JP6275847B2 - アルファ接合因子プロペプチドバリアント - Google Patents
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Description
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)。
X38-X39-X40-X41-X42 (I)
(式中、X38はVであり、X39はL、I、V、又はMであり、X40はG又はRであり、X41はYであり、X42はLである)。
X38-X39-X40-X41-X42 (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)。
- プレペプチド
- 38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアント:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)
- 任意選択により、延長ペプチド、及び
- GLP-1ポリペプチド
を含む融合ポリペプチドであるGLP-1前駆体を提供する。
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)。
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR (配列番号2)。
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)。一実施形態において、α接合因子プロペプチドバリアントは、X38〜X42としてVIGYS、VIDYS、VATYL、VIGYR、又はAIGYLを含まない。
- プレペプチド
- 38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアント:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)
- 任意選択により、延長ペプチド、及び
- GLP-1ペプチド
を含む融合ポリペプチドであるGLP-1前駆体を提供する。
X38が、F、L、又はVであり、
X39が、L、I、V、又はMであり、
X40が、G又はRであり、
X41が、S、Y、L、I、V、又はMであり、
X42が、Y、W、L、V、又はMである
配列を有する。
X38が、I又はVであり、
X39が、L、I、V、又はMであり、
X40が、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41が、Y、F、又はWであり、
X42が、L又はIである
配列を有する。
X38が、Vであり、
X39が、L、I、V、又はMであり、
X40が、G又はRであり、
X41が、Yであり、
X42が、Lである
配列を有する。
本発明を、以下の非限定的な実施形態によって更に記述する:
1. 酵母におけるポリペプチドの組換え発現のための方法であって、前記方法は、ポリペプチドの上流にプロセシング及び分泌シグナルをコードするDNA配列を含む酵母株を培養する工程を含み、前記プロセシング及び分泌シグナルは、38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアントを含む、方法:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)。
2. X38が、F、L、又はVであり、
X39が、L、I、V、又はMであり、
X40が、G又はRであり、
X41が、S、Y、L、I、V、又はMであり、
X42が、Y、W、L、V、又はMである、
実施形態1に記載の方法。
3. X38が、I又はVであり、
X39が、L、I、V、又はMであり、
X40が、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41が、Y、F、又はWであり、
X42が、L又はIである、
実施形態1に記載の方法。
4. X38が、Vであり、
X39が、L、I、V、又はMであり、
X40が、G又はRであり、
X41が、Yであり、
X42が、Lである、
実施形態1から3のいずれか一項に記載の方法。
5. X38-X39-X40-X41-X42における4個のアミノ酸残基が、VIGYL又はVIGYSにおける対応するアミノ酸残基に同一である、実施形態1から4のいずれか一項に記載の方法。
6. X38-X39-X40-X41-X42における少なくとも3個のアミノ酸残基が、VIGYL又はVIGYSにおける対応するアミノ酸残基に同一である、実施形態1から5のいずれか一項に記載の方法。
7. X41がYである、実施形態1から6のいずれか一項に記載の方法。
8. X41がLである、実施形態1から6のいずれか一項に記載の方法。
9. X42がLである、実施形態1から8のいずれか一項に記載の方法。
10. X42がSである、実施形態1及び5から8のいずれか一項に記載の方法。
11. X42がY、W、L、I、V、又はMである、実施形態1及び5から8のいずれか一項に記載の方法。
12. X40がRである、実施形態1から11のいずれか一項に記載の方法。
13. X38がVであり、X39がIであり、X41がYであり、X42がLである、実施形態12に記載の方法。
14. X38がVであり、X39がIであり、X41がYであり、X42がSである、実施形態12に記載の方法。
15. 式(I)がVI-X40-YL又はVI-X40-YSである、実施形態1又は12に記載の方法。
16. X40がA、Y、F、W、R、K、L、I、V、又はMである、実施形態15に記載の方法。
17. 前記α接合因子プロペプチドバリアントが、配列番号2(アミノ酸残基20〜85)に記載のα接合因子プロペプチドに比べて、X38〜X42配列の外に10個未満のアミノ酸残基の変更を有する、実施形態1から16のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記α接合因子プロペプチドバリアントが、配列番号2(アミノ酸残基20〜85)に記載のα接合因子プロペプチドに比べて、X38〜X42配列の外に5個未満のアミノ酸残基の変更を有する、実施形態1から17のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記α接合因子プロペプチドバリアントが、配列番号2(アミノ酸残基20〜85)に記載のα接合因子プロペプチドに比べて、X38〜X42配列の外に2個未満のアミノ酸残基の変更を有する、実施形態1から18のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記α接合因子プロペプチドバリアントが、C末端部分としての前記α接合因子プロペプチドバリアントに融合している、N末端部分としてのプレペプチドを含むα接合因子プレプロペプチドの一部である、実施形態1から19のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記プレペプチドが、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナルペプチド由来、サッカロミセス・セレビシエ由来のMFα1遺伝子のα因子シグナル由来、又はそのバリアントである、実施形態20に記載の方法。
22. 前記酵母が、O-グリコシル化に対するその能力を低減する、少なくとも1つの遺伝子修飾を保有する、実施形態1から21のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記酵母が、O-グリコシル化に対するその能力を低減する、PMT1又はPMT2に対する遺伝子内の少なくとも1つの遺伝子修飾を保有する、実施形態22に記載の方法。
24. 前記酵母が、対応する非修飾の遺伝子を保有する酵母に比べて、アルファリーダーとともに発現される場合、ポリペプチドGLP-1(7-37)[K34R]のタンパク質O-マンノシルトランスフェラーゼ1(PMT1)によるO-グリコシル化に対するその能力を低減する、少なくとも1つの遺伝子修飾を保有する、実施形態22又は23に記載の方法。
25. 前記酵母が、対応する非修飾の遺伝子を保有する酵母に比べて、アルファリーダーとともに発現される場合、ポリペプチドGLP-1(7-37)[K34R]のタンパク質O-マンノシルトランスフェラーゼ2(PMT2)によるO-グリコシル化に対するその能力を低減する、少なくとも1つの遺伝子修飾を保有する、実施形態22から24のいずれか一項に記載の方法。
26. O-グリコシル化に対する前記能力が、2分の1以下に低減している、実施形態22から25のいずれか一項に記載の方法。
27. O-グリコシル化に対する前記能力が、4分の1以下に低減している、実施形態22から26のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記少なくとも1つの遺伝子修飾が、PMT1又はPMT2のコード領域に位置する、実施形態22から27のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記少なくとも1つの遺伝子修飾が、PMT1又はPMT2の発現及び/若しくは転写の調節を担い、又はその調節に関与する領域に位置する、実施形態22から27のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記酵母においてPMT1遺伝子が欠失している、実施形態22から27のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記酵母におけるPMT1及びPMT2遺伝子が両方とも欠失している、実施形態22から27のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ポリペプチドがGLP-1ペプチドを含む、実施形態1から31のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ポリペプチドが、GLP-1(9-37)[K34R]又はGLP-1(9-37)[K34R]を含む、実施形態32に記載の方法。
34. 前記ポリペプチドが、GLP-1(7-37)[K34R]、GLP-1(9-37)[K34R]、又はGLP-1(9-37)[K34R,G37K] (配列番号44)である、実施形態33に記載の方法。
35. 前記ポリペプチドがN末端延長部を有する、実施形態32から34のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記N末端延長部が、EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK、及びEELDARLEALKからなる群から選択される、実施形態35に記載の方法。
37. 前記N末端延長部が、DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE、DVKPGQPMY、及びDVKPGQPMYDDDDKからなる群から選択される、実施形態35に記載の方法。
38. 前記N末端延長部が、QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW、及びEAEAWHからなる群から選択される、実施形態35に記載の方法。
39. 38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアント:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)。
40. X38〜X42が、VIGYS、VIDYS、VATYL、VIGYR、及びAIGYLではない、実施形態39に記載のα接合因子プロペプチドバリアント。
41. - プレペプチド
- 38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアント:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、F、L、I、又はVであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V、又はMであり、
X41は、S、Y、F、W、L、I、V、又はMであり、
X42は、Y、W、L、I、V、M、又はSであり、
ただし、X38〜X42は、VIGYSではない)
- 任意選択により、延長ペプチド、及び
- GLP-1ペプチド
を含む融合ポリペプチドであるGLP-1前駆体。
42. 前記GLP-1前駆体に含まれる諸ペプチドが、これらを列挙した順序、すなわちプレペプチド-α接合因子プロペプチドバリアント、任意選択の延長ペプチド及びGLP-1ペプチドに従って融合される、実施形態41に記載のGLP-1前駆体。
43. 実施形態39から42のいずれか一項に規定のポリペプチドをコードするDNA配列。
44. 実施形態43に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
45. 発現させようとするポリペプチドをコードする前記DNA配列が、上流のプロモーター及び下流のターミネーターに作動可能に連結されている、実施形態44に記載の発現ベクター。
46. 実施形態44又は45に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
47. サッカロミセス種、ピキア種、ハンセヌラ(Hansenula)種、アークスラ(Arxula)種、クルイベロミセス種、ヤロウイア種、及びシゾサッカロミセス種からなる群から選択される、実施形態46に記載の宿主細胞。
本発明者らは、TDH3プロモーター、MFアルファプレプロペプチドをコードする遺伝子、N末端が延長されたGLP-1(DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(7-37)[K34R]) (配列番号45)をコードする遺伝子、酵母における維持のための最小2ミクロン領域、及び選択マーカー、すなわち分裂酵母由来のTPI遺伝子を含むプラスミドを構築した(図1を参照されたい)。
TDH3プロモーター、MFアルファプレプロペプチドをコードする遺伝子、N末端が延長されたGLP-1(DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(7-37)[K34R])をコードする遺伝子、酵母内に維持するための最小2ミクロン領域、及び選択マーカー(図1)を含む、実施例1〜45におけるプラスミドと同様のプラスミドを、一方はPMT1遺伝子を含み(PMT+)、他方はPMT1遺伝子が欠失している(PMT-)、異なる2つの株のバックグラウンドに形質転換した。PMT1遺伝子は、O-グリコシル化に関与するタンパク質マンノシルトランスフェラーゼをコードする。
他のGLP-1ペプチドの発現の間の1つの変異の効果を調べるために、本発明者らは、TDH3プロモーター、野生型(40G)又は40R変異いずれかの形態におけるMFアルファプレプロペプチドをコードする遺伝子、N末端が延長されたGLP-1(DVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(9-37)[K34R]又はDVKPGQPMYDDDDK-GLP-1(9-37)[K34R,G37K])をコードする遺伝子、酵母内に維持するための最小2ミクロン領域、及び選択マーカー、すなわち分裂酵母由来のTPI遺伝子を含むプラスミドを構築した(図1を参照されたい)。
Claims (18)
- 酵母における、GLP-1ペプチドを含むポリペプチドの組換え発現のための方法であって、前記方法は、ポリペプチドの上流にプロセシング及び分泌シグナルをコードするDNA配列を含む酵母株を培養する工程を含み、前記プロセシング及び分泌シグナルは、38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアントを含み:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、Vであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、G、R、又はKであり、
X41は、Yであり、
X42は、L又はIである)
前記α接合因子プロペプチドバリアントが、配列番号2(アミノ酸残基20〜85)に記載のα接合因子プロペプチドに比べて、X38〜X42配列の外に4個未満のアミノ酸残基の変更を有し、且つ、組換えポリペプチドの収率を高め、及び/又はO-グリコシル化不純物の量を低下させる機能を有する、方法。 - X40がRである、請求項1に記載の方法。
- X38-X39-X40-X41-X42におけるアミノ酸残基のうちの3個が、VIGYLにおける対応するアミノ酸残基と同一である、請求項1又は2に記載の方法。
- X38-X39-X40-X41-X42が、VIRYLである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵母が、O-グリコシル化に対するその能力を低減する、少なくとも1つの遺伝子修飾を保有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵母においてPMT1遺伝子が欠失している、請求項5に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、GLP-1(9-37)[K34R]又はGLP-1(9-37)[K34R,G37K]を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、GLP-1(9-37)[K34R]又はGLP-1(9-37)[K34R,G37K]からなる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドがN末端延長部を有する、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記N末端延長部が、EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK、及びEELDARLEALKからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記N末端延長部が、DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE、DVKPGQPMY、及びDVKPGQPMYDDDDKからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記N末端延長部が、QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW、及びEAEAWHからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアントであって:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、Vであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、G、R、又はKであり、
X41は、Yであり、
X42は、L又はIである)
配列番号2(アミノ酸残基20〜85)に記載のα接合因子プロペプチドに比べて、X38〜X42配列の外に4個未満のアミノ酸残基の変更を有し、且つ、組換えGLP-1ペプチドの収率を高め、及び/又はO-グリコシル化GLP-1ペプチドの量を低下させる機能を有する、α接合因子プロペプチドバリアント。 - - プレペプチド
- 38〜42位のVIGYL配列に少なくとも1つの置換を有し、以下の一般式(I)のアミノ酸配列を含むα接合因子プロペプチドバリアントであって:
X38-X39-X40-X41-X42 (配列番号1) (I)
(式中、
X38は、Vであり、
X39は、L、I、V、又はMであり、
X40は、G、R、又はKであり、
X41は、Yであり、
X42は、L又はIである)
配列番号2(アミノ酸残基20〜85)に記載のα接合因子プロペプチドに比べて、X38〜X42配列の外に4個未満のアミノ酸残基の変更を有し、且つ、組換えポリペプチドの収率を高め、及び/又はO-グリコシル化不純物の量を低下させる機能を有する、α接合因子プロペプチドバリアント
- 任意選択により、延長ペプチド、及び
- GLP-1ペプチド
を含む融合ポリペプチドであるGLP-1前駆体。 - ・X 40 がRである、
・X 38 -X 39 -X 40 -X 41 -X 42 におけるアミノ酸残基のうちの3個が、VIGYLにおける対応するアミノ酸残基と同一である、又は
・X 38 -X 39 -X 40 -X 41 -X 42 が、VIRYLである、
請求項14に記載のGLP-1前駆体。 - 前記GLP-1ペプチドが、GLP-1(9-37)[K34R]若しくはGLP-1(9-37)[K34R,G37K]を含む、又は、GLP-1(9-37)[K34R]若しくはGLP-1(9-37)[K34R,G37K]からなる、請求項14又は15に記載のGLP-1前駆体。
- 請求項14から16のいずれか一項に規定のポリペプチドをコードするDNA配列を含む発現ベクター。
- 請求項17に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
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