:40 (0,25:10,00 ml) do hodowli w rurkach (o wymiarach 25 x 150 mm), zawierających świeżą pożywkę LB/amoicylioίj/kaoamycyoa i hodowano z napowietrzaniem wstrząsowym w temperaturze 30°C do uzyskania zmierzonej gęstości optycznej (OD590) wynoszącej około 0,4. Poprzez podniesienie temperatury do 42°C przez 30 minut dokonano indukcji genu kodującego polimerazę RNA T7, co z kolei spowodowało indukcję genów pozostających pod kontrolą promotora T7, jak to opisał S. Tabor (1990). Następnie temperaturę obniżono do 37°C i komórki hodowano, wstrząsając, jeszcze przez 90 minut. ^e^ukowane hodowle kontrolne utrzymywano w temperaturze 30°C. Dokonano analizy białek, stosując elektroforezę na żelu pnhakryIamidnwym z użyciem soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), jak to opisał C.D. Denoya i wsp., 1986, J. Bacteriol. 168: 1133-1141. Aktywność enzymatyczną poddano analizie, jak to opisano w przykładzie 11.

Przykład 11. Oznaczanie aktywności BCKDH E1 S. avermitilis w nienczyszcznnych wyciągach rekombinacyjnych szczepów E. coli.

A. Wytworzenie lizatu komórek.

177 922

Komórki (pochodzące z 8 ml hodowli) zebrano przez odwirowanie (5 minut przy 5000 obr./min. - 3000 x g - stosując rotor Sorvall SS-34, schłodzony do temperatury 4°C), po czym ponownie zawieszono je w 5 ml bufora „rozrywającego” (0,05 M bufora fosforanu potasowego, pH 7,0, zawierającego 3% Triton Χ-100, 15% glicerolu, 3 mM ditiotreitu, 1 mg/ml inhibitora trypsyny z białka jaja indyczego, 5 mM EDTA i 0,04 mM TPP [pirofosforanu tiaminy]). Ponownie zawieszone komórki przenoszono do tłoczni typu French, gdzie komórki ulegały pękaniu po jednym przejściu przy 5000 x psi. Następnie, próbki o objętości po 1,5 ml produktu tłoczenia w tłoczni typu French przenoszono do rurki do mikroodwirowywania i klarowano przez 30-sekundowe odwirowanie przy 14000 obr./min. Do każdego testu enzymatycznego stosowano próbkę o objętości 100 pl z każdego supematantu. Stężenie białka oznaczano, stosując test białkowy BioRad (BioRad Laboratories, Richmond, stan Kalifornia), oparty na sposobie wiązania barwnika, opisanym przez Bradforda (Bradford, M., Anal. Biochem., 72: 248,1976).

B. Test na kompleks sldadowejEldehydrogynazg alfa-ketfnokwasów o rozgalęaonym łańcuchu (BCKDH) S. pvermitilis.

Aktywność BCKDH E1 oznaczono stosując zmodyfikowaną wersję uprzednio opisywanego testu radiochemicznego (Chuang, D.T., 1988, Methods Enzymol., 166: 146-154 iHafner, E.W. i wsp., 1991, J. Antibiotics 44: 349). Na dno saalenej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 15 ml dodano: 0,148 ml 0,25 M bufora fosforanu potasowego o pH 6,5; 0,002 ml 0,1 M kwasu etylenonwuaminkcaterkkctowego (EDTA, sól dwuskdowp); 0,004 ml 0,1 M MgCh; 0,02 ml 3,7 mM pirofosforanu tiaminy (TPP); 0,2 ml 37 mM NaAsOi; 0,01 ml 37 mM 2,6-dwuchlorofenkloindofenklu (sól sodowa, Sigma D-1878); 0,008 ml roztworu podstawowego alff-[1-¹⁴C]ketoizokapronianu (wytworzonego jak to opisano poniżej); 0,058 ml wody i 0,1 ml sklarowanego beakomórkkwego wyciągu. Wylot fiolki natychmiast zatkano papierem typu Whatman 4CHR (nr katalogu Whatmana 3004614), który następnie impregnowano z użyciem Sotyable (środek zwiększający rozpuszczalność tkanek i żelu, nabyty w firmie NEN-Dupont). Ba fiolce umieszczono zptyczkę plastykową; zptycakę i górną połowę fiolki oblano parafiną i poddano inkubacji, delikatnie wstrząsając, przez 2 godziny w temperaturze 30°C. Po zakończeniu inkubacji papier filtracyjny przeniesiono do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 7 ml, zawierającej 4 ml płynnej mieszaniny scyntylacyjnej „Reany Safe” (Beckman) dla oznaczenia radioaktywności. Roztwór podstawowy alfa-[ 1-C]eetoizkeαpronipnu wytworzono, mieszając 5,6 mikaklitra 20 mM alfp-ketkizokapronianu (sól sodowa, Sigma K-0629), 50 mikrolitrów alfa-[1-¹⁴C]ketkizkkppromanu (55 mCi/mmol, 50 pCi/ml, Amersham) i dostateczną ilość wody dla uayseαnia końcowej objętości 1 ml. Swoistą, aktywność składowej E1 dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu wyrażono w pr^molach dwutlenku węgla uwalnianego na minutę na miligram białka, jak to przedstawiono w poniższej tabeli 1.

Tabela 1

Aktywność dehydrogenazy E1 alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu Streptomyces avermitilis w nieoczyszczonych wyciągach rekombinacyjnych komórek E. coli

Produkt	Plazmid	Szczep	Indukcja	Aktywność swoista E1 BCKDH1'2
1	2	3	4	5
Bez wstawki	pT7-7	CD677	+	0,9
E1-a	pCD670	CD676	-	0,6
			+	0,8
E1-b	pCD666	CD673	-	0,5
			+	0,7
E1-[a+b]	pCD736	CD737	-	2,0
			+	13,7

177 922

Tabela 1 (ciąg dalszy)

1	2	3	4	5
E1-[a+b]3	pCD705	CD705	-	0,9
			+	0,5
E1-[a+b]-E2-E3	pCD685	CD687	-	2,9
			+	6,0

¹ Swoistą aktywność składowej El dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu wyrażono w pikomolach dwutlenku węgla uwalnianego na minutę na miligram białka ² Wyniki stanowią średnią dwóch pomiarów ³ Produkt ten zawierał część C-końcową otwartej ramki odczytu E1-beta umiejscowioną w niewłaściwej orientacji i był stosowany jako kontrola ujemna

SEQUENCE ID NR 1 przedstawia sekwencję DNA kodującą podjednostkę' E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 403-1548.

SEQUENCE ID NR 2 przedstawia sekwencję DNA kodującą podjednostkę E1-beta BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 1622-2626.

SEQUENCE ID NR 3 przedstawia sekwencję DNA, rozpoczynającą otwartą ramkę odczytu, kodującą region aminokońcowy podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 2626-2727.

SEQUENCE ID NR 4 przedstawia sekwencję DNA, odpowiadającą zasadom 3-251 pCD539. Stanowi ona wewnętrzną część sekwencji genu kodującego podjednostkę E2 BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 5.

SEQUENCE ID NR 5 przedstawia 2728 par zasad fragmentu genomowego DNA S. avermitilis, przedstawionego na fig. 4, zawierającego otwarte ramki odczytu podjednostek E1-alfa, E1-beta i E2 (część) BCKDH S. avermitilis.

SEQUENCE ID NR 6 przedstawia sekwencję aminokwasową podjednostki E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasowa jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 1.

SEQUENCE ID NR 7 przedstawia sekwencję aminokwasową podjednostki E1-beta BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasowa jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 2.

SEQUENCE ID NR 8 przedstawia sekwencję aminokwasową części aminokońcowej podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasowa jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 3.

SEQUENCE ID NR 9 przedstawia sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA odpowiadającą zasadom 3-251 pCD539 (SEQUENCE ID NR 4). Ta sekwencja aminokwasowa odpowiada wewnętrznemu fragmentowi peptydowemu podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis.

ΥΠ 922

Specyfikacja sekwencji (1) Informacja ogólna (i) ZGŁASZAJĄCY: (wszystkie wskazane kraje z wyjątkiem Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej) (A) NAZWA: Pfizer Inc.

(B) ULICA: 235 East 42nd St., 20th Floor (C) MIASTO: New York (D) STAN: Nowy Jork (E) KRAJ: Stany Zjednoczone A.P.

(F) KOD POCZTOWY: 100017 (ii) ZGŁASZAJĄCY: (wyłącznie dla Stanów Zjednoczonych Amery ki Północnej):

(A) CLAUDIO D. DENOYA (B) ULICA: 80 Spyglass Circle (C) MIASTO: Groton (D) STAN: Connecticut (E) KRAJ:Stany Zjednoczone A. P.

(F) KOD POCZTOWY: 06340 (iii) TYTUŁ WYNALAZKU: Geny kodujące kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgaęzionym łańcuchu, pochodzące z drobnoustroju Streptomyces avermitilis“ (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Peter C. Richardson (B) ULICA: Pfizer Inc., 235 East 42nd St., 20th Floor (C) MIASTO: New York (D) STAN: Nowy Jork (E) KRAJ: Stany Zjednoczone A.P.

(F) KOD POCZTOWY: 10017-5755 (v) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/100518 (B) DATA ZŁOŻENIA: 30 lipca 1993 (C) KLASYFIKACJA:

(vi) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/100518 (B) DATA ZŁOŻENIA: 30 lipca 1993 (vii) INFORMACJA O RZECZNIKU/AGENCIE:

(A) NAZWISKO: Sheyka, Robert F.

(B) NUMER LICENCJI: 31304 (C) NUMER REFERENCYJNY: PC8346 (viii) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (212) 573-1189 (B) TELEFAKS: (212) 573-1939 (C) TELEKS: (-) (ix) LICZBA SEKWENCJI: 9 (x) FORMA KOMPUTEROWA:

(A) TYP MEDIUM: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1,0, wersja 1,25

177 922 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1146 par zasad (b) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 1

ATGACGGTCA TGGAGCAGCG GGGCGCTTAC CGGCCCACAC CGCCGCCCGC CTGGCAGCCC

CGCACCGACC CCGCGCCACT GCTGCCCGAC GCGCTGCCCC ACCGCGTCCT GGGCACCGAG

GCGGCCGCGG AGGCCGACCC GCTACTGCTG CGCCGCCTGT ACGCGGAGCT GGTGCGCGGC

CGCCGCTACA ACACGCAGGC CACGGCTCTC ACCAAGCAGG GCCGGCTCGC CGTCTACCCG

TCGAGCACGG GCCAGGAGGC CTGCGAGGTC GCCGCCGCGC TCGTGCTGGA GGAGCGCGAC

TGGCTCTTCC CCAGCTACCG GGACACCCTC GCCGCCGTCG CCCGCGGCCT CGATCCCGTC

CAGGCGCTCA CCCTCCTGCG CGGCGACTGG CACACCGGGT ACGACCCCCG TGAGCACCGC

ATCGCGCCCC TGTGCACCCC TCTCGCGACC CAGCTCCCGC ACGCCGTCGG CCTCGCGCAC

GCCGCCCGCC TCAAGGGCGA CGACGTGGTC GCGCTCGCCC TGGTCGGCGA CGGCGGCACC

AGCGAGGGCG ACTTCCACGA GGCACTGAAC TTCGCCGCCG TCTGGCAGGC GCCGGTCGTC

TTCCTCGTGC AGAACAACGG CTTCGCCATC TCCGTCCCGC TCGCCAAGCA GACCGCCGCC

CCGTCGCTGG CCCACAAGCC CGTCGGCTAC GGGATGCCGG GCCGCCTGGT CGACGGCAAC

GACGCGGCGG CCGTGCACGA GGTCCTCAGC GACGCCGTGG CCCACGCGCG CGCGGGAGGG

GGGCCGACGC TCGTGGAGGC GGTGACCTAC CGCATCGACG CCCACACCAA CGCCGACGAC

GCGACGCGCT ACCGGCGCGA CTCCGAGGTG GAGGCCTGGC GCGCGCACGA CCCGATCGCG

CTCCTGGAGC ACGAGTTGAC CGAACGCGGG CTGCTCGACG AGGACGGCAT CCGGGCCGCC

CGCGAGGACG CCGAGGCGAT GGCCGCGGAC CTGCGCGCAC GCATGAACCA GGATCCGGCC

CTGGACCCCA TGGACCTGTT CGCCCATGTG TATGCCGAGC CCACCCCCCA GCTGCGGGAG

CAGGAAGCCC AGTTGCGGGC CGAGCTGGCA GCGGAGGCCG ACGGGCCCCA AGGAGTCGGC

CGATGA (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1005 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

177 922 (xi) : OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 2

ATGACCACCG TTGCCCTCAA GCCGGCCACC ATGGCGCAGG CACTCACACG CGCGTTGCGT

GACGCCATGG CCCCCGACCC CGCCGTCCAC GTGATGGGCG AGGACGTCGG CACGCTCGGC

GGGGTCTTCC GGGTCACCGA CGGGCTCGCC AAGGAGTTCG GCGAGGACCG CTGCACGGAC

ACGCCGCTCG CCGAGGCAGG CATCCTCGGC ACGGCCGTCG GCATGGCGAT GTACGGGCTG

CGGCCGGTCG TCGAGATGCA GTTCGACGCG TTCGCGTACC CGGCGTTCGA GCAGCTCATC

AGCCATGTCG CGCGGGATGC GCAACGCACC CGCGGGGCGA TGCCGCTGCC GATCACCATC

CGTGTCCCCT ACGGCGGCGG AATCGGCGGA GTCGAACACC ACAGCGACTC CTCCGAGGCG

TACTACATGG CGACTCCGGG GCTCCATGTC GTCACGCCCG CCACGGTCGC CGACGCGTAC

GGGCTGCTGC GCGCCGCCAT CGCCTCCGAC GACCCGGTCG TCTTCCTGGA GCCCAAGCGG

CTGTACTGGT CGAAGGACTC CTGGAACCCG GACGAGCCGG GGACCGTTGA ACCGATAGGC

CGCGCGGTGG TGCGGCGCTC GGGCCGGAGC GCCACGCTCA TCACGTACGG GCCTTCCCTG

CCCGTCTGCC TGGAGGCGGC CGAGGCGGCC CGGGCCGAGG GCTGGGACCT CGAAGTCGTC

GATCTGCGCT CCCTGGTGCC CTTCGACGAC GAGACGGTTG TGCGCGTCGG TGCGCGGACC

GGACGCGCCG TCGTCGTGCA CGAGTCGGGT GGTTACGGCG GCCCGGGCGG GGAGATCGCC

GCGGGCATCA CCGAGCGCTG CTTCCACCAT CTGGAGGCGC CGGTGCTGCG CGTCGCCGGG ttccacatcc cgtatccgcc gccgatgctg gagcgccatc atctgcccgg tgtcgaccgg

ATCCTGGACG CGGTGGGGCG GCTTCAGTGG GAGGCGGGGA GCTGA (2) INFORMACJA 0 SEQ ID NO 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) D-ŁDGOSC: 102 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 3

ATGGCCCAGG TGCTCGAGTT CAAGCTCCCC GACCTCGGGG AGGGCCTGAC CGAGGCCGAG

ATCGTCCGCT GGCTGGTGCA GGTCGGCGAC GTCGTGGCGA TC (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁOGOSC: 249 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 4:

177 922

ATCTCCCTCA TCGCGCTGCT cgccaggatc tgcaccgccg cactggcccg cttccccgag

CTCAACTCCA CCGTCGACAT GGACGCCCGC GAGGTCGTAC GGCTCGACCA GGTGCACCTG

GGCTTCGCCG CGCAGACCGA ACGGGGGCTC GTCGTCCCGG TCGTGCGGGA CGCGCACGCG

CGGGACGCCG AGTCGCTCAG CGCCGAGTTC GCGCGGCTGA CCGAGGCCGC CCGGACCGGC

ACCCTCACA (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) D-ŁDGOSO: 2728 par zasad (b) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 5

GTCGACGCGG GCTCCGAAAC CGCGGATCAC GCCGTCGTCG ATGAGCCGGT TGATTCGCGC

CTCGGCCACG GACCGTATCG AGGCGCGGCC

ATCGATGGCG TCCAGCGGGC GGGCGGGCGG

CATTTGTTCA GGTGCCATGT CCTCCGGCCT

GGCTGTGGAG AACCGTTTGT CCACAGCCTG

CCGAACAATC GGTAGGTGAG GCGCCTCACA

GGAGGTGCCG TCATGACGGT CATGGAGCAG

GCCTGGCAGC CCCGCACCGA CCCCGCGCCA

CTGGGCACCG AGGCGGCCGC GGAGGCCGAC

CTGGTGCGCG GCCGCCGCTA CAACACGCAG

GCCGTCTACC CGTCGAGCAC GGGCC.AGGAG

GAGGAGCGCG ACTGGCTCTT CCCCAGCTAC

CTCGATCCCG TCCAGGCGCT CACCCTCCTG

CGTGAGCACC GCATCGCGCC CCTGTGCACC

GGCCTCGCGC ACGCCGCCCG CCTCAAGGGC

GACGGCGGCA CCAGCGAGGG CGACTTCCAC

GCGCCGGTCG TCTTCCTCGT GCAGAACAAC

CAGACCGCCG CCCCGTCGCT GGCCCACAAG

GTCGACGGCA ACGACGCGGC GGCCGTGCAC

CGCGCGGCAG GGGGGCCGAC GCTCGTGGAG

GTAGGCATTG GCACGCGACA CGTGGGCGCG

GTCCGCCTGG AGCATCTGGA GGATGTCCTG

CAGGCGGTACC CCGCGCTCCG CTCCCTCGGC

CCTTACCATG GACGTAGTGC GTTCATTCCA

ACGGTGCCTG TAGCCAAAAT GTGCCGACGA

CCCGTGGCGC GCCCAAAGCC GCTCCCACGA

CGGGGCGCTT ACCGGCCCAC ACCGCCGCCC

CTGCTGCCCG ACGCGCTGCC CCACCGCGTC

CCGCTACTGC TGCGCCGCCT GTACGCGGAG

GCCACGGCTC TCACCAAGCA GGGCCGGCTC

GCCTGCGAGG TCGCCGCCGC GCTCGTGCTG

CGGGACACCC TCGCCGCCGT CGCCCGCGGC

CGCGGCGACT GGCACACCGG GTACGACCCC

CCTCTCGCGA CCCAGCTCCC GCACGCCGTC

GACGACGTGG TCGCGCTCGC CCTGGTCGGC

GAGGCACTGA ACTTCGCCGC CGTCTGGCAG

GGCTTCGCCA TCTCCGTCCC GCTCGCCAAG

GCCGTCGGCT ACGGGATGCC GGGCCGCCTG

GAGGTCCTCA GCGACGCCGT GGCCCACGCG

GCGCTGACCT ACCGCATCGA CGCCCACACC AACGCCGACG ACGCGACGCG CTACCGGGGG

177 922

GACTCCGAGG TGGAGGCCTG GCGCGCGCAC GACCCGATCG CGCTCCTGGA GCACGAGTTG

ACCGAACGCG GGCTGCTCGA CGAGGACGGC ATCCGGGCCG CCCGCGAGGA CGCCGAGGCG

ATGGCCGCGG ACCTGCGCGC ACGCATGAAC CAGGATCCGG CCCTGGACCC CATGGACCTG

TTCGCCCATG TGTATGCCGA GCCCACCCCC CAGCTGCGGG AGCAGGAAGC CCAGTTGCGG

GCCGAGCTGG CAGCGGAGGC CGACGGGCCC CAAGGAGTCG GCCGATGAAG AGAGTTGACC

ATCGGGCCCC GAGAAGCGGG CCGATGACCT CCGTTGGCCT TTGGCCGGAA GGAGCCGGGC

GATGACCACC GTTGCCCTCA AGCCGGCCAC CATGGCGCAG GCACTCACAC GCGCGTTGCG

TGACGCCATG GCCGCCGACC CCGCCGTCCA CGTGATGGGC GAGGACGTCG GCACGCTCGG

CGGCGTCTTC CGGGTCACCG ACGCGCTCGC CAAGGAGTTC GGCGAGGACC GCTGCACGGA

CACGCCGCTC GCCGAGGCAG GCATCCTCGG CACGGCCGTC GGCATGGCGA TGTACGGGCT

GCGGCCGGTC GTCGAGATGC AGTTCGACGC GTTCGCGTAC CCGGCGTTCG AGCAGCTCAT

CAGCCATGTC GCGCGGGATG CGCAACGCAC CCGCGGGGCG ATGCCGCTGC CGATCACCAT

CCGTGTCCCC TACGGCGGCG GAATCGGCGG AGTCGAACAC CACAGCGACT CCTCCGAGGC

GTACTACATG GCGACTCCGG GGCTCCATGT CGTCACGCCC GCCACGGTCG CCGACGCGTA

CGGGCTGCTG CGCGCCGCCA TCGCCTCCGA CGACCCGGTC GTCTTCCTGG AGCCCAAGCG

GCTGTACTGG TCGAAGGACT CCTGGAACCC GGACGAGCCG GGGACCGTTG AACCGATAGG

CCGCGCGGTG GTGCGGCGCT CGGGCCGGAG CGCCACGCTC ATCACGTACG GGCCTTCCCT

GCCCGTCTGC CTGGAGGCGG CCGAGGCGGC CCGGGCCGAG GGCTGGGACC TCGAAGTCGT

CGATCTGCGC TCCCTGGTGC CCTTCGACGA CGAGACGGTT GTGCGCGTCG GTGCGCGGAC

CGGACGCGCC GTCGTCGTGC ACGAGTCGGG TGGTTACGGC GGCCCGGGCG GGGAGATCGC

CGCGGGCATC ACCGAGCGCT GCTTCCACCA TCTGGAGGCG CCGGTGCTGC GCGTCGCCGG

GTTCGACATC CCGTATCCGC CGCCGATGCT GGAGCGCCAT CATCTGCCCG GTGTCGACCG

GATCCTGGAC GCGGTGGGGC GGCTTCAGTG GGAGGCGGGG AGCTGATGGC CCAGGTGCTC

GAGTTCAAGC TCCCCGACCT CGGGGAGGGC CTGACCGAGG CCGAGATCGT CCGCTGGCTG

GTGCAGGTCG GCGACGTCGT GGCGATCG

(2) INFORMACJA 0 SEQ ID NO 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 381 aminokwasów

(B) TYP: aminokwas

(C) LICZBA NICI: jedna

(D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd

(xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 6:

Met Thr Val Met Glu Gin Arg Gly Ala Tyr Arg Pro Thr Pro Pro 15 10 15

177 922

Ala

Trp GIo

Pro 20

Arg Thr

Asp

Pro

Ala 25

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 30

Ala

Leu

Pro

Hi3

Arg

Val

Leu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Asp

Pro

Leu

3S

40

45

Leu

Leu

Arg

Arg

Leu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Val

Airg

Gly

Arg

Arg

Tyr

Aso

50

55

60

Thr

GIo

Ala

Thr

Ala

Leu

Thr

Ly3

GIo

Gly

Arg

Leu

Ala

VaI

Tyr

Pro

65

70

75

80

Ser

Ser

Thr

Gly

GIo

Glu

Ala

Cys

Glu

VaI

Ala

Ala

Ala

Leu

Val

Leu

85

90

95

Glu

Glu

Arg

Asp

Trp

Leu

Phe

Pro

Ser

Tyr

Arg

Asp

Thr

Leu

Ala

Ala

100

105

110

Val

Ala

Arg

Gly

Leu

Asp

Pro

VaI

GIo

Ala

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

115

120

125

Asp

Trp

His

Thr

Gly

Tyr

Asp

Pro

Arg

Glu

His

Arg

Ile

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Cys

Thr

Pro

Leu

Ala

Thr

Glo

Leu

Pro

His

Ala

VaI

Gly

Leu

Ala

His

145

150

155

160

Ala

Ala

Arg

Leu

Lys

Gly

Asp

Asp

Val

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

Val

Gly

165

170

175

Asp

Gly

Gly

Thr

Ser

Glu

Gly

Asp

Phe

His

Glu

Ala

Leu

A3o

Phe

Ala

180

185

190

Ala

V^1

Trp

GIo

Ala

Pro

Val

Val

Phe

Leu

Val

Glo

Aso

Aso

Gly

Phe

195

200

205

Ala

Ile

Ser

Val

Pro

Leu

Ala

Lys

GIo

Thr

Ala

Ala

Pro

Ser

Leu

Ala

210

215

220

His

Lys

Ala

Val

Gly

Tyr

Gly

Met

Pro

Gly

Arg

Leu

VaI

Asp

Gly

Aso

225

230

235

240

Asp

Ala

ALa

Ala

Val

Hi.3

Glu

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Val

Ala

His

Ala

245

250

255

Arg

Ala

Gly

Gly

Gly

Pro

Thr

Leu

VaI

Glu

Ala

Val

Thr

Tyr

Arg

Ile

260

265

270

Asp

Ala

His

Thr

Aso

Ala

Asp

ASp

Ala

Thr

Azq

Tyr

Arg

Gly

Asp

Ser

275

280

285

Glu

Val

Glu

Ala

Trp

Arg

Ala

His

Asp

Pro

Ile

Ala

Leu

I 2U

Glu

His

290

295.

300

Glu

Leu

Thr

Glu

Arg

Gly

Leu

Leu

Asp

Glu

Ast

Gly

Ile

Arg

Ala

Ala

305

310

315

320

Arg

Glu

Asp

Ala

Glu

Ala

Met

Ala

Ala

Asd

Leu

Arg

Ala

Arg

Met

Aso

325

330

335

GIo

A3p

Pro

Ala

Leu

Asp

Pro

Met

Aso

Leu

Phe

Ala

His

VaI

Tyr

Ala

340

345

350

Glu Pro Thr Pro Glo Leu Arg Glu GIo Glu Ala Gin Leu Arg Ala Glu

177 922

355 360 ³⁶⁵

Leu Ala Ala Glu Ala Asp Gly Pro Gln Gly Val Gly Arg 370 375 380 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 334 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 7:

Met 1

Thr

Thr

Val Ala 5

Leu

Lys Pro

Ala Thr Met Ala Gln Ala Leu Thr

10

15

Arg

Aia

Leu

Arg

Asp

Ala

Met

Ala

Ala

Asp

Pro

Ala

Val

His

Val

Met

20

25

30

Gly

Glu

Asp

Val

Gly

Thr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Arg

Val

Thr

Asp

Gly

35

40

45

Leu

Ala

Lys

Glu

Phe

Gly

Glu

Asp

Arg

Cys

Thr

Asp

Thr

Pro

Leu

Ala

50

55

60

Glu

Ala

Gly

Ile

Leu

Gly

Thr

Ala

Val

Gly

Met

Ala

Met

Tyr

Gly

Leu

65

70

75

80

Arg

Pro

Val

Val

Glu

Met

Gln

Phe

Asp

Ala

Phe

Ala

Tyr

Pro

Ala

Phe

85

90

95

Glu

Gln

Leu

Ile

Ser

His

Vai

Ala

Arg

Asp

Ala

Gln

Arg

Thr

Arg

Gly

100

105

110

Ala

Ket

Pro

Leu

Pro

Ile

Thr

Ile

Arg

Val

Pro

Tyr

Gly

Gly

Gly

Ile

115

120

125

Gly

Gly

Val

Glu

His

Hi3

Ser

Asp

Ser

Ser

Glu

Ala

Tyr

Tyr

Met

Ala

130

135

140

Thr

Pro

Gly

Leu

His

Val

Vai

Thr

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Asp

Ala

Tyr

145

150

155

160

Gly

Leu

Leu

Arg

ALa

Ala

Ile

ALa

Ser

Asp

Asp

Pro

Val

Val

Phe

Leu

165

170

175

Glu

Pro

Lys

Arg

Leu

Tyr

Trp

Ser

Lys

A3p

Ser

Trp

Asn

Pro

Asp

Glu

130

135

190

Pro

Gly

Thr

Val

Glu

Pro

Ile

Gly

Arg

ALa

Val

Val

Arg

Arg

Ser

Gly

195

200

205

Arg

Ser

Ala

Thr

Leu

He

Thr

Tyr

Gly

Pro

Ser

Leu

Pro

Val

Cys

Leu

210

215

220

Glu

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Asrg

Ala

Glu

Gly

Tro

Asp

Leu

Glu

Val

Val

225

230

235

240

Asp

Leu

Arg

Ser

Leu

Val

Pro

Phe

Asp

Asp

Glu

Thr

Val

Val

Arg

Val

245

250

255

177 922

Gly

Ala

Arg

Thr

Gly

Arg

Ala

Val

Val

Val

Hxs

Glu

Ser

Gly

Gly

Tyr

260

265

270

Gly

Gly

Pro

Gly

Gly

Glu

Ile

Ala

Ala

Gly

Ile

Thr

Glu

Arg

Cy3

Phe

275

230

235

His

His

Leu

Glu

Ala

Pro

Val

Leu

Arg

Val

Ala

Gly

Phe

Asp

Ile

Pro

290

295

300

Tyr

Pro

Pro

Pro

Met

Leu

Glu

Arg

His

H .3

Leu

Pro

Gly

Val

Asp

Arg

305

310

315

320

Ile

Leu

Asp

Ala

Val

Gly

Arg

Leu

Gin

Trp

Glu

Ala

Gly

Ser

325 330 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 8

Met 1

Ala

Gin Val Leu Glu Phe Lys 5

Leu

Pro Asp Leu Gly Glu Gly

Leu

10

15

Thr

Glu

Ala

Glu

Ile

Val

Arg

Trp

Leu

Val

Gin

Val

Gly

A3p

Val

Val

20

25

30*

Ala Ile (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 83 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 9

Ile

Ser

Leu

Ile

Ala

Leu

Leu

Ala

Arg

Ile

Cys

Thr

Ala

Ala

Leu

Ala

1

5

10

15

Arg

Phe

Pro

Glu

Leu

Asn

Ser

Thr

Val

Asp

Met

Asp

Ala

Arg

Glu

Val

20

25

30

Val

Arg

Leu

Aso

Gin

Val

His

Leu

Gly

Phe

Ala

Ala

Gin

Thr

Glu

Arg

35

40

45

Gly

Leu

Val

Val

Pro

Val

Val

Arg

Asp

Ala

His

Ala

Arg

Asp

Ala

Glu

50

55

60

Ser

Leu

Ser

Ala

Glu

Phe

Ala

Arg

Leu

Thr

Glu

Ala

Ala

Arg

Thr

Gly

65

70

75

30

Thr Leu Thr

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu drobnoustroju Streptomyces avermitilis i/lub równoważna mu czynnościowa część tego segmentu DNA obejmująca sekwencję DNA oznaczonąjako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę allelicznątakiej sekwencji.
2. 2. Segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto region DNA, regulujący ekspresję tego kompleksu dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.
3. 3. Segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi go DNA rekombinacyjne.
4. 4. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera DNA rekombinacyjne obejmujące segment izolowany DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu drobnoustroju Streptomyces avermitilis i/lub równoważna mu czynnościowa część tego segmentu DNA obejmującego sekwencję DNA oznaczonąjako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę alleliczną takiej sekwencji.
5. 5. Plazmid, znamienny tym, że zawiera DNA rekombinacyjne obejmujące segment izolowany DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu drobnoustroju Streptomyces avermitilis i/lub równoważną, mu czynnościową część tego segmentu DNA obejmująca sekwencję DNA oznaczoną jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę alleliczną takiej sekwencji.
6. 6. Segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że dobrany jest z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DNA posiadajągenomową mapę restrykcyjną, taką jak przedstawiono na fig. 3.
7. 7. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera segment DNA dobrany z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DNA posiadajągenomową mapę rertiykcyjną, taką.jak to przedatawiono nf fig. 3.
8. 8. Segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera region DNA regulujący transkrypcję lub translację sekwencji DNA oznaczonej jako SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji.
9. 9. Geny kodujące kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, znamienne tym, że znajdują się w segmencie DNA dobranym z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DNA posiadają genomową mapę ęestl*^k<^c^t^I^^ taką jak to przedstawiono na fig. 3.
10. 10. Segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi część sekwencji DNA zgodnej z SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji i jest zdolny do hybrydyzacji, odpowiednio, SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako sondę, lub do amplifikacji całości lub części takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako primer polimerazowej reakcji łańcuchowej.
11. 11. Oczyszczony polipeptyd, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową, przedstawioną w SEQ. ID NO 6, SEQ. ID NO 7, SeQ. ID NO 8 lub SEQ. ID NO 9.

    177 922