HUT68751A

HUT68751A - A method of constructing synthetic leader sequences

Info

Publication number: HUT68751A
Application number: HU9301801A
Authority: HU
Inventors: Lars Christiansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1995-07-28
Also published as: AU660161B2; CZ119293A3; ZA919932B; FI932831A0; WO1992011378A1; CA2098731A1; PT99848A; IE914433A1; NZ241011A; SK62593A3; DK300090D0; AU9134891A; MX9102684A; FI932831A; EP0563175A1; IL100408A0; JPH06503957A; HU9301801D0; KR930703450A

Description

A találmány egy olyan módszerrel kapcsolatos, melynek során szintetikus vezető peptid szekvenciákat hozunk létre heterológ polipeptidek élesztőgombában való szekretálása céljából, valamint az ezen módszerben használatos élesztőgomba expressziós vektorok létrehozásával.

Az élesztőgombák számos olyan proteint termelnek, melyek intracellulárisan szintetizálódnak, de a sejten kivül játszanak szerepet. Az ilyen extracelluláris proteinekre szekretált proteinekként utalnak. Ezek a szekretált proteinek kezdetben a sejten belül szekretálódnak prekurzor vagy pre-protein alakban, . melyek tartalmaznak egy előszekvenciát az expresszált termék endoplazmás retikulum (ER) membránján való hatékony átjuttatásának biztosítása céljából. Az előszekvencia, melyet jelpeptidnek neveznek, általában a kívánt termékről a transzlokáció alatt hasitódik le. A szekréciós útra való rátérés utén a protein a Golgi-apparátusba szállitódik. A Golgi-apparátusból a protein különböző utakra kerülhet, melyek pl. olyan részecskékhez vezetnek, mint a sejt vakuolum vagy a sejt membrán, vagy ki is kerülhet a sejtből, hogy a külső tápközegbe szekretálódjon (Pfeffer,

S.R. and Rothman, J.E. Ann.Rev.Biochem. 56:829-852, (1987)).

Számos megközelítést javasoltak az élesztőgombával heterológ proteinek élesztőgombában való expresszálására és szekréciójára. A 88632-es számú európai szabadalom leír egy olyan eljárást, melyben az élesztőgombával heterológ proteinek expresszálódnak, feldolgozásra kerülnek és szekretálódnak oly módon, hogy egy élesztőgombát transzformálnak egy a kívánt proteint és jelpeptidet kódoló DNS-at magába foglaló expressziós vektorral, a transzformált szervezetből tenyészetet készítenek, a tenyészetet szapo ritják, majd a tenyésztéshez használt tápközegből a proteint kinyerik. A jelpeptid lehet a kívánt protein jelpeptidje, lehet egy heterológ jelpeptid, vagy egy természetes és egy heterológ jelpeptid hibridje.

Az élesztőgombával heterológ jelpeptidek használatakor felmerülhet az a probléma, hogy a heterológ jelpeptid nem biztosit hatékony transzlokációt és/vagy hasadást a jelpeptid után.

A S.cerevisiae MFal (a-faktor) 165 aminosav preproformájaként szintetizálódik, mely tartalmazza 19 aminosav jel-vagy prepeptidjeit, melyet 64 aminosav vezető vagy propeptidje követ, körülvéve három N-kötésü glikolizációs helyet, melyet a (LysArg(Asp/Glu, Alá)2-3 alfa-faktor)₄ (Kurjan, J. és Herskowitz, I. Cell 30:933-943. 1982) követ. A preproMFal jel-vezető részét széleskörűen alkalmazzák a heterológ proteinek S. cerevisiae-ben való szintézisének és szekréciójának eléréséhez.

Az élesztőgombával homológ jel/vezető peptidek használata ismert a 4,546,082-es számú US szabadalomból, a 116 201-es, a 123 294-es, a 123 544-es, a 163 529-es és a 123 289-es számú közzétett európai szabadalmi bejelentésekből, valamint a 3614/83-as számú DK szabadalmi bejelentésből.

A 123 289-es EP-ben a S.cerevisiae a-faktor prekurzor kerül leírásra, mig a WO 84/01153 a Saccharomyces cerevisiae invertáz jelpeptid használatát jelzi, és a DK 3614/83 a Saccharomyces cerevisiae PH05 jelpeptid alkalmazását idegen proteinek szekréciój ához.

A 4,546,082-es számú US szabadalmi specifikáció, a 16 201, 123 294, 123 544 és a 163 529-es számú EP-ak olyan eljárásokat írnak le, melyekben a Saccharomyces cerevisiae-ből származó a faktor (MFal vagy MFa2) jel-vezető kerül alkalmazásra az expresszált heterológ fehérjék élesztőgombában való szekréciós folyamatában. A S.cerevisiae MFal jel/vezető szekvenciát kódoló DNS szekvenciának a gén 5' végéhez való fuzionálását bemutatták a kívánt protein szekretálásához és a kívánt protein feldolgozásához .

A 206 783-es számú EP leir egy rendszert polipeptidek

S.cerevisiae-ből való szekretálására, ahol az a-faktor vezető szekvencia csonkított a natív vezető szekvencián jelenlevő négy a-faktor peptid eltávolítása céljából, azért, hogy a vezető szekvencia fuzionálva maradjon egy heterológ polipeptidhez a LysArgGluAlaGluAla a-faktor reakciós helyen keresztül. Erről a szerkezetről azt jelzik, hogy kisebb peptidek (50 aminosavnál kisebbek) hatékony előállításához vezet. A nagyobb polipeptidek szekréciójához és előállításához a natív a-faktor vezető szekvenciát csonkítottuk, azért, hogy egy vagy két a-faktor peptid maradjon a vezető peptid és a polipeptid között.

Számos proteint olyan módon irányítanak, hogy proteolitikus feldolgozó rendszernek legyen kitéve, mely hasítani tudja a peptid kötést két egymást követő bázikus aminosav karboxi végén. Ezt az enzimatikus aktivitást a S.cerevisiae-ben a KEX 2 gén kódolja (Julius, D.A. et al., Cell 37:1075 (1984b)). A termék KEX 2 géntermék általi feldolgozása szükséges az aktív S cerevisiae al párosodási faktor (MFal vagy α-faktor) szekretálásához, de ez nem vesz részt az aktív S.cerevisiae a párosodási faktor szekréció j ában.

A szekretálásra szánt polipeptid szekréciója és a helyes előállítása néhány esetben akkor érhető el, amikor a fentiekben megadott hivatkozásban jelöltek szerint megszerkesztett vektorral transzformált élesztőgombát tenyésztjük. Sok esetben, azonban, a szekréció szintje nagyon alacsony vagy nincs is szekréció, vagy a proteolitikus előállítás helytelen vagy nem teljes. Ezért a találmánynak tárgya olyan vezető peptidek biztosítása, melyek biztosítják a heterológ polipeptidek sokkal hatékonyabb expresszióját és/vagy előállítását.

A következőkben megadjuk a találmány összefoglalását

Meglepő módon azt találtuk, hogy az a-faktor vezető peptidet számos eltérő DNS szekvenciával lehet helyettesíteni, ezáltal egy heterológ polipeptid szekrécióját lehet elérni élesztőgombában.

Erre a megfigyelésre alapozva, egy olyan módszert fejlesztettünk ki, mellyel random DNS fragmenteket klónoztunk élesztőgomba vektorokba a jelpeptidet kódoló DNS szekvenciától downstream irányban és a heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvenciától upstream irányban. A vektorokkal való transzformálás után az élesztőgomba sejteket szkrineltük a kérdéses heterológ polipeptid szekréciójára.

Még spéciiikusabban a jelen találmány egy olyan módszerre vonatkozik, mellyel egy szintetikus vezető peptid szekvenciát hozunk létre heterológ polipeptidek élesztőgombában való szekretálására. A módszer a következőket tartalmazza:

(a) egy random DNS fragmentet egy élesztőgomba expressziós vektorba inzertálunk, mely vektor a következő szekvenciát • · ·

- 6 tartalmazza

5'-SP-X_n-3'-RS-5*-X_m-(NZT)_p-Xg-PS-*gén*-3' ahol SP egy jelpeptidet kódoló DNS szekvencia,

X_n n aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol n 0 vagy 1- kb 10 aminosav,

RS egy restrikciós endonukleáz felismerő hely a random DNS fragmentek inzertálására, mely hely az X_n és X_m csatlakozásánál található,

X_m egy m aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol m 0 vagy 1-kb. 10 közötti egész, (NZT)p egy Asn-Xaa-Thr-t kódoló DNS szekvencia, ahol p 0 vagy 1, Xq egy q aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol q 0 vagy 1- kb.

közötti egész,

PS egy élesztőgomba reakció helyet meghatározó peptidet kódoló DNS szekvencia, és *gén* egy heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvencia ;

(b) az (a) lépés expressziós vektorával transzformálunk egy élesztőgomba gazdasejtet;

(c) a (b) lépés transzformált gazdasejtjét megfelelő körülmények között tenyésztjük; és (d) a (c) lépés tenyészetét szkrineljük a heterológ polipeptidek szekréciój ára.

A találmány szövegösszefüggésében a vezető peptid fogalmán egy olyan peptidet értünk, melynek az funkciója , hogy lehetővé tegye a heterológ polipeptid endoplazmás retikulumból a Golgi apparátusba való irányítását, ezután pedig tovább egy szekréciós vezikulumba való továbbjuttatását a tápközegbe való szekréció «

- 7 elérése céljából (pl. az expresszált polipeptid exportálását a sejtfalon keresztül vagy legalább a celluláris membránon keresztül a sejt periplazmás üregébe). A vezető peptidekkel kapcsolatban használt szintetikus fogalma azt jelzi, hogy a jelen módszerrel létrehozott vezető peptid olyan peptid, ami nem található meg a természetben.

A jelpeptid kifejezésen azt az előszekvenciát értjük, mely a természetben túlnyomóan hidrofób és az élesztőgombában expresszált extracelluláris protein prekurzor formájának Nterminális szekvenciájaként van jelen. A jelpeptid funkciója az, hogy lehetővé tegye a szekretálandó heterológ polipeptid számára, hogy belépjen az endoplazmás retikulumba. A jelpeptid általában ekkor hasitódik le. A jelpeptid lehet a proteint termelő élesztőgombával heterológ vagy homológ, ahogy a fentiek szerint bemutattuk, azonban sokkal hatékonyabb hasítást érhetünk el, ha a jelpeptid homológ a kérdéses élesztőgombával.

A heterológ polipeptid kifejezés egy olyan polipeptidet jelez, melyet a gazda élesztőgomba nem termel a természetben. A találmány módszerében a heterológ polipeptid előnyösen olyan, melynek a transzformált élesztőgomba sejtek általi szekrécióját könnyen lehet detektálni, pl. megalapozott standard módszerekkel, mint pl. immunológiai szkrineléssel, olyan antitesteket használva, melyek a kérdéses polipeptiddel reakcióba lépnek (cf. pl. Sambrook, Fritsch and Maniatis Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989), vagy a heterológ polipeptid specifikus biológiai aktivitásának szkrinelésével. A szkrinelés pozitív eredménye azt jelzi, hogy az élesztőgombában való heterológ polipeptid szekréciójához használható vezető pepiidet hoztunk létre.

A random DNS fragment bármely legalább három nukleotid hosszúságú DNS szekvenciát jelent, például a genom DNS (bármely organizmusét) restrikciós endonukleázzal való emésztésével nyert szekvenciát, vagy szintetikus DNS előállításával, pl. a Beaucage, S.L. és Caruthers, M.H. által leirt foszfoamidit módszer felhasználásával (Tetrahedron Letters 22:1859-1869, 1981).

Az (NZT)p által kódolt Asn-Xaa-Thr peptid egy aszparaginhoz kötődő glikolizációs hely. Az Xaa bármely ismert aminosavat jelenthet a Pro-t kivéve.

Egy másik megvalósulásban, a találmány egy élesztőgomba expressziós klónozó vektorra vonatkozik, mely a következő szekvenciát tartalmazza:

5'-SP-X_n-3'-RS-5’-X_m-(NZT)_p-Xq-PS-*gén*-3' ahol SP, X_n, RS, X_m, (NZT)p, X_q, PS és a *gén* a fentiek szerint meghatározott.

Ez a vektor a vezető peptid szekvenciák megszerkesztésében használható a fent leirt módszernek megfelelően.

Egy további megvalósulásban a találmány kapcsolatos olyan élesztőgomba expressziós vektorral, mely a következő szekvenciát tartalmazza:

5'-SP-X_n-ranDNS-X_m-(NZT)_p-Xg-PS-*gén*-3' ahol SP, X_n, X^ (NZT)p, X_g, PS és a *gén* a fentiek szerint meghatározott és a ranDNS egy restrikciós endonukleáz felismerő helyre inzertált random DNS fragment. A restrikciós endonukleáz felismerő hely az X_n és az X_m találkozásnál található.

Ebben a vektorban a vezető peptid szekvencia (melyet egyszer már azonosítottunk a találmány módszerével) a következő szekven« « * 4 4 4 «····« 4

- 9 ciából áll: X_n-ranDNS-X_m-(NZT)_p-Xg. Egy ilyen vektor alkalmazható a kérdéses heterológ polipeptid termelésében.

Egy megint másik megvalósulásban a találmány élesztőgombában való heterológ polipeptid termelés folyamatával kapcsolatos. Ez a folyamat a következőkből áll: egy olyan élesztőgomba sejtet tenyésztünk egy megfelelő tápközegben - mely képes expresszálni a heterológ polipeptidet és melyet egy a fent leirt élesztőgomba expressziós vektorral transzformáltunk, melybe bele tartozik egy a találmány módszerével előállított vezető peptid szekvencia is a heterológ polipeptid expresszálásának és szekréciójának eléréséhez, mely után a heterológ polipeptidet kinyerjük a tápközegből.

Az expressziós vektorba inzertált random DNS fragment hoszszusága nem különösebben jelentős. Azonban a kezelhető hosszúsághoz a fragment előnyösen 16-600 bázispár hosszúságú. Még előnyösebben a fragment hosszúsága 15-300 bázispár hosszúság közé esik. Jelenleg úgy véljük, hogy a fragment megfelelő hoszszusága 30-150 bázispár közé esik.

A random DNS fragment előnyösen nagy arányban kódol poláros aminosavat. Ezek közé az aminosavak közé a következők tartoznak: Glu, Asp, Lys, Arg, His, Thr, Ser, Asn, és a Gin. A jelen szövegösszefüggésben a nagy arányban kifejezésen azt értjük, hogy a DNS fragment nagyobb számú poláris aminosavat kódol, mint a megfelelő hosszúságú egyéb DNS szekvenciák. Ettől függetlenül, vagy ezenkívül előnyös lehet, ha a fragment legalább egy prolint kódol.

Az 5'-SP-X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)p-Xg-PS-*gén*-3' szekvenciában • «

- 10 n és/vagy m és/vagy q előnyösen >1. Előnyösen az összes n, m és q >1.

Bizonyítékok támasztják alá (cf. WO 89/02463) hogy a vezető szekvenciában egy aszparaginhoz kötődő glikozilációs hely jelenléte nagyobb szekréciós hatékonyságot ad a vezető pepiidnek. Ezért az 5 '-SP-X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)_p-X_q-PS-*gén*-3' szekvenciában p előnyösen 1.

A jelpeptid szekvencia (SP) kódolhat bármely olyan jelpeptidet, mely hatékonyan biztosítja az expresszált heterológ polipeptidnek a sejt szekréciós útjaira való eljutását. A jelpeptid lehet egy természetesen előforduló jelpeptid vagy annak funkcionális része, vagy lehet egy szintetikus peptid is. Megfelelő jelpeptideknek találták az a-faktor jelpeptidet, az egér nyál amiláz jelpeptidet, egy módosított karboxipeptidáz jelpeptidet az élesztőgomba BARI jelpeptidet vagy a Humicola lanuginosa lipáz jelpeptidet, vagy ezek származékát. Az egér nyál amiláz jel szekvenciát 0. Hagenbüchle et al., írták le (Natúré 289: 643-646, 1981). A karboxipeptidáz jel szekvenciát L.A. Valis et al írták le (Cell 48:887-897. 1987). A BARI jelpeptidet a WO 87/02670-es számú szabadalom Írja le. A H.lanuginosa lipáz jelpeptidet az EP 305216-os számú szabadalom írja le.

A PS DNS szekvencia által kódolt élesztőgomba reakció hely a Lys és Arg párosított kombinációjának bármelyike lehet, pl. LysArg, Arg-Lys, Lys-Lys, vagy Arg-Arg, mely lehetővé teszi, hogy a Saccharomyces cerevisiae KEX2 proteáza vagy más élesztőgomba fajokban levő ezzel egyenértékű proteáz reagáljon a heterológ polipeptiddel (D.A. Julius et al., Cell 37 1984, 1075 ff.). Ha a KEX2 reakció nem megfelelő, mert pl. a polipeptid termék ha • · sitásához vezetne, más proteázhoz való reakció hely választható ehelyett, mely egy olyan aminosav kombinációt taralmaz, mely nem található meg a polipeptid termékben pl. az FX_a-hoz való reakció hely az Ile-Glu-Gly-Arg (cf. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) .

A találmány módszerével előállított heterológ protein bármely olyan protein lehet, mely előnyösen termeltethető élesztőgombában. Az ilyen proteinekre példák a következők: aprotinin, szövet faktor reakcióut inhibitor, vagy más proteáz inhibitorok, inzulin vagy inzulin prekurzorok, humán vagy szarvasmarha növekedési hormon, interleukin, glukagon, szövet plazminogén aktivátor, a vagy β transzformáló növekedési faktorok, thrombocitaeredetü növekedési faktor, enzimek vagy ezek funkcionális analógjai. A jelen szövegösszefüggésben a funkcionális analóg kifejezés alatt olyan polipeptidet értünk, mely a természetes proteinnel hasonló funkcióval rendelkezik (ezt úgy kell érteni, hogy a természetes protein természetére vonatkozik és nem annyira a biológiai aktivitás szintjére) . A polipeptid szerkezetileg lehet a természetes proteinhez hasonló és származhat a természetes proteinból oly módon, hogy a természetes protein C- és Nterminálisához (egyikhez vagy mindkettőhöz) egy vagy több aminosavat adunk, vagy egy vagy több aminosavat helyettesítünk a természetes aminosav szekvencia egy vagy számos különböző helyén, vagy úgy, hogy elveszünk egy vagy több aminosavat a természetes protein egyik vagy mindkét végéről az aminosav szekvencia egy vagy több helyén, vagy egy vagy több aminosavat inzertálunk a természetes aminosav szekvencia egy vagy több helyére. Az ilyen • « • · · · · · ······ · « · · · ·♦♦« «·

- 12 módosítások jól ismertek a fent említett proteinek jó néhánya esetében.

A random DNS fragment és az 5'-SP-X_n~3'-RS-5'-X_m-(NZT)p-X_qPS-*gén*-3'szekvencia előállítható szintetikusan, megalapozott standard módszerekkel pl. foszfoamidit módszerrel, melyet S.L. Beaucage és M.H. Caruthers írtak le (Tetrahedron Letters 22: 1859-1869, 1981) vagy a Matthes et al által leirt módszerrel (EMBO Journal 3:801-805. 1984). A foszfoamidit módszernek megfelelően oligonukleotidokat szintetizálunk pl. egy automata DNS szintetizátorban, tisztítjuk, kettős szálúvá tesszük, ligáljuk és az élesztőgomba expressziós vektorba klónozzuk. Meg kell jegyezni, hogy az 5'-SP-X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)_p-X_q-PS-*gén*-3' szekvenciát nem szükséges egy egyszerre előállítani, összeállítható két vagy több oligonukleotidból, melyet ezen a módon szintetikusan állítottunk elő.

A random DNS fragment vagy az

5'-SP-X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)p-Xg-PS-*gén*-3’ szekvencia egy vagy több része lehet genom vagy cDNS eredetű, pl. kinyerhető oly módon, hogy előállítunk egy genom vagy egy cDNS könyvtárat majd az adott részt (SP vagy *gén* tipikusan) kódoló DNS szekvenciákra szkrinelünk hibridizációval szintetikus oligonukleotid próbákat használva standard technikákkal összhangban (cf. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Ebben az esetben egy jelpeptidet kódoló genom vagy cDNS szekvencia csatlakoztatható egy genom vagy cDNS szekvenciához, mely a heterológ proteint kódolja, ezután a DNS szekvencia módosítható oly módon, hogy az X_n-3'-RS5'-X_m~(NZT)p-Xg-PS szekvenciát kódoló szintetikus oligonukleoti- 13 «

• · · · ·♦

dókat inzertáljuk jól ismert eljárásokkal összhangban.

Végül, a random DNS fragment és/vagy az

5'-SP-X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)p-Xg-PS-*gén*-3' szekvencia lehet kevert szintetikus és genom, kevert szintetikus és cDNS vagy kevert genom és cDNS eredetű, melyet a szintetikus, a genom vagy a cDNS eredetű fragmentek kétszáluvá tételével állítunk elő (tetszés szerint), a fragmentek megfelelnek a teljes DNS szekvencia különböző részeinek, standard technikákkal összhangban. így előre látható, hogy a jelpeptidet vagy a heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvencia lehet genom vagy cDNS eredetű, mig az X_n-3'-RS-5'-X^-(NZT)p-Xg-PS-*gén*-3' szekvencia szintetikusan állítható elő.

Az inzulin prekurzorokat kódoló előnyben részesített DNS szerkezetek, vagy ezek módosulatai az 1-13-as számú szekvenciák között kerül bemutatásra a Szekvencia Listában. A DNS szekvencia megfelelő módosulataira példák a nukleotid helyettesítések, melyek nem eredményezik a protein más aminosav szerkezetét, de mely megfelel az élesztőgomba kódon használatának, melybe a DNS szerkezetet inzertáljuk, vagy olyan nukleotid helyettesítések, melyek eltérő aminosav szekvenciát eredményeznek és ezért feltehetően egy eltérő protein szerkezetet. A lehetséges módosításokra más példák a következők: három vagy három nukleotid többszörösének a szekvenciába való inzertálása, három vagy három nukleotid többszörösének a szekvencia bármelyik végéhez történő hozzáadása, vagy három vagy három nukleotid többszörösének a deléciója a szekvencia valamelyik végéről vagy a szekvencián belül.

Az 5’-SP-X_n-3'-RS-5'-x_m-(NZT)p-X_q-PS-*gén*-3' vagy az

5'-SP-X_n-ranDNS-X_m-(NZT)p-X_q-PS-*gén*-3' szekvenciákat hordozó « * «· · · ·· · « · · · • · · 4 4 4 ·«···· · •·· · «··« ·· rekombináns expressziós vektor bármely olyan vektor lehet, mely képes az élesztőgombában replikálódni. A vektorban bármelyik DNS szekvencia működőképesen kell kapcsolódjon egy megfelelő promóter szekvenciához. A promóter bármely DNS szekvencia lehet, mely transzkripciós aktivitással rendelkezik élesztőgombában és mely az élesztőgombával homológ vagy heterológ proteineket kódoló génekből származtatható. A promóter előnyösen az élesztőgombával homológ proteint kódoló génből származik. A megfelelő promóterekre példák a következők: a Saccharomvces cerevisiae MFal, a TPI, az ADH vagy a PGK promóterek.

A fent bemutatott szekvencia működőképesen kell kapcsolódjon egy megfelelő terminátorhoz is (cf. T. Alber and G. Kawasaki, J. Mól. Appl. Génét. 1:419-434, 1982).

A találmány rekombináns expressziós vektora továbbá tartalmaz egy olyan DNS szekvenciát, mely képessé teszi a vektort arra, hogy replikálódjon az élesztőgombában. Az ilyen szekvenciákra példák a következők: a 2 μ élesztőgomba plazmid, a REP 1-3 replikációs gének és a replikációs origó. A vektor tartalmazhat egy szelektálható markert is pl. egy Schizosaccharomvces pombe TPI gént, amint azt P.R. Russell leírta (Gene 40:125-130, 1985).

Az 5'-SP-X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)p-Xg-PS-*gén*-3' szekvencia, a random DNS fragment, a promóter és a terminátor sorrendben történő ligálási eljárása és ezek olyan megfelelő élesztőgomba vektorokba való inzertálása, melyek rendelkeznek az élesztőgomba replikációhoz szükséges információval, jól ismert eljárások a tudomány e területén képzett szakember számára (cf. pl. Sambrook, Fritsch and Maniatis op. cit.). Érthető, hogy a vektor megszer keszthető úgy, hogy először egy a teljes 5 '-SP-X_n-3 '-RS-5 '-X_m« · __ — ··· · ···· ♦ · (NZT)p-Xg-PS-*gén*-3' szekvenciát tartalmazó DNS szerkezetet állítjuk elő, majd ezt a fragmentet egy megfelelő expressziós vektorba inzertáljuk, vagy az egyes elemekhez (mint pl. a jelpeptid az X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)_p-X_q vagy a heterológ polipeptid) a genetikai információval rendelkező DNS fragmenteket egymás után inzertáljuk, melyet ligálás követ.

A találmány módszerében használt élesztőgomba bármely megfelelő élesztőgomba lehet, mely a szaporítás során a kérdéses heterológ polipeptid óriási mennyiségeit termeli. A megfelelő élesztőgombákra a következő élesztőgomba fajok törzsei lehetnek példák: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluvveri, Schizosaccharomyces pombe vagy a Saccharomyces uvarum. Az élesztőgomba sejtek transzformációja végrehajtható pl. protoplaszt képzéssel, melyet az ismert módon végzett transzformáció követ. A sejtek szaporításához használt tápközeg bármely olyan hagyományos tápközeg lehet, mely megfelel a szaporodó élesztőgombának. A szekretált heterológ protein, melynek jelentős része helyesen előállított formában található meg a tápközegben, a tápközegből hagyományos eljárásokkal nyerhető ki, melyek közé a következők tartoznak: az élesztőgomba sejteket a tápközegből centrifugálással vagy szűréssel szeparáljuk, a felüluszó vagy a szürlet proteinszerü anyagait precipitáljuk (pl. sóval, pl. ammóniumszulfáttal), ezután számos kromatográfiás eljárással tisztítjuk pl. ioncserés kromatográfiával, affinitás kromatográfiával vagy hasonlóval.

A következőkben megadjuk a rajzok rövid leírását.

A találmányt a csatolt rajzokra való utalással szemléltetjük a továbbiakban.

1. ábra a ρΜΤ742δ szerkezetét mutatja sematikusan

2. ábra a pLaC202 szerkezetét mutatja sematikusan

3. ábra a pLaC202 a random DNS fragment klónozási helyén levő

DNS szekvenciát és a származtatott aminosav szekvenciát mutatja (meg kell jegyeznünk, hogy a szekvenciát az egyedülálló Clal helyen belül hasítjuk és ha a random DNS nélkül ligálunk, ez az leolvasási keret változásához vezet);

4. ábra a pLSC6315D# szerkezetét mutatja sematikusan;

A találmányt a továbbiakban a következő példákkal szemléltetjük, melyekkel nem szándékoztunk a találmány körét korlátozni.

PÉLDÁK

A következőkben bemutatjuk a plazmidokat és a DNS anyagokat.

Az összes expressziós plazmid a C-POT típusba tartozik. Az ilyen plazmidok a 171 142-es számú EP szabadalmi bejelentésben kerültek leírásra és úgy jellemezték őket, hogy tartalmazzák a Schizosaccharomvces pombe trióz foszfát izomeráz gént (PÓT) a plazmid szelekció és stabilizáció céljából. A PÓT gént tartalmazó plazmid beszerezhető a deponált E. coli törzsből (ATCC 39685). A ·· · · · · 4

4 4 4 ·· ··«··« · • 4 β « · * «· a» plazmidok továbbá tartalmazzák a S. cerevisiae trióz foszfát izomeráz promótert és terminátort (P_TPI és T_Tpi) . Ezek azonosak a pMT742-vel (M. Egel-Mitani et al. , Gene 73:113-120, 1988, lásd az

1. ábrát), a Ρτρι^_ύ körülvevő Sph-Xbal restrikciós helyek által meghatározott régiót és a jel/vezető/termék-et kódoló régiót kivéve.

A Ρψρχ-t módosítottuk a pMT742-ben talált szekvenciát figyelembe véve, a szerkesztési munka megkönnyítése céljából. Egy belső Sphl restrikciós helyet elimináltunk Sphl hasítással, az egyszálu farok részek eltávolításával, majd ujraligálással. Továbbá, a promótertől upstream irányban levő és az azoktól független DNS szekvenciákat Bal31-es exonukleázzal való kezeléssel eltávolitottuk, majd ezt követően egy Sphl restrikciós hely kötőt adtunk hozzá. Ezt a 373 bázispár hosszúságú SphI-EcoRI fragmenten jelenlevő promóter szerkezetet jelöljük PTPiö^-nak és ha a már leirt plazmidokban használjuk őket ezt a promóter módosítást a δ plazmid nevéhez való hozzáadásával jelöljük pl. ρΜΤ742δ (1. ábra).

A különböző DNS fragmentek összeépülése alkalmanként bekövetkezik egy kisebb pT7-es tipusu E.coli plazmidban is, melyet korábban leirtunk (cf. WO 89/02463), csupán a P_TPj-vel kapcsolatos módosítással, pl ρΤ7δ. A későbbiekben leirt random klónozáshoz különböző eredetű genom DNS-at használtunk. A S.cerevisiae DNS-at az MT633-as törzsből izoláltuk (1990 december 7-én deponálták a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen nevű törzsgyüjteményben a DSM 6278-as depozit számon, A Budapesti Szerződés feltételeinek megfelelően). Az A. orvzae DNS-at az

A1560-as törzsből izoláltuk (IFO 4177).

• « <4·♦ • · 4 »» ♦ a <* · « « ·· • «4·* * * «·» « ·* *· «»

Végül számos szintetikus DNS fragmentet alkalmaztunk, melyek mindegyikét automata DNS szintetizálón állítottunk elő (Applied Biosystems model 380A) foszforamidit kémiát és a kereskedelemben beszerezhető reagenseket alkalmazva (S.L. Beaucage and M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869). Az oligonukleotidokat poliakrilamid gél elektroforézissel tisztítottuk denaturáló körülmények között. Az ilyen DNS egyes szálak komplementer párjainak kettősszáluvá tétele előtt ezeket T4 polinukleotid kinázzal és ATP-vel kezeltük.

Az összes többi alkalmazott módszer és anyag ismert a tudomány e területén (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).

1. PÉLDA

A pLaC202-es plazmid megszerkesztése

A pT7 1966 490 bázispár hosszúságú SphI-Apal (cf. WO 89/02463) és a pT7.aMI3 179 bázispár hosszúságú Hinfl-Xbal fragmentjei (cf. WO 89/02463, 1. ábra) a következő szintetikus adaptoron:

NOR367/373: CAACCATCGATAACACCACTTTGGCTAAGAG

CCGGGTTGGTAGCTATTGTGGTGAAACCGATTCTCTAA keresztül kapcsolódnak a pMT742 11 kb-u Xbal-Sphl fragmentben, mely a pLaC202 plazmidot eredményezi (2. és 3. ábra valamint az 1-es számú szekvencia a Szekvencia Listában).

Ez az egyedüli Clal helyet tartalmazó vektor létrehozza a

random DNS klónozó vektor egy megvalósulását, melyben a termék gén az MI3 inzulin prekurzort (B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)) kódolja. A következő példák az ezen szerkezeten keresztül klónozott vezetőkkel kapcsolatosak.

2. PÉLDA

A következőkben megadjuk a pLSC6315 és a pLSC5210 megszerkesztését

Az MT663 S.cerevisiae-ből teljes DNS-at izoláltunk és Taqlgyel, HinPI-gyel, vagy Taql+HinPI-gyel való emésztésnek vetettük alá. A lehasitott darabokat méret szerint szeparáltuk 1%-os agaróz gélen és a 600 bázispárnál kisebb fragmenteket izoláltuk mind a három emésztésből. A korábban Clal-gyel emésztett, az önligálódástól Borjú Bél Alkalikus Foszfátázzál, és a defoszforilációtól megvédett pLaC202-t összekevertük a fent leirt fragmentek összegyűjtött mennyiségeivel és ligáltuk. Az MT172-es E.coli törzset (MT172= MC 1000 m⁺rara⁺ leuB-6; MC 1000, cf. Casabadan and S. Cohen, J, Mól. Bioi. 138:179. 1980) a fenti ligációs keverékkel transzformáltuk és megközelitoen 5000 Ap¹^ transzformánst nyertünk az egyes keverékek esetében. Rekombináns plazmidokat állítottunk elő az 5000 transzformánst magába foglaló összegyűjtött anyag mindhárom típusából. Ezeket a plazmid mennyiségeket használtuk fel a S.cerevisiae MT663-as törzsének transzformálására és a nyert TPI transzformánsokat immunoszkrineltük az MI3 szekréciójára.

A meglepően nagyszámú pozitív transzformánsok közül az

- 20 <* «· ··· • · ···«

• ·· • ♦ •«9« ·· egyértelműen leghatékonyabbakat újra izoláltuk és plazmid tartalmukat izoláltuk.

Ezen eljárás eredményeként azt vártuk, hogy a nyert élesztőgomba transzformánsok zöme a plazmidok heterogén populációját tartalmazza, és ezért a valódi kiónok kinyeréséhez a plazmid ujraizolálás lépését végeztük el. A nyolc ujraizolált élesztőgomba transzformánsból származó plazmid preparációkat az E.coli MT172-es Ap^R-ré való transzformálására használtuk. A nyolc élesztőgomba izolátumhoz a 12 E.coli transzformánsból származó plazmidokat egyenként használtuk az MT663 élesztőgomba törzs transzformálására, és a TPI-t valamint az MI3-at szekretáló transzformánsokat immunoszkrineléssel azonosítottuk.

A nyolc izolált pLaC202 származék inzertjeinek szekvenálása három különböző szekvenciát mutatott, melyek közül kettő, a pLSC6315 és a pLSC5210 segítette leghatékonyabban az MI3 szekréciót. A klónozott DNS és az oldalrégiók szekvenciáit sorrendben a 2-es és a 4-es számú szekvenciák mutatják a Szekvencia Listában.

3. PÉLDA

A következőkben bemutatjuk a pLSC6315 módosításait

A klónozott szintetikus vezető szekvencia további módosításaihoz a pLSC6315-ot választottuk.

A pLSC6315-öt az Apai endonukleázzal emésztettük, melyet a Bal31 exonukleázzal való kezelés követett. Fenolos extrakció után a kapott DNS-at Xbal-gyel emésztettük és az eredeti 367 bp hosszúságú Apal-Xbal fragmentnél kisebb DNS fragmenteket izoláltuk.

* · ·· ·· ·· · · · 4 4 • · · « «· • ·«·* · · ··· · *·»· »·

A pLaC202-t Clal-gyel emésztettük és a kapott egyszálu CG farkakat eltávolitottuk, melyet Xbal-gyel való emésztés követett, majd a 11 kb hosszúságú XbaI-]ClaI[ fragmentet (] [ azt jelzi, hogy az egyszálu farkakat levágtuk) izoláltuk. Ezt a fragmentet összekevertük a fentiek szerint izolált pLSC6415-ös fragmentekkel és ligáltuk (6. ábra).

A 2. példában leirt transzformációs és szkrinelési eljárást megismételtük és a pLSC6315D3 és a pLSC6315D7 plazmidokat az MI3 szekréciót az eredeti pLSC6315-ös plazmidnál hatékonyabban támogató plazmidokként izoláltuk (cf. sorrendben a 6-os ás a 8-as számú szekvenciák a Szekvencia Listában).

4. PÉLDA

A következőkben megadjuk a pLAOl-5 megszerkesztését

Az Aspergillus oryzae A1560-as törzséből a teljes DNS-at a

2. példában a S.cerevisiae esetében korábban leírtak szerint kezeltük, a klónozás és az ujraklónozás pontosan a 2. példában leírtak szerint történt, azzal az eltéréssel, hogy az első klónozásban az E.coli transzformánsok számát megközelítően 3000re csökkentettük ligációs elegyenként. Ez a kísérlet az A.oryzae DNS 5 kiónjának izolálását eredményezte, mely a pLaC202 összefüggésében a S.cerevisiae-bői származó MI3 inzulin prekurzor szekrécióját közvetíti.

Az inzertek szekvenálása 5 különböző szekvenciát mutatott, melyek közül kettő (a pLA02 és a pLAO5) sokkal hatékonyabb volt az MI3 szekrécióját figyelembe véve. A pLA02-ben és a pLA05-ben levő DNS inzertek szekvenciáit és az oldalrégiókat sorrendben a 10-es és a 12-es számú szekvenciák mutatják a Szekvencia Listában.

5. PÉLDA

A fentiek szerint plazmidokat magukba foglaló élesztőgomba törzseket YPD tápközegen szaporítottuk (Sherman, F. et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) Minden törzs 6 képviselőjének 5 ml tenyészetét rázattuk 30 °C hőmérsékleten 60 órán keresztül, a végső OD ςθθ megközelítően 15 volt. Centrifugálás után a felüluszót eltávolitottuk a HPLC-vel történő analízishez, mely módszerrel a szekretált inzulin prekurzor koncentrációját mértük a Leó Snel et al. által leirt módszer szerint (Chromatographia 24:329-332, 1987).

Az I Táblázatban a jelen találmány szerint izolált vezető szekvencia használatával elért, inzulin prekurzor (MI3) expressziós szintjeit adtuk meg a ρΜΤ742δ transzformánsaival elért szint százalékaként, S.cerevisiae MFa(l) vezetőt felhasználva.

I. TÁBLÁZAT

pMT742	100%
PLSC6315	100%
PLSC5210	60%
PLSC6315D3	175%
PLSC6315D7	120%
pLAO2	120%
pLAO5	60%

• ·

A következőkben megadjuk a Szekvencia Listát (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) SZABADALMAZTATÓ: Novo Nordisk A/S (ii) A SZABADALOM CÍME: Szintetikus vezető szekvenciák megszerkesztésének módszere (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 13 (ív) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: Novo Nordisk A/S, Patent Department (B) UTCA: Novo Allé (C) VÁROS: Bagsvaerd (D) ORSZÁG: Dánia (E) IRÁNYITÓSZÁM: DK-2880 (v) SZÁMÍTÓGÉPPEL OLVASHATÓ FORMA:

(A) A MÉDIUM TÍPUSA: floppy lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, 1.25-0s verzió (vi) JELEN ALKALMAZÁSI ADATOK:

(A) ALKALMAZÁSI SZÁM:

(B) IKTATÁSI SZÁM:

(C) OSZTÁLYOZÁS:

(viii) ÜGYVÉDI/IRODA ADATOK:

(A) NÉV: Thalsoe-Madsen, Birgit (C) REFERENCIA/ DOKUMENTUM SZÁM: 3540.204-WO (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:

(A) TELEFON:+45 4444 8888 (B) TELEFAX:+45 4449 3256 (C) TELEX: 37304 (2) AZ 1-ES SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 335 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTIPUS: egyszálu (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: CDNS (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1-ES SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC

ATACACAATA

TAAACGATTA AAAGAATGAA AGTCTTCCTG CTGCTTTCCC TCATTGGATT CTGCTGGGCC ··« ·*· · ···· ··

CAACCATOGA TAACACCACT TTGGCLAAGA GATTOGTTAA CCAACACTIG TGCGGITCCC180

ACTTGGTTGA AGCTTTGTAC TTGGTITGCG GTGAAAGAGG TTTCITCrAC ACTCCTAAGG240

CTGCIAAGGG TATTCTOGAA CAATGCICTA CCTCCATCTG CTCCTTGTAC CAATTGGAAA300

ACTACTGCAA CTAGAOGCAG CCOGCAGGCT CTAGA335 /2/ A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

/i/ A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

/A/ HOSSZÚSÁG: 492 bázispár /B/ TÍPUS: nukleinsav /0/ SZÁLAZOTTSÁG:egyszalu /D/ TOPOLÓGIA: lineáris /ii/ A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS /ix/ JELLEMZŐK:

/A/ NÉV/KULCS : CDS . ZB/ LOKÁCIÓ: 76..468 /ix/ JELLEMZŐK:

/A/ NÉV/KULCS:sig' pepiid /B/ LOKÁCIÓ: 76..5o9 / ix/ JELLEMZŐK:

/A/ NÉV/KULCS: mai_pepTid /B/ LOKÁCIÓ: 310..468 /xi/ A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA60

TAAAOGATTA AAAGA ATC AAA GTC TTC CTG CIG CIT TCC CTC ATT GGA TTC111

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly The -78 -75-70

TGC TGG

GCC CAA CCA TOG

ATA GAT GGA ACA CAT ITT CCG AAC AAC AAT

159

Cys

Trp -65

Alá Gin

Pro

Ser

Ile -60

Asp

Gly Thr

His Phe Pro -55

Asn Asn Asn

GTC

CCA

ATA

GAC

ACA

AGA

AAA

GAA

GGA

CTA

CAG

CAT

GAT

TAC

GAT

ACA

207

Val

Pro

Ile

Asp

Thr

Arg

Lys

G1U

Gly

Leu

Gin

His

Asp

Tyr Asp

Thr

-50

-45

-40

-35

GAA

ATT

TTG

GAG

CAC

ATT

GGA

AGC

GAT

GAG

TTA

ATT

TTG

AAT

GAA

GAG

255

Glu

Ile

Leu

Glu

His

Ile

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Ile

Leu

Asn

Glu

-30

-25

-20

TAT

GTT

ATT

GAA

AGA

ACT

TTG

CAA

GCC

ATC

GAT

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

303

Tyr

Val

Ile

G1U

Arg

Thr

Leu

Gin

Alá

Ile

Asp

Asn

Thr

Leu

Alá

-15

-10

-5

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

351

Lys Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Alá

1

5

10

TTC TAC TTC GTT TGC

GCT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT OCT AAG GCT

Leu Tyr Leu 15

Val

cys

Gly 20

Glu

Arg

Gly

Ebe

Ebe Tyr Thr Pro Lys Alá

25

30

GCT

AAG

GGT

ΑΤΓ

CTC

GAA

CAA

TGC

TCT

ACC

TCC

ATC

TGC

TCC

TTC

TAC

Alá

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

35

40

45

CAA

TTC

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGACGCAGC COGCAGGCTC TAGA

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

50

399

447

492 /2/ A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

/i/ A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

/A/ HOSSZÚSÁG: 131 aminosav /B/ TÍPUS: aminosav /0/ TOPOLÓGIA: lineáris /ii/ A MOLEKULA TÍPUSA: protein /xi/ A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Met Lys Val Ebe Leu Leu Leu Ser leu Ile Gly Ebe Cys Trp Alá Gin

-78

-75

-70

-65

Pro

Ser

Ile

Asp Gly

Thr

His

Ebe

Pro

Asn Asn

Asn

Val

Pro

Ile

Asp

-60

-55

-50

Thr Arg Lys

Glu Gly

Leu

Gin

His

Asp Tyr Asp

Thr

Glu

Ile

Leu

Glu

-45

-40

-35

His

Ile

Gly

Ser Asp

Glu

Leu

Ile

Leu

Asn

Glu

Tyr

Val

Ile

Glu

-30

-25

-20

-15

Arg

Thr

Leu

Gin Alá

Ile

Asp

Asn

Thr

Leu

Alá

Lys Arg

Ebe

Val

-10

-5

1

Asn

Gin

His

Leu Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Alá

Leu

Tyr

Leu

Val

5

10

15

Cys

Gly

Glu

Arg Gly

Ebe

Tyr

Thr

Eho

Lys

Alá

Lys Gly

Ile

20

25

30

Val

Glu

Gin

Cys Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu Glu

Asn

35

40

45

50

Tyr Cys Asn /2/ A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

/i/ A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

/A/ HOSSZÚSÁG: 42o bázispár /B/ TÍPUS: _z nukleinsav /C/ SZÁLAZOTTSÁG:egyszálu /D/ TOPOLÓGIA: lineáris

2.7

/ii/ A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS / ix/ JELLEMZŐK:

/A/NÉV/KULCS: CDS /B/ LOKÁCIÓ: 76..396 /ix/ JELLEMZŐK:

/A/ NÉV/KULGS: sig__pepiid /B/ LOKÁCIÓ: 76.0237 /ix/ JELLEMZŐK:

/A/ NEV/KULCS: iaat__peptid /B/ LOKÁCIÓ: 238..396 /xi/ A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A4 SZÁMÚ SZEKVENCIA

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA60

TAAAOGATTA AAAGA ATG AAA CTC TTC CTG CTG CTT TCC CTG ΑΊΤ GGA TTC111

Met Lys Val Fhe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Fhe -54 -50-45

TGC Cys

TCG Trp

GÓC CAA CCA

TOG CTA TIG GAG TCA CTT AOG CTC GTT GAT CTT

4

Gin

Pro

Ser leu

Leu -35

Glu

Ser

Leu

Thr

Leu -30

Val Asp Val

GAC

GCA

CTG

TCG

GAT

ATT

GAT

CTA

CTT

GAG

TCT

GAA

AOG

CTT

CTG

Asp

Alá

Leu

Ser

Asp

Ile

Asp

Val

Leu

Val

Glu

Ser

G1U

Thr

Leu

Val

-25

-20

-15

CTT

CTC

GAT

AAC

ACC

ACT

TIG

GCT

AAG

AGA

TTC

CTT

AAC

CAA

CAC

TTC

Leu

Val

Asp

Asn

1hr

Thr

Leu

Alá

Lys

Arg

Fhe

Val

Asn

Gin

His

Leu

-10

-5

1

5

TCC

GGT

TCC

CAC

TTC

CTT

GAA

GCT

TTC

TAC

TIG

GTT

TCC

GGT

GAA

AGA

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Alá

Leu

Tyr

Leu

Val

cys

Gly

G1U

kcg

10

15

20

GCT

TTC

TAC

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GCT

ATT

CTC

GAA

CAA

TGC

Gly

Fhe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Alá

Lys

Gly

Ile

Val

G1U

Gin

Cys

25

30

35

TCT

ACC

TCC

ATC

TGC

TCC

TIG

TAC

CAA

TIG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

40

45

50

TAGAOGCAGC COGCAGGCTC TAGA

159

207

255

303

351

396

420 (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA _z JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: lo7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris • · (ϋ) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Az S. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Met -54

Lys Val

Phe

Leu -50

Leu

leu

Ser

Leu

Ile -45

Gly

Phe

Cys Trp

Alá -40

Gin

Pro

Ser

Leu

Leu -35

Glu

Ser

Leu

Thr

Leu -30

Val

Asp

Val

Asp Alá -25

Leu

Ser

Asp

Ile

Asp -20

Val

Leu

Val

Glu

Ser -15

Glu

Thr

Leu

Val

Leu Val -10

Asp

Asn

Ihr

Thr -5

leu

Alá

Lys Arg

Phe 1

Val

Asn

Gin

His 5

Leu

Cys Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Alá

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly 20

Glu

Arg Gly Phe

Phe 25

Tyr

Ihr

Pro

Lys

Alá 30

Alá

Lys Gly

Ile

Val 35

Glu

Gin

Cys

Cys Thr 40

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu 45

iyr

Gin

Leu Glu

Asn 50

Tyr cys

Asn

(2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA''ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA .JELLEMZŐI·:

(A) HOSSZÚSÁG·: -453 bázis pár (B) TIPUS: , nukleinsav (C) SZALAZOTTSÁG:egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii)A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS ( -j y) JELLEMZŐK:

(_A) NÉV/KULCS: CDS ' ’ (_B) LOKÁCIÓ: 76..<2o (ix) JELLEMZŐK:

(A) NEV/KULCS :sig-_peptid (B) LOKÁCIÓ: 76..27o (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: mat_peptid (B) LOKÁCIÓ: 271..42o (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GAITACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA

TAAACGAITA AAAGA ATC AAA GTC TTC CTG CTG CTT TCC CTC ΑΊΤ GGA TTC Met Lys Val Fhe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Phe -65 -60 -55

111

2 9

• « ·♦ • · · * · • · * · · · ··· * ·A··

• · • · ·· • • ·

TGC TGG

GCC

CAA

CCA

ATA

GAC

ACA AGA AAAGAA

GGA

CTA

CAG

CAT

GAT

159

Cys Trp

Alá

Gin

Pro

Ile

Asp

Ihr Arg Lys Glu

Gly

Leu

Gin His

Asp

-- \

-50

- ·

-45

. .v

-40

TAC GAT

ACA

GAA

ΑΤΓ

TIG

GAG

CAC

ΑΓΓ

GGA AGC

GAT

GAG

ΊΊΆ ACC

COG

207

Tyr Asp

Túr

G1U

Ile

Leu

Glu

His

Ile

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Ihr

Pro

-35

-30

-25

AAT

GAA

GAG

TAT

CTT

ΑΤΓ

GAA

AGA

ACT

TIG

CAA

GCC

ATC

GAT

AAC

ACC

255

Asn

G1U

Glu

iyr

Val

Ile

Glu

Arg

Ihr

Leu

Gin

Alá

Ile

Asp

Asn

Ihr

-20

-15

-10

ACT

TIG

GCT

AAG

AGA

TTC

CTT

AAC

CAA

CAC

TIG

TGC

GCT

TCC

CAC

TIG

303

Ihr

Leu

Alá

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys Gly

Ser

His

Leu

-5

1

5

10

CTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

CTT

TGC

GCT

GAA

AGA

GCT

TTC

TAC

ACT

351

Val

Glu

Alá

Leu

iyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Fhe

Tyr

Ihr

15

20

25

ccr

AAG

GCT

AAG

GCT

ΑΤΓ

GTC

GAA

CAA

TGC

TGT

ACC

TCC

ATC

TGC

399

Pro

Lys

Alá

Lys

Gly

Ile

Val

G1U

Gin

Cys

cys

Ihr

Ser

Ile

Cys

30

35

40

TCC

TIG

TAC

CAA

TIG

GAA

AAC

TACIGCAACT AGAOGCAGCC OGCAGGCTCT

450

Ser

Leu

iyr

Gin

Leu

Glu

Asn

...

45

50

AGA

453

(2)

A' 7

. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A .SZEKVENCIA JELLEMYŐI (A) HOSSZÚSÁG: 115 aminosav

			(B)TIPUS:		aminosav
			(D) TOPOLÓGIA:	lineáris
	A MOLEKULA	TÍPUSA: protein
	(xi) Á SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A	7o	SZÁMÚ SZEKVENCIA:
Met	Lys	Val	Phe Leu	Leu	Leu	Ser Leu Ile	Gly Fhe Cys Trp	Alá	Gin
-65				-60			-55				-50
Pro	Ile	Asp	Ihr Arg	Lys	Glu	Gly Leu Gin	His	Asp Tyr Asp	Thr	Glu
			-45			-40.	- . .	- -		-35
Ile	Leu	Glu	His Ile	Gly	Ser	Asp Glu Leu	Thr	Pro Asn	Glu	Glu	iyr
		—	-30		-	- -25-			-20
Val	Ile	Glu Arg Ihr	Leu	Gin	Alá Ile Asp	Asn	Ihr Ihr	Leu	Alá	Lys
		-15				-10		-5
Arg	Phe	Val	Asn Gin	His	Leu	Cys Gly Ser	His	Leu Val	Glu	Alá	Leu
	1			5			10				15

··

-A'30 - *

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly phe.Phe Tyr Thr Pro Lys Alá Alá

2530

Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Hír Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin 35 4045

Leu Glu Asn (2)A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 459 bázispár (B) 'TÍPUS: _z aminosav (C) SZÁLAZOTTSÁG: egyszálu (D) TOPOLÓGIA lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS CDS (_B) LOKÁCIÓ: 76..435 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: sig peptid (B) LOKÁCIÓ: 76..276 (ix) 'JELLEMZŐK:

(A) N.ÉV/KULCS: mat_peptid (B) LOKÁCIÓ: 277..435 (xi) A^r-SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GAHACAAAC TATCAATITC ATACACAATA60

TAAAOGAHA AAAGA ATC AAA GTC 1TC CTG CTG CTT TCC CTC ATT GGA TTCHl

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Fhe

-67 -65 ·-60

TCC Cys -55

TCG GCC CAA CCT GTC

CCA ΑΊΑ GAC ACA AGA AAA GAA GGA CIA CAG

159

Trp Alá

Gin Pro Val -50

Pro

Ile Asp

Ihr

Arg Lys -45

Glu

Gly Leu Gin -40

CAT

GAT

TAC

GAT

ACA

GAA

ATT

TTC

GAG

CAC

ATT

GGA

AGC

GAT

GAG

ΊΤΑ

207

His

Asp

Tyr Asp

Ihr

Glu

Ile

Leu

Glu

His

Ile

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

-35

-30

-25

ACC

CCG

AAT

GAA

GAG

TAT

CTT

ATI

GAA

AGA

ACT

TTC

CAA

GCC

ATC

GAT

255

1hr

Pro

Asn

Glu

G1U

Tyr

Val

He

Glu

Arg

Ίϊιτ

Leu

Gin

Alá

He

Asp

-20

-15

-10

AAC

ACC

Acr

TTC

GCT

AAG

AGA

TTC

CTT

AAC

CAA

CAC

TTC

TCC

GGT

TCC

303

Asn

Tűr

Thr

Leu

Alá

Lys Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

-5 15

--.31 351

CAC TIG GIT GAA GCT

TIG TAC TIG GIT TGC GGT GAA AGA GGT TTC TTC

His Leu Val 10

Glu

Alá

Leu 15

Tyr

Leu

Val

cys

Gly Glu Arg Gly Phe Fhe

20

25

TAC

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GGT

ATT

GTC

GAA

CAA

TGC

TGT

ACC

TCC

Tyr

Thr

Pro

Lys

Alá

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

30

35

40

ATC

TGC

TCC

TIG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGACGCAGC

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr Cys

Asn

45

50

399

445

COGCAGGCTC TAGA (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(1) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 12o-aniino'sav ··· (B) TÍPUS _z aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris

459 (ii) AMOLEKÜLA TÍPUSA: protein (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Met -67

Lys Val -65

Fhe leu Leu

Leu Ser Leu Ile -60

Gly Phe

Cys Trp Alá Gin -55

Pro

Val

Pro

Ile

Asp

Thr

Arg

Lys

Glu

Gly

Leu

Gin

His

Asp Tyr Asp

-50

-45

-40

Thr

Glu

Ile

Leu

Glu

His

Ile

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Hír

Pro

Asn

Glu

-35

-30

-25

-20

Glu

Tyr

Val

Ile

Glu

Arg

Thr

Leu

Gin

Alá

Ile

Asp

Asn

Thr

Leu

-15

-10

-5

Alá

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

1

5

10

Alá

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg Gly Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

15

20

25

Alá

Lys Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys Cys Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

30

35

40

45

Tyr

Gin

Leu Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

(2) A lo. SZÁMÚ SZEKVENCIA-.ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA_zJELLEMEZŐI:.

(A) HOSSZÚSÁG:' ' 4oö .bázispár (B) TÍPUS: - nukleinsav (C) ^;SZALAZOT-TSAG-:- egyszalu (_D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS • · ♦ 4·· • · · 4 · ·· ··· · ·*·«4 ·

-:.32(ix) JELLEMZŐK: ' * (A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 76. .384 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: sig pepiid (B) LOKÁCIÓ: 76..2Σ5 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: mat_peptid (B) LOKÁCIÓ: 226..384 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A lo. SZEKVENCIA

GAATTCATTC AAGAATACTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTIC ATACACAATA60

TAAAOGATTA AAAGA ATG AAA GTC TTC CTG CTG CIT TCC CTC ATT GGA TTC111

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Phe -50 -45-40

TGC TGG Cys Ttp

GCC CAA CCA TCG ATC TTG GAT TAT CTT GAC TIG GCT GOG GAA

159

Alá Gin Pro -35

Ser Ile

Leu

Asp Tyr Val Asp Leu Gly Alá Glu

-30

-25

CTG

ATC

TCC

ATT

CCT

GGG

TAT

GAT

AAC

CTC

AAC

GAC

GOG

ATC

GAT

AAC

207

Leu

Ile

Ser

Ile

Arg Gly

Tyr Asp

Asn

Leu

Asn

Asp

Alá

Ile Asp

Asn

-20

-15

-

-10

ACC

ACT

TIG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TIG TGC

GGT

TCC

CAC

255

Thr

leu

Alá

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin His

Leu. Cys

Gly

Ser

His

-5

1

5

10

TIG

CTT

GAA

GCT

TIG

TAC

TTG

GTT

TGC

GCT

GAA

AGA

GCT

TTC

TAC

303

Leu

Val

Glu

Alá

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

15

20

25

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GGT

ATT

CTC

GAA

CAA

TGC

TCT

ACC

TCC

ATC

351

Thr

Pro

Lys

Alá

Lys

Gly

Ile

Val

G1U

Gin

Cys

Thr

Ser

Ile

30

35

-

- -

. 40

TGC

TCC

TIG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC

404

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr Cys

Asn

45

50

TAGA (2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A- SZEKVENCIA -JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: I03. aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii)A MOLEKULA TÍPUSA: protein

408

- . 33 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Met Lys Val

Phe

Leu Leu

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly Phe Cys Trp

Alá

Gin

-50

-45

-40-

-35

Pro Ser Ile

Leu

Asp Tyr

Val

Asp

leu

Gly

Alá

Glu

Leu

Ile

Ser

Ile

-30

-25

-20

Arg Gly Tyr Asp

Asn Leu

Asn

Asp

Alá

Ile

Asp

Asn

Ihr

Leu

Alá

-15

-10

-5

Lys Arg Phe

Val

Asn Gin

His

leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Alá

1

5

10

Leu Tyr Leu

Val

Cys- Gly

Glu

Arg Gly

Fhe

Phe

Tyr

Ihr

Pro

Lys

Alá

15

20

25

30

Alá Lys Gly

Ile

Val Glu

Gin

Cys Cys

Ihr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

35

40

45

Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (2)A- 1-2. S-ZÁMíJ. SZEKVENCIA ADATAI (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 372 bázispár (B) TÍPUS: , nukleinsav (C) SZÁ-LAZOTTSÁG: egys zálu.

(D) TOPOLÓGIA:_ . lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LÖKÁCIÓ: 76..348 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: sig_peptid (B) LOKÁCIÓ: 76.. 189 (ix) JELLEMZŐK:_ (A) NÉV/KUlCS: mat_peptid (B) LOKÁCIÓ: 19o..348 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 12. SZEKVENCIA

GAATTCATIC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATEACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA60

TAAACGATTA AAAGA AIG AAA GTC TTC - CIG CIG CIT TCC CTC ΑΓΓ GGA TTC111

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Phe -38 -35-30

TCC TCG GCC CAA CCA TCG CAC ACT ACC ATC GGC ACC GCA ACT GAC AAA

Cys Trp Alá Gin Pro Ser His Thr Thr. Ile Gly.Thr Alá Thr Asp Lys

-25 -20-15

159 • ·

AAC ATC Asn Ile -10

GAT AAC ACC

ACT TTC GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTC

Asp

Asn Thr

Thr Leu -5

Alá

Lys

Arg Phe Val Asn Gin His Leu

1

5

TCC

GGT

TCC

CAC

TTC

GTT

GAA

GCT

TTC

TAC

TTC

GTT

TCC

GGT

GAA

AGA

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Alá

leu

Tyr

leu

Val

cys

Gly

Glu

Arg

10

15

20

GGT

TTC

TAC

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GGT

ΑΊΤ

GTC

GAA

CAA

TGC

Gly

Phe

Tyr

Ihr

Pro

Lys

Alá

Lys

Gly

Ile

Val

G1U

Gin

Cys

25

30

35

TCT

ACC

TCC ATC

TGC

TCC

TTC

TAC

CAA

TTC

GAA

AAC

TAC

TCC

AAC

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

G1U

Asn

Tyr Cys

Asn

40

45

50

TAGAOGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

207

255

303

348

372 (2)1 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 91 aminosav (B) TÍPUS:, aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A.SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A 13. SZEKVENCIA

Met

Lys

Val

Phe

Leu

Ser

leu

Ile

Gly

Phe

Cys Trp

Alá

Gin

-38

-35

-30

-25

Pro

Ser

His

Thr

Ile

Gly

Thr

Alá

Thr

Asp

Lys

Asn Ile

Asp

Asn

-20

-15

-10

Thr

Leu

Alá

Lys Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys Gly

Ser

His

-5

1

5

10

Leu

Val

Glu

Alá

Leu

Tyr

Leu

Val

cys Gly

Glu

Arg Gly Phe

Phe

Tyr

15

20

25

Thr

Pro

Lys

Alá

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys Cys Thr

Ser

Ile

30

35

40

Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

50

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy szintetikus vezető peptid szekvencia megszerkesztésének módszere, élesztőgombában való heterológ polipeptidek szekretálására azzal jellemezve, hogy (a) egy random DNS fragmentet egy élesztőgomba expressziós vektorba inzertálunk, mely vektor a következő szekvenciát tartalmazza:

5'-SP-X_n-3'-RS-5’-X_m-(NZT)p-Xg-PS-*gén*-3' ahol SP egy jelpeptidet kódoló DNS szekvencia,

X_n n aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol n 0 vagy 1- kb 10 aminosav,

RS egy restrikciós endonukleáz felismerő hely a random DNS fragmentek inzertálására, mely hely az X_n és X^ csatlakozásánál található,

X_m egy m aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol m 0 vagy 1-kb.

10, (NZT)p egy Asn-Xaa-Thr-t kódoló DNS szekvencia, ahol p 0 vagy 1, Xq egy Q aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol q 0 vagy 1- kb. 10 ,

PS egy élesztőgomba reakció helyet meghatározó peptidet kódoló DNS szekvencia, és *gén* egy heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvencia lehet, (b) az (a) lépés expressziós vektorával egy élesztőgomba gazda sejtet transzformálunk, (c) a (b) lépés transzformált gazdasejtjét megfelelő körülmények között tenyésztjük; és (d) a (c) lépés tenyészetét a heterológ polipeptidek szekréciójára szrineljük.
2. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a vektorba inzertált random DNS fragment genom vagy szintetikus eredetű lehet.
3. Az l.vagy 2. igénypontok szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a random DNS fragment 6-600 bázispárral rendelkezik.
4. Az 1.-3. igénypontok szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a random DNS fragment a poláros aminosavakat nagy arányban kódolja.
5. Az 1.-4. igénypontok szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a random DNS fragment legalább egy prolint kódol.
6. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy n és/vagy m és/vagy q 1-nél nagyobb vagy azzal megegyezik.
7. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy p 1-gyel megegyezik.

Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve hogy SP az a-faktor jelpeptidet, az egér nyál amiláz jelpeptidet, a karboxipeptidáz jelpeptidet, az élesztőgomba BARI jelpeptidet vagy a Humicola lanuginosa lipáz jelpeptidet vagy ezek származékát kódoló DNS szekvencia lehet.

• · *· *♦ *4 * Λ f 4 · • · 4 4 ·♦ ···*·* · •*· · ··· · ··
9. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a PS a Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg, vagy Ile-Glu-Gly-Arg párokat kódoló DNS szekvencia lehet.
10. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a heterológ polipeptid aprotinin vagy szövet faktor reakcióut inhibitor vagy más proteáz inhibitor vagy inzulin vagy inzulin prekurzor, humán vagy szarvasmarha növekedési hormon vagy interleukin, vagy glukagon, vagy szövet plazminogén aktivátor, vagy transzformáló növekedési a vagy β faktor vagy thrombocyta eredetű növekedési faktor, enzim vagy ezek funkcionális analógja lehet.
11. Egy élesztőgomba expressziós klónozó vektor azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciát tartalmazza:

5'-SP-X_n-3'-RS-5'-X_m-(NZT)p-Xg-PS-*gén*-3' ahol SP egy jelpeptidet kódoló DNS szekvencia,

X_n n aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol n 0 vagy 1- kb 10 aminosav,

RS egy restrikciós endonukleáz felismerő hely a random DNS fragmentek inzertálására, mely hely az X_n és X_m csatlakozásánál található,

X_m egy m aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol m 0 vagy 1-kb.

10, (NZT)p egy Asn-Xaa-Thr-t kódoló DNS szekvencia, ahol p 0 vagy 1, Xq egy Q aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol q 0 vagy 1- kb.

10,

4 · ·· «« ·· 9 * <· « · • · · < ·· *··«·« · «·· · ·*«· ··

PS egy élesztőgomba reakció helyet meghatározó peptidet kódoló DNS szekvencia, és *gén* egy heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvencia lehet.
12. Az 11. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy n és/vagy m és/vagy q 1-nél nagyobb vagy azzal megegyezik.
13. Az 11. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy p 1-gyel megegyezik.
14. Az 11. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy SP az α-faktor jelpeptidet, az egér nyál amiláz jelpeptidet, a karboxipeptidáz jelpeptidet, vagy az élesztőgomba BARI jelpeptidet kódoló DNS szekvencia lehet.
15. Az 11. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a PS a Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg, vagy Ile-Glu-Gly-Arg párokat kódoló DNS szekvencia lehet.
16. Az 11. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a heterológ polipeptid aprotinin vagy exogén reakcióut inhibitor vagy más proteáz inhibitor vagy inzulin vagy inzulin prekurzor, humán vagy szarvasmarha növekedési hormon vagy interleukin, vagy glukagon, vagy szövet plazminogén aktivátor, vagy transzformáló növekedési a vagy β faktor vagy thrombocyta eredetű növekedési faktor, enzim vagy ezek funkcionális analógja lehet.

• · · · ·* • ·»·· · * ··· · ·«·« ··
17. Egy élesztőgomba expressziós vektor azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciát tartalmazza:

5'-SP-X_n-ranDNS-X_m-(NZT)_p-X_q-PS-*gén*-3' ahol SP egy jelpeptidet kódoló DNS szekvencia,

X_n n aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol n 0 vagy 1- kb 10 aminosav, ranDNS egy restrikciós endonukleáz felismerő helyre inzertált random DNS fragment, mely az X_n és X_m csatlakozásánál található,

X_m m aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol m 0 vagy 1-kb. 10 , (NZT)p egy Asn-Xaa-Thr-t kódoló DNS szekvencia, ahol p 0 vagy 1, X_q egy Q aminosavat kódoló DNS szekvencia, ahol q 0 vagy 1- kb. 10 ,

PS egy élesztőgomba reakció helyet meghatározó peptidet kódoló

DNS szekvencia, és *gén* egy heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvencia lehet;

az X_n~Xg szekvencia egy vezető peptid szekvenciát kódol.
18. A 17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a vektorba inzertált random DNS fragment genom vagy szintetikus eredetű lehet.
19. A 17.vagy 18. igénypontok szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a random DNS fragment 6-600 bázispárral rendel kezik.
20. A 17.- 19. igénypontok szerinti hogy a random DNS fragment a poláros kódolj a.
21.

17.-20. igénypontok szerinti módszer azzal jellemezve, aminosavakat nagy arányban módszer azzal jellemezve, hogy random DNS fragment legalább egy prolint kódol.
22.

17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy és/vagy m és/vagy q nagyobb 1-nél vagy azzal megegyezik.
23. A

17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy

1-gyel megegyezik.
24. A

17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy

SP az a-faktor jelpeptidet, az egér nyál amiláz jelpeptidet, karboxipeptidáz jelpeptidet, az élesztőgomba BARI jelpeptidet vagy a Humicola lanuginosa lipáz jelpeptidet vagy ezek származékát kódoló DNS szekvencia lehet.
25. A 17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy

PS a Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg, vagy

Ile-Glu-Gly-Arg párokat kódoló DNS szekvencia lehet.
26. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy heterológ polipeptid aprotinin vagy szövet faktor reakcióut inhibitor vagy más proteáz inhibitor vagy inzulin vagy inzulin prekurzor, humán vagy szarvasmarha növekedési hormon vagy interleukin, vagy glukagon, vagy szövet plazminogén aktivátor, vagy · ·· *· ·· · ·* · · transzformáló növekedési a vagy β faktor vagy thrombocyta eredetű növekedési faktor, enzim vagy ezek funkcionális analógja lehet.
27. Egy élesztőgomba sejt azzal jellemezve, hogy képes egy heterológ polipeptidet expresszálni és melyet a 11-16. igénypontoknak megfelelően egy élesztőgomba expressziós vektorral transzformáltunk.
28. Egy élesztőgomba sejt azzal jellemezve, hogy képes egy heterológ polipeptidet expresszálni és melyet egy a 17-26. igénypontoknak megfelelő élesztőgomba expressziós vektorral transzformáltunk.
29. Eljárás egy heterológ polipeptid élesztőgombában való előállítására, azzal jellemezve, hogy egy olyan élesztőgomba sejtet tenyésztünk egy megfelelő tápközegben, mely képes egy heterológ polipeptidet expresszálni, és melyet a 17-26. igénypontok bármelyikének megfelelő élesztőgomba expressziós vektorral transzformáltunk, ideértve az 1. igénypont módszerével előállított vezető peptid szekvenciát is, a heterológ polipeptid expressziójának és szekréciójának elérése céljából, majd ezt követően a heterológ polipeptidet a tápközegből kinyerjük.