SK62593A3

SK62593A3 - Method of constructing synthetic leader sequences

Info

Publication number: SK62593A3
Application number: SK62593A
Authority: SK
Inventors: Lars Christiansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1993-10-06
Also published as: AU660161B2; CZ119293A3; ZA919932B; FI932831A0; WO1992011378A1; CA2098731A1; PT99848A; IE914433A1; HUT68751A; NZ241011A; DK300090D0; AU9134891A; MX9102684A; FI932831A; EP0563175A1; IL100408A0; JPH06503957A; HU9301801D0; KR930703450A

Description

Kvasinkové organizmy produkujú mnohé bielkoviny, ktoré sa syntetizujú intracelulárne. ktoré však majú funkciu mimo bunku. Takéto extracelulárne bielkoviny sa označujú ako sekretované bielkoviny. Tieto sekretované bielkoviny sa vylučujú spočiatku vo vnútri bunky v prekurzorovej alebo predbielkovinovej forme obsahujúcej presekvenciu zaisťujúcu účinné riadenie vylučovaného produktu membránou endoplazmického retikula (ER). Presekvencia, spravidla označovaná ako signálny peptid, sa všeobecne odštepuje od žiadaného produktu v priebehu translokácie. Len čo vstúpi na vylučovaciu cestu. prenáša sa bielkovina do jednotky GolgiZ Golgi môže bielkovina pokračovať rôznymi cestami, ktoré vedú do úsekov, ako sú bunečná vakuola alebo bunečná membrána alebo môžu opustiť bunku a vylučovať sa do vonkajšieho prostredia CS.R. Pfeffer a J. Ľ. Rothman, Ann. Rev. Bioch. 56, str. 829, 1987).

Boli navrhnuté rôzne spôsoby expresie a vylučovania v kvasinkách bielkovín heterologických ku kvasinkám. V európskej uverejnenej prihláške vynálezu číslo 88 632 sa popisuje spôsob, ktorým dochádza v prípade bielkovín heterologických ku kvasinkám, k expresil. spracovaniu a vylučovaniu transformáciou kvasinkového organizmu expresívnym spojivom kotviacim DNA kódujúcu žiadanú bielkovinu a signálny peptid, k príprave kultúry transformovaného organizmu, k rastu kultúry a k získaniu bielkoviny z kultivačného prostredia. Signálny peptid môže byť signálnym peptidom samotného žiadaného peptidu, heterologickým signálnym peptidom alebo hybridom natívneho a heterológového signálneho peptidu.

Problémom pri použití signálnych peptidov, heterologických ku kvasinkám, môže byť skutočnosť, že heterologický signálny peptid nezaisťuje účinnú translokáciu a/alebo odštiepenie po signálnom peptide.

S. cerevisiae MF 1 ((X -faktor) sa syntetizuje ako preprofonna 165 aminokyselín obsahujúci signálny alebo prepeptid s 19 aminokyselinami nasledovaný vedúcim alebo propeptidom so 64 amínokyselinami majúcim tri V-viazané glykozylačné miesta nasledované (LysArg(Asp/Glu.Ala)2-3 -faktor)^ (J- Kurjan a I. Herskovitz, Celí 30, str. 933 až 943, 1982). Signálny vedúci podiel preproMf 1 sa v širokej miere používa na dosiahnutie syntézy a sekréciu heterologickéj bielkoviny v S. cerevisiae.

Použitie signálnych/vedúcich peptidov horaologických ku kvasinkám je známe napríklad z amerického patentového spisu číslo 4 546082, z európskej uverejnenej prihlášky vynálezu číslo 116201, 123294, 123544, 163529 a 123289 a z dánskej uverejnenej prihlášky vynálezu číslo 3614/83.

Podľa európskej prihlášky vynálezu číslo 123289 sa používa

S. cerevisiae (X -faktorového prekurzoru, pričom podľa svetového patentového spisu WO 84/01153 sa naznačuje použitie Saccharomyces cerevisiae invertázového signálneho peptidu a podľa uverejnenej dánskej prihlášky vynálezu číslo 3614/83 sa používa Saccharomyces cerevisiae PHO5 signálneho peptidu na sekréciu cudzích bielkovín.

V americkom patentovom spise číslo 4 546082 a v európskych patentových spisoch číslo 16201, 123294, 123544 a 163529 sa popisuje spôsob, podľa ktorého sa IX-faktorový signálny vedúci prvok C'signal-leader) zo Saccharomyces cerevisiae (MF*K1 alebo MF C(2) používa v sekrečnom procese vytlačených heterologických bielkovín v kvasinkách. Popisuje sa fúzia DNA sekvencie kódujúca Saccharomyces cerevisiae MF1 signálnej vedúcej sekvencie na ukončení 5' génu pre žiadanú sekréciu bielkoviny a spracovanie žiadanej bielkoviny.

Európsky patentový spis číslo 206783 popisuje systém pre sekréciu polypeptidov zo Saccharomyces cerevisiae, pričom c( -faktorová vedúca sekvencia je zrezaná na eliminácii štyroch W -faktorových peptidov obsiahnutých na natívnej vedúcej sekvencii, takže sa uvoľňuje vedúci peptid sám arielovaný na heterologický polypeptid prostredníctvom -faktorového spracovateľského miesta LysArgGluAlaGluAla_ľ Uvádza sa, že táto konštrukcia vedie k účinnému spôsobu prípravy menších peptidov (obsahujúcich menej , ako 50 aminokyselín). Na sekréciu a spracovanie väčších polypeptidov sa natívna -faktorová vedúca sekvencia zreže kvôli uvoľ. neniu jedného alebo dvoch -faktorových peptidov medzi vedúcim peptidom a polypeptidom.

Počet sekretovaných bielkovín sa smeruje tak, aby boli vystavené proteolytickému spracovateľskému systému, ktorý môže odštiepiť peptidovú väzbu na karboxylovom ukončení dvoch nasledujúcich bázických aminokyselín. Táto enzymatická aktivita je v Saccharomyces cerevisiae zakódovaná KEX 2 génom (D- A. Julius a kol.. Celí 37, str. 1075, 1984b). Spracovanie produktu KEX 2 génovým produktom je nutné pre sekréciu aktívneho Saccharomyces cerevisiae faktoru 1 (MF (Á 1 alebo -faktor) , nie je však zahrnutý v sekrécii aktívneho S.cerevisiae faktoru*.

Sekrécia a správne spracovanie polypeptidu, ktorý má byť výsledkom sekrécie, sa v niektorých prípadoch dosahuje, ak sa kultivujú kvasinkové organizmy, ktoré sú transformované vektorom , konštruovaným ako je hore uvedené. V mnohých prípadoch však hladina sekrécie je veľmi nízka alebo k sekrécii vôbec nedochádza « alebo próteolytické spracovanie môže byť nesprávne alebo nekompletné. Zámerom vynálezu je preto vytvoriť vedúce peptidy, ktoré zaisťujú účinnejšiu expresiu a/alebo spracovanie heterológových polypeptidov.

Podstata vynálezu

Podstata spôsobu konštrukcie syntetickej vedúcej peptidovej sekvencie na sekréciu heterológových polypeptidov v kvasinkách podľa vynálezu spočíva v tom, že sa

a) vnáša štatistický DNA fragment do kvasinkového expresného < vektora zahrňujúceho sekvenciu

5' -SP-Xn-3’ -RS-5' -X_m-(NZT)p-Xq-PS-^,'gen’^t-3’ *

kde znamená

SP DNA sekvenciu kódujúcu signálny peptid,

Xn DNA sekvenciu kódujúcu n aminokyselín, pričom n znamená alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín.

RS reštrikčné endonukleázové rekognizačné miesto pre včlenenie štatistických DNA fragmentov, ktoré miesto je na spojení Xn a Xm,

Xm DNA sekvenciu kódujúcu m aminokyselín, pričom m znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín, (NZT)p DNA sekvenciu kódujúcu Asn-Xaa-Thr, pričom m znamená 0 alebo číslo 1,

Xq DNA sekvenciu kódujúcu q aminokyselín, pričom q znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín,

PS DNA sekvenciu kódujúcu peptid definujúcu kvasinkové , spracovateľské miesto a geťi’' sekvenciu kódujúcu heterologický polypeptid.

^ť b) transformuje sa kvasinková hostiteľská bunka expresným j vektorom podľa stupňa (a),

Í! * i c) kultivuje sa transformovaná hostiteľská bunka podľa stupňa (b) za vhodných podmienok a

d) vytriedi sa kultúra podľa stupňa (c) pre sekréciu heterológového polypeptidu.

'í ; j i

S prekvapením sa totiž zistilo, že je možné presunúť (X -faktorový vedúci peptid mnohými rôznymi DNA sekvenciami, čím sa dosiahne sekrécia heterolocfického polypeptidu v kvasinkách. Na základe tohto objavu bol vyvinutý spôsob, ktorým sa štatistické DNA fragmenty klonujú do kvasinkových vektorov v smere DNA sekvencie kódujúcej pre signálny peptid a proti smeru DNA sekvencie kódujúcej pre heterológový polypeptid. Po transformácii vektormi sa kvasinkové bunky vytriedia pre sekréciu žiadaného heterologického polypeptidu.

Vynález sa preto týka predovšetkým hore definovaného spôsobu konštrukcie syntetickej vedúcej peptidovej sekvencie pre sekréciu heterologických polypeptidov v kvasinkách.

Výrazom vedúci peptid sa tu vždy mieni peptid, ktorého úlohou je umožniť riadenie heterologického polypeptidu z endoplazmového retikula na Golgi aparatúru a ďalej k sekretačnému spojidlu pre sekréciu do prostredia (to znamená export vytlačeného polypeptidu cez bunečnú stenu alebo aspoň cez celulárnu membránu do periplazmovej oblasti bunky). Výrazom syntetický v súvislosti s vedúcimi peptidmi sa tu vždy mieni, že vedúci peptid, konštruovaný podľa vynálezu, nebol v prírode nájdený.

Výrazom signálny peptid sa tu vždy mieni presekvencia, ktorá je prevažne hydrofóbnej povahy a je obsiahnutá ako N-zakonČujúca sekvencia v kvasinkách. Funkciou signálneho peptidu je umožniť sekréciu heterologickej bielkoviny do endoplazmového retikula. Signálny peptid sa spravidla v priebehu tohto procesu odštiepi. Signálny peptid môže byť heterologický alebo homologický s kvasinkovým organizmom produkujúcim bielkovinu, ako je hore vysvetlené. Oveľa účinnejšie odštiepenie signálneho peptidu sa však dosiahne, ak je homologický s príslušným kvasinkovým organ i zrnom.

Výrazom heterologický polypeptid sa mieni polypeptid, ktorý sa neprodukuje prírodným hostiteľským kvasinkovým organizmom. Pri spôsobe podľa vynálezu je heterologickým polypeptidom s výho dou polypeptid, ktorého sekrécia transformovanými kvasinkovými bunkami sa môže ľahko zistiť, napríklad ustanovením štandardných spôsobov, ako je imunologické vytriedenie použitím protilátok reaktívnych s príslušným polypeptidom (viď napríklad Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular Cloning^: A Laboratory Manual (Molekulárne klonovanie: Laboratórna príručka). Cold Spring Harbor, New York, 1989) alebo vytriedením pre špecifickú biologickú účinnosť heterologického peptidu. Pozitívny výsledok vytriedenia Indikuje, že bol konštruovaný vedúci peptid, užitočný pre sekréciu heterologického polypeptidu v kvasinkách.

Výrazom “štatistický DNA fragment sa mieni akákoľvek sekvencia DNA o dĺžke aspoň troch nukleotidov, napríklad získaná digesciou genómovej DNA (akéhokoľvek organizmu) s reštrikčnou endonukleázou alebo s reštrikčnými endonukleázami alebo prípravou syntetickej DNA, napríklad fosíoaraidátovým spôsobom, ktorý popísal S.L- Beaucage a H.H.Caruthers, Tetrahedron Letters 22. str. 1859 až 1860, 1981.

Peptid Asn-Xaa-Thr kódovaný “(NZT)p je asparagínom viazané glykozylačné miesto. Xaa znamená ktorúkoľvek zo známych aminokyselín okrem prolínu.

Vynález sa tiež týka kvasinkového expresného klonovacieho vektora zahrňujúceho nasledujúcu sekvenciu

5’ -SP-Xn-3' -RS-5' -Xm-(NZT)_P-X<₁-PS-geii~3’ kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam.

Tento vektor sa môže používať na spôsob konštrukcie syntetickej vedúcej peptidovej sekvencie hore popísaným spôsobom.

Vynález sa tiež týka kvasinkového expresného vektoru zahrňujúceho nasledujúcu sekvenciu

5' -SP-Xn-štatistická DNA-Xin-(NZT)p-Xq-PS-^gen”-3‘ kde znamená výraz štatistická DNA” fragment včlenený do reštrikčného endonukleázového rekognizačného miesta v spojení Xn a Xm a ostatné symboly majú hore uvedený význam.

' V tomto vektore vedúca peptidová sekvencia (identifikovaná j spôsobom podľa vynálezu) je zložená zo sekvencie ' Xn-štatistická DNA-Xní-(NZT)_P-X_q »

kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam. Takýto vektor sa môže používať pre produkty žiadaného heterologického polypeptidu.

Vynález sa tiež týka spôsobu prípravy heterologického polypeptidu v kvasinkách, pričom sa kultivuje kvasinková bunka, ktorá je schopná expresie heterologického polypeptidu a ktorá sa > transformuje kvasinkovým expresným vektorom, ako je hore uvedené, včítane vedúcej peptidovej sekvencie konštruovanej spôsobom podľa vynálezu vo vhodnom prostredí na získanie expresie a sekrécie heterologického polypeptidu, pričom sa nakoniec heterologický peptid získa z prostredia.

Dĺžka štatistického DNA fragmentu včleneného do expresného vektora nemá rozhodujúci význam. Aby však bola dĺžka vhodná na manipuláciu, má fragment s výhodou dĺžku 16 až 600 párov báz. Predovšetkým má fragment dĺžku približne 15 až približne 300 páί rov báz. V súčasnej dobe sa mieni, že vhodná dĺžka fragmentu je približne 30 až približne 150 párov báz.

! Štatistický DNA fragment s výhodou kóduje vysoký podiel polárnych aminokyselín. Tieto aminokyseliny sú volené zo súboru zahrnujúceho Glu, Asp, Arg, His, Thr, Ser. Asn a Gin. V tejto súvislosti sa výrazom vysoký podiel” mieni, že DNA fragment kóduje väčší počet polárnych aminokyselín ako majú schopnosť iné j ' DNA sekvencie zodpovedajúcej dĺžky. Nezávisle na tom alebo nad to •í môže byť výhodné, aby fragment kódoval aspoň jeden prolín.

V sekvenc i 1

5’ -Sp-Xn-3' -RS-5’ -Xm-(NZT)p-Xc,-PS-^gen^-S' znamená n a/alebo m a/alebo q s výhodou 1 alebo väčšie číslo ako

1. Predovšetkým všetky symboly n, m. a q znamenajú 1 alebo väčšie číslo ako 1 a ostatné symboly majú hore uvedený význam.

* Sú niektoré skutočnosti (viď svetový patentový spis

VO 89/02463), ktoré potvrdzujú, že prítomnosť na asparagín viazaného glykozylačného miesta vo vedúcej sekvencii môže podporovať ; sekrečnú účinnosť vedúceho peptidu. V sekvencii

i.

5' -SP-Xn-3' -RS-5' -Xin-(NZT)p-Xq-PS-^Ägen^x<-3' znamená proste symbol p s výhodou 1, pričom ostatné symboly majú hore uvedený význam.

j Signálna peptidová sekvencia (SP) môže kódovať akýkoľvek ; signálny peptid, ktorý zaisťuje účinné riadenie vytlačovaného heí terologického polypeptidu do sekrečnej cesty bunky. Signálnym peptidom môže byť prírodné sa vyskytujúci signálny peptid alebo jeho funkčný podiel, alebo to môže byť syntetický peptid. Vhodnýt.’·;

mi signálnymi peptidmi sú (Á faktorové signálne peptidy, signálny ‘ , peptid myších slinných žliaz. modifikovaný karboxypeptidázový ! signálny peptid. signálny peptid kvasiniek BAR1 alebo lipázový signálny peptid Humicola lanuginosa alebo jeho derivát. Amylázová ,· signálna sekvencia myších slinných žliaz je popísaná v publikácii

O. Hagenbuchle a kol., Náture 289. str. 643 až 646, 1981. Karboxypeptidázová signálna sekvencia je popísaná v publikácii

L-A. Valls a kol.. Celí 48, str. 887 až 897, 1987- Signálny t

r peptid kvasiniek BAK1 je popísaný vo svetovom patentovom spise

VO 87/02670. Lipázový signálny peptid Humicola lanuginosa je popísaný v európskom patentovom spise číslo EP 305 216.

Kvasinkovým spracovateľským miestom. kódovaným DNA sekvenciou PS môže byt vhodná akákoľvek párová kombinácia Lys a Arg, napríklad Lys-Arg. Arg-Lys. Lys-Lys alebo Arg-Arg. ktorá umožňuje výrobu heterologického polypeptidu KEX2 proteázou Saccharorayces cerevisiae alebo ekvivalentnou proteázou iného druhu kvasiniek (D.A. Julius a kol., Celí 37, od str. 1075, 1984). Pokiaľ nie je KEX2 proces vhodný, napríklad sa má dosiahnuť štiepenie polypeptidového produktu, má sa voliť spracovateľské miesto pre inú proteázu miesto zahrnutia amínokyselinovej kombinácie, ktorá nie je zistená v polypeptidovom produkte. napríklad procesné miesto pre FXa. Ile-Glu-Cly-Arg (ako popisuje Sambrook, Eritscli a Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulárne klonovanie; Laboratórna príručka). Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Heterologickou bielkovinou produkovanou spôsobom podľa vynálezu môže byť akákoľvek bielkovina, ktorá sa výhodne produkuje kvasinkami. Ako príklady takých bielkovín sa uvádzajú aprotinín, tkanivový faktorový inhibítor alebo iné proteázové inhibítory, inzulín alebo inzulínové prekurzory, ľudský alebo hovädzí rastový faktor interleukín, glukagón, tkanivový plazminogénový aktivátor, transformačný rastový faktor alebo β, rastový faktor odvodený od krvných doštičiek, enzýmy alebo ich funkčné analógy. Výrazom funkčný analóg” sa vždy mieni polypeptid a podobnú funkciu ako má natívna bielkovina (mieni sa vzťah k prírode skôr ako hladina biologickej účinnosti natívnej bielkoviny). Polypeptid môže byť štrukturálne podobný natívnej bielkovine a môže byť odvodený od natívnej bielkoviny pridaním jednej alebo niekoľkých aminokyselín buď na jedno alebo na obe C a N-ukončenia natívnej bielkoviny, náhradou jednej alebo niekoľkých aminokyselín na jednom alebo na mnohých odlišných miestach v natívnej amínokyselinovej sekvencii. vypustením jednej alebo niekoľkých aminokyselín na jednom alebo na oboch ukončeniach natívnej bielkoviny na jednom alebo na niekoľkých miestach v amínokyselinovej sekvencii alebo vložením jednej alebo niekoľkých aminokyselín na jednom alebo na niekoľkých miestach natívnej amínokyselinovej sekvencie. Takéto modifikácie sú dobre známe pre mnohé hore uvedené bielkoviny.

Štatistický DNA fragment a sekvencia

5’-SP-Xn-3·-RS-5’-X_m-<NZT)p-Xq-PS-xgenx-3· kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam, sa môžu pripravovať synteticky známymi spôsobmi, napríklad fosfoamidátovým spôsobôm. ktorý popísali S.L. Beaucage a M. H. Caruthers. Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1869, 1981 alebo spôsobom, ktorý popísal Matthes a kol-, EMBO Journal 3, str. 801 až 805, 1984. Fosfoamidátovým spôsobom sa syntetizujú oligonukleotidy, napríklad v automatickom DNA syntetizére, čistia sa, tepelne sa hybrldizujú, ligatujú a klonujú dó kvasinkového expresného vektora. Pripomína sa, že sekvencia

5’-SP-Xn-3’-RS-5'-Xm-<NZT)p-Xq-PS-xgenx-3' kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam, sa nemusí pripravovať jedinou operáciou, ale môže sa vytvárať z dvoch alebo z niekoľkých oligonukleotídov, pripravených synteticky takým spôsobom.

Štatistický DNA fragment alebo jedna alebo niekoľko častí sekvencie

5'-SP-Xn-3'-RS-5’-X_m-CNZT)p-Xq-PS-xgenx-3’ kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam, môžu byť tiež genomického alebo cDNA pôvodu, napríklad získané prípravou genomického alebo cDNA súboru (library) s vytriedením pre DNA sekvencie kódujúce pre uvedené páry (spravidla SP alebo xgenx) hybridizáciou s použitím syntetických oligonukleotídových sond spolu so štandardnými spôsobmi (Sambrook, Fritsch a Maniatis.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulárne klonovanie^:Laboratórna príručka) Cold Spring Harbor, Nev York, 1989). V takom prípade génomická alebo cDNA sekvencia, kódujúca signálny peptid, sa môže viazať na genomickú alebo cDNA sekvenciu kódujúcu heterologickú bielkovinu, načo sa DNA sekvencia môže modifikovať včlenením syntetických oligonukleotídov kódujúcich známym spôsobom sekvenciu

Xn-3’-RS-5'-X_m-(NZT)p-Xq-PS kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam.

Štatistický DNA fragment a/alebo sekvencia

5’ -SP-Xn-3' -RS-5' -Xni-(NZT)_P-Xq-PS-xgenx-3' kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam, môže byť zmesného pôvodu syntetického a genomického. zmesného pôvodu syntetického a cDNA alebo zmesného pôvodu genomického a cDNA, pričom sa príprava vykonáva známym spôsobom tepelnou hybridizáciou fragmentov syntetického, genomického alebo cDNA pôvodu (podľa vhodnosti), pričom fragmenty zodpovedajú rôznym častiam DNA sekvencie ako celku.

Preto je možno mať predstavu.

že DNA sekvencia, kódujúca signálny peptid alebo heterologický polypeptid môže byt genomického alebo cDNA pôvodu.

zatiaľ čo sekvencia

Xn-3’-RS-5'-Xm^-(NZT)p-Xq-PS môže byť pripravená synteticky.

Výhodná konštrukcia DNA, kódujúcej inzulínové prekurzory. je objasnená na sekvenčnom zozname ID číslo 1-13 (Sequence Listing ID Nos. 1-13) alebo na jeho modifikáciách. Príklady vhodných modifikácií DNA sekvencie sú nukleotídové substitúcie, ktorá nevedú k rastu na inú amínokyselinovú sekvenciu bielkoviny, ktoré však môžu zodpovedať kodomovému použitiu kvasinkového organizmu.

do ktorého sa vkladá DNA konštrukcia alebo nukleotídové substitúcie. ktoré umožňujú rast do odlišnej amínokyselinovej sekvencie. a tak možnú odlišnú štruktúru bielkoviny. Ako iný prípad možnej modifikácie sa uvádza včlenenie troch alebo násobku troch nukleotídov do sekvencie, adícia troch alebo násobku troch nukleotídov na jeho ukončenie sekvencie a vyústenie troch alebo násobku troch nukleotídov buď z ukončenia alebo zvnútra sekvencie.

Rekombinantným expresným vektorom nesúcim sekvenciu

5' -SP-Xn-3' -RS-5' -Xin-(NZT)_P-Xq-PS-xgenx-3· alebo

5’-SP-Xn-štatistická DNÄ-X_m-(NZT)p-Xq-PS-xgenx-3· kde jednotlivé symboly majú vždy hore uvedený význam. môže byt akýkoľvek vektor, ktorý je schopný replikácie v kvasinkovom organizme. Vo vektore ktorákoľvek DNA sekvencia môže byt operatívne napojená na vhodný promótor sekvencie. Promótorom môže byt akákoľvek DNA sekvencia, ktorá vykazuje transkripčnú aktivitu v kvasinkách a môže byt odvodená od génov kódujúcich bielkoviny buď homologickej alebo heterologickej ku kvasinkám. Promótor je s výhodou odvodený od génu kódujúceho bielkovinový homológ ku kvasinkám. Ako príklady vhodných promótorov sa uvádzajú promótory Saccharomycetes cerevisiae MFX.1, TPI, ADII alebo PGK.

Hore uvedené sekvencie majú byt tiež operatívne spojené s vhodným terminátorom. ako je napríklad TPI terminátor (viď T. Alber a G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, str. 419 až 434, 1982).

Rekombinantný expresný vektor podľa vynálezu ďalej zahrňuje DNA sekvenciu. umožňujúcu replikáciu vektoru v kvasinkách. Ako príklady takých sekvencií sa uvádzajú kvasinkové plazmidové 2/v replikačné gény REP 1-3 a začiatok replikácie. Vektor tiež môže zahrňovať selektovateľný signálny znak, napríklad Schizosaccharomyces pombe TPI gén. ako popisuje P.R.Russell, Gene 40. str. 125 až 130, 1985,

Procesy, používané na ligáciu sekvencie

5*-SP-Xn-3'-RS-5'-X_m-(NZT)_P-Xq-PS-xgenx-3' kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam, štatistický DNA fragment, promótor a terminátor a ich včleňovanie do vhodných kvasinkových vektorov obsahujúcich informáciu nutnú pre replikáciu kvasiniek sú pracovníkom v odbore dobre známe (viď napríklad

Sambrook, Fritsch a Maniatís, Molecular Cloning: A Laboratory

Manual (Molekulárne klonovanie: Laboratórna príručka) Cold Spring

Harbor, New York. 1989). Je jasné, že sa vektor môže konštruovať buď najskôr prípravou DNA konštrukcie obsahujúcej celú sekvenciu

5*-SP'Xn-3'-RS-5’-X_m-(NZT)_P-Xq-PS-xgenx-3’ kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam a následne včlenením tohto fragmentu do vhodného expresného vektoru alebo následným včlenením DNA fragmentov obsahujúcich genetickú informáciu pre jednotlivé prvky (ako napríklad signálny peptid, sekvencie

Xn-3'-RS-5’-Xm-(NZT)_P-Xq-PS kde jednotlivé symboly majú hore uvedený význam, alebo heterologický polypeptid) s následnou ligáciou.

Kvasinkový organizmus, používaný pri spôsobe podľa vynálezu môže byt akýkoľvek vhodný kvasinkový organizmus, ktorý pri kultivovaní produkuje veľké množstvá heterologického žiadaného polypeptidu- Ako príklady takých kvasinkových organizmov sa môžu uviest kmene kvasiniek druhu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces porobe a Saccharomyces uvarum. Transformácia kvasinkových buniek sa môže napríklad realizovať protoplastovou formáciou nasledovanou transformáciou známym spôsobom. Použitým prostredím ku kultivácii buniek môže byť akékoľvek prostredie pre rast kvasinkového organizmu. Sekretovaná heterologická bielkovina, ktorej značný podiel je obsiahnutý v prostredí v správne produkovanej forme, sa môže získať známym spôsobom včítane oddelenia kvasinkových buniek z prostredia odstredením alebo filtráciou. vyzrážaním bielkovinových zložiek supernatantu alebo odfiltrovaním pri použití soli napríklad síranu amonného a následným čistením rôznymi chromatografickými procesmi, ako je napríklad ionexová chromatografia s afinitnou chromatograf iou.

Vynález bližšie objasňujú pripojené výkresy^: na obr. 1 je schéma konštrukcie mPT7426m, na obr. 2 je schéma konštrukcie pLaC202.

na obr. 3 je DNA sekvencia a odvodená amínokyselinová sekvencia na klonovacom mieste v pLaC202 pre štatistické DNA fragmenty (pripomína sa, že sekvencia sa štiepi v Clal mieste a že ligácia bez včlenenia štatistickej DNA vedie k zmene v čítacom rámci) na obr.

je schéma konštrukcie pLSC6315D=.

Vynález tiež objasňujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia, ktoré však nie sú mienené ako obmedzenia vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Plazmidové a DNA materiály

Všetky expresné plazmidy sú C-POT typu. Všetky plastimidy sú popísané v uverejnenej európskej prihláške vynálezu číslo 171142 a sú charakterizované obsahom Schizosaccharomyces pombe triózovým fosfátovým izomerázovým génom (POT) pre účely plazmidovej selekcie a stabilizácie. Plazmid, obsahujúci POT gén, je dostupný ako uložený E. coli kmeň (ATCĽ 39685). Plazmidy ďalej obsahujú S. cerevisiae triózový fosfátový izomerázový promótor a terminátor (Ptpi a Ttpx)- Sú identické s pMT742 (M. Ľngel-Mitani a koi.. Gene 73, str. 113 až 120, 1988)(vid’ obr. 1) s výnimkou pre oblasť definovanú Sph-Xbal reštrikčnými miestami zahrňujúcimi PTPI a kódujúcimi oblasť pre signál/vedúci prvok/produkt.

Ptpi sa modifikuje so zreteľom na sekvenciu nájdenú v pMT742 jedine na uľahčenie konštrukčnej operácie. Vnútorné Sphl reštrikčné miesto sa eliminuje Sphl štiepením. odstránením chvostov a religáciou. Okrem toho DNA sekvencia v smere proti promótoru a bez akéhokoľvek napadania promótora sa odstraňuje ’ Bal31 exonukleázovým spracovaním a následnou adíciou SpHI reštrikčného miestového spojovníka. Táto promótorová konštrukcia na 373 bp Sphl-EcoRI fragmentu sa označuje pMT7426 (obr. 1).

Súbor rôznych DNA fragmentov zaujíma prípadné miesto v menšom E. coli plazmide typu p'1’7 hore popísaného (viď svetový patentový spis VO 89/02463) len modifikovaného so zreteľom na hore popísaný PTPI, to jest pT7 6. Pre štatistické klonovanie, ďalej popísané, sa používajú genómové DNA rôznych pôvodov. S. cerevisiae DNA sa izoluje z kmeňa MT633 (deponovaný 7. decembra 1990 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr podľa ustanovenia Budapeštianskej dohody na Medzinárodnom zhromaždení o deponovaní mikroorganizmov na účely patentových postupov pod číslom DSM 6278). A. oryzae DNA sa izoluje z kmeňa A1560 (IFO 4177).

Konečne sa používajú početné syntetické DNA fragmenty, ktoré sú všetky syntetizované na automatickom DNA syntetizéri (Applied Blosystems model 380A) s použitím fosforamiditovej chémie a obchodne dostupných reakčných činidiel (S-L.Beaucage a M.H.Caruthers, Tetrahedrom Letters 22, str. 1859 až 1869). 01igonukleotídy sa čistia polyakrylamidovou gelovou elektroforézou za denaturačných podmienok. Pred tepelnou hydridizáciou sa kinázujú komplementárne páry takých DNA jednoduchých reťazcov í s použitím T4 polynukleotídovej kinázy a ATP.

i

Všetky iné spôsoby a materiály sú všeobecne známe (viď napríklad J. Sambrook a kol-. Molecular Cloning^: A Laboratory Manual. (Molekulárne klonovanie: Laboratórna príručka), Cold i

.·!

I

Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, Nev York. 1989).

Príklad 1

Konštrukcia pLaC202

490 bp Sphl-Apal pT7 1966 (viď svetový patentový spis VO 89/02463, obr. 5) a 179 bp Hinfl-Xbal fragment pT7. <^M13 (viď svetový patentový spis VO 89/02463. obr. 1) spojený v 11 kbXbal-Sphl fragment pMT742 cez syntetický adaptor;

NOR367/373 CAACCATCGATAACACCACTTTGGCTAAGAG CCGGGTTGGTAGCTATTGTGGTGAAACCGATTCTCTAA rezultujú v plazmide pLaC202 (obr. 2 a 3. ako tiež sekvencie ID No. 1).

Tento vektor, obsahujúci špecifické Clal miesto, tvorí jedno prevedenie štatistického DNA klonovacieho vektoru, v ktorom produkovaný gén kóduje pre inzulínový prekurzor MI3 (B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)). Nasledujúce príklady a týkajú vedúcich prvkov klonovaných touto konštrukciou.

Príklad 2

Konštrukcia pLSC6315 a pLSC5210

Celá DNA sa izoluje z S.cerevisiae kmeňa MT663 a digeruje sa s Taql, HinPI alebo Taql + HinPI- Produkty sa oddelia podľa veľkosti na 1 % agarózovom geli a fragmenty menšie akp 600 bp sa izolujú z každej z troch digescií.

pLaC202, vopred digerovaný s Clyl. u ktorého sa predišlo samoligácii s teľacou črevnou alkalickou fosfatázou (CIAP) defosforyláciou sa mieša s fragmentovými fondami hore popísanými a liguje sa. Kmeň E. coli MT172 (MT172 = MC 1000 m+r-ara+ leuB-6; MC 1000 (viď M. Casadaban a S. Cohen, J. Mol. Biol. 138, str. 179, 1980)) sa transformuje s hore uvedenou ligačnou zmesou a získajú sa vhodné 5000 Ap^R transformanty pre každú zmes. Pripravia sa rekombinantné plazmidy z každého z troch typov vo fondoch zahrňujúcich všetkých 5000 transformantov. Tieto plazmldové fondy sa používajú na transformáciu S. cerevislae kmeňa MT663 a rezultujúce T0I transformanty sa imunotriedia na sekréciu MI3.

•J

Z prekvapivo veľkého počtu pozitívnych transformantov sa reizoluje osem zjavne najúčinnejších a z nich izolovaný plazmidový obsah.

Ako výsledok tejto operácie sa očakáva, že väčšina kvasinkových získaných transformantov má heterofénnu populáciu plazmidov a na získanie pravých klonov sa preto vykonáva stupeň plazmidovej reizolácie. Plazmidové preparácie z každého z ôsmich reizolovených kvasinkových transformantov sa používajú na transformáciu Ľ. coli kmeňa MT172 až Ap^R. Plazmidy z 12 E. coli transformantov pre l

každý z ôsmich kvasinkových izolátov sa individuálne používa na transformáciu kvasinkového kmeňa MT663, TPI a MI3 sekretačné transformanty sa identifikujú imunotriedením.

Sekventovanie ínzertov ôsmich izolovaných derivátov pLaC202 vykazuje tri odlišné sekvencie. dve z nich pLSC6315 a pLSC5210 sú najúčinnejšími nosičmi M13 sekrécie. Sekvencie kionované DNA a lemovacie oblasti sú ukázané na sekvenčnom zozname ID číslo 2 a 4.

I

Príklad 3

Modifikácia pLSC6315 i

j PLSC6315 sa volí na ďalšiu modifikáciu klonovanej syntetic; kej vedúcej sekvencie.

í í

j PLSC6315 sa digeruje s Apal endonukleázou s následným spracovaním endonukleázovou Béil31. Po fenolovej extrakcii sa rezul.tujúca DNA digeruje s Xbal a izolujú sa DNA fragmenty menšie ako originálne 367 bp ApaI-Xbal fragment.

pLaC202 sa digerujú s Clal a jednoretazcové CG generované chvosty sa odstránia s následnou digesciou Xbal a izoláciou 11 kb XbaI-]ClaI[ fragmentu (][ znamená, že sú jednoretazcové chvosty odrezané). Tento fragment sa mieša s pLSC6415 fragmentmi izolovanými hore a ligatovanými (obr. 6).

Proces transformácie a triedenia. popísaný v príklade 2, sa opakuje s pLSC6315D3 a PLSC6315D7 sa izoluje ako plazmldy podporujúce MI3 sekréciu oveľa účinnejšie ako originálny pLSC6315 (viď sekvenčný zoznam ID číslo 6 alebo 8).

Príklad 4

Konštrukcia pLAOl - 5

Celá DNA z mikroorganizmov Aspergillus oryzae kmeň A1560 sa spracováva ako hore popísané pre mikroorganizmus S.cerevisiae DNA v príklade 2 a klonovariie a reklonovanie sa vykonáva presne, ako je popísané v príklade 2, s tou výnimkou, že počet E. coli transformantov v prvom klonovaní sa zníži na približne 3000 na 1igačnú zmes. Tento pokus vedie k izolácii piatich klonov A. oryzae DNA, ktoré v pLaC202 kontexte sprostredkovávajú sekréciu inzulínového prekurzoru MI3 z S. cerevisiae.

Sekventovanie inzertov vykazuje pät odlišných sekvencií, dve z nich (pLAG2 a pLA05) sú oveľa účinnejšie, pokiaľ je zámerom sekrécie M13. Sekvencia DNA inzertov v pLA02 a pLA05 sú ukázané spolu s lemovacími oblastami v sekvenčnom zozname ID číslo 10 alebo 12.

Príklad 5

Kvasinkové kmene, kotviace plazmldy. ako je hore popísané.

sa nechávajú rásť v prostredí YP1) (F. Sherman a kol., Methods in Yeast Genetics (Spôsoby v genetike kvasiniek), Cold Spring Harbor Laboratory 1981). Pre každý kmeň sa 6 individuálnych 5 ml kultúr pretrepáva pri teplote 30 °C počas 60 hodín s konečným QD600 približne 15. Po dostredení sa supernatant odstráni na analýzu HPLC, čím sa meria koncentrácia sekretovaného inzulínového prekurzoru spôsobom, ktorý popísal Leo Snel a kol., Chromatographia 24, str. 329 až 332, 1987).

V tabuľke 1 sú uvedené expresné hladiny inzulínového prekurzoru, MI3, použitím vedúcich sekvencií izolovaných spôsobom podľa vynálezu, ako percento hladiny získané s transformantmi pMT742j, pri použi tí MF (1) vedúceho prvku S. cerevisiae.

Tabuľka I

ΡΜΤ742 PLSĽ6315 PLSC5210 PĽSC6315D3 PĽSC6315D7 pLA02 PLAO5

100 % 100 % % 175 % 120 % 120 % %

Priemyselná využiteľnosť

Kvasinkový expresný vektor zahrňujúci sekvenciu pre konštrukciu syntetických vedúcich peptidových sekvencií.

Sekvenčný zoznam

Cl) Všeobecná informácia

Ci) Prihlasovateľ: Novo Nordisk A/S

Cii) Názov vynálezu: Spôsob konštrukcie syntetickej vedúcej peptidovej sekvencie

Cii i) Počet sekvencif: 13

C i v) Korešpondenčná adresa:

(A) adresa: Novo Nordisk A/S, patentové oddelenie (B) ulica: Novo AÍle (C) mesto: Bagsvaerd (E) krajina^ Dánsko (F) ZIP: DK-2880

Cv) Počítačom čitateľná forma:

(A) typ prostredia: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) operačný systém: PC-D0S/MS-D0S

CD) software: PatentlnRelease # 1,0, verzia # 1,25

Cvi) Súčasné údaje o prihláške vynálezu:

CA) číslo prihlášky vynálezu (B) dátum podania (C) medzinárodná klasifikácia

Cviii) Informácie o zástupcovi (A) meno: Tlialsoe-Madsen. Birgit

CB) číslo-- 3540.204-VO

Cix) Telekomunikačné informácia:

CA) telefón: + 45 4444 8888

CB) telefax: + 45 4449 3256

CC) telex: 37304

C2) Informácie pre SEQ ID N0^:1

Ci) Charakteristiky sekvencie:

CA) dĺžka: 335 párov báz

CB) typ: nukleová kyselina

CC) retazovitost: jeden reťazec

CD) topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA

Cxi) Popis sekvencie: SĽQ ID N0:l:

GAAITCATTC AAGAATAGIT CAAACAAGAA G^TTACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA60

TAAAOGATTA AAAGAATGAA AGTOTÓČIG CIGCTITCCC TCATIGGATr CIGCIGGGCC .120

CAACCATOGA TAACACCACT TIGGCTAAGA GATTCGTIAA CCAACACTIG TGCGGTTCCC180

ACTIGGTTGA AGdTTGTAC TTGGTTIGOG GTGAAAGAGG TITCTTCTAC ACTCCTAAGG240

CTCCTAAGGG TATIGTOGAA CAATCCTGTA CCTCCATCIG CTCCTIGTAC CAATIGGAAA300

ACTACIGCAA CTAGAOGCAG CCOGCAGGCT CTAGAlis

C2) Informácie pre SEQ ID NQ:2:

Ci) Charakteristiky sekvencie:

(A) dížka^: 492 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) retazovitost: jeden retazec

CD) topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA

Cix) Charakteristiky (A) meno/kľúč^: CDS (B) lokácia: 76..468 (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč: sig peptid

CB) lokácia: 76..309

Clx) Charakteristiky

CA) meno/kľúč: mat peptid (B) lokácia: 310..468

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID N0^:2^:

GAAITCATTC AAGAATAGIT CAAACAAGAA GATIACAAAC TATCAA'i'ľiC ATACACAATA

TAAAOGATTA AAAGA ATG AAA GTC TTC CIG CIG CIT TCC CTC ATT GGA ΊΤ0 Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe -78 -75 -70

TGC TGG GCC CAA CCA TOG ΆΤΑ GAT GGA ACA CAT ΊΤΤ COG AAC AAC AAT cys Trp Ala Gin Pro Ser íle Asp Gly Ihr His Phe Pro Asn Asn Asn -65 -60 -55

111

159

GTC CCA ΑΤΑ GAC ACA AGA AAA GAA GGA CIA CAG CAT GAT TAC GAT ACA

Val Pro íle Asp Thr Arg Lys Glu Gly Leu GLn His Asp lyr Asp ihr ”50 -45 _4q-35

GAA ATT TTC GAG CAC ΑΊΤ GGA AGC GAT GAG ΊΤΑ ATT TTC AAT GAAGAG

Glu íle Leu Glu His íle Gly Ser Asp Glu Leu íle Leu Asn GluGlu

-30 . -25-20

TAT GTT ATT GAA AGA ACT TTC CAA GCC ATC GAT AAC ACC ACT TTCGCT

Tyr Val íle Glu Arg Thr Leu Gin Ala íle Asp Asn Thr Ihr LeuAla

-15 -10-5

AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTC TGC GCT TCC CAC TTC CTT GAA GCT Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 1 510

TTC TAC TTG GIT TGC GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG GCT Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala

20 2530

GCT AAG GCT ATT GTC GAA CAA TCC TCT ACC TCC ATC TCC TCC TTC TAC Ala Lys Gly íle Val Glu Gin Cys cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr

4045

CAA TTC GAA AAC TAC TCC AAC TAGAOGCAGC COGCAGGCTC TAGA

Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

207

255

303

351

399

447

492 (2) Informácie pre SEQ ID NO = 3:

(i) (x i )

Charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka^: 131 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia^: lineárna

Typ molekuly: bielkovina

Popis sekvencie: SEQ ID NQ:3=

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe Cys Trp Ala Gin

-78 -75 -70“

Pro Ser íle Asp Gly Ihr His Phe Pro Asn Asn Asn Val Pro íleAsp

-60 -55-50

Thr Arg Lys Glu Gly Leu Gin His Asp Tyr Asp Ihr Glu íle Leu Glu -45 -40“35

His íle Gly Ser Asp Glu Leu íle Leu Asn Glu Glu Tyr Val I-le Glu -30 -25 -20-15 i

Arg

Ihr

Leu

Gin

Ala

íle

Asp

Asn

Ihr

Leu

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

-10

-5

1

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

5

10

15

cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Lys

Gly

íle

20

25

30

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

35

40

45

50

Tyr Cys Asn (2) Informácie pre SEQ ID Ν0 = 4:

(i) Charakteristiky sekvencie^: (A) dĺžka: 420 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazovitosť: jeden reťazec (D) topológia: lineárna (i i) Typ molekuly: cDNA (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč^: CDS (B) lokácia: 76..396 (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč: sig peptid (B) lokácia: 76..237 (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč: mat peptid (B) lokácia: 238..396 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID N0=4:

GAATTCAITC AAGAATAGIT CAAACAAGAA GATĽACAAAC TATCAATCTC ATACACAÄTA

TAAACGAITA AAAGA ATG AAA GTC TTC CTC CTC CIT TCC CIC ATT GGA TTC Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe -54 -50-45

TCC TCG GCC CAA CCA TOG CIA TTC GAG TCA CIT AOG CTC GIT GATGIT

Cys Trp Ala Gin Pro Ser Leu Leu Glu Ser leu Ihr Leu Val AspVal

-40 -35-30

GAC GCA CTC TCG GAT ΑΊΤ GAT GCA CIT GIT GAG TCT GAA ACG CITGTC

Asp Ala Leu Ser Asp íle Asp Val Leu Val Glu Ser Glu Ihr LeuVal

-25 -20-15

111

159

207

CIT GTC Leu Val -10

GAT AAC ACC

ACT TIG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG

255

Asp

Asn Ihr

Ihr Leu -5

Ala

Lys

Arg Phe Val Asn Gin His Leu

1

5

TGC

GGT

TCC

CAC

TTC

GIT

GAA

GCT

TTC

TAC

TIG

GTT

TCC

GGT

GAA

AGA

303

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu Ala

Leu

iyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

10

15

20

GGT

TTC

TAC

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GGT

AIT

GTC

GAA

CAA

TCC

351

Gly

Phe

Tyr

Ihr

Pro

Lys

Ala

Lys Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

25

30

35

TGT

ACC

TCC

ATC

TGC

TCC

TIG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TCC

AAC

396

Cys

Ihr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu Glu

Asn

Tyr Cys

Asn

40

45

50

TAGAOGCAGC COGCAGGCTC TAGA 420 (2) Informácie pre SEQ ID N0=5:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 107 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D), topológia: lineárna

C i i) Typ molekuly: bielkovina (xi) Popis sekvencie: SEQ ID N0=5:

	Met -54	Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe Cys Trp Ala Gin
-50	-45	-40
	Pro	Ser Leu Leu Glu	Ser Leu Ihr Leu Val	Asp Val Asp Ala Leu Ser
		-35	-30	-25
f	Asp	íle Asp Val Leu	Val Glu Ser Glu Ihr	Leu Val Leu Val Asp Asn
j		-20	-15	-10
*	Thr	Ihr Leu Ala Lys	Arg Phe Val Asn Gin	His Leu Cys Gly Ser His
í		-5	1	5 10
i i	Leu	Val Glu Ala Leu	Tyr Leu Val Cys Gly	Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
i i		15	20	25
*	Ihr	Pro Lys Ala Ala	Lys Gly íle Val Glu	Gin Cys Cys Ihr Ser íle
v		30	35	40

Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 45 50 ’i

(2) Informácie pre SEQ ID 110 = 6 =
	(i)	Charakteristiky sekvencie: (A) dĺžka: 453 párov báz (B) typ= nukleová kyselina (C) reťazovitosť= jeden reťazec (D) topológia= lineárna
	( i i )	Typ molekuly: cDNA
	(ix)	Charakteristiky (A) meno/kľúč= CDS
í		(B) lokácia: 76..420
•	(ix)	Charakteristiky
		(A) meno/kľúč: sig peptid
Λ		(B) lokácia: 76..270
	(ix)	Charakteristiky
		(A) meno/kľúč: mat peptid
		(B) lokácia: 271..420
	(xi)	Popis sekvencie: SEQ ID N0=6^:

GAATTCAITC AAGAATAGIT CAÄACAAGAA GÄTTACAAAC TATCAÄTITC ATACACAATA60

TAAAOGÄTTA AAAGA ATC ÄÄÄ GTC TTC CTC CTC CIT TCC CTC ΑΊΤ GGA TTC111

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe -65 -60“55

TGC TGG cys Trp

GCC CAA

CCA ATA

GAC ACA

AGA AAA

GAA Glu

GGA CLA CAG CAT GAT

159

Ala

Gin -50

Pro

íle

Asp

Ihr

Arg -45

Lys

Gly Leu

Gin His Asp -40

TAC GAT

ACA

GAA

ATT

TTC

GAG

CAC

AIT

GGA

AGC

GAT

GAG

ΤΓΑ

ACC

CCG

207

Tyr Asp

Ihr

Glu

íle

Leu

Glu

His

íle

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Ihr

Pro

-35

-30

-25

AAT GAA

GAG

TAT

GIT

ATT

GAA

AGA

ACT

TTC

CAA

GCC

ATC

GAT

AAC

ACC

255

Asn Glu

Glu

Tyr

val

íle

Glu

Arg

Ihr

Leu

Gin

Ala

íle

Asp

Asn

Ihr

-20

-15

-10

ACT TTC

GCT

AAG

AGA

TTC

GIT

AAC

CAA

CAC

TTC

TCC

GGT

TCC

CAC

TTC

303

Thr Leu

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

-5

1

5

10

GIT GAA

GCT

TTC

TAC

TTG

GIT

TGC

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

ACT

351

Val Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg Gly

Phe

Tyr

Ihr

20 25

CCT AAG GCT GCT AAG Pro Lys Ala Ala Lys 30

GGT ATT GTC GAA CAA TGC TCT ACC TCC ATC TGC

Gly íle Val Glu Gin Cys cys Ihr Ser íle Cys 35 40

399

TCC Ser

TTC TAC CAA TTC GAA AAC TACTGCAACT AGACGCAGCC CGCAGGCICT Leu. Tyr Gin Leu Glu Asn

50

450

AGA

453 (2) Informácie pre SEQ ID N0=7:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 115 aminokyselín (B) typ: aminokyselina <D> topológia: lineárna (i i) Typ molekuly: bielkovina (xi) Popis sekvencie: SEQ ID N0^:7^;

Met

Lys Val

Phe

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp .

Ala

Gin

-65

-60

-55

-50

Pro

íle Asp

Thr

Arg

Lys

Glu

Gly

Leu

Gin

His

Asp

Tyr

Asp

Ihr

Glu

-45

-40

-35

íle

Leu Glu

His

íle

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Thr

Pro

Asn

Glu

Tyr

-30

-25

-20

Val

íle Glu

Arg

Ihr

Leu

Gin

Ala

íle

Asp

Asn

Ihr

Leu

Ala

Lys

-15

-10

-5

Arg

Fhe Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

1

5

10

15

Tyr

Leu Val

Cys

Gly 20

Glu

Arg

Gly

Ehe

Phe 25

Tyr

Ihr

Pro

Lys

Ala 30

Ala

Lys

Gly íle

Val

G1U

Gin

Cys

Ihr

Ser

íle

cys

Ser

Leu

Tyr

• Gin

35

40

45

Leu Glu Asn <2) Informácie pre SEQ ID N0^;8:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 459 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazovítosť: jeden reťazec (D) topológia: lineárna (i i) Typ molekuly: cDNA <ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč: CDS ( ix) (ix) (xi) (B) lokácia: 76..435 Charakteristiky (A) meno/kľúč^: sig peptid (B) lokácia: 76..276 Charakteristiky (A) meno/kľúč-· mat peptid (B) lokácia: 277..435

Popis sekvencie: SEQ ID N0=8:

GAAITCATTC AAGAATAGIT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA

TAAAOGATIA AAAGA ATG AAA GTC TTC CTG CTG CIT TCC CTC ATT GGA TTC Met Lys Val Phe leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe -67 -65 -60

TGC Cys -55

TGG GCC

CAA Gin

CCT GTC CCA ATA GAC ACA AGA AAA GAA GGA CLA CAG

Trp

Ala

Pro Val Pro -50

íle

Asp

Thr Arg Lys Glu Gly Leu Gin

-45

-40

CAT

GAT

TAC

GAT

ACA

GAA

ATT

TTG

GAG

CAC

ATT

GGA

AGC

GAT

GAG

ΊΤΑ

His

Asp

Tyr

Asp

Thr

Glu

íle

Leu

Glu

His

íle

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

-35

-30

-25

ACC

CCG

AAT

GAA

GAG

TAT

GIT

ATT

GAA

AGA

ACT

TTC

CAA

GCC

ATC

GAT

Thr

Pro

Asn

Glu

Tyr

Val

íle

G1U

Arg

Thr

Leu

Gin

Ala

íle

Asp

-20

-15

-10

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAG

AGA

TTC

GIT

AAC

CAA

CAC

TTC

TGC

GGT

TCC

Asn

Thr

Leu

Ala

Lys Arg

Phe Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys Gly

Ser

-5

1

5

CAC

TTG

GIT

GAA

GCT TTG

TAC '

TTG <

GIT '

TGC <

GGT GAA AGA GGT TTC TTC

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu '

Val

Cys <

Gly Glu Arg Gly Phe Phe

10

15

20

25

TAC

ACT

cer

AAG

GCT

AAG

GGT .

ATT

GTC

GAA '

CAA TGC TCT ACC TCC

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Lys

Gly

íle

Val

Glu <

Gin Cys Cys Thr Ser

30

35

40

ATC

TGC

TCC

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC TAGAOGCAGC

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

45

50

COGCAGGCTC TAGA

111

159

207

255

303

351

399

445

459

C2) Informácie pre SEQ ID N0=9:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 120 aminokyselín (B) typ: aminokyselina

CD) topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: bielkovina

Pop

i s sekv

’enc

ie:

SEQ

ID

NO:

9 =

Met

Lys

Val

Fhe

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cýs

Trp

Ala

Gin

-67

-65

-60

-55

Pro

Val

Pro

íle

Asp

Thr

Arg

Lys

Glu

Gly

Leu

Gin

His

Asp

Tyr

Asp

-50

-45

-40

Ihr

Glu

íle

Leu

Glu

His

íle

Gly

Ser

Asp

Glu

Leu

Thr

Pro

Asn

Glu

-35

-30

-25

-20

Glu

iyr

Val

íle

Glu

Arg

Ihr

Leu

Gin

Ala

íle

Asp

Asn

Ihr

Leu

-15

-10

-5

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

1

5

10

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

iyr

Ihr

Pro

Lys

15

20

25

Ala

Lys

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

Ihr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

30

35

40

45

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

iyr

cys

Asn

C2) Informácie pre SEQ ID NO-IO:

: Charakteristiky sekvencie:

j (A) dĺžka: 408 párov báz | (B) typ: nukleová kyselina

I CC) reťazovítosť: jeden reťazec

CD) topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA ' Cix) Charakteristiky i

·< CA) meno/kľúč: CDS ?

(B) lokácia: 76-.384 (ix) Charakteristiky (A) ineno/kľúč: sig peptid (B) lokácia: 76-.225 (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúc: mat peptid (B) lokácia: 226..384 (xi) Popis sekvencie¹ SEQ ID N0^:10:

GAATTCAITC AAGAATAGIT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATITC ATACACAATA60

TAAAOGATTA AAAGA ATG AAA GTC TTG CIC CTG CIT TCC CIC ATT GGA TTC111

Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe -50 -45-40

TGC TGG GCC CAA

CCA TOG ATC

TTG Leu

GAT TAT GIT GAC TTG GGT GCG GAA

159

Cys Trp Ala

Gin -35

Pro

Ser íle

Asp Tyr Val Asp Leu Gly

Ala Glu

-30

-25

CTG

ATC

TCC

ATT

OGT

GGG

TAT

GAT

AAC

CIC

AAC

GAC

GOG

ATC

GAT

AAC

207

Leu

íle

Ser

íle

Arg

Gly

Tyr Asp

Asn

Leu

Asn

Asp

Ala

íle

Asp

Asn

-20

-15

-10

ACC

ACT

TTG

GCT

AAG

AGA

TTC GIT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

255

Thr

Leu

Ala

Lys

Arg

Rie Val

Asn

Gin His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

-5

1

5

10

TTC

GIT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GIT

TGC

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TAC

303

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

15

20

25

ACT

CCT

AAG

GCT

GCT AAG

GGT

ATT

GTC

GAA

CAA

TGC

TGT

ACC

TCC

ATC

351

Thr

Pro

Lys

Ala

Lys

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys Cys

Thr

Ser

íle

30

35

40

TGC

TCC

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGACGCAGC COGCAGGCTC

404

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr Cys

Asn

45

50

TAGA

408

(2) Informácie pre SEQ ID NO:11:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 103 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna

Typ molekuly: bielkovina

Popis sekvencie: SEQ ID N0=ll:

(ii) (xi)

Met

Lys

Val

Phe

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

-50

-45

-40

-35

Pro

Ser

íle

Leu

Asp

iyr

Val

Asp

Leu

Gly

Ala

Glu

Leu

íle

Ser

íle

-30

-25

-20

Arg

Gly

Tyr

Asp

Asn

Leu

Asn

Asp

Ala

íle

Asp

Asn

Thr

Leu

Ala

-15

-10

-5

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

1

5

10

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

G1U

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

15

20

25

30

Ala

Lys

Gly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

35

40

45

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

(2) Informácie pre SEQ ID N0=12:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 372 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazovitosC: jeden reťazec (D) topológia: lineárna (i i) Typ molekuly: cDNA (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč^: qds (B) lokácia: 76..348 (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč: sig peptid (B) lokácia: 76..189 (ix) Charakteristiky (A) meno/kľúč: mat peptid (B) lokácia: 190..348 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID N0=12:

•GknITCATTC AAGAATAGIT CAAACAAGAA GAITACAAAC TATCAATITC ATACACAAIA

TAAACGATTA AAAGA ATG AAA GTC TTC CTC CTC CIT TCC CTC ATT GGA TTC Met Lys Val Phe Leu Leu Leu Ser Leu íle Gly Phe -33

111

TCC TGG GCC CAA CCA TOG

CAC

ACT ACC

ATC

GGC

ACC

GCA

ACT

GAC

AAA

Cys Trp Ala Gin Pro Ser

His

Thr Thr

íle

C-ly

Thr

Ala Thr

Asp Lvs

-25

-20

-15

AAC ATC CAT

AAC

ACC

ACT

TTC

GCT

AAG

AGA

TTC

GIT

AAC

CAA

CAC

TTC

Asn íle Asp

Asn

Thr

Leu

Ala

Lys Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

-10

-5

1

5

TCC GGT TCC

CAC

TTC

GIT

GAA

GCT

TTC

TAC

TTC

GTT

TCC

GGT

GAA

AGA

Cys C-ly Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

cys

Gly

Glu

Arg

10

15

20

GGT TTC TTC

TAC

ACT

CCT

AAG

GCT

AAG

GGT

ATT

GTC

GAA

CAA

TGC

Gly Phe Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

Lys

c-ly

íle

Val

Glu

Gin

Cys

25

30

35

TCT ACC TCC

ATC

TCC

TTC

TAC

CAA

TTG

CAA

AAC

TAC

TCC

AAC

Cys Thr Ser

íle

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr Cys

Asn

40

45

50

TAGAOGCAGC COGCAGGCTC TAGA

159

207

255

303

343

372 (2) Informácie pre SEQ ID NO-13-Charakteristiky sekvencie:

(A) (i) (B) (D) (11)

Typ dĺžka: 91 aminokyselín typ: aminokyselina topológia: lineárna molekuly: bielkovina

Popis (xi) sekvencie; SEQ ID N0=13:

Met

Lys

Val

Phe

Leu

Ser

Leu

íle

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

-38

-35

-30

-25

Pro

Ser

His

Tnr

Thr

íle

Gly

Thr

Ala

Thr

Asp

Lys

Asn

íle

Asp

Asn

-20

-15

-10

Thr

Leu

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

-5

1

5

10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Fhe

Tyr

15

20

25

Pro

Lys

Ala

Lys

c-ly

íle

Val

C-lu

Gin

Cys

Thr

Ser

íle

30

35

40

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

C-lu

Asn

Tyr

Cys

Asn

50 fl/ č’zs'-yz

Claims

1. Spôsob konštrukcie syntetickej vedúcej peptidovej sekvencie pre sekréciu heterologických polypeptidov v kvasinkách, vyznačujúci sa tým, že sa^:

a) vnáša štatistický DNA fragment do kvasinkového expresného vektora zahrnú júceho sekvenciu

5’-SP-Xn-3'-RS-5'-Xm-CNZT)_P-Xg-PS-xgenx-3 kde znamená

SP DNA sekvenciu kódujúcu signálny peptid,

Xn DNA sekvenciu kódujúcu n aminokyselín, pričom n znamená

0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín,

Xm DNA sekvenciu kódujúcu m amínokyselín, pričom m znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín, (NZT)p DNA sekvenciu kódujúcu Asn-Xaa-Thr, pričom m znamená 0 alebo číslo 1,

Xq DNA sekvenciu kódujúcu g aminokyselín, pričom q znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín,

PS DNA sekvenciu kódujúcu peptid definujúcu kvasinkové spracovateľské miesto a xgenx sekvenciu kódujúcu heterologický polypeptid.

b) transformuje sa kvasinková hostiteľská bunka expresným vektorom podľa stupňa (a),

c) kultivuje sa transformovaná hostiteľská bunka podľa stupňa (b) za vhodných podmienok a

d) vytriedi sa kultúra podľa stupňa (c) pre sekréciu heterológového polypeptidu-

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým» že štatistický DNA fragment. začleňovaný do vektora, je génomického alebo syntetického pôvodu.

3. Sposob podlá nároku 1 az 2, vyznačujúci sa tým, že štatistický DNA fragment má dĺžku až približne 600 párov báz.

4. Spôsob podľa nároku štatistický DNA fragment am í nokyse1 í n.

5. Spôsob podľa nároku štatistický DNA fragment kóduj

1 až 3, vyznačujúci sa tým. že kóduje vysoký podiel polárnych 1 až 4, vyznačujúci sa tým. že aspoň jeden prolín.

6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým. že a/alebo m a/alebo q znamená 1 alebo číslo väčšie ako 1.

7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým. že P znamená 1.

8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým. že SP znamená DNA sekvenciu kódujúcu (Á -faktorový signálny peptid, signálny peptid myších slinných žliaz, karboxypeptidázový signálny peptid, signálny peptid kvasiniek BAR1 alebo lipázový signálny peptid Humicola lanuginosa alebo jeho derivát.

9. Spôsob podľa nároku 1. vyznačujúci sa tým. že PS je DNA sekvencie kódujúcej Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg alebo Ile-Glu-Gly-Arg.

10. Spôsob podľa nároku 1. vyznačujúci sa tým. že heterologický peptid je volený zo súboru zahrnujúceho aprotinín, tkanivový faktorový inhibítor alebo iné proteázové inhibítory. inzulín alebo inzulínové prekurzory, ľudský alebo hovädzí rastový faktor, interleukín, glukagón, tkanivový plazminogénový aktivátor, transformačný rastový faktor alebo β, rastový faktor odvodený od krvných doštičiek, enzýmy alebo ich funkčné analógy.

11. Kvasinkový expresný klonujúci vektor.vyznačujúci sa tým. že zahrňuje sekvenciu

5’-SP-Xn-3’-RS-5’-Xm-(NZT)p-Xq-PS-xgenx-3’ amená

DNA sekvenciu kódujúcu signálny peptid,

DNA sekvenciu kódujúcu n aminokyselín, pričom n znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín, reštrikčné endonukleázové rekognizačné miesto pre včlenenie štatistických DNA fragmentov, ktoré miesto je na spojení Xn a Xm,

DNA sekvenciu kódujúcu m aminokyselín, pričom m znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín,

DNA sekvenciu kódujúcu Asn-Xaa-Thr, pričom m znamená 0 alebo číslo 1,

DNA sekvenciu kódujúcu q aminokyselín, pričom q znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín,

DNA sekvenciu kódujúcu peptid definujúcu kvasinkové spracovateľské miesto a sekvenciu kódujúcu heterologický polypeptid.

Kvasinkový expresný klonujúci vektor podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že n a/alebo m a/alebo q znamená 1 alebo číslo väčšie ako 1.

13. Kvasinkový expresný klonujúci vektor podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že p znamená 1.

14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že SP znamená DNA sekvencií kódujúce -faktorový signálny peptid, signálny peptid myších slinných žliaz, karboxypeptidázový signálny peptid alebo signálny peptid kvasiniek BAR1.

kde z:

SP

Xn

RS

Xin (NZT)p

Xq

PS xgenx 12.

15. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým. že PS je DNA sekvencia kódujúca Lys-Arg. Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg alebo Ile-Glu-Gly-Arg.

16- Spôsob podľa nároku 11. vyznačujúci sa tým. že heterologický peptid je volený zo súboru zahrňujúceho aprotinín, tkanivový inhibítor alebo iné proteázové inhibítory, inzulín alebo inzulínové prekurzory, ľudský alebo hovädzí rastový faktor, interleukín, glukagón. tkanivový plazminogénový aktivátor. transformačný rastový faktor alebo β , rastový faktor odvodený od krvných doštičiek, enzýmy alebo ich funkčné analógy.

17- Kvasinkový expresný vektor, vyznačujúci sa tým. že zahrňuje sekvenciu

5’-SP-Xn-štatistická DNA-X_m-(NZT)_P-Xq-PS-xgenx-3’ kde znamená

SP DNA sekvenciu kódujúcu signálny peptid.

Xn DNA sekvenciu kódujúcu n aminokyselín, pričom n znamená

0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín, štatistický DNA fragment včlenený do reštrikčného endo nukleázového rekognizačného miesta v spojení X_n a Xm a

RS reštrikčné endonukleázové rekognizačné miesto pre včlenenie štatistických DNA fragmentov, ktoré miesto je na spojení Xn a Xm.

Xm DNA sekvenciu kódujúcu in aminokyselín, pričom m znamená 0 alebo celé číslo 1 až približne 10 aminokyselín, (NZT)p DNA sekvenciu kódujúcu Asn-Xaa-Thr, pričom m znamená 0 alebo číslo 1,

pričom sekvencia X-X kóduje vedúcu peptidovú sekvenciu.

18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým. že štatistický DNA fragment, začleňovaný do vektoru, je genomlckého alebo syntetického pôvodu -

19. Spôsob podľa nároku 17 alebo 18, vyznačujúci sa tým. že štatistický DNA fragment má dĺžku 6 až približne 600 párov báz.

20. Spôsob podľa nároku 17 až 19, vyznačujúci sa tým, že • štatistický DNA fragment kóduje vysoký podiel polárnych aminokyselín.

21- Spôsob podľa nároku 17 až 20, vyznačujúci sa tým, že štatistický DNA fragment kóduje aspoň jeden prolín.

22. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že a/alebo

m a/alebo i q znamená 1 alebo číslo väčšie ako 1. 23. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým. že p znamená 1. 24. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým. že SP známe-

ná DNA sekvenciu kódujúcu 0(-faktorový signálny peptid. signálny peptid myších slinných žliaz, karboxypeptidázový signálny peptid. signálny peptid kvasiniek BAR1 alebo lipázový signálny peptid Humicola lanuginosa alebo jeho derivát.

25. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým. že PS je DNA sekvencia kódujúca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg alebo Ile-Glu-Gly-Arg.

26. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že heterologický peptid je volený zo súboru zahrňujúceho aprotinín, inzulín alebo inzulínové prekurzory, ľudský alebo hovädzí rastový faktor, interleukín, glukagón, tkanivový plazminogénový aktivátor, transformačný rastový faktor alebo β, rastový faktor odvodený od krvných doštičiek, enzýmy alebo ich funkčné analógy.

27. Kvasinková bunka schopná expresie heterologického polypeptidu a transformovaná kvasInkovým expresným vektorom podľa nároku 17 až 26.

28. Spôsob produkcie heterologického polypeptidu v kvasinkách, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje kvasničná bunka, schopná expres ie heterologického polypeptidu a transformovaná kvasinkovým expresným vektorom podľa nároku 17 až 26 za včlenenia vedúcej peptidovej sekvencie konštruovanej spôsobom podľa nároku 1, vo vhodnom prostredí k expresii a sekrécii heterologického polypeptidu, načo sa heterologický peptid izoluje z prostredia.