KR930703450A - 합성 선도 서열의 작제방법 - Google Patents

합성 선도 서열의 작제방법

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KR930703450A
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Abstract

이하의 서열로 이루어진 효모 발현 클로닝 벡터.
5′-SP-Xn-3′-RS-5′-Xm-(NZT)p-Xq-PS-*유전자*-3′
[여기서 SP는 신호펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, Xn은 n아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 n은 0또는 정수 1내지 약 10의 아미노산)이고, RS는 무작위 DNA 단편들이 삽입되는 제한엔도뉴클레아제 인식부부위로서 그 부위는 Xn과 Xm의 접합에서 제공되고, Xm은 m아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 m은 0또는 1내지 약 10의 정수)이고, (NZT)p는 Asn-Xaa-Thr을 코오드화하는 DNA서열(여기서 p는 0또는 1)이고, Xq는 q아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 q는 0 또는 1내지 약 10의 정수)이고, PS는 효모프로세싱부위를 나타내는 펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, 그리고 *유전자*은 이종 폴리펩티드를 코오드화하는 DNA서열이다].
그 벡터는 RS부위에 무작위 DNA단편들을 삽입하고 이 벡터로 형질전환된 효모세포를 배양하고 그리고 이종 폴리펩티드의 분리를 위해서 배양액을 스크리닝함으로써 합성 선도펩티드서열을 작제하는데 이용될 수 있다.

Description

합성 선도 서열의 작제방법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 pMT742δ의 작제를 나타내는 개락도이다. 제2도는 pLaC202의 작제를 나타내는 개락도이다. 제3도는 무작위 DNA단편들에 대한 pLaC202내의 클로닝부위에서의 DNA서열 및 유도된 아미노산 서열을 보여준다(서열이 특유의 ClaI 부위에서 절단되고 무작위 DNA의 삽입없는 연결은 리딩프레임의 변화를 가져올 것이라는 것에 주의해야 한다), 제4도는 pLSC6315D#의 작제를 나타내는 개략도이다.

Claims (29)

  1. 효모내에서 이종 폴리펩티드를 분비시키기 위해 합성 선도펩티드서열을 작제하는 방법에 있어서, 그 방법은 (a) 무작위 DNA단편을 이하의 서열로 이루어진 효모 발현 벡터내에 삽입시키는 단계;
    5′-SP-Xn-3′-RS-5′-Xm-(NZT)p-Xq-PS-*유전자*-3′
    〔여기서 SP는 신호펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, Xn은 n아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 n은 0또는 정수 1내지 약 10의 아미노산)이고, RS는 무작위 DNA 단편들이 삽입되는 제한엔도뉴클레아제 인식부위로서 그 부위는 Xn과 Xm의 접합에서 제공되고, Xm은 m아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 m은 0또는 1내지 약 10의 정수)이고, (NZT)p는 Asn-Xaa-Thr을 코오드화하는 DNA서열(여기서 p는 0또는 1)이고, Xq는 q아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 q는 0또는 1내지 약 10의 정수)이고, PS는 효모프로세싱부위를 나나태는 펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, 그리고 *유전자*은 이종 폴리펩티드를 코오드화하는 DNA서열이다 〕(b)(a) 단계의 발현벡터로 효모수주세포를 형질전환시키는 단계; (c)(b) 단계에서 형질전환된 숙주세포를 적당한 조건하에서 배양시키는 단계; 및 (d) 이종 폴리펩티드를 분비시키기 위해서 (c)단계의 배양물을 스크리닝하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 벡터내에 삽입되는 무작위 DNA단편이 게놈 또는 합성 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 무작위 DNA단편이 6내지 약 600염기쌍의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 하나에 있어서, 무작위 DNA단편이 높은 비율의 극성 아미노산을 코오드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 하나에 있어서, 무작위 DNA단편이 적어도 하나의 프롤린을 코오드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, n및/또는 m및/또는 q가 1이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, p가 1인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, SP가 α-인자 시호펩티드, 생쥐타액 아밀라제의 신호펩티드, 또는Humicola lanuginosa;리파제 신호펩티드, 또는 그들의 유도체를 코오드화하는 DNA서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, PS가 Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg또는 Ile-Glu--Gly-Arg를 코오드화하는 DNA서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 아프로티닌, 조직인자 경로 저해제 또는 다른 프로테아제 저해제, 인슈린 또는 인슈린 전구체, 인간 또는 소의 성장호르몬, 인터루킨, 글루카곤, 조직 플라스미노겐 활성제, 형질전환 성장인자 α또는 β, 혈소판 유래성장인자, 효소, 또는 그들의 기능유사체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 이하의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 효모 발현 클로닝 벡터.
    5′-SP-Xn-3′-RS-5′-Xm-(NZT)p-Xq-PS-*유전자*-3′
    〔여기서 SP는 신호펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, Xn은 n아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 n은 0또는 정수 1내지약 10의 아미노산)이고, RS는 무작위 DNA 단편들이 삽입되는 제한엔도뉴클레아제 인식부위로서 그 부위는 Xn과 Xm의 접합에서 제공되고, Xm은 m아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 m은 0또는 1내지 약 10의 정수)이고, (NZT)p는 Asn-Xaa-Thr을 코오드화하는 DNA서열(여기서 p는 0또는 1)이고, Xq는 q아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 q는 0또는 1내지 약 10의 정수)이고, PS는 효모프로세싱부위를 나타내는 펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, 그리고 *유전자*은 이종 폴리펩티드를 코오드화하는 DNA서열이다 〕.
  12. 제11항에 있어서, n및/또는 m및/또는 q가 1이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
  13. 제11항에 있어서, p가 1인 것을 특징으로 하는 벡터.
  14. 제11항에 있어서, SP가 α-인자 신호펩티드, 생쥐타액 아밀라제의 신호펩티드, 카르복시펩티다제 신호펩티드 또는 효모BAR1신호펩티드를 코오드화하는 DNA서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, PS가 Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg, Lys-Lys또는 Ile-Glu--Gly-Arg를 코오드화하는 DNA서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 아프로티닌, 외인성 경로 저해제 또는 다른 프로테아제 저해제, 인슈린 또는 인슈린 전구체, 인간 또는 소의 성장호르몬, 인터루킨, 글루카곤, 조직 플라스미노겐 활성제, 형질전환 성장인자 α또는 β, 혈소판 유래성장인자, 효소, 또는 그들의 기능유사체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 이하의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 효모 발현 벡터.
    5′-SP-Xn-3′-RAM-DNA-Xm-(NZT)p-Xq-PS-*유전자*-3′
    〔여기서 SP는 신호펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, Xn은 n아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 n은 0또는 정수 1내지 약 10의 아미노산)이고, RanDNA는 Xn과 Xm의 접합에서 제공되는, 제한 엔도뉴클레아제 인식부위에 삽이되는 무작위 DNA단편이고, Xm은 m아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 m은 0또는 1내지 약 10의 정수)이고, (NZT)p는 Asn-Xaa-Thr을 코오드화하는 DNA서열(여기서 p는 0또는 1)이고, Xq는 q아미노산을 코오드화하는 DNA서열(여기서 q는 0또는 1내지 약 10의 정수)이고, PS는 효모프로세싱부위를 나타내는 펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, 그리고 *유전자*은 이종 폴리펩티드를 코오드화하는 DNA서열이고, 서열 Xn-Xq가 선도 펩티드서열을 코오드화한다 〕.
  18. 제17항에 있어서, 벡터내에 삽입되는 무작위 DNA단편이 게놈 또는 기원 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항 또는 18항에 있어서, 무작위 DNA단편이 6내지 약 600염기쌍의 길이는 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항중 어느 하나에 있어서, 무작위 DNA단편이 높은 비율의 극성 아미노산들을 코오드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항 내지 20항중 어느 하나에 있어서, 무작위 DNA단편이 적어도 하나의 프롤린을 코오드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 17항에 있어서, n및/또는 m및/또는 q가 1이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17항에 있어서, p가 1인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 17항에 있어서, SP가 α-인자 신호펩티드, 생쥐타액 아밀라제의 신호펩티드, 또는Humicola lanuginosa;리파제 신호펩티드, 또는 그들의 유도체를 코오드화하는 DNA서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 17항에 있어서, PS가 Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg, Lys-Lys또는 Ile-Glu--Gly-Arg를 코오드화하는 DNA서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 아프로티닌, 조직인자 경로 저해제 또는 다른 프로테아제 저해제, 인슈린 또는 인슈린 전구체, 인간 또는 소의 성장호르몬, 인터루킨, 글루카곤, 조직 플라스미노겐 활성제, 형질전환 성장인자 α또는 β, 혈소판 유래성장인자, 효소, 또는 그들의 기능유사체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 11항 내지 제16항중 어느 하나에 의한 효모 발현 벡터로 형질전환되서 이종 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 효모 세포.
  28. 제 17항 내지 제26항중 어느 하나에 의한 효모 발현 벡터로 형질전환되서 이종 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 효모 세포.
  29. 효모내에서 이종 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 그 방법은 제1항의 방법에 의해서 작제된 선도 펩티드서열을 가지는 제17항 내지 제26항중 어느 하나에 따른 효모 발현 벡터로 형질전환되어서 이종 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 효모세포를 적합한 배지내에서 배양시켜서 이종 폴리펩티드의 발현 및 분비를 얻은후 그 이종폴리펩티드를 그 배지로부터 회수하는 것을 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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