CN106029688A - 交配因子α原肽变体 - Google Patents

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CN106029688A CN201580010737.4A CN201580010737A CN106029688A CN 106029688 A CN106029688 A CN 106029688A CN 201580010737 A CN201580010737 A CN 201580010737A CN 106029688 A CN106029688 A CN 106029688A
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Abstract

本发明涉及可用于在酵母中重组表达包含GLP‑1肽的多肽的交配因子α原肽变体。本发明还涉及用于在酵母中表达多肽的DNA序列、载体和宿主细胞。

Description

交配因子α原肽变体
技术领域
本发明涉及蛋白质表达和蛋白质化学的技术领域，其中通过在酵母中重组表达而制备多肽。
背景技术
重组多肽表达技术使得能够产生大量的由于例如其生物活性而可使用的所需多肽。这样的多肽通常在微生物宿主细胞中表达为重组融合多肽。感兴趣的多肽常常连接至融合伴侣多肽，以便提高表达水平、促进分泌、增加溶解度、促进多肽折叠，以保护该多肽免遭非故意的蛋白水解或促进感兴趣的多肽的纯化。
为了确保从酵母中分泌重组表达的多肽，前原肽(pre-pro peptide)(通常被称为“前导序列”)通常融合至重组产物的N-末端。该前序列确保融合蛋白转位至内质网(ER)内，ER是分泌途径的起点。该原序列确保从ER进一步转运至高尔基体，在高尔基体中，被称为Kex2p的内源性蛋白酶通常用来切下该原序列。经处理的重组肽随后分泌至生长培养基，从该培养基中可以纯化该重组肽。
当分泌重组多肽时，来自交配因子α(Mating Factor Alpha)的前原序列通常用作前导序列。然而，许多其他序列能够促进分泌过程。前导序列不仅对所分泌的肽的量，而且对有关降解和翻译后修饰如O-糖基化的质量具有重要影响。由于降解和O-糖基化通常是不希望的事件，因此期望一种将这些修饰减少至最低可能的程度，并且同时使分泌的多肽的产率最大化的前导序列。
EP 0121884 A2描述了使用酵母α-因子在酿酒酵母(S.cerevisiae)中重组生产人胰岛素。
EP 0324274A1描述了使用截短的α-因子前导序列改善异源蛋白质在酵母中的表达和分泌。
Thim等人(PNAS 83(1986)6766-6770)描述了使用交配因子α在酿酒酵母中分泌和加工胰岛素前体。
WO95/34666描述了用于在酿酒酵母中产生分泌的多肽的合成前导序列。
Rakestraw等人(Biotech.Bioeng.103(2009)1192-1201)描述了突变的交配因子α前导序列，它增加单链抗体的分泌并且增加人IgG1在酿酒酵母中的产生水平。
需要增加多肽前体的产率并减少O-糖基化的重组多肽的比例的更加特异性的前导序列。尤其需要用于在酵母中表达GLP-1肽的前导序列，该前导序列增加GLP-1肽或其前体的产率并减少GLP-1肽的O-糖基化。这样更加特异性的前导序列可以促进更高产率的重组多肽以及更低量的O-糖基化杂质。
发明内容
本发明的一个目的是提供具有提高的异源多肽表达水平的酵母细胞。本发明的另一个目的是提供分泌重组多肽的酵母细胞，该重组多肽具有减少量的该重组多肽的O-糖基化变体。特别地，本发明的一个目的是提供具有提高的重组多肽表达水平和减少的O-糖基化变体量的酵母细胞。本发明的一个目的是提供用于在酵母细胞中重组表达GLP-1肽的改善的表达系统。
根据本发明的第一方面，提供了一种用于在酵母中重组表达包含GLP-1肽的多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS。
在用于在酵母中重组表达多肽的方法的一个实施方案中，所述交配因子α原肽变体在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(I)
其中X38是V；X39是L、I、V或M；X40是G或R；X41是Y，且X42是L。
在另一个实施方案中，用于重组表达的多肽是GLP-1肽。
在另一个实施方案中，用于重组表达的多肽包含GLP-1(7-37)[K34R]、GLP-1(9-37)[K34R]或GLP-1(9-37)[K34R,G37K]。
根据本发明的第二方面，提供了一种交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42 (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS。
根据本发明的第三方面，提供了一种GLP-1前体，它是一种融合多肽，其包含：
-前肽(pre-peptide)，
-交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS，
-任选的延伸肽，和
-GLP-1多肽。
根据本发明的第四方面，提供了编码所述交配因子α原肽变体或GLP-1前体的DNA序列。
根据本发明的第五方面，提供了一种表达载体，其包含编码所述交配因子α原肽变体或GLP-1前体的DNA序列。
根据本发明的第六方面，提供了包含根据本发明所述的表达载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，用于表达的宿主细胞具有非功能性pmt1基因或根本不具有pmt1基因。已惊人地发现，这样的宿主细胞除了由本发明的交配因子α原肽变体获得的O-糖基化多肽的量的降低外，还独立于所述降低而降低O-糖基化多肽的量。
附图说明
图1示出了如实施例1中使用的最小(minimal)表达质粒。
图2示出了N-末端延伸的GLP-1(7-37)[K34R]前体，其包括野生型交配因子α前原肽，指示出了原肽的VIGYL亚序列。
具体实施方式
根据本发明的第一方面，提供了一种用于在酵母中重组表达多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS。
如本文所用的术语“前导序列”意在表示由前肽(信号肽)和原肽组成的氨基酸序列。前导序列的非限制性实例是例如来自酿酒酵母的α-因子信号前导序列和WO95/34666中所述的用于酵母的合成前导序列。
如本文所用的“前肽”意在表示作为N-末端序列存在于待表达的多肽的前体形式上的信号肽。信号肽的功能是在宿主细胞中促进多肽转位至内质网内。信号肽通常在该过程期间被切下。信号肽可以与产生该多肽的宿主细胞是异源或同源的。
如本文所用的“原肽”意在表示功能是使表达的多肽从内质网被引导至高尔基体并进一步引导至分泌小泡以便分泌至培养基中(即，多肽跨过细胞壁或至少通过细胞膜输出至酵母细胞的壁膜间隙内)的肽序列。原肽的非限制性实例是酵母α-因子原肽(参见US4,546,082和4,870,008)和在US 5,395,922、5,795,746、5,162,498和WO 98/32867中公开的合成原肽。原肽将优选在C-末端含有内肽酶加工位点，如Lys-Arg序列或其任何功能类似物。
如本文所用的术语“交配因子α”(MFα、MFa或MFalpha)意在表示酿酒酵母前原序列，其在结构MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR(SEQ ID NO:2)中包含作为氨基酸残基1-19的交配因子α前肽和作为氨基酸残基20-85的交配因子α原肽。
交配因子α包含作为氨基酸残基38-42的序列VIGYL(SEQ ID NO:3)。交配因子α的变体已用于多肽的重组表达，其在交配因子α序列中包含作为氨基酸残基38-42的序列VIGYS(SEQ ID NO:4)。
在本文中，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可以可互换地使用，以表示多肽。应当理解，所使用的具体术语对于分子的大小没有限制(除非在特定的情况下直接说明)。
通常根据按照IUPAC命名法的单字母缩写来指定氨基酸残基，例如，D表示天冬氨酸(Asp)而G表示甘氨酸。然而，在一些情况下也使用相应的三字母缩写。
如本文所用的“遗传编码的氨基酸”意在表示由以下氨基酸组成的组：G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S、T以及它们的任何生物学修饰。这类生物学修饰的非限制性实例是例如酰胺化、糖基化和二硫键形成。
如本文所用的“类似物”意在表示通过一个或多个来自参考多肽的氨基酸残基的置换、缺失和/或添加而从参考多肽衍生的多肽。GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:5)的类似物的非限制性实例是残基34已被精氨酸残基置换的GLP-1(7-37)[K34R](SEQ ID NO:6)和残基34已被精氨酸残基置换并且氨基酸残基7-8已经缺失的GLP-1(9-37)[K34R](SEQ ID NO:7)(采用针对GLP-1肽的氨基酸残基的常用编号)。
如本文所用的关于多肽的“变体”意在表示该多肽的化学变体，其保留与原始蛋白质基本相同的主要功能。因此，变体通常是多肽的修饰形式，其中引入使修饰的多肽获得一些期望的性质、同时保留原始多肽的基本相同的主要功能所需的尽可能少的修饰。多肽变体的非限制性实例是例如延伸的多肽、截短的多肽、融合多肽和类似物。交配因子α原肽的变体的一个非限制性实例是L42S-交配因子α(20-85)(SEQ ID NO:8)。GLP-1(7-37)的变体的一个非限制性实例是GLP-1(7-37)[K34R]。
在一个实施方案中，多肽的变体与未修饰的多肽相比包含1-2个氨基酸置换、缺失或添加。在另一实施方案中，变体与未修饰的多肽相比包含1-5个氨基酸置换、缺失或添加。在另一实施方案中，相对于相应的未修饰的多肽，变体包含1-15个氨基酸置换、缺失或添加。
根据本发明的第二方面，提供了一种交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS。在一个实施方案中，交配因子α原肽变体不包含VIGYS、VIDYS、VATYL、VIGYR或AIGYL作为X38-X42。
根据本发明的第三方面，提供了一种GLP-1前体，它是一种融合多肽，其包含：
-前肽，
-交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS，
-任选的延伸肽，和
-GLP-1肽。
如本文所用的术语“GLP-1肽”意在表示GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺及其类似物，它们能够通过常规重组DNA技术以及常规合成方法产生。这样的GLP-1肽包括但不限于天然胰高血糖素样肽-1，例如，如WO 87/06941中公开的包含GLP-1(7-37)和其功能性变体的这类肽片段；如WO 90/11296中公开的包含GLP-1(7-36)和其功能性衍生物的这类肽片段；如WO 91/11457中公开的活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的这类类似物；如EP0699686-A2中公开的GLP-1的这类N-末端截短片段；以及如EP 0708179-A2中公开的包含N-末端咪唑基团的这类GLP-1类似物和衍生物。GLP-1肽的非限制性实例是GLP-1(7-37)和GLP-1(7-37)[K34R]。
如本文所用的术语“GLP-1前体”意在表示包含延伸的GLP-1肽的多肽，其中该延伸用于促进GLP-1肽的分泌、表达或回收。GLP-1前体的实例可见于WO03/010186和WO09/083549中。GLP-1前体旨在包括具有小延伸例如2-5个氨基酸残基的GLP-1肽，以及具有包含前肽和原肽的较长延伸的GLP-1肽。
在用于在酵母中重组表达多肽的方法的一个实施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一种序列，其中
X38是F、L或V；
X39是L、I、V或M；
X40是G或R；
X41是S、Y、L、I、V或M，并且
X42是Y、W、L、V或M。
在另一个实施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一种序列，其中
X38是I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是Y、F或W，并且
X42是L或I。
在另一个实施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一种序列，其中
X38是V；
X39是L、I、V或M；
X40是G或R；
X41是Y，并且
X42是L。
在另一个实施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一种序列，其中X40是R。在另一个实施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一种序列，其中X40是R，并且X42是L。
在又一个实施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一种序列，其中X38是V，X39是I，X40是R，X41是Y，并且X42是L。
在另一个实施方案中，重组表达的多肽是GLP-1肽或其变体，如GLP-1(7-37)[K34R]或GLP-1(9-37)[K34R]。
在一个实施方案中，重组表达的多肽具有N-末端延伸，即，位于交配因子α变体与待产生的多肽之间。该延伸可促进由宿主细胞表达或分泌所述多肽，或者它可保护所述多肽的一部分免遭不期望的在N-末端的蛋白水解处理。在另一个实施方案中，所述N-末端延伸是具有2-10个氨基酸残基或具有约8至约200个氨基酸残基的多肽。当延伸用于促进在宿主细胞中表达多肽时，或当延伸用于保护多肽免遭在N-末端的蛋白水解处理时，通常使用较小的N-末端延伸。在另一个实施方案中，所述N-末端延伸选自EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK和EELDARLEALK。在另一个实施方案中，所述N-末端延伸选自QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW和EAEAWH。
当表达的多肽包含N-末端延伸时，惯常通过使用蛋白酶、肽酶或通过化学切割来切下该N-末端延伸。可以使用蛋白酶如胰蛋白酶、Acromobacter lyticus蛋白酶和肠激酶。选择用于切割的具体蛋白水解酶通常取决于所产生的多肽。因此，本领域技术人员通常将根据多肽序列，尤其是任何内部主要或次要切割位点的存在，以及使N-末端延伸适应于形成良好的切割位点，来选择蛋白水解酶。
当用来切割具有N-末端延伸的表达的多肽时，蛋白酶的切割效率可以如下通过简单的试验来确定：将多肽的适当水溶液在有利于蛋白酶的pH和温度下温育，并随着时间从反应混合物中取出样品。一取出样品就将酶活性灭活。收集覆盖了感兴趣的时段的所有样品之后，通过例如HPLC分析测定相应的没有N-末端延伸的多肽的浓度。将切割的多肽的浓度描述为时间的函数将指示该反应的进程。比较多肽的不同N-末端延伸的这类反应轨迹将允许依据蛋白酶释放不含N-末端延伸的多肽的能力对N-末端延伸进行排序。
编码多肽的核酸构建体可以适当地为基因组、cDNA或合成来源的。通过公知的技术经由遗传密码的修饰来完成氨基酸序列的改变。
编码多肽的DNA序列通常插入到可以是任何载体的重组载体中，该载体可以方便地经历重组DNA程序，并且载体的选择通常将取决于其将被引入到的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外的实体存在、其复制与染色体复制无关的载体，例如质粒。或者，该载体可以是这样的载体，当引入到宿主细胞中时，其被整合到宿主细胞基因组中并与其所整合至的染色体一起复制。
该载体优选地是表达载体，其中编码多肽的DNA序列与DNA转录所需的其他区段可操作地连接。术语“可操作地连接”表示这些区段排列成使得它们一致地发挥作用以用于它们的预期目的，例如，转录在启动子中开始并通过编码该多肽的DNA序列继续进行，直至其在终止子内终止。
因此，用于表达多肽的表达载体将包含能够启动和引导经克隆的基因或cDNA的转录的启动子。该启动子可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中显示出转录活性并且可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
此外，用于表达多肽的表达载体还将包含终止子序列，即被宿主细胞识别而终止转录的序列。该终止子序列与编码该多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在所选择的宿主细胞中有功能的任何终止子均可在本发明中使用。
多肽的表达目的在于被引导至分泌途径，以用于细胞外表达至生长培养基中。例如，从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得作为前导序列中的前肽用于在酵母宿主细胞中表达的有用的信号肽。有用的前肽(信号肽)的其他实例是天冬氨酸蛋白酶3(Yps1)信号肽(Egel-Mitani等人(1990)YEAST 6:127-137和US 5,726,038)、MFα1基因的α-因子信号(Thorner(1981)in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomycescerevisiae，Strathern等人编著,pp 143-180,Cold Spring Harbor Laboratory,NY和US4,870,008)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(O.Hagenbuchle等人,Nature 289,1981,pp.643-646)、修饰的羧肽酶信号肽(L.A.Valls等人,Cell 48,1987,pp.887-897)和酵母BAR1信号肽(WO 87/02670)。
分别用于连接编码多肽的DNA序列、启动子、终止子和分泌信号序列，以及用于将它们插入到含有复制所需信息的适当载体中的程序是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NewYork,1989)。
许多酵母细胞含有被称为2微米质粒的内源质粒，该质粒含有确保其稳定维持在酵母细胞中的各种元件(Guerineau等人,1971,Biochem.Biophys.Res.Comm.42(3):550-557)。该内源2微米质粒的全部或一部分可与重组基因一起使用，作为一种用于确保稳定维持重组表达所需的序列的方法(Beggs J.D.,1978,Transformation of yeast by areplicating hybrid plasmid,Nature,275:104-109)。本发明人已发现，当内源2微米质粒存在于细胞中时，用于重组表达的表达质粒仅需要包含复制起点和STB区域。内源2微米质粒上存在的其他因子可以反式作用。复制起点和STB区域仅构成内源2μ质粒的一小部分。
在一方面，本发明提供了一种仅含有来自2微米质粒的复制起点和STB区域的表达质粒。因此，这一最小表达质粒不含有FLP区域、重复1区域、REP1区域、D-蛋白、重复2区域和REP2区域中的任何一个。在一个实施方案中，该质粒包含表达盒、大肠杆菌部分(包括AmpR基因)、如Russell,PR(1985,Transcription of the triose-phosphate gene ofSchizosaccharomyces pombe initiates from a start point different from that inSaccharomyces cerevisiae,Gene,40:125-130)中所述的编码磷酸丙糖异构酶的粟酒裂殖酵母(S.pombe)序列。在另一个实施方案中，所述最小质粒不包含AmpR或其他抗生素抗性基因。在例如大肠杆菌中的克隆工作期间，这样的抗生素抗性基因是有用的，但是在用于工业规模的重组蛋白表达的质粒中优选消除抗生素抗性基因。可使抗生素抗性基因成为非功能性的或通过公知的程序从宿主细胞中去除，参见例如WO 00/04172。所述最小表达质粒可用于多肽在酵母中的表达。
本发明的载体优选含有一个或多个选择性标记，其允许容易地选择转化的细胞。选择性标记是这样一种基因，其产物提供杀虫剂或病毒抗性、重金属抗性、互补营养缺陷等。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于在营养缺陷型酵母细胞中使用的选择性标记包括ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于酵母的优选选择性标记是粟酒裂殖酵母TPI基因(Russell(1985)Gene 40:125-130)。
在载体中，多核苷酸序列与合适的启动子序列可操作地连接。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因中获得。在酵母宿主细胞中有用的启动子的实例是酿酒酵母MFα1、TPI1、ADH2、TDH3或PGK1启动子。
本发明的多核苷酸构建体通常也将与合适的终止子可操作地连接。在酵母中，合适的终止子的实例是TPI1终止子(Alber等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)，但是也可以是任何内源酵母终止子。
用于分别连接本发明的多核苷酸序列、启动子和终止子，以及用于将它们插入到含有酵母复制所需信息的合适的酵母载体中的程序是本领域技术人员公知的。应当理解，载体可以如下构建：首先制备含有编码待表达的多肽的完整DNA序列的DNA构建体，随后将该片段插入到合适的表达载体中，或者顺序插入含有单个元件(如本发明的交配因子α变体，任选包含N-末端延伸的待表达的多肽)的遗传信息的DNA片段，然后通过连接、无缝克隆方法或通过在酵母细胞中经由同源重组直接克隆来组装这些元件。
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含编码本发明的交配因子α变体和待表达的多肽的多核苷酸序列。将包含这种多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中，使得该载体保持为染色体组成部分或自我复制的染色体外载体。
如本文所用的“宿主细胞”意在表示用于表达感兴趣的多肽的微生物。宿主细胞包括由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何后代。
本发明的合适的宿主细胞是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(basidiosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。产子囊酵母分为蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包括四个亚科：裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属)、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。产担子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidim)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、网孢菌属(Filobasidium)和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌纲的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，掷孢酵母属(Sorobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属(Candida))。因为酵母的分类在将来可能改变，所以为了本发明的目的，应按照Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,and Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)所述定义酵母。酵母的生物学和酵母遗传学的操作是本领域公知的(参见，例如，Biochemistry and Genetics of Yeast,Bacil,M.,Horecker,B.J.和Stopani,A.O.M.编著,第2版,1987；The Yeasts,Rose,A.H.和Harrison,J.S.编著,第2版,1987；和The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces,Strathern等人,editors,1981)。
本发明的方法中使用的酵母宿主细胞可以是任何合适的酵母生物体，其一旦培养，便产生大量待表达的多肽。
合适的酵母生物体的实例是选自假丝酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)和耶氏酵母属(Yarrowia)的种的细胞的菌株。在一个实施方案中，酵母宿主细胞选自卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、粟酒裂殖酵母、葡萄汁酵母(Sacchoromyces uvarum)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)和发酵地霉(Geotrichumfermentans)。其他有用的酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母、玉蜀黍黑粉菌(Ustilgomaylis)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltose)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和Pichia methanoliol(参见Gleeson等人,J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459-3465；US4,882,279和US 4,879,231)。例如，酵母细胞的转化可以通过原生质体形成以及随后以本身已知的方式转化来实现。
用于表达多肽的宿主细胞优选为不含任何功能性抗生素抗性基因的细胞。尽管这样的抗生素抗性基因在例如大肠杆菌中的初始克隆步骤过程中是有用的，但是可使抗生素抗性基因成为非功能性的或通过公知的程序从宿主细胞中去除，参见例如WO 00/04172。
如本文所用的“培养基”意在表示用于培养宿主细胞，即，支持酵母的生长和产物形成的液体溶液。合适的酵母用培养基是例如YPD或如WO2008/037735中所述。该培养基含有至少一种碳源，一种或数种氮源，包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐和硫酸盐在内的必要的盐，微量金属，水溶性维生素，和加工助剂，包括但不限于消泡剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体和诱导物。典型的碳源是例如单糖或二糖。典型的氮源是例如氨、尿素、氨基酸、酵母提取物、玉米浆和完全或部分水解的蛋白质。典型的微量金属是例如Fe、Zn、Mn、Cu、Mo和H3BO3。典型的水溶性维生素是例如生物素、泛酸盐、烟酸、硫胺素、对氨基苯甲酸、胆碱、吡哆醇、叶酸、核黄素和抗坏血酸。
如本文所用的“发酵”意在表示用于使浸入液体培养基中的微生物繁殖的无菌过程。发酵优选在具有用于添加包括但不限于空气、氧气和氨等压缩的无菌气体的供应管线的无菌搅拌罐中进行。发酵罐可以含有用于监控pH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、加料速率和加酸及加碱速率的传感器和装置。此外，发酵罐可装备有用于监控细胞密度的水平、代谢物和产物(不论其理化形式如何)的浓度的光学器件。
在发酵过程中产生的所需产物作为可溶性细胞外物质而存在，或者作为呈可溶性物质形式或呈包括聚集物质的不溶性物质形式的细胞内物质而存在。所需产物优选作为可溶性细胞外物质而存在。发酵过程通常在具有100mL至200,000L的工作容积的罐中进行。发酵过程可以作为分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程或连续过程来操作。
分泌的多肽——其中大部分将以适当处理的形式存在于培养基中——可通过常规程序从培养基中回收，这些程序包括通过离心、过滤从培养基中分离酵母细胞，或者通过离子交换基质或通过反相吸附基质捕获多肽，依靠盐例如硫酸铵使上清液或滤液的蛋白质组分沉淀，然后通过各种色谱程序例如离子交换色谱法、亲和色谱法等进行纯化。
本发明的新型交配因子α变体还有利于在酵母中表达过程中减少多肽的O-糖基化。如此，本发明的交配因子α变体可以在用于在酵母中制备多肽如GLP-1肽的改进方法中使用。在具有降低的O-糖基化能力的酵母细胞中表达多肽可维持所述前体的提高的产率，而同时甚至进一步降低在表达过程中O-糖基化的所述多肽的比例。
蛋白质O-甘露糖基转移酶(PMT)启动了O-甘露糖基聚糖的组装，这是真菌中必要的蛋白质修饰。PMT在真菌中保守，并且PMT家族在系统发育上分类为PMT1、PMT2和PMT4亚家族，它们在蛋白质底物特异性上不同。通过从多萜基磷酸-D-甘露糖中转移甘露糖基残基，蛋白质O-甘露糖基转移酶Pmt1p和Pmt2p在酵母的内质网中催化蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸残基的O-糖基化(Gentzsch等人,FEBS Lett 1995,18,pp128-130)。在酿酒酵母中以及在许多其他酵母中，PMT家族是高度过剩的，并且只有PMT1/PMT2和PMT4亚家族成员的同时缺失才是致死性的(Girrbach和Strahl,J.Biol.Chem.2003,278,pp12554-62)。US5,714,377描述了具有由于PMT1/PMT2修饰而降低的O-糖基化能力的酵母细胞仍然存活，并且在工业发酵条件下显示出良好的生长特性。
非限制性实施方案
通过以下非限制性实施方案进一步描述了本发明：
1.一种用于在酵母中重组表达多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS。
2.根据实施方案1所述的方法，其中
X38是F、L或V；
X39是L、I、V或M；
X40是G或R；
X41是S、Y、L、I、V或M，并且
X42是Y、W、L、V或M。
3.根据权利要求1所述的方法，其中
X38是I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是Y、F或W，并且
X42是L或I。
4.根据实施方案1-3中任意一项所述的方法，其中
X38是V；
X39是L、I、V或M；
X40是G或R；
X41是Y，并且
X42是L。
5.根据实施方案1-4中任意一项所述的方法，其中X38-X39-X40-X41-X42中的四个氨基酸残基与VIGYL或VIGYS中的相应氨基酸残基相同。
6.根据实施方案1-5中任意一项所述的方法，其中X38-X39-X40-X41-X42中的至少三个氨基酸残基与VIGYL或VIGYS中的相应氨基酸残基相同。
7.根据实施方案1-6中任意一项所述的方法，其中X41是Y。
8.根据实施方案1-6中任意一项所述的方法，其中X41是L。
9.根据实施方案1-8中任意一项所述的方法，其中X42是L。
10.根据实施方案1和5-8中任意一项所述的方法，其中X42是S。
11.根据实施方案1和5-8中任意一项所述的方法，其中X42是Y、W、L、I、V或M。
12.根据实施方案1-11中任意一项所述的方法，其中X40是R。
13.根据实施方案12所述的方法，其中X38是V，X39是I，X41是Y，并且X42是L。
14.根据实施方案12所述的方法，其中X38是V，X39是I，X41是Y，并且X42是S。
15.根据实施方案1和12中任意一项所述的方法，其中式(I)是VI-X40-YL或VI-X40-YS。
16.根据实施方案15所述的方法，其中X40是A、Y、F、W、R、K、L、I、V或M。
17.根据实施方案1-16中任意一项所述的方法，其中与SEQ ID NO:2所示的交配因子α原肽(氨基酸残基20-85)相比，所述交配因子α原肽变体在X38-X42序列之外具有少于10个氨基酸残基变化。
18.根据实施方案1-17中任意一项所述的方法，其中与SEQ ID NO:2所示的交配因子α原肽(氨基酸残基20-85)相比，所述交配因子α原肽变体在X38-X42序列之外具有少于5个氨基酸残基变化。
19.根据实施方案1-18中任意一项所述的方法，其中与SEQ ID NO:2所示的交配因子α原肽(氨基酸残基20-85)相比，所述交配因子α原肽变体在X38-X42序列之外具有少于2个氨基酸残基变化。
20.根据实施方案1-19中任意一项所述的方法，其中所述交配因子α原肽变体是交配因子α前原肽的一部分，该交配因子α前原肽包含与作为C-末端部分的所述交配因子α原肽变体融合的作为N-末端部分的前肽。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述前肽来自酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽，来自酿酒酵母的MFα1基因的α-因子信号或其变体。
22.根据实施方案1-21中任意一项所述的方法，其中所述酵母携带至少一个降低其O-糖基化能力的遗传修饰。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述酵母携带PMT1或PMT2的基因内的至少一个降低其O-糖基化能力的遗传修饰。
24.根据实施方案22-23中任意一项所述的方法，其中所述酵母携带至少一个如下的遗传修饰，与携带相应未修饰的基因的酵母相比，该遗传修饰降低其通过蛋白质O-甘露糖基转移酶1(PMT1)对与α前导序列一起表达的多肽GLP-1(7-37)[K34R]的O-糖基化的能力。
25.根据实施方案22-24中任意一项所述的方法，其中所述酵母携带至少一个如下的遗传修饰，与携带相应未修饰的基因的酵母相比，该遗传修饰降低其通过蛋白质O-甘露糖基转移酶2(PMT2)对与α前导序列一起表达的多肽GLP-1(7-37)[K34R]的O-糖基化的能力。
26.根据实施方案22-25中任意一项所述的方法，其中所述O-糖基化能力降低至少2倍。
27.根据实施方案22-26中任意一项所述的方法，其中所述O-糖基化能力降低至少4倍。
28.根据实施方案22-27中任意一项所述的方法，其中所述至少一个遗传修饰位于PMT1或PMT2的编码区。
29.根据实施方案22-27中任意一项所述的方法，其中所述至少一个遗传修饰位于负责或参与PMT1或PMT2的表达和/或转录调节的区域。
30.根据实施方案22-27中任意一项所述的方法，其中所述酵母中的PMT1基因缺失。
31.根据实施方案22-27中任意一项所述的方法，其中所述酵母中的PMT1和PMT2基因均缺失。
32.根据实施方案1-31中任意一项所述的方法，其中所述多肽包含GLP-1肽。
33.根据实施方案32所述的方法，其中所述多肽包含GLP-1(9-37)[K34R]或GLP-1(9-37)[K34R]。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述多肽是GLP-1(7-37)[K34R]、GLP-1(9-37)[K34R]或GLP-1(9-37)[K34R,G37K](SEQ ID NO:44)。
35.根据实施方案32-34中任意一项所述的方法，其中所述多肽具有N-末端延伸。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述N-末端延伸选自EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK和EELDARLEALK。
37.根据实施方案35所述的方法，其中所述N-末端延伸选自DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE、DVKPGQPMY和DVKPGQPMYDDDDK。
38.根据实施方案35所述的方法，其中所述N-末端延伸选自QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW和EAEAWH。
39.交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS。
40.根据实施方案39所述的交配因子α原肽变体，其中X38-X42不是VIGYS、VIDYS、VATYL、VIGYR或AIGYL。
41.GLP-1前体，其为一种融合多肽，其包含：
-前肽，
-交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具
有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS，
-任选的延伸肽，和
-GLP-1肽。
42.根据实施方案41所述的GLP-1前体，其中所述GLP-1前体所包含的肽按照它们所列出的顺序融合，即，前肽-交配因子α原肽变体，任选的延伸肽和GLP-1肽。
43.编码根据实施方案39-42中任意一项所述的多肽的DNA序列。
44.包含根据实施方案43所述的DNA序列的表达载体。
45.根据实施方案44所述的表达载体，其中编码待表达的多肽的所述DNA序列与上游启动子和下游终止子可操作地连接。
46.包含根据实施方案44-45中任意一项所述的表达载体的宿主细胞。
47.根据实施方案46所述的宿主细胞，其选自酵母属的种、毕赤酵母属的种、汉逊酵母属的种、Arxula的种、克鲁维酵母属的种、耶氏酵母属的种和裂殖酵母属的种。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均在此通过引用以其全文并入本文，并且其程度如同单独地且特别地指出每篇参考文献均通过引用而并入且在本文中以其全文进行阐述(在法律允许的最大程度上)。本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明的范围的限制。说明书中的任何措辞均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。本文中专利文件的引用和并入仅仅是为了方便而做出的，并没有反映关于这些专利文件的有效性、可专利性和/或可执行性的任何观点。如由适用的法律所允许的，本发明包括所附权利要求书中列举的主题的所有修改和等同物。
实施例
实施例1-45
我们构建了一种质粒，其含有TDH3启动子，编码MFalpha前原肽的基因，编码N-末端延伸的GLP-1(DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(7-37)[K34R])(SEQ ID NO:45)的基因，用于在酵母中维持的最小2微米区域，和选择性标记，即来自粟酒裂殖酵母的TPI基因(参见图1)。
在该质粒背景中，我们在编码MFalpha-原肽区域的位置38-42的区域中引入了各种单突变，X38-X42＝VIGYL序列(参见图2)。使用野生型VIGYL序列的实验是实施例1，参见表1至表5。其他参考实验是实施例5-6、10-11、28-29、37-38和44-45。
将这些质粒引入缺乏TPI1基因的酿酒酵母菌株中，以允许在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基上选择携带该质粒的转化体。此后将转化体在摇瓶中的5ml相关培养基中培养3天，并通过LCMS分析培养上清液中分泌的GLP-1肽的浓度和该肽的O-糖基化程度。表1至表5中显示了X38-X42序列的野生型和单氨基酸残基突变体(在每个位置上包括一对参考实施例)的产率和O-糖基化程度。
表1.在位置38(X38)上具有单氨基酸突变的交配因子α原肽突变体的控制下，N-末端延伸的GLP-1的表达的数据。N-末端延伸的GLP-1和O-糖基化(O-glyco)杂质的浓度针对在具有野生型Val作为X38的交配因子α原肽的控制下来自相同表达的数据进行归一化。
表2.在位置39(X39)上具有单氨基酸突变的交配因子α原肽突变体的控制下，N-末端延伸的GLP-1的表达的数据。N-末端延伸的GLP-1和O-糖基化(O-glyco)杂质的浓度针对在具有野生型Ile作为X39的交配因子α原肽的控制下来自相同表达的数据进行归一化。
表3.在位置40(X40)上具有单氨基酸突变的交配因子α原肽突变体的控制下，N-末端延伸的GLP-1的表达的数据。N-末端延伸的GLP-1和O-糖基化(O-glyco)杂质的浓度针对在具有野生型Gly作为X40的交配因子α原肽的控制下来自相同表达的数据进行归一化。
表4.在位置41(X41)上具有单氨基酸突变的交配因子α原肽突变体的控制下，N-末端延伸的GLP-1的表达的数据。N-末端延伸的GLP-1和O-糖基化(O-glyco)杂质的浓度针对在具有野生型Tyr作为X41的交配因子α原肽的控制下来自相同表达的数据进行归一化。
表5.在位置42(X42)上具有单氨基酸突变的交配因子α原肽突变体的控制下，N-末端延伸的GLP-1的表达的数据。N-末端延伸的GLP-1和O-糖基化(O-glyco)杂质的浓度针对在具有野生型Leu作为X42的交配因子α原肽的控制下来自相同表达的数据进行归一化。
实施例46.
一种类似于实施例1-45中的质粒的质粒，其含有TDH3启动子，编码MFalpha前原肽的基因，编码N-末端延伸的GLP-1(DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(7-37)[K34R])的基因，用于在酵母中维持的最小2微米区域，和选择性标记(图1)，将该质粒转化至两种不同的菌株背景中——一种含有PMT1基因(PMT+)，另一种缺失PMT1基因(PMT-)。该PMT1基因编码参与O-糖基化的蛋白质甘露糖基转移酶。
所述MFalpha原肽是野生型(40G)或突变的(G40R)。在连续培养中在相同的条件下培养所述菌株，稀释率＝0.1，并且pH 5.8。通过HPLC分析样品以测定在用过的培养基中GLP-1前体的浓度，并通过LCMS分析以测定O-糖基化的GLP-1前体的比例。
结果证明效应的确是累加的。
G40R突变使O-糖基化减少大于80％。PMT1的缺失使O-糖基化进一步减少大于80％，在这一情况下得到接近检测限的O-糖基化水平。此外，在PMT+菌株以及pmt1缺失菌株中，G40R突变均使N-末端延伸的GLP-1的产率与40G野生型形式相比有惊人的增长(参见表6)。
这些结果表明，在MFalpha原肽中的有益突变例如G40R与PMT1缺失的宿主菌株的结合导致O-糖基化的累加减少。
表6.与相应的野生型40G相比，当使用40R突变的MFalpha原肽时，在连续培养中肽DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(7-37)[K34R]的归一化的最大浓度(产率)。
实施例47.
为了考察所述突变之一在其他GLP-1肽的表达过程中的作用，我们构建了质粒，其含有TDH3启动子，编码野生型(40G)或40R突变形式的MFalpha前原肽的基因，编码N-末端延伸的GLP-1(DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(9-37)[K34R]或DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(9-37)[K34R,G37K])的基因，用于在酵母中维持的最小2微米区域，和选择性标记，即来自粟酒裂殖酵母的TPI基因(参见图1)。
将这些质粒引入缺乏TPI1基因的酿酒酵母菌株中，以允许在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基上选择携带该质粒的转化体。此后将转化体在摇瓶中的5ml相关培养基中培养3天，并通过LCMS分析培养上清液中分泌的GLP-1肽的浓度和该肽的O-糖基化程度。表7显示了野生型(wt)和40R突变在表达时的结果，包括GLP-1肽的产率和GLP-1肽的O-糖基化程度。
表7.在位置40(X40)上具有或不具有到Arg的单氨基酸置换的交配因子α原肽突变体的控制下，特异性N-末端延伸的GLP-1肽的表达的数据。N-末端延伸的GLP-1肽(产率)和O-糖基化杂质的浓度针对在具有野生型Gly作为X40的交配因子α原肽的控制下来自相同GLP-1肽的表达的数据进行归一化。
BDL：低于检测限
虽然本发明的某些特征已在本文中说明和描述，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同物。因此，应当理解，所附的权利要求书旨在涵盖落在本发明的真正精神内的所有这些修改和变化。

Claims (15)

1.一种用于在酵母中重组表达包含GLP-1肽的多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS。
2.根据权利要求1所述的方法，其中
X38是F、L或V；
X39是L、I、V或M；
X40是G或R；
X41是S、Y、L、I、V或M，并且
X42是Y、W、L、V或M。
3.根据权利要求1所述的方法，其中
X38是I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是Y、F或W，并且
X42是L或I。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中
X38是V；
X39是L、I、V或M；
X40是G或R；
X41是Y，并且
X42是L。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中X40是R。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中与SEQ ID NO:2所示的交配因子α原肽(氨基酸残基20-85)相比，所述交配因子α原肽变体在X38-X42序列之外具有少于10个氨基酸残基变化。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述酵母携带至少一个降低其O-糖基化能力的遗传修饰。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述酵母中的PMT1基因缺失。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述多肽包含GLP-1(9-37)[K34R]或GLP-1(9-37)[K34R,G37K]。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述多肽由GLP-1(9-37)[K34R]或GLP-1(9-37)[K34R]组成。
11.根据权利要求9-10中任意一项所述的方法，其中所述多肽具有N-末端延伸。
12.交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS、VIDYS、VATYL、VIGYR或AIGYL。
13.GLP-1前体，其为一种融合多肽，其包含：
-前肽，
-交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：
X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)
其中
X38是F、L、I或V；
X39是L、I、V或M；
X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；
X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；
X42是Y、W、L、I、V、M或S；
条件为X38-X42不是VIGYS，
-任选的延伸肽，和
-GLP-1肽。
14.表达载体，其包含编码根据权利要求12-13中任意一项所述的多肽的DNA序列。
15.包含根据权利要求14所述的表达载体的宿主细胞。
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