CZ119293A3

CZ119293A3 - Method of constructing synthetic leading peptide sequence

Info

Publication number: CZ119293A3
Application number: CS931192A
Authority: CZ
Inventors: Lars Christiansen
Original assignee: Novo Nordisk As; Lars Christiansen
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1994-02-16
Also published as: AU660161B2; ZA919932B; FI932831A0; WO1992011378A1; CA2098731A1; PT99848A; IE914433A1; HUT68751A; NZ241011A; SK62593A3; DK300090D0; AU9134891A; MX9102684A; FI932831A; EP0563175A1; IL100408A0; JPH06503957A; HU9301801D0; KR930703450A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu konstrukce syntetických vedoucích peptidových sekvenci pro sekreci heterologických polypeptidů v kvasinkách a kvasinkových expresních vektorů pro použití při tomto způsobu.

Dosavadní stav techniky bílkoviny, které se funkci mimo buňku, jakožto sekretované náiní peptid,

Kvasinkové organismy produkují četné syntetizují intracelulárně, které však mají Takové extrace1ulární bílkoviny se označují bílkoviny. Tyto sekretované bílkoviny se vylučují zpočátku uvnitř buňky v prekursorové nebo v predbílkovinové formě obsahující presekvenci zajišťující účinné řízení vylučovaného produktu membránou endoplasmického retikula (ER). Presekvence, zpravidla označovaná jakožto signální peptid, se obecně odštěpuje od žádaného •ř produktu v průběhu trans lokace. Jakmile vstoupí na vylučovací cestu, přenáší se bílkovina do jednotky Golgí. Z Goigi může bílkovina pokračovat různými cestami, které vedou do úseků, jako jsou buněčná vakuoia nebo buněčná membrána nebo mohou opustit buňku a vylučovat se do venkovního prostředí (S. R. Pfeffer a J. E. Rothman, Ann. Rev. Biochem. 56 , str. 829 až 852, 1987).

Byly navrženy různé způsoby exprese a vylučování v kvasinkách bílkovin hetero1gických ke kvasinkám. V evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo 88 632 se popisuje způsob, kterým dochází v případě bílkovin hetoroíogických ke kvasinkám, k expresi, zpracování a vylučování transformací kvasinkového organismu expresivnim pojivém kotvícím DNA kódující žádanou bílkovinu a sigk přípravě kultury transformovaného organismu, kul ti vačni ho prostředi.. samotného žádaného peptidu, heterologickým signálním peptidem nebo hybridem nativního a heterologového signálního peptidu.

k růstu kultury a k získáni bílkovny z Signáini peptid může být signálním p

Problémem při použiti signálních peptidú, heterologických ke kvasinkám, může být skutečnost, že hetero1ogický signální peptid nezajišťuje účinnou translokaci a/nebo odštěpení po signálním peptidu.

S. čerevišiae MFal (σ-faktor) se syntetizuje jako preproforma 165 aminokyselin obsahující signální nebo prepeptid s 19 aminokyselinami následovaný vedoucím nebo propeptidem se 64 aminokyselinami majícím tři N-vázaná glykosylační mista následovaná (LysArg(Asp/Glu, Ala)2 -3a-faktor)4 (J. Kurjan a I. Herskowitz, Cell 30, str. 933 až 943, 1982). Signální vedoucí podíl preproMFal se v široké míře používá k dosažení syntézy a sekrece heterologické bílkoviny v S. cerevisiae.

Použití signálních/vedoucích peptidú homůlogických ke kvasinkám je o sobě známé například z amerického patentového spisu číslo 4 546082, z evropské zveřejněné přihlášky vynálezu číslo

116201, 123294, 123544, 163529 a 123289 a z dánského zveřejněné přihlášky vynálezu číslo 3614/83.

Podle evropské přihlášky vynálezu číslo 123289 se používá S. cerevisiae α-faktorového prekursoru, přičemž podle světového patentového spisu WO 84/01153 se naznačuje použití Saccharomyces cerevisiae invertazového signálního peptidu a podle zveřejněné dánské přihlášky vynálezu čislo 3614/83 se používá Saccharomyces cerevisiae PHO5 signálního peptidu pro sekreci cizích bílkovin.

V americkém patentovém spise číslo 4 546082 a v evropských patentových spisech čislo 16201, 123294, 123544 a 163529 se popisuje způsob, podle kterého se α-faktorový signální vedoucí prvek (signal-leader) ze Saccharomyces cerevisiae (MFal nebo MFa2) používá v sekrečním procesu vytlačených hetero1ogických bílkovin v kvasinkách. Popisuje se fuze DNA sekvence kódující Saccharomyces cerevisiae MFal signální vedoucí sekvenci na zakončení 5' genu pro žádanou sekreci bílkoviny a zpracování žádané bílkoviny.

Evropský patentový spis číslo 206783 popisuje systém pro sekreci polypeptidů ze Saccharomyces cerevisiae, přičemž a-faktorová vedoucí sekvence je seříznuta k eliminaci čtyř a-faktorových peptidů obsažených na nativní vedoucí sekvenci, takže se uvolňuje vedoucí peptid sám anelovaný na hetero1ogický polypeptid prostřednictvím α-faktorového zpracovatelského místa LysArgGluAlaGluAla. Uvádí se, že tato konstrukce vede k účinnému způsobu přípravy menších peptidů (obsahujících méně než 50 aminokyselin). Pro sekreci a zpracování větších polypeptidů se nativní a-faktorová vedoucí sekvence seřízne k uvolnění jednoho nebo dvou.a-faktorových peptidů mezi vedoucím peptidem a po 1ypeptidem.

Počet sekretovaných bílkovin se směřuje tak, aby byly vystaveny proteo1ytickému zpracovatelskému systému, který může odštěpit peptidovou vazbu na karboxylovém zakončení dvou následujících bazických aminokyselin. Tato enzymatická aktivita je v Saccharomyces cerevisiae zakódována KEX 2 genem (D. A. Julius a kol., Cell 37, str. 1075, 1984b). Zpracování produktu KEX 2 genovým produktem je nutné pro sekreci aktivního Saccharomyces cerevisiae faktoru al (MFal nebo a-faktor) není však zahrnut v sekreci aktiv niho S.cerevisiae faktoru a.

Sekrece a správné zpracování polypetidu, který má být výsledkem sekrece, se v některých případech dosahuje, jestliže se kultivují kvasinkové organismy, které jsou transformovány vektorem, konstruovaným jak shora uvedeno. V mnoha případech však hladina sekrece je velmi nízká nebo k sekreci vůbec nedochází nebo proteo1ytické zpracování může být nesprávné nebo nekompletní. Záměrem vynálezu je proto vytvořit vedoucí peptidy, které zajišťují účinnější expresi a/nebo zpracování heterologových polypeptidů.

I

Podstata vynálezu

Podstata způsobu konstrukce syntetické vedoucí peptidové sekvence pro sekreci heterologových polypeptidů v kvasinkách podle vynálezu spočívá v tom, že se

a) vnáší statistický DNA fragment do kvasinkového expresního vektoru zahrnujícího sekvenci ' -SP-Xn-3 ' -RS-5 ' -X_m-(NZT)_p-X<.-PS-*gen*-3 ' kde znamená

SP DNA sekvenci kódující signální peptid

X_n DNA sekvenci kódující n aminokyselin, přičemž n zna4 mená O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin, RS restrikční endonuklesové rekognizační místo pro včlenění statistických DNA fragmentů, kteréžto místo je na spojení X_n a X_a,

X_B DNA sekvenci kódující m aminokyselin, přičemž m znamená O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin, (NZT)p DNA sekvenci kódující Asn-Xaa-Thr, přičemž m znamená O nebo číslo 1,

X_q DNA sekvenci kódující q aminokyselin, přičemž q znamená O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin,

PS DNA sekvenci kodujici peptid definující kvasinkové zpracovatelské místo a *gen* sekvenci kódující heterologický polypeptid,

b) transformuje se kvasinková hostitelská buňka expresním vektorem podle stupně (a),

c) kultivuje se transformovaná hostitelská buňka podle stupně (b) za vhodných podmínek a

d) vytřídí se kultura podle stupně (c) pro sekreci hetero1ogového polypeptidu.

S překvapením se totiž zjistilo, že je možno přesunout a-faktorový vedoucí peptid mnoha různými DNA sekvencemi, čímž se dosáhne sekrece heterologického polypeptidu v kvasinkách. Na základě tohoto objevu byl vyvinut způsob, kterým se statistické DNA fragmenty klonují do kvasinkových vektorů ve směru DNA sekvence kódující pro signální peptid a proti, směru DNA sekvence kódující pro heterologový polypeptid. Po transformaci vektory se kvasinkové buňky vytřídí pro sekreci žádaného hatero1ogického polypeptidu.

Vynález se proto týká především shora definovaného způsobu konstrukce syntetické vedoucí peptidové sekvence pro sekreci hetero 1 ogických polypeptidů v kvasinkách.

Výrazem vedoucí peptid se zde vždy mini peptid, jehož úlohou je umožnit řízení heteroiogického polypeptidu z endoplasmového retikuia na Golgi aparaturu a dále k sektretačnimu pojidlu pro sekreci do prostředí (to znamená export vytlačeného polypeptidu přes buněčnou stěnu nebo alespoň přes celulárni membránu do perisplamové oblasti buňky). Výrazem syntetický v souvislosti

- 5 s vedoucími peptidy se zde vždy mini, že vedoucí peptid, konstruovaný podle vynálezu, nebyl v přírodě nalezen. ‘

Výrazem signální peptid se zde vždy mini presekvence, která je převážně hydrofobní povahy a je obsažena jakožto N-zakončující sekvence v kvasinkách. Funkcí signálního peptidů je umožnit sekreci hatero1ogické bílkoviny do endoplasmového retikula. Signální peptid se zpravidla v průběhu tohoto procesu odštěpí. Signální peptid může být heterologický nebo homologický s kvasinkovým organismem produkujícím bílkovinu, jak shora vysvětleno. Mnohem účinnějšího odštěpení signálního peptidů se však dosahuje, jestliže je homologický s příslušným kvasinkovým organismem.

Výrazem hetero1ogický polypeptid se míní polypeptid, který se neprodukuje přírodním hostitelským kvasinkovým organismem. Při způsobu podle vynálezu je hetero1ogickým polypeptidem š výhodou polypeptid, jehož sekrece transformovanými kvasinkovými buňkami se může snadno zjistit, například ustavením standardních způsobů, jako je imunologické vytřídění použitím protilátek reaktivních s příslušným polypeptidem (viz například Sambrook, Fritsch a Maniatis, Moiecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulární clonování: Laboratorní příručka), Cold Spring Harbor, New York, 1989) nebo vytříděním pro specifickou biologickou účinnost heteroiogického peptidů. Pozitivní výsledek vytřídění indikuje, že byl kontruován vedoucí peptid, užitečný pro sekreci heterologického polypeptidu v kvasinkách.

Výrazem statistický DNA fragment se míní jakákoliv sekvence DNA o délce alespoň tří nukleotidů, například získaná digesci genomově DNA (jakéhokoliv organismu) s restrikční endonukleasou nebo s restrikčnimi endonukleásami nebo přípravou syntetické DNA, například fos ioamidátovým způsobem, který popsai S.L. Beaucage a H.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1869, 1981.

Peptid Asn-Xaa-Thr kódovaný (NZT)_V je asparaginem vázané glykosylačm místo. X?.a” znamená kteroukoliv ze známých aminokyselin krom- prolinu.

Vynalez se také tyká kvasinkového expresního cionovacího vektrou zahrnujícího následující sekvenci '-SP-X_r,-3 '-RS-5 '-X.--(NZT) _?-Χ._Ί-PS-*ger, -·*-3 ' kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam.

Tohoto vektoru se může používat pro způsob konstrukce syntetické vedoucí peptidové sekvence shora popsaným způsobem.

Vynález se také týká kvasinkového expresního vektrou zahrnujícího následující sekvenci ' -SP-Xn-statistická DNA-X_r„-(NZT) _?-X,₇-PS-*gen*-3 ' kde znamená výraz statistická DNA fragment včleněný do restrikčniho endonuklesového rekognizačního místa ve spojení X_n a X_a a ostatní symboly mají shora uvedený význam.

V tomto vektoru vedoucí peptidová sekvence (identifikovaná způsobem podle vynálezu) je složen ze sekvence

X_n-statistická DNA~X_m-(NZT)_p-X_q kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam. Takového vektoru se může používat pro produkti žádaného heterologickěho polypeptidu.

Vynález se také týká způsobu přípravy hetero1ogického polypeptidu v kvasinkách, přičemž se kultivuje kvasinková buňka, která je schopna exprese heterologického polypeptidu a která se transformuje kvasinkovým expresním vektorem, jak shora uvedeno, včetně vedoucí peptidové sekvence konstruované způsobem podle vynálezu ve vhodném prostředí k získání exprese a sekrece heterolo— gického polypeptidu, přičemž se nakonec heterologický peptid získá z prostředí.

Délka statistického DNA fragmentu, včleněného do expresního vektoru, nemá rozhodující význam. Aby však byla délka vhodná pro manipulaci, má fragment s výhodou délku 16 až 600 páru bází. Především má fragment délku přibližně 15 až přibližně 300 párů bázi. V současné době se mini, že vhodná délka fragmentu je přibližně 30 až přibližně 150 páru bázi.

Statistický DNA fragment s výhodou kóduje vysoký podíl polárních aminokyselin. Tyto aminokyseliny jsou voleny ze souboru zahrnujícího Glu, Asp, Arg, His, Thr, Ser, Asn a Gin. V této souvislosti se výrazem vysoký podíl míní, že DNA fragment kóduje větší počet polárních aminokyselin než mají schopnost jiné DNA sekvence odpovídající délky. Nezávisle na tom nebo nad to mů7 že být výhodné, aby fragment kodoval alespoň jeden prolin.

⁼ ' V sekvenci “ ' ” '

5'—SP—X_n—3'-RS-5'-X_m-(NZT)_p-X_q-PS-*gen*-3' znamená n a/nebo m a/nebo q s výhodou 1 nebo větší číslo než 1. Především všechny symboly n, m a q znamenají 1 nebo větší číslo než 1 a ostatní symboly mají shora uvedený význam.

Jsou některé skutečnosti (viz světový patentový spis WO 89/02463), které potvrzují, že přítomnost na asparagin vázaného glykosylačniho místa ve vedousí sekvenci může podporovat sekreční účinnost vedoucího peptidu. V sekvenci

5'-SP-Xn-3'-RS-5'-X_m-(NZT)_p—Xq—PS-*gen*—3' . znamená prosto symbol p s výhodou 1, přičemž ostatní symboly mají shora uvedený význam.

y - b Signální peptidová sekvence (SP) může kodovat jakýkoliv i’ signální peptid, který zajišťuje účinné řízení vytlačovaného heterologického polypeptidu do sekreční cesty buňky. Signálním peptidem může být přírodně se vyskytující signální peptid nebo jeho funkční podíl nebo to může být syntetický peptid. Vhodnými signální nimi peptidy jsou α-faktorové signální peptidy, signální peptid í myších slinných žláz, modifikovaný karboxypeptidasový signální peptid, signální peptid kvasinek BARI nebo lipasový signální peptid Humicola lanuginosa nebo jeho derivát. Amylasová signálni sekvence myšších slinných žláz je popsána v publikaci O. Hagenbůchle a kol., Nátuře 289, str. 643 až 646, 1981. Karboxypeptidasová signální sekvence je popsána v publikaci L.A. Vails a kol., Cell 48, str. 887 až 897, 1987. Signální peptid kvasinek BARI je popsán ve světovém patentovém spise WO 87/02670. Lipasový signální peptid Humicola lanuginosa je popsán v evropském patentovém spise číslo EP 305 216.

Kvasinkovým zpracovatelským místem, kódovaným DNA sekvencí PS může být vhodně jakákloliv párová kombinace Lys a Arg, například Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys nebo Arg-Arg, která umožňuje výrobu heterologického polypeptidu KEX2 přoteasou Saccharomyces cerevisiae nebo ekvivalentní přoteasou jiného druhu kvasinek (D.A. Julius a kol., Call 37, od str. 1075, 1984). Pokud není KEX2 proces vhodný, například se má dosáhnout štěpení po 1ypeptidového produk8 tu, má se volit zpracovatelské místo pro jinou proteasu místo zahrnutí aminokyselinové kombinace, která nejí zjištěna v polypeptidovém produktu, například procesní místo pro FX_a , Ile-Glu-GlyArg (jak popisuje Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulární c1onování:Laboratorni příručka), Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Heterologickou bílkovinou, produkovanou způsobem podle vynálezu, může být jakákoliv bílkovina, která se výhodně produkuje kvasinkami. Jakožto příklady takových bílkovin se uváděj! aprotinin, tkáňový faktorový inhibitor nebo jiné proteasové inhibitory, insulin nebo insulinové prekursory, lidský nebo hovězí růstový faktor, interleukin, glukagon, tkáňový plasminogenový aktivátor, transformační růstový faktor σ nebo p, růstový faktor odvozený od krevních destiček, enzymy nebo jejich funkční analogy. Výrazem funkční analog se zde vždy míní polypeptid s podobnou funkcí jako má nativní bílkovina (míní se vztah k přírodě spiše než hladina biologické účinnosti nativní bílkoviny). Polypeptid může být strukturálně podobný nativní bílkovině a může být odvozen od nativní bílkoviny přidáním jedné nebo několika aminokyselin bud na jedno nebo na obě C a N-zakončeni nativní bílkoviny, náhradou jedné nebo několika aminokyselin na jednon nebe na četných odlišných místech v nativní aminokyselinové sekvenci, vypuštěním jedné nebo několika aminokyselin na jednom nebo na obou zakončeních nativní bílkoviny na jednom nebo na několika místech v aminokyselinové sekvenci nebo vložením jedné nebo několika aminokyselin na jednom nebo na několika místech nativní aminokyselinové sekvence Takové modifikace jsou dobře známé pro četné shora uvedené bílkoví ny.

•^tatisti ck* ' —SP—Xr. — 3'

DNA. fragment a sekvence -RS-5'-Xa-(NZT)_?-X,-PS-*gen*-3‘ kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam, se mohou připravovat synteticky o sobě známými způsoby například fosfoaroidátovým způsobem, který popsali S.L.Beaucage a M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1359, 1981 nebo způsobem, který popsal Matthes a kol., EMBO Journal 3, -str. 801 až 805, 1984.

Fosfoamidátovým způsobem se syntetizují oligonukleotidy, napřík9 lad v automatickém DNA syntetizeru, čisti se, tepelně se hybridizují, ligatují a clonuji do kvasinkového expresního vektoru. Připomíná se, že se sekvence ' —SP—X_ri —3 ' -RS-5 · -X_a-(NZT) _P-X_q-PS-*gen*-3 ‘ kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam, nemusí připravovat jedinou operací, ale může se vytvářet ze dvou nebo z několika o 1igonukleotidů, připravených synteticky takovým způsobem.

Statistický DNA fragment nebo jedna nebo několik částí sekvence

5'-SP-X_n-3'-RS-5'-X_a-(NZT)_p-X_q-PS-*gen*-3' kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam, mohou být také genomického nebo cDNA původu, například získané přípravou genomického nebo cDNA souboru (library) a vytříděním pro DNA sekvence kódující pro uvedené páry (zpravidla SP nebo *gen*) hybridizací za použiti syntetických oligonukleotidových sond spolu se standardními způsoby ( Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulární cionování: Laboratorní příručka), Cold Spring Harbor, New York, 1989). V takovém případě genomická nebo cDNA sekvence, kódující signální peptid, se může vázat na genomickou nebo cDNA sekvenci kódující heterologickou bílkovinu, načež se DNA sekvence může modifikovat včleněním syntetických o 1 igunukleotidů kódujících o scbě známým způsobem sekvenci

X_n-3 '-RS-5 '-X_n-(NZT) _p-X.₃-PS kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam.

Statistický DNA fragment a/nebo sekvence ' -SP-X_ri-3 ' -RS-5 ' -X_a-(NZT) _P-X_q-PS-*gen*~3 ' kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam, může být směsného původu syntetického a genomického, směsného původu syntetického a cDNA nebo směsného původu genomického a cDNA, přičemž se příprava provádí o sobě známým způsobem tepelnou hybridizaci fragmentů syntetického, genomického nebo cDNA původu (podle vhodnosti), přičemž fragmenty opdpovidaji razným částem DNA sekvence jako celku. Proto je možno mít představu, Se DNA sekvence, kódující signální peptid nebo heterc1ogicky polypeptid, může být gnomickeho nebo cDNA Důvodu, zatímco sekvence

X --.3 ' -RS-5 ' -x _E — (NZT)_p—X - -PS může být připravena synteticky.

Výhodná kontrukce DNA, kódující insulinové prckursory, je objasněna na sekvenčním seznamu ID číslo 1-13 (Sequencs Listing ID Nos. 1-13) nebo na jeho modifikacích. Příklady vhodných modifikací DNA sekvence jsou nukleotidová substituce, které nevedou k růstu na jinou aminokyselinovou sekvenci bílkoviny, které však mohou odpovídat kodomovénu použití kvasinkového organismu, do kterého se vkládá DNA konstrukce nebo nukleotidové substituce, které umoftují růst do odlišné aminokyselinové sekvence a tak možnou odlišnou strukturu bílkoviny. Jakožto jiný případ možné modifikace se uvádí včlenění tří nebo násobku tří nukleotidů do sekvence, adice tři nebo násobku tří nukleotidů na jedno zakončení sekvence a vyuštění tři nebo násobku tří nukleotidů bud ze zakončení nebo z vnitřku sekvence.

Rekombinantním expresním vektorem nesoucím sekvenci 5'-SP-Xn-3'—RS—5'-Xm-(NZT)_p-X_q-PS-*gen*-3' nebo

5'-SP-X_n-statistická DNA-Xm-(NZT)_p-X_q-PS-*gen*-3' kde jednotlivé symboly mají vždy shora uvedený význam, může být jakýkoliv vektor, který je schopen replikace v kvasinkovém organismu. Ve vektoru kterákoliv DNA sekvence může být operativně napojena na vhodný promotor sekvence. Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence, která vykazuje transkripční aktivitu v kvasinkách a může být odvozena od genů kódujících bílkoviny bud homologické nebo htetero1ogické ke kvasinkám. Promotor je s výhodou odvozen od genu kódujícího bílkovinový homolog ke kvasinkám. Jakožto příklady vhodných promotorů se uvádějí promotory Saccharomycetes cerevisiae MFal, TPI, ADH nebo PGK.

Shora uvedené sekvence mají být také operativně spojeny se vhodným terminátorem, jako je například TPI terminátor (viz T. Alber a G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, str. 419 až 434, 1982).

Rekombinantní expresní vektor podle vynálezu dále zahrnuje

DNA sekvenci, umožňující replikaci vektoru v kvasinkách. Jakožto příklady takových sekvencí se uváděj! kvasinkové plasmidové 2μ replikačnl geny REP 1-3 a počátek replikace. Vektor také múze zahrnovat selektovatelný signální znak, například Schizosaccharomyces pombe TPI gen, jak popisuje P.R. Russell, Gene 40, str. 125 až 130, 1985.

Procesy, používané k ligaci sekvence

5'-SP-Xn-3'—RS—5'-X_m-(NZT)_p-X_q-PS-*gen*-3 ' kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam, statistický DNA fragment, promotor a terminátor a jejich včleňování do vhodných kvasinkových vektorů obsahujících informaci nutnou pro replikaci kvasinek jsou pracovníkům v oboru dobře známy (viz například Sambrook, Fritsch a'Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulární clonováni: Laboratorní příručka), Cold Spring Harbor, New York, 1989). Je jasné, že se vektor může konstruovat bud nejdříve přípravou DNA konstrukce obsahující celou sekvenci ' -SP-Xn-3 ' -RS-5 ' -X_m-(NZT) _P-Xq-PS-*gen*-3 ' kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam, a následně včleněním tohoto fragmentu do vhodného expresního vektoru nebo následným včleněním DNA fragmentů obsahujících genetickou informaci pro jednotlivé prvky (jako například signální peptid, sekvence

Xn-3'-RS-5'-Xo-(NZT)p-Xq kde jednotlivé symboly mají shora uvedený význam, nebo heterologický polypeptid) s následnou ligaci.

Kvasinkový organismus, používaný při způsobu podle vynálezu může být jakýkoliv vhodný kvasinkový organismus, který při kultivování produkuje velká množství heterologického žádaného polypeptidu. Jakožto příklady takových kvasinkových organismů se mohou uvést kmeny kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe a Saccharomyces uvarum. Transformace kvasinkových buněk se může například realizovat protopíastovou formací následovanou transformací o sobě známým způsobem. Použitým prostředím ke kultivaci buněk může být jakékoliv prostředí pro růst kvasinkvého organismu. Sektrtovaná hetorologická bílkovina, jejíž značný podíl je obsažen v prostředí ve správně produkované formě, se může získat o sobě známým způsobem včetně odděleni kvasinkových buněk z prostředí odstředěním nebe filtrací, vysráženim bi1kovinových složek supernatantu nebo odfiltrováním sa použití soli, například síranu amonného a následným čištěním různými chromatografickými procesy, jako je například ionexová chromatografie a afinitní chromatografie.

Vynález blíže objasňují připojené výkresy: na obr. 1 je schéma konstrukce pMT7425m, na obr. 2 je schéma konstrukce pLaC2O2, na obr. 3 je DNA sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence na clonovacim místě v pLaC2O2 pro statistické DNA fragmenty (připomíná se, že sekvence se štěpí v Clal místě a že ligace bez včlenění statistické DNA vede ke změně ve čtecím rámci), na obr. 4 je schéma konstrukce pLSC6315D#.

Vynález rovněž objasňují následující příklady praktického provedení, které však nejsou míněny jako omezení vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Plasmidové a DNA materiály

Všechny expresní plasmidy jsou C-POT typu. Všechny plastimdy jsou popsány ve zveřejněné evropské přihlášce vynálezu číslo 171142 a jsou charakterizovány obsahem Schizosaccharomyces pombe triosovým fosfátovým isomerasovým genem (POT) pro účely pláámidové selekce a stabilizace. Plasmid, obsahující POT gen, je dostupný jakožto uložený E. coli kmen (ATCC 39635). Plasmidy dále obsahují S. cerevisiae triosový fosfátový isomerasový promotor a terminátor (P_T?T a Ttpi). Jsou identické s pMT742 (M. Engel-Mitani a kol., Gene 73, str. 113 až 120, 1988) (viz obr. 1) s výjimkou pro oblast definovanou Sph-Xbal restrikčními místy zahrnujícími Ptpi a kódujícími oblast pro signál/vedoucí prvek/produkt.

Ptpi se modifikuje se zřetelem na sekvenci nalezenou v pMT742 jedině k usnadnění konstrukční oprerace. Vnitřní Sphl restrikční místo se eliminuje Sphl štěpením, odstraněním ocasů a religací. Kromě toho DNA sekvence ve směru proti promotoru a bez jakéhokoliv napadání promotoru, se odstraňuje Bal31 exonukleaso13 vým zpracováním s následnou adici Sphl restrikčniho mistového spojovníku. Tato promotorova konstrukce na 373 bp - Sphí-EcoRI fragmentu se označuje pMT7426 (obr. 1).

Soubor různých DNA fragmentů zaujímá případně místo v menším E. coli plasmidů typu pT7 shora popsaného (viz světový patentový spis WO 89/02463) pouze modifikovaného se zřetelem na shora popsaný Ptpi, to je pT7 6. Pro statistické clonování, dále popsané, se používá genomové DNA různých původů. S. cerevisíae DNA se izoluje ze kmene MT633 (deponován 7. prosince 1990 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur pdle ustanovení Budapešťské dohody na Mezinárodním shromáždění o deponování mikroorganismů pro účely patentovaných postupů pod číslem DSM 6278). A. oryzae DNA se izoluje ze kmene A1560 (IFO 4177).

Konečně se používají četné syntetické DNA fragmenty, které jsou všechny syntetizovány na automatickém DNA syntetizeru (Applied Biosystems model 38OA) za použití fosforamiditové chemie a obchodně dostupných reakčních činidel (S.L. Beaucage a M.H. Caruthers, Tetrahedrom Letters 22, str. 1859 až 1869, 1981). Oligonukleotidy se čistí poolyakrylamidovou gelovou elektroforesou za denaturačních podmínek. Před tepelnou hybridizací se kinasuji komplementární páry takových DNA jednoduchých řetězců za použiti T4 po 1ynukieotidové kinasy a ATP.

Všechny jiné způsboy a meteriály jsou obecně známé (viz například (J.Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulární clonování: Laboratorní příručka) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Příklad 1

Konstrukce pLaC2O2

490 bp SphI-Apal pT7 1966 (viz světový patentový spis WO 89/02463, obr. 5) a 179 bp Hinfl-Xbal fragment ρΤ7.σΜΙ3 (viz světový patentový spis WO 89/02463, obr·. 1) .spojeny v 11 kb Xbal-Sphl fragmen- pMT~42 přes syntetický adaptor:

N0R36 7/373 CAACCATCGATAACACCACTTTGGCTAAGAG

CCGGGTTGGTAGCTATTGTGGTGAAACCGATTCTCTAA resultují v plasmid pLaC2O2 (obr. 2 a 3, jakož taká sekvence ID

No.1) .

Tento vektor, obsahující specifické Clal místo, tvoří jedno provedení statistického DNA klonovaciho vektrou, ve kterém produkovaný gen kóduje pró insulinový prekursor MI3 (B(l-29)-Ala-AlaLys-A(1-21)). Následující příklady se týkají vedoucích prvků clonovaných touto konstrukcí.

Příklad 2

Konstrukce pLSC6315 a pLSC521O

Celá DNA se izoluje z S. cerevisiae kmenu MT663 a digeruje se s Taql, HinPI nebo Taql + HinPI. Produkty se oddělí podle velikosti na 1¾ agarosovém gelu a fragmenty menší než 600 bp se izolují z každé ze tří digesci.

pLaC202, předem digerovaný s Clyl, u něhož se předešlo samoligaci s telecí střevní alkalickou fosfatázou (CIAP) defosforylací se mísí s fragmentovými fondy shora popsanými a liguje se. Kmen E. coli MT172 (MT172 = MC ÍOOO nrr-ara+ leuB-6; MC 1OOO (viz M. Casadaban a S. Cohen, J. Mol. Biol. 138, str. 179, 1980)) se transformuje se shora“uvedenou ligační směsí a získají se vhodné 5000 ApR transformanty pro každou směs. Připraví se rekombinantní plasmidy z každého ze tři typů ve fondech zahrnujících všech 5000 transformantů. Těchto plasmidových fondů se používá k transformaci S. cerevisiae kmenu MT663 a resultujici TOI transformanty se immunotřídí pro sekreci MI3.

Z překvapivbě velkého počtu pozitivních transformantů se reizoluje osm zjevně nejúčinnějších a z nich izolovaný plasmidový obsah.

Jako výsledek této operace se očekává, že většina kvasinkových získaných transformantů má heterofenni populaci plasmidů a k získání pravých clonů se proto provádí stupeň plasmidové reizolace. Plasmidové preparace Z každého z osmi reizolovaných kvasinkových transformantů se používá ke transformaci E. coli kmene MT172 až ApR. Plasmidů z 12 E. coli transformantů pro každý z osmi kvasinkových isolátů se individuálně používá k transformaci kvasinkového kmene MT663, TPI a MI3 sekreteační transformanty se identifikují immunotřiděnim. . ......

Sekvencování inzertů osmi izolovaných derivátů pLaC2O2 vykazuje tři odlišné sekvence, dvě z nich pLSC6315 a pLSC521O jsou nejúčinnějším nosičem MI3 sekrece. Sekvence clonované DNA a lemovací oblasti jsou ukázány na sekvenčním seznamu ID čislo 2 a 4.

Příklad 3

Modifikace pLSC6315 pLSC6315 se voli pro další modifikaci clonované syntetické vedoucí sekvence.

pLSC6315 se digeruje s Apal endonukleasou s následným zpracováním endonukleasovou Bal31. Po fenolové extrakci se rezultujíci DNA digeruje s Xbal a izoluji se DNA fragmenty menší než originální 367 bp Apal-Xbal fragment.

pLaC2O2 se digerují s Clal a jednořetězcové CG generované ocasy se odstraní s následnou digescí Xbal a izolací 11 kb XbaI-]ClaI[ fragmentu (][ znamená, že jsou jednořetězcové ocasy odříznuty). Tento fragment se misi s pLSC6415 fragmenty isolovanými shora a iigatovanými (obr. 6).

Proces transformace a třídění, popsaný v příkladu 2, se opakuje a pLSC6315D3 a pLSC6315D7 se izoluje jakožto plasmidy podporující MI3 sekreci mnohem účinněji než originální pLSC6315 (viz sekvenční seznam ID číslo 6 nebo 8).

Přiklad 4

Konstrukce pLAOl - 5

Celá DNA z mikroorganismu Aspergiilus oryzae kmen A156O se zpracovává jako shora popsáno pro mikroorganismus S. cerevisiae DNA v příkladu 2 a clonování a reclonováni se provádí přesně, jako je popsáno v přikladu 2, s tou výjimkou, že počet E. coli transformantů v prvním clonování se sníží na přibližné 3000 na ligační směs. Tento pokus vede k izolaci pěti clonu A. oryzae DNA, které v pLaC2O2 kontextu zprostředkovávají sekreci insuiino16 vého prekursoru MI3 z S. cersvisias.

Sekvencováni .inzertů vykazuje pět odlišných sekvencí, dvě

z nichž	(pLA02 a
sekrece	MI 3. Sekv
spolu s	1emovac ími
bo 12 .
Příklad	5

Kvasinkové kmeny, kotvící plasmidy, jak shora popsáno, se nechávají růst v prostředí YPD (F. Sherman a kol., Methods in Yeast Genetics (Způsoby v genetice kvasinek), Cold Spring Harbor Laboratory 1981). Pro každý kmen se 6 individuálních 5 ml kultur protřepává při teplotě 30 ’C po dobu 60 hodin s konečným OD_SOo přibližně 15. Po dostředění se supernatant odstraní pro analýzu HPLC, čímž se měří koncentrace sekretovaného inzulínového prekursoru způsobem, který popsal Leo Snei a kol., Chromatographia 24, str. 329 až 332, 1987).

V tabulce I jsou uvedeny expresní hladiny insulinového pre-

kursoru, MI 3, použitím podle vynálezu, jakožto pMT7425, za použití MFo	vedoucích sekvencí izolovaných způsobem procento hladiny získané s transformanty :(1) vedoucího prvku S. cersvisiae.
Tabulka I
pMT742	100 %
pLSC6315	100 %
PLSC521O	60 %
pLSC6315D3	175 %
pLSC6315D7	120 %
pLA02	120 %
pLA05	60 %
Promyslová využitelnost

Kvasinkový expresní vektor zahrnující sekvenci pro konstrukt syntetických vedoucích peptidovych sekvenci.

— 17 — (i i >

(iii) (iv) (V) (Vi)

Sekvenční seznam (1) Obecná informace (i) Přihlašovatel: Novo Nordisk A/S

Název vynálezu: Způsob konstrukce syntetické vedouc peptidové sekvence

Počet sekvencí: 13 Korespondenční adresa:

(A) adresa: Novo Nordisk A/S, patentové oddělení (B) ulice: Novo Alle (C) město.: Bagsvaerd (E) země: Dánsko (F) ZIP: DK-288O Počítačem čitelná forma:

(A) typ prostředí: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: PatentlnRe1ease # 1,0, verse # 1,25 Současné údaje o přihlášce vynálezu:

(A) číslo přihlášky vynálezu (B) datum podání (C) mezinárodní klasifikace (viii) Informace o zástupci (A) jméno: Thaisoe-Madsen, Birgit (B) číslo: 3540.204-W0 (ix) Telekomunikační informace:

(A) telefon: + 45 4444 8883 (3) telefax: + 45 4449 3256 (C) telex 37304 (2) Informace pro SEQ ID NO:1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) dé1ka: 3 3 5 páru báz i (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:

GAATTCATTC AAGAAIAGTT CAAACAAGAA GATIACAAAC TATCAATTTC AIACACAATA 60

TAAACGATTA AAAGAAIGAA AGTCTTCCTG CTGCTTTCCC .TCATTGGATT CTGCTGGGCC / 120

CAACCATOGA TAACACCACT TTGGCTAAGA GATTOCTTAA CCAACACITG TGOGCTTCCC 180

ACTTGGTTGA AGCTTICTAC TIGGTITGCG GTCAAAGAGG TTIUTICTAC ACTCCTAAGG 240

CTCCTAAGGG TATICTOGAA CAATGCTCTA CCTCCATCTG CTCCTTCTAC CAAITCGAAA 300

ACTACTGCAA CTAGACGCAG CCCGCAGGCT CTAGA 335 (2) Informace pro SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence: .

(A) délka: 492 páru bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 76..468 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: sig peptid (B) lokace: 76..309 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: mat peptid (B) lokace: 310..468 (xi) Popis sekvence: SEQ*ID NO:2:

GAAÍTCAITC AAGAATACTT CAAACAAGAA GATIACAAAC TATCAATITC AIACACAATA

IAAAOGA.TTA AAAGA ATG AAA CTC TTC CTG CTG -CTT TCC CTC ATT G^A TTC Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Phe -78 75 “70

TGC TGG GCC CAA CCA TOG AIA GAT GGA ACA CAT ΊΠ COG AAC AAC AAT

Cys Trp Ala Gin Pro Ser Ile Asp Gly Thr His Phe Pro Asn Asn Asn -65 -60 -55

159

GTC

CCA

ATA

GAC

ACA AGA AAA

GAA

GGA

CTA CAG

CAT

GAT TAC

GAT

ACA---

20?

Val -50

Pro

Ile

Asp

Thr Arg Lys -45

Glu

Gly

Ieu

Gin -40

His

Asp Tyr Asp

Thr -35

GAA

ATT

TTC

GAG

CAC

ATT GGA

AGC

GAT

GAG

TTA

ATT

TTC

AAT

GAA

GAG

255

Glu

Ile

Ieu

GlU

His -30

Ile Gly

Ser

Asp

Glu -25

Ieu

Ile

Leu

Asn

Glu -20

Glu

TAT

CTT

ATT

GAA

AGA

ACT TTC

CAA

GCC

ATC

GAT

AAC

ACC

ACT

TTC

GCT

303

Tyr

Val

Ile

Glu -15

Arg

Thr Leu

Gin

Ala -10

Ile

Asp

Asn

Thr

Thr -5

Leu

Ala

AAG

AGA

TTC

GIT

AAC

CAA CAC

TTC

TGC

GGT

TCC

CAC

TTC

GTT

GAA

GCT

351

Lys Arg

Phe

Val

Asn

Gin His

Leu

Cys Gly

Ser

His

Ieu

Val

Glu

Ala

1

- .....5-

• - ·;

10

-

TTC TAC TTC' GIT TCC GCT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG GCT 399

Leu Tyr Ieu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Fhe Tyr Thr Pro Lys Ala .15 20 25 _ -y: 30

GCT AAG GCT ATT CTC GAA CAA TCC TCT ACC TCC ATC TCC TCC TTG TAC 447

Ala Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

40 --.--45

CAA TTC GAA AAC TAC TCC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

492 (2) Informace pro SEQ ID NO:3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 131 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:

Met Lys Val Phe Ieu Ieu Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala Gin -78 -75 -70 -65

Pro Ser Ile Asp Gly Thr His -60

Phe Pro Asn Asn Asn Val Pro -55 -50

Ile Asp

Thr Arg Lys Glu Gly Leu Gin His Asp Tyr ASp Thr Glu Ile Ieu Glu -45 -40 -35 Hic; ne Gly Ser Asp Glu Leu Ile Leu Asn Glu Glu Tyr Val Ile Glu -30 -25 —20 -15

Arg Thr Leu Gin Ala Ile Asp Asn Thr Thr Leu Ala Lys Arg Phe Val -10 -5 1

Asn Gin His Ieu Cys Gly Ser His Ieu Val Glu Ala Leu Tyr leu Val

5. 10 Λ...; ... 15. .·./; / .. .

Cys Gly Glu Arg Gly Fhe Fhe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile

·.’ 1 25 ' /.Z ' 30. :/..-- ./ ;

Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile cys Ser Leu iyr Gin Leu Glu Asn

35	40	. 45	. 50
Tyr Cys Asn

(2) Informace pro SEQ ID N0:4:

(i) (ii) (ix) (ix) (ix) (xi)

Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 420 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární

Typ molekuly: cDNA

Charakteristiky (A) jméno/klič: CDS (B) lokace: 76..396

Charakteristiky (A) jméno/klíč: sig peptid (B) lokace: 76..237

Charakteristiky (A) jméno/klič: mat peptid (B) lokace: 238..396

Popis sekvence: SEQ ID N0:4:

GAATTCATTC AAGAAIAGIT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATITC AIACACAAIA

TAAAOGATTA AAAGA ATG AAA GTC TTC CIG CIG CIT TCC CTC ATT GGA TTC Met Lys Val Fhe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Fhe -54 -50 -45

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

TCG

CTA

TTG

GAG

TCA

CIT· ACG

CTC

GTT

GAT

GTT

Cys

Tip

Ala

Gin

Pro

Ser

Leu

GlU

Ser

Leu Thr

Leu

Val

Asp

Val

-40

-35

-30

GAC

GCA

CIG

TOG

GAT

ATT

GAT

GTA

CIT

GIT

GAG TCT

GAA

ACG

CTT

GTG

Asp

Ala

Leu

Ser

Asp

Ile

Asp

Val

Leu

Val

Glu Ser

Glu

Thr

Leu

Val

-25

-20

-15

111

159

207

CTT GTC GAT AAC ACC ACT TTC GCT AAG AGA TTC GIT AAC CAA CAC TTC Leu Val Asp Asn Thr Thr Leu Ala Lys Arg íhe Val Asn Gin His Leu ’¹⁰ -5 1 ₅

TCCGGTTCCCACTTCGITGAAGCTTTCTACTTCGTTTGCGGTGAAAGA Cys Gly Ser His Ieu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Aru ¹⁰ 15 20

GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG GCT GCT AAG GCT ATT GTC GAA CAA TCC

Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys

30 35

TCT ACC TCC ATC TCC TCC TTC TAC CAA TTC GAA AAC TAC TCC AAC

Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn ⁴⁰ 45 50

TAGAOGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

255

303

351

396

420 (2) Informace pro SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 107 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:5:

Met

Lys

Val

Phe

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

cys Trp

Ala

Gin

-54

-50

•

-45

-40

Pro

Ser

Leu

Glu

Ser

Leu

Thr

Leu

Val

Asp

Val

Asp Ala

Leu

Ser

-35

-30

-25

Asp

Ile

Asp

Val

Leu

Val

Glu

Ser

Glu

Thr

Leu

Val

Leu Val

Asp

Asn

-20

-15

-10

Thr

Leu

Ala

Lys Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys Gly

Ser

His

-5

1

5

10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg Gly Phe

Phe

Tyr

15

20

25

Thr

Pro

Lys

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys Cys Thr

Ser

Ile

30

35

40

Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 45 50 (2) Informace pro SEQ ID NO:6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 453 párů. bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: CDS (B) lokace: 76..420 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: sig peptid (B) lokace: 76..270 * · (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: mat peptid (B) lokace: 271..420 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

GAAITCAITC AAGAATACTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACAAIA

TAAACGATIA AAAGA ATC AAA GTC TTC CTC CTC CIT TCC CTC ATT GGA TTC 111

Met Lys Val Fhe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Fhe -65 -60 -55

TCC Cys	TCG Trp	GCC CAA CCA ATA GAC ACA AGA AAA	GAA Glu	GGA CLA CAG CAT GAT	159
Ala	Gin Pro Ile Asp Thr Arg	Lys	Gly	Leu	Gin His -40	Asp
-50	-45
TAC GAT ACA	GAA AIT TTC	GAG CAC ATT	GGA	AGC	GAT	GAG	TTA ACC	COG	207
Tyr Asp Thr	Glu Ile Leu	Glu His Tle	Gly	Ser	Asp	Glu	Leu Thr	Pro
		-35		-30				-25
AAT	GAA	GAG	TAT GIT ATT	GAA AGA ACT	TTC	CAA	GCC	ATC	GAT AAC	ACC	255
Asn	Glu	Glu	Tyr Val Tle	Glu Arg Thr	Leu	Gin	Ala	Ile	Asp Asn	Thr
	-20			-15			-10
ACT	TTC	GCT	AAG AGA TTC	GIT AAC CAA	CAC	TTC	TCC	GCT	TCC CAC	TTC	303
Thr	Leu	Ala	Lys Arg Fhe	Val Asn Gin	His	Leu	Cys	Gly	Ser His	Leu
-5			1		5				10
GIT	GAA	GCT	TTC TAC TTC	GTT TCC GCT	GAA	AGA	GCT	TTC	TTC TAC	ACT	351
Val	Glu	Ala	Leu Tyr Leu	Val Cys Gly	Glu	Arg Gly	Fhe	Phe Tyr	Thr
			15	20					25

CCT AAG GCT GCT AAG GCT ATT GTC GAA CAA TGC TCT ACC TCC ATC TGC

Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys

·. 35 40 = - TCC TIG TAC CAA TTC GAA AAC TACIGCAACT AGACGCAGCC CGCAGGCTCT Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn

50

AGA

399

450

453 (2) Informace pro SEQ ID N0:7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 115 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7:

Met

Lys

Val

Phe

Leu Leu

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

cys

Trp

Ala

Gin

-65

-60

-55

-50

Pro

Ile

Asp

Thr

Arg Lys

Glu

Gly

Leu

Gin

His

Asp

Tyr

Asp

Thr

Glu

-45

-40

-35

Ile

Leu

Glu

His

Ile Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Thr

Pro

Asn

Glu

Tyr

-30

-25

-20

Val

Ile

Glu

Arg

Thr Leu

Gin

Ala

Ile

Asp

Asn

Thr

Leu

Ala

Lys

-15

-10

-5

Arg

Phe

Val

Asn

Gin His

Leu

cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

—

1

5

10

15

Tyr :

Leu

Val

cys

Gly Glu .

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

20

25

30

Lys <

Gly

Ile

Val

Glu Gin ¹

Cys

Thr

Ser

Ile

cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

35

40

45

Leu i

Glu

Asn

50

(2)

Inf

ormace

pro SEQ

ID

NO:

8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 459 párů bází' (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 76..435 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: sig peptid (B) lokace: 76..276 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: mat peptid (B) lokace: 277..435 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:8:

GAATTCATTC AAGAAIAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAAITTC AIACACAAIA

TAAACGAITA AAAGA ATS AAA GTC TTC CIG CIG CIT TCC CTC ATT GGA TTC Met Lys Val The Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly The -67 -65 -60

111

TGC

TGG

GCC

CAA

CCT

GTC CCA

ATA

GAC

ACA AGA AAA

GAA

GGA

CIA

CAG

Cys -55

Trp

Ala

Gin

Pro

Val Pro -50

Ile

Asp

Thr Arg Lys -45

Glu

Gly

Leu

Gin -40

CAT

GAT

TAC

GAT

ACA

GAA ATT

TTG

GAG

CAC

ATT

GGA

AGC

GAT

GAG

ΤΊΑ

His

Asp

iyr Asp

Thr -35

Glu Ile

Leu

Glu

His -30

Ile

Gly

Ser

Asp

Glu -25

Leu

ACC

COS

AAT

GAA

GAG

TAT GIT

ATT

GAA AGA

ACT

TTG

CAA

GCC

ATC

GAT

Thr

Pro

Asn

Glu -20

Glu

Tyr Val

Ile

Glu -15

Arg

Thr

Leu

Gin

Ala -10

Ile

Asp

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAG AGA

TTC

GIT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

Asn

Thr

Leu

Ala

Lys Arg

The

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys Gly

Ser

-5 1 5

159

207

255

CAC TTG GIT GAA GCT His Leu Val Glu Ala 10

TTG TAC TTG

GIT Val

TGC GGT GAA AGA

GGT TTC TTC Gly íhe Ehe 25

Leu Tyr 15

Leu

Cys Gly Glu 20

Arg

TAC

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GCT

ATT

GTC

GAA

CAA

TGC

TGT

ACC

TCC

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

cys

Cys

Thr

Ser

30

35

40

ATC

TGC

TCC

TTG

TAC

CAA

TIG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGAOGCAGC

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

GlU

Asn

Tyr cys

Asn

45

50

303

351

399

445

CCGCAGGCTC TAGA

459 (2) Informace pro SEQ ID NO:9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 120 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:9:

Met Lys Val Fhe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cýs Trp Ala Gin

-67 -65 . -A -60 -55

Pro Val Pro Ile Asp Thr ArgLys Glu Gly Ieu Gin His Asp Tyr Asp

-50 -45 -40

Thr Glu Ile Leu Glu His Ile Gly Ser Asp Glu Leu Thr Pro Asn Glu

-35 -30 -25 -20

GÍu Tyr Val Ile Glu Arg Ihr Leu Gin Ala Ile Asp Asn Thr Thr Leu

-15 -10 -5

Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu 1 5 10

Ala Leu iyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 15 20 25

Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Ihr Ser Ile Cys Ser Leu 30 35 40 45

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 (2) Informace pro SEQ ID NO:10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 408 párů. bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovitost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 76..384 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: sig peptid (ix) (B) lokace: 76..225 Charakteristiky (xi.) (A) jméno/klíč:

(B) lokace: 226 Popis sekvence:

mat peptid .384

SEQ ID NO:10:

GAATTCAITC AAGAATACTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TAIGÁATTIC AIACACAATA

TAAAOGATTA AAAGA ATG AAA CTC TTC CTG CTG CTT TCC CIC ATT GGA TTC 111

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Ehe -50 . -45 .. -40

TGC TGG GCC CAA CCA TCG ATC	TTG GAT TAT CTT GAC	TTG GCT GOG GAA	159
Cys Trp Ala Gin	Pro Ser	Ile	Leu	Asp Tyr -30	Val Asp	Leu Gly -25	Ala	Glu
	-35
CTG ATC TCC	ATT	CCT GGG	TAT	GAT	AAC CTC	AAC GAC	GOG ATG GAT	AAC	207
Leu Ile Ser	Ile	Arg Gly Tyr Asp	Asn Leu	Asn Asp	Ala Ile Asp	Asn
-20				-15			-10
ACC ACT TTG	GCT	AAG AGA TTC CTT AAC CAA	CAC TTG	TGC GCT	TCC	CAC	255
Thr Thr Leu	Ala	Lys Arg	The Val	Asn Gin His Leu	cys Gly	Ser	His
-5			1			5			10
TTG CTT GAA	GCT	TTG TAC	TTG	GTT	TGC GCT	GAA AGA	GCT TTC	TTC	TAC	303
Leu Val Glu	Ala	Leu Tyr	Leu	Val	Cys Gly	Glu Arg	Gly Phe	Phe	Tyr
		15			20			25
ACT CCT AAG	GCT	GCT AAG	GGT	ATT	GTC GAA	CAA TGC	TCT ACC	TCC	ATG	351
Thr Pro Lys	Ala	Ala Lys	Gly	Ile	Val Glu	Gin cys	Cys Thr	Ser	Ile
	30				35		40
TGC TCC TTG	TAC	CAA TTG	GAA	AAC	TAC TGC	AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCIG	404
Cys Ser Leu	Tyr	Gin Leu	Glu	Asn	Tyr Cys	Asn

50

TAGA 408 (2) Informace pro SEQ ID NO:11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 103 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:11:

Met

Lys

Val

Phe

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

-50

-45

-40

-35

Pro

Ser

Ile

Leu

Asp

Tyr

Val

Asp

Leu

Gly

Ala

Glu

Leu

Ile

Ser

Ile

-30

-25

-20

Arg

Gly

iyr

Asp

Asn

Leu

Asn

Asp

Ala

Ile

Asp

Asn

Thr

Leu

Ala

-15

-10

-5

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

1

5

10

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

iyr

Thr

Pro

Lys

Ala

15

-20

25

30

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

cys

Thr

Ser

Ile

cys

Ser

Leu

Tyr

35

40

45

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

cys

Asn

50

(2) Informace pro SEQ ID NO:I2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) 'délka: 372 párů. bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 76..348 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: sig peptid (B) lokace: 76..189 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klič: mat peptid (B) lokace: 190..348 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:12:

•GAATTCAITC AACAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC AlACACAATA

TAAAOGATTA AAACA ATG AAA GTC TTG CTG CTG CTT TCC CTC ATT GCA TTC Met Lvs Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Gly Phe -33 -35 -30

TGC TGG GCC CAA CCA TCG CAC ACT ACC ATC GGC ACC GCA ACT GAC AAA Cys Trp Ala C-ln Pro Ser His Thr Thr Ile C-lv Thr Ala Thr Aso Lvs

-25 -20 -15 * '

111

159

207

255

303

343

372

AAC

ATC

GAT

AAC

ACC

ACT

TÍG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TIG

A^sn

Ile

Asp

Asn

Thr

Leu

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

-10

-5

1

5

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GIT

TGC

GGT

GAA

AGA

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

10

15

20

GGT

TTC

TAC

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GGT

ATT

GTC

GAA

CAA

TGC

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Lvs

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

25

30

35

TGT

ACC

TCC

ATC

TGC

TCC

TTG

TAC

CAA

TIG

CAA

AAC

TAC

TGC

AAC

Cys

Thr

Ser

Tle

Cys

Ser

Leu

Tyr

GlJl

Leu

GlU

Asn

Tyr Cys

Asn

40

45

50

TAGAOGCAGC COGCAGGCTC TAGA (2) Informace pro SEQ ID NO:13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 91 aminokyselin (B) typ: aminokyselina

(D)

• * i

neární

(ii)

Typ

mo1ekuly:

bii

kovina

(xi

)

Pop

i 3 sekveno.

:eq

ID NO:13:

Met

Lys

Val

Phe

Leu Leu Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Fhe

Cys Trp

Ala

C-ln

-33

-35

-30

-25

Pro

Ser

His

Thr

Thr Ile Gly

Thr

Ala

Thr

Asp

Lys

Asn

Ile

Asp

Asn

-20

-15

-10

Thr

Leu

Ala

Lys Arg Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

-5

1

5

10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu TVr Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

15

. 20

25

Thr

Pro

Lys

Ais

Ala Lys Gly

Zls

Val

Glu

C-ln

Cys

Thr

Ser

Tle

30

35

40

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin Leu Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

Claims

PATENTOVĚ

NÁROKY

1. Způsob konstrukce syntetické vedoucí peptidové sekvence pro sekreci heteroiogických polypeptidů v kvasinkách vyznačující se tím, že se

a) vnáší statistický DNA fragment do kvasinkového expresního vektoru zahrnujícího sekvenci

5'-SP-Xn-3'-RS-5'-X_ffl-(NZT)_p-Xq-PS-*gen*-3' kde znamená

SP DNA sekvenci kódující signální peptid,

X_n DNA sekvenci kódující n aminokyselin, přičemž n znamená O nebo celé Číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin,

RS restrikční endonukleasové rekognizační místo pro včlet nění statistických DNA fragmentů, kteréžto místo je na spojeni X_n a X_m,

X_m DNA sekvenci kódující m aminokyselin, přičemž m znamená O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin, (NZT)p DNA sekvenci kódující Asn-Xaa-Thr, přičemž m znamená O nebo číslo 1,

X_q DNA sekvenci kódující q aminokyselin, přičemž q znamená O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin,

PS DNA sekvenci kódující peptid definující kvasinkové zpracovatelské místo a *gen* sekvenci kódující hetero1ogický polypeptid,

b) transformuje se kvasinková hostitelská buňka expresním vektorem podle stupně (a),

c) kultivuje se transformovaná hostitelská buňka podle stupně (b) za vhodných podmínek a

d) vytřídí se kultura podle stupně (c) pro sekrecí hetero1ogového polypeptidů.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že statistický DNA fragment, začleňovaný do vektoru, je genomického nebo syntetického původu.
3 .

Způsob podle nároku 1 až 2, vyznačující s e tím, že statistický DNA fragment má délku 6 až přibližně 600 párů bází.
4. Způsob podle nároku laž3, vyznačující se tím, že statistický DNA fragment kóduje vysoký podíl polárních aminokyselin.
5. Způsob podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že statistický DNA fragment kóduje alespoň jeden prolin.

6. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í s e t í m, že a/nebo m a/nebo q znamená 1 nebo číslo větší než 1 • 7. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í s e t i m, že p znamená 1. 8 . Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c í s e t í m, že SP znamená DNA sekvenci kódující a-.faktorový signální pept 4 ol

signální peptid myších slinných žláz, karboxypeptidasový signální peptid, signální peptid kvasinek BARI nebo lipasový signální peptid Humicoia lanuginosa nebo jeho derivát.
9. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že PS je DNA sekvence kódující Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg nebo I1e-Glu-Gly-Arg.
10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hetero! oaick’> peptid je volen ze souboru zahrnujícího aproti— nin, tkáňový faktorový inhibitor nebo jiné proteasové inhibitory, insulin nebo insulinové prekurscry-, lidský nebo hovězí růstový faktor, interleukin, glukagcn, tkáňový plasminogenový aktivátor, transformační růstový faktor α nebo S, růstový faktor odvozený od krevních destiček, enzymy nebo jejich funkční analogy.
11. Kvasinkový expresní clonující vektor, v yznaču jící se tím,že zahrnuje sekvenci

5'-SP-X_n-3-RS-5'-Xn-CNZT),-X_q-FS-*gen‘-3'

-kde znamenám — -- - - - . . . . .

SP DNA sekvenci kódující signální peptid

X_n DNA sekvenci kódující n aminokyselin, přičemž n znamená

O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin,

RS restrikční endonukleasové rekognizační místo pro včlenění statistických DNA fragmentů, kteréžto místo je na spojení Xn S Xn,

X_m DNA sekvenci kódující m aminokyselin, přičemž m znamená

O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin, (NZT)p DNA sekvenci kódující Asn-Xaa-Thr, přičemž m znamená O nebo číslo 1,

X_q DNA sekvenci kódující q aminokyselin, přičemž q znamená mená O nebo celé číslo 1 až přibližně 1O aminokyselin,

PS DNA sekvenci kodujicí peptid definující kvasinkové zpracovatelské místo a ‘gen* sekvenci kódující hetero1ogický polypeptid.
12. Kvasinkový expresní cionujici vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že n a/nebo m a/nebo q znamená 1 nebo číslo větší než 1.
13. Kvasinkový expresní cionujici vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že p znamená 1.
14. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tim, že SP znamená DNA sekvenci kódující α-faktorový signáini peptid, signální peptid myších siinných žiaz, karboxypeptidasový signální peptid nebo signální peptid kvasinek BARI.
15. Způsob podle nároku 11,vyznačující se t i m, že PS je DNA sekvence kodujicí Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg nebo I ie-Glu-Giy-Arg.
16. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že heterologický peptid je volen ze souboru zahrnujícího aprotinin, tkáňový faktorový inhibitor nebo jiné proteasové inhibitory, insulin nebo insulinové prekursory, lidský nebo hovézí růstový faktor, interieukin, glukagcn, tkáňový plasminogenový aktivátor, transformační růstový faktor σ nebo β, růstový faktor odvozený od krevních destiček, enzymy nebo jejich funkční analogy
17. Kvasinkový expresní vektor, vyznačující se t í m , že zahrnuje sekvenci

5'—SP—X_n—statistická DNA-X_ffl-(NZT)_p-X_q-PS-*gen*-3' kde znamená

SP DNA sekvenci kodujici signální peptid

X_n DNA sekvenci kódující n aminokyselin, přičemž n znamená

O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin, statistická DNA fragment včleněný do restrikčniho endonukleasového rekognizačního místa ve spojení X_n a X_o a

RS restrikční endonukleasové rekognizační místo pro včlenění statistických DNA fragmentů, kteréžto místo je na spojení X n a X _m , (NZT)p

DNA sekvenci kódující m aminokyselin, přičemž m znamená O nebo celé číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin,

DNA sekvenci kodujici Asn-Xaa-Thr, přičemž m znamená O nebo číslo 1,

Xq DNA sekvenci kódující q aminokyselin, přičemž q znamená mené O nebo ceié číslo 1 až přibližně 10 aminokyselin,

PS DNA sekvenci kódující peptid definující kvasinkové zpra*gen * přičemž covatelskě místo a sekvenci kódující hetero1ogický polypeptid, sekvence X-X kóduje vedoucí peptidovou sekvenci.

13. Způsob t i m, že stati genomického nebo podle nároku 17, v y z n a č u j i c i tický DNA fragment, začleňovaný do vektor; syntetického původu.

i A
19. Způsob podle nároku 17 nebo 13 se t i m, že statistický DNA fragment ně 600 párů bází.

v y z n a má délku 6 o u jící až př i b1 i ž —
20. Způsob podle nároku 17 až 19, vyznačující se ti m, že statistický DNA fragment kóduje vysoký podíl polárních aminokyselin.
21. Způsob podle nároku 17 až 20, vyznačující se tím, že statistický DNA fragment kóduje alespoň jeden prolin.
22. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že a/nebo m a/nebo q znamená 1 nebo číslo větší než 1.
23. Způsob podle nároku 17, vyznačující se p znamená 1.
24. Způsob podle nároku 17, vyznačující se t i m, že SP znamená DNA sekvenci kódující α-faktorový signální peptid, signální peptid myších slinných žláz, karboxypeptidasový signální peptid, signální peptid kvasinek BARI nebo lipasový signální peptid Humicola lanuginosa nebo jeho derivát.
25. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tim, že PS je DNA sekvence kodujici Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys Arg-Arg nebo Ile-Glu-Gly-Arg.
26. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že heterologický peptid je volen ze souboru zahrnujícího aprotinin, tkáňový faktorový inhibitor nebo jiné proteasové inhibitory, insulin nebo insulinové prekursory, lidský nebo hovězí růstový faktor, interleukin, glukagon, tkáňový plasminogenový aktivátor, transformační růstový faktor a nebo p, růstový faktor odvozený od krevních destiček, enzymy nebo jejich funkční analogy
27. Kvasinková buňka schopná exprese hetero1ogického polypeptidu a transformovaná kvasinkovým expresním vektorem podle nároku 17 až 26.
28 .

Způsob produkce hetero1ogického polypeptidu v kvasinkách, vyznačující se tím, že se kultivuje kvasničná buňka, schopná exprese hetero1ogického polypeptidu a transformovaná kvasinkovým expresním vektorem podle nároku 17 až 26 za včlenění vedoucí peptidové sekvence konstruované způsobem podle nároku 1, ve vhodném prostředí k expresi a sekreci hetero1ogického polypeptidu, načež se hetero1ogický peptid izoluje z prostře-