JPH03219875A - Ｃｐｂ―ｉの製造方法並びにこれに用いる組換えプラスミドおよび形質転換酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト胎盤を始めとするヒト組織より得られる
抗血液凝固物質（カルフォビンデン、以下ＣＰＢ−’Ｉ
と称する）の遺伝子組換えによる製造方法、ならびにこ
れに用いる組換えプラスミドおよび形質転換酵母に関す
る。

〔従来の技術〕

これまでに、生体関連の抗血液凝固物質として、ヘパリ
ン、ヘパリンコファクター■、アンチトロンビン■、α
■−アンチトリプシン等が知られている。これまでのと
ころ、抗血液凝固剤として実用化されたのはヘパリンの
みであるが、副作用の問題や、使用方法が限定されてい
ること等から満足のいくものではなかった。

このような状況の下で、本出願人は、ヒト胎盤からＣＰ
Ｂ−Ｉ　　（当初Ｐ’ＣＩと称していた）を分離精製す
ることに成功し、特許出願した（特開昭６２−１７４０
２３号）。さらに、本出願人は、ＣＰＢ−■に対して特
異的なモノクローナル抗体を作製し、（特開昭６３−１
２３３９５号）、その後にこの抗体をプローブとしてヒ
ト胎ＩＪ　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡライブラリーからＣＰＢ−Ｉ
をコードする遺伝子断片をクローニングし、これを遺伝
子組換え技術により大腸菌で発現することに成功した（
特開昭６４−２００９５号）。

このようにして大腸菌により発現・精製されたＣＰＢ−
Ｉは、胎盤より精製された本来のＣＰＢＩとほぼ同等の
抗血液凝固活性を有することが確認された。しかしなが
ら、この場合に発現の宿主となっている大腸菌は、発熱
物質（パイロジエン）を特に多く産生ずることが知られ
ており、目的のＣＰＢ−ｒの精製において、このような
パイロジエン等の除去操作が煩雑になることが危惧され
た。

また、一般に、特定の外来遺伝子を遺伝子組換え技術に
より発現させる場合は、発現の宿主細胞として何を用い
るか、発現用プロモーターとして何を用いるかによって
、目的のペプチドの発現量は大きく変化することが知ら
れている。これまでの様々な遺伝子組換えによる外来遺
伝子の発現に関する報告により、−船釣に効率のよい発
現系というものが次第に明らかにされつつある。しかし
ながら、目的の外来遺伝子の発現産物が発現の宿主細胞
に及ぼす影響等により、通常発現量が高いとされている
発現系が、特定の外来遺伝子の発現には好ましい結果を
示さないことがあることが判ってきた。これとは逆に、
特定の外来遺伝子に対しては非常に相性がよく、極めて
高い量の発現が可能となるような発現系が存在すること
も知られている。

したがって、ＣＰＢ−Ｉの工業的生産を目的として研究
を進めるうえでは、より効率よくしかも安定にＣＰＢ−
Ｉを生産することが可能なＣＰＢ−１の生産に適した発
現系を見いだすことが望まれていた。

〔発明の目的〕

このような状況において、本発明者らは、ＣＰＢ−Ｉの
遺伝子組換えによる製造に関して研究を重ねた結果、酵
母を宿主としてしかも特定の発現系を用いることにより
、所望する生理活性を有するＣＰＢ−１を極めて効率よ
くしかも安定に産生ずる形質転換酵母を得ることに成功
し、ＣＰＢ−１の効率的な製造方法を見いだして本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明の目的は抗血液凝固物質ＣＰＢ−１を
遺伝子組換え技術を用いて製造する際において、ＣＰＢ
−Ｉを極めて効率よく産生させるための酵母用組換えプ
ラスミドふよび形質転換酵母ならびにこれを用いたＣＰ
Ｂ−Ｉの製造方法を提供することにある。

〔発明の構成および効果〕

かかる目的を達成する本発明組換えプラスミドの構成は
、酵母由来の遺伝子と大腸菌プラスミド由来の遺伝子を
有するシャトルベクターであって、さらにＰｈｏ５プロ
モーター、ＣＰＢ−Ｉ−ｃＤＮＡおよびＧＡＰ−ＤＨタ
ーミネータ−からなるＣＰＢ−１発現遺伝子断片を有す
ることを特徴とするものである。

本発明において、遺伝子組換え技術により発現させる遺
伝子：　ＣＰＢ−Ｉ−ｃＤＮＡについては、本発明者ら
により先にクローニングされており、詳細は、特開昭６
４−２００９５号公報に記載されている。

このＣＰＢ−Ｉ−ｃＤＮＡは、アミノ酸３１９個からな
るペプチド（ＣＰＢ−１）をコードする遺伝子断片を含
む１５６６ｂｐの遺伝子断片である。

これにコードされるＣＰＢ−１構造遺伝子は、下記のア
ミノ酸配列をコードしていることが確認されている。

Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＡｓｐＰｈｅ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｇａｙ　　Ｐｈｅ　　八ｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ａｒ
ｇ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＴｈｒ　
　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｍｅｔ　
　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ＾
ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ、Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＳｅｒＡｒｇ　Ｓｅｒ　
Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｉ
ｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ八ｌへ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　
Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　八ｒｇ　　
Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　ＬｅｕＡｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　
Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙｓ　ＰｈｅＧｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　
　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　
　Ｐｒｏ　　ＳｅｒＡｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　１ｉｅ Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　５ｅｒ Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　　ｌｉｅ　Ａｓｐ Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ Ｇａｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ Ｐｈｅ　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ １１ｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　Ａｒｇ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ Ｓｅｒ　　Ｍｅｔ　　１ｉｅ Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｙ １１ｅ　　Ａｌａ　　５ｅｒ １１ｅ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｎ ５ｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｇｌｎ Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　５ｅｒ Ｔｙｒ　　Ｍａｔ　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　　Ａｓｐ Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　Ｐｒ。

Ｔｙｒ　Ａｌａ　　Ｍｅｔ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　ｌ１ｅ ｒｌｅ　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ ｌｙｓ　　にｌｙ　　Ａｓｐ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ Ａｓｐ　Ａｓｐ　　Ｖａｌ Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｍａｔ Ａｒｇ　Ａｓｐ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｎ Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ ｔｌｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ Ａｌａ　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ しｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　１ｉｅ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒ Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ 旧Ｓ　八Ｉａ Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ Ｌｅｕ　　Ｖａｌ Ａｓｐ　　Ａｌａ Ａｓｐ　　Ａｌａ しｙｓ　　Ｔｒｐ １１ｅ　　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　　ｖａｌ Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ ５ｅｒ　　Ｇｌｙ Ｖａｌ　　Ｌｙｓ Ａｌａ　　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ ｖａｌ　　Ｓｅｒ Ａｒｇ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ Ａｓｐ　　Ｔｙｒ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐｓｐ 従って、本発明におけるＣＰＢ−１発現プラスミドの構
築には、上記のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片が
使用される。ＣＰＢ−１をコードする遺伝子断片の具体
的な塩基配列としては、その−例として下記の塩基配列
からなるＤＮＡを含む遺伝子断片が挙げられる。

ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＧＴＴ　ＣＴＣＡＧＡ　ＧＧ
ＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡ（：ＴＴＣＣＣＴ　　
ＧＧＡ　　ＴＴＴ　　ＧＡＴ　　ＧＡＧ　　ＣＧＧ　　
ＧＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＣＡ　　ＧＡ八へＣＴ　ＣＴＴ
　ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＴ
ＴＧ　ＧＧＣＡＣＡＧＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＣＡ
ＴＣＣＴＧ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＡＣＡ　ＴＣＣ
ＣＧＡ　ＡＧＴ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＣＧＣＣＡ
Ｇ　ＧＡＡ　ＡＴＣＴＣＴ　ＧＣＡＧＣ’Ｔ　ＴＴＴ　
ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　ＧＧＣＡＧＧ　ＧＡ
Ｔ　ＣＴＴ　ＣＴＧＧＡＴ　　ＧＡＣＣＴＧ　　ＡＡＡ
　　ＴＣＡ　　ＧＡＡ　　ＣＴＡ　　ＡＣＴ　　ＣＧＡ
　＾＾＾　ＴＴＴＧＡＡ　　ＡＡＡ　　ＴＴＡ　　ＡＴ
Ｔ　　ＧＴＧ　　ＧＣＴ　　ＣＴＧ　　ＡＴＧ　　＾＾
八　ＣＣＣＴＣＴＣＧＧ　　ＣＴＴ　　ＴＡＴ　　ＧＡ
Ｔ　　ＧＣＴ　　ＴＡＴ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡ
Ａ　　ＣＡＴ　　ＧＣＣＴＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＡ　
　ＧＣＴ　　ＧＧＡ　　ＡＣＡ　　ＡＡＴ　　ＧＡＡ　
　ＡＡＡ　ＧＴＡ　　ＣＴＧＡ［：Ａ　ＧＡＡ　ＡＴＴ
　ＡＴＴ　ＧＣＴ　Ｔ［：Ａ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＣＴ
　ＧＡＡ　ＧＡＡＣＴＧ　　ＡＧＡ　　ＧＣＣＡＴＣＡ
ＡＡ　　ＣＡＡ　　ＧＴＴ　　ＴＡＴ　　ＧＡＡ　　Ｇ
ＡＡ　　ＧＡＡＴＡＴ　　ＧＧＣＴＣＡ　　ＡＧＣＣＴ
Ｇ　　ＧＡＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＣＧＴＧ　　ＧＴＧ　
　ＧＧＧＧＡＣＡＣＴ　　ＴＣＡ　ＧＧＧ　　ＴＡＣ’
　　ＴＡＣＣＡＧ　　ＣＧＧ　　ＡＴＧ　　ＴＴＧ　　
ＧＴＧＧＴＴ　　ＣＴＣＣＴＴ　　ＣＡＧ　　ＧＣＴ　
　ＡＡＣＡＧＡ　　ＧＡＣＣＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＣＴ
ＧＧＡ　　ＡＴＴ　　ＧＡＴ　　ＧＡＡ　　ＧＣＴ　　
ＣＡＡ　　ＧＴＴ　　ＧＡＡ　　ＣＡＡ　　ＧＡＴ　　
ＧＣＴＣＡＧ　　ＧＣＴ　　ＴＴＡ　　ＴＴＴ　　ＣＡ
Ｇ　　ＧＣＴ　　ＧＧＡ　　ＧＡＡ　　ＣＴＴ　　ＡＡ
Ａ　　ＴＧＧＧＧＧ　　ＡＣＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＡ　
　ＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＴＴＴ　　ＡＴＣＡＣＣＡＴＣ
ＴＴＴＧＧＡ　　ＡＣＡ　　ＣＧＡ　ＡＣＴ　　ＧＴＧ
　　ＴＣＴ　　ＣＡＴ　ＴＴＧ　　ＡＧＡ　　ＡＡＧ　
　ＧＴＧＴＴＴ　　ＧＡＣＡＡＧ　　ＴＡＣＡＴＧ　　
ＡＣＴ　　ＡＴＡ　　Ｔ［’Ａ　　ＧＧＡ　　ＴＴＴ　
　ＣＡＡ＾ＴＴ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ　　ＡＣＣＡＴＴ
　　ＧＡＣＣＧＣＧＡＧ　　ＡＣＴ　　Ｔ［：Ｔ　　Ｇ
ＧＣＡＡＴ　　ＴＴＡ　　ＧＡＧ　　ＣＡＡ　　ＣＴＡ
　　［：Ｔ（”　　ＣＴＴ　　ＧＣＴ　　ＧＴＴ　　Ｇ
ＴＧ　　ＡＡＡＴＣＴ　　ＡＴＴ　　ＣＧＡ　　ＡＧＴ
　　ＡＴＡ　　Ｃ［：Ｔ　　ＧＣＣＴＡＣＣＴＴ　　Ｇ
ＣＡ　　ＧＡＧＡＣＣ［”ＴＩ”　　ＴＡＴ　　ＴＡＴ
　　ＧＣＴ　　ＡＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＡ　　ＧＣＴ
　　ＧＧＧ　　ＡＣＡＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＣＡＴ　　
ＡＣＣＣＴ［’　ＡＴＣＡＧＡ　　ＧＴＣＡＴＧ　　Ｇ
ＴＴ　ＴＣＣＡＧＧ　　ＡＧＴ　　ＧＡＧ　　ＡＴＴ　
　ＧＡＴ　　ＣＴＧ　　ＴＴＴ　　ＡＡＣＡＴＣＡＧＧ
　　ＡＡＧＧＡＧ　ＴＴＴ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　　ＡＡＴ
　ＴＴＴ　　ＧＣＣＡＣＣＴＣＴ　ＣＴＴ　ＴＡＴＴＣ
ＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　　ＧＧＡ　　ＧＡＴ　ＡＣ
Ａ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＡＴＡＡＧ　　八ＡＡ　
　ＧＣＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ　　［：Ｔ（
：　　ＴＧＴ　　ＧＧＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＴＧＡＣＴ
ＡＡ これまでに報告されている酵母の発現系で用いられたプ
ロモーターとしては、ＡＤＨＩ（アルコールデヒドロゲ
ナーゼ）プロモーター［）１ｅｔｚｅｍａｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、　　Ｖｏｌ、２９３．　　ｐ７１７−７２２（
１９８１）　］、Ｐ　ｈ　ｏ　５　（抑制性酸性フォス
ファターゼ）プロモーター〔宮之原ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ。

Ｖｏｌ、８０．　ｐｉ−５（１９８３）　）　、ＰＧＫ
　１　　（７ｔスフｔグルコキナーゼ）プロモーター［
１１ｉｔｚｍａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２１
９．　ｐ６２０−６２５（１９８３））　、ＧＡ　ＰＤ
Ｈ（クリセロアルデハイドフォスフェートデヒドロゲナ
ーゼ）プロモーターＣＢｉｔｔｅｒら、Ｇｅｎｅ。

ＶｏｌＪ２．　ｐ２６４−２７４　（１９８３）　）等
が挙げられる。ここに挙げた酵母用プロモーター゛の中
では、特にＧＡＰ−ＤＨプロモーターが、プロモーター
活性が強く、その結果効率よく外来遺伝子を発現するこ
とが知られている。

本発明に係るＣＰＢ−１の発現においては、ＧＡＰ−Ｄ
Ｈプロモーターを用いた発現系は発現量の面ではかなり
よい結果が得られたものの、形質転換体の継代による発
現の安定性という一面において問題が残ることが確認さ
れた。

そのために、種々のプロモーターとの組み合せにより、
種々のＣＰＢ−Ｉ発現系を構築し、得られた形質転換体
によるＣＰ１３−１の発現量と継代による発現の安定性
の両面から検討を進めたところ、前記本発明プラスミド
を用いた発現系によりＣＰＢ−１を発現させた場合が非
常によい結果を示すことが確δ忍された。

すなわち、本発明に係る酵母発現系においては、Ｐｈｏ
５プロモーターおよびＧＡＰ−ＤＨターミネータ−を用
いることを特徴とし、酵母と大腸菌の遺伝子を有するシ
ャトルベクターが使用される。

特に、酵母菌由来遺伝子として、２μｏｒｉおよびａｒ
ｓｌの２つのｏｒｉｇｉｎ並びに選択マーカー遺伝子を
用いるのが好ましい。

この酵母用選択マーカー遺伝子としては、種々のアミノ
酸を産生ずる遺伝子、例えばロイシン産生遺伝子、ヒス
チジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子等が用い
られる。このようなアミノ酸産生選択マーカー遺伝子を
用いる場合には、形質転換を行う宿主酵母として、該ア
ミノ酸要求性のものを使用する。

一方、大腸菌由来遺伝子としては、大腸菌内でプラスミ
ドの自律増殖を可能にする。ｒｉｇｉｎおよび大腸菌内
で機能する選択マーカー遺伝子が用いられる。この大腸
菌用選択マーカーとしては、種々の薬剤耐性遺伝子、例
えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺
伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が使用される
。このようなｏｒｉｇｉｎと薬剤耐性遺伝子の双方を有
する大腸菌由来遺伝子断片として、例えば大腸菌プラス
ミドｐＢＲ３２２由来の遺伝子断片を使用することが可
能である。

このような外来遺伝子発現用シャトルベクタの一例とし
て、第２図に示すシャトルベクターｐＰＳ　１が挙げら
れる。このシャトルベクターは、Ｐｈ○５プロモーター
とＧＡＰターミネータ−の間に、外来遺伝子の組み込み
部位として、Ｘｈｏ　ＩおよびＢａｍＨＩ部位を有する
。

本発明のＣＰＢ−１発現プラスミドは、このようなシャ
トルベクターの外来遺伝子用形質発現調節部位にＣＰＢ
−１−ｃＤＮＡを組み込むことにより構築される。両遺
伝子の結合は、常法により行われるが、合成リンカ−等
を使用することにより、端の制限酵素認識部位（制限酵
素による切口）が異なる２つのＤＮＡ断片を結合させる
ことが可能となる。このような合成リンカ−は、市販の
ものを使用することもできるし、目的に応じてＤＮＡ合
成機により調製することもできる。

このようなＣＰＢ−１発現プラスミドを常法により宿主
となる酵母菌に導入することにより、本発明のＣＰＢ−
Ｉ発現形質転換酵母が得られる。

代表的な酵母の形質転換方法としては、酵母をプロトプ
ラスト化してプラスミドを導入する方法［１１ｉｎｎｅ
ｎら、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　Ｖｏｌ。

７５、　ｐ１９２９（１９７８）　〕、アルカリ金属に
よる酵母の形質転換方法〔木材ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、　Ｖｏｌ。

１５３、　ｐ１６３（１９８３）　］等が挙げられる。

宿主酵母の代表例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｌ１２２　Ｃａ　１ｅｕ２
　ｈｉｓ４　Ｃａｎ１〕（微工研条寄第３１２号）等が
挙げられる。宿主酵母は、発現用プラスミドに用いた酵
母選択マーカー遺伝子に適したものが使用される。また
、通常の宿主酵母では、Ｐｈｏ５プロモーターはリン酸
の存在下においてプロモーター活性が抑制されることか
ら、リン酸存在下においても、Ｐｈｏ５プロモーター活
性を抑制しないように改良された酵母宿主細胞を使用す
ることも可能である。そのような酵母としては、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｌ１
２２ｐｈｏ８０　（微工研条寄第５０９号）が挙げられ
る。

このような改良株を用いれば、リン酸の存在下にふいて
もＰｈｏ５プロモーターは機能が抑制されず、ＣＰＢ−
Ｉを発現させることが可能となる。

通常の酵母宿主、すなわちリン酸存在下においてはＰｈ
ｏ５プロモーターの機能を抑制する酵母を用いた形質転
換体では、最初にリン酸を含む培地で酵母を対数増殖期
まで増殖した後、これを遠心により集菌して、次にリン
酸を含まない培地中で培養することにより、所望の菌体
数まで増殖した酵母にＰｈｏ５プロモーターを機能させ
、ＣＰＢ−Ｉを一挙に発現させることができる。

また、培地としては、酵母の選択マーカーが活かされる
培地を使用する。例えば、上記のＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｔｆ２２　［ａ　Ｉ
ｅｕ２　ｈｉｓ４Ｃａｎｌ］を用いた場合には、該宿主
酵母菌がロイシン・ヒスチジン要求株であり、そのいず
れかのアミノ酸が組換えプラスミドにより補充される場
合には、もう片方の欠損するアミノ酸を含む合成培地、
例えばバルクホルダー最小培地〔東証ら、ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１１３．　ｐ７２７−７３８
　、Ｐ、Ｒ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ。

Ａｍ、　Ｊ、　Ｓｏｔ、、　３０．　ｐ２０６（１９４
３）　〕が使用される。

単位培地当りの菌体数を増加させて、ＣＰＢ−■の発現
量を向上させるためには、上記のような選択性合成培地
０代わりに、半合成培地と呼ばれる酵母エキスを含む栄
養分の高い培地を使用することができる。通常、このよ
うな非選択性の培地を用いると菌体数は増加するものの
、プラスミドを脱落させた酵母菌も増殖し、結果的に発
現量は低下することが多いが、本発明の形質転換体では
、そのような現象は確認されず、非選択性の培地におい
ても選択性培地の場合と同等の発現量を示す。

大量培養の際には、段階的な培養により酵母菌数を増殖
させるが、まず数リットルの規模で選択性の培地を用い
て培養し、次にこれを栄養豊富な半合成培地により数十
〜数百リットルの規模で培養することができる。

このようなＣＰＢ−Ｉ−の製造方法によれば、酵母菌体
破砕液中に含まれる最も多い蛋白質としてＣＰＢ−Ｉを
発現させることが出来、後の精製においても極めて効率
的に目的のＣＰＦ３−１を精製することが可能となる。

ＣＰＢ−Ｉの精製方法としては、通常の精製手段を応用
することにより、きわめて効率よくＣＰＢ−Ｉを精製す
ることができる。

このようにして得られた酵母由来ＣＰＢ−Ｉのアミノ末
端の解析を行ったところ、胎盤から精製されたＣＰＢ−
Ｉと同様、アミノ末端がアセチル化を受けていることが
確認された。このことがら、本発明方法により製造され
たＣＰＢ−１の生理活性が天然のものと比較して何等劣
るものではないことが推測される。

本発明は、このような性状的に優れたＣＰＢ■を、形質
転換酵母により極めて大量に発現させることを可能にす
るものであり、特に工業的レベルでのＣＰＢ−１の製造
において、きわめて優れた技術を提供するものである。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例 （１）ＣＰＢ−Ｉ遺伝子の調製 ヒト胎ｑ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーより、ファージ
を用いたクローニングを行い、抗ＣＰＢ−１７ウスモノ
クローナル抗体を用いて発現産物のスクリニングを行っ
た。その結果、１５６６ｂｐにわたるほぼ完全長のｃＤ
ＮＡを得ることができ、この遺伝子断片には、アミノ酸
３１９個からなるＣＰＢ−１をコードする遺伝子を含む
ことが確認された（第１図参照）。ＣＰＢ−ＩのｃＤＮ
Ａのクローニングに関しては、特開昭６４−２００９５
号公報にさらに詳細に記載されている。

（２）酵母用シャトルベクターｐｐｓ　１のｍ製外来遺
伝子発現用のプロモーターとして酸性フォスファターゼ
（Ｐｂｏ２）のプロモーターを有する酵母−大腸菌シャ
トルベクターｐＡＭ８２　（特開昭５９−３６６９９号
）を、制限酵素Ｘｈｏ　ＩおよびＰｖｕ　ＩＩで処理し
、これを２％アガロースゲル電気泳動に処することによ
り、Ｐｈｏ５プロモーター他を含む約９、８ｋｂｐの遺
伝子断片を得た。

一方、ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の旧ｎｄＩ［Ｉ断片〔Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　　Ｖｏｌ、　２５５．　　
Ｎ（Ｌ　６．　　ｐ２５９６−２６０５（１９８０）］
をｐＢＲ３２２の旧ｎｄＩＩｒ部位に組み込んだプラス
ミドｐＢＲ−ＧＡＰを、制限酵素５ａｌｌおよびＢｃｏ
ＲＶで処理し、ＧＡＰターミネータ−を含む遺伝子断片
（Ｓａｌ　Ｉ　−ＢｃｏＲＶ　７ラグメント）を得た。

この遺伝子断片をクローニングベクターｐＵｃ１９のＳ
ａｌ　Ｉ　−３＋ｎａ　Ｉ部位に組み込み、ＧＡＰター
ミネータ−を有するプラスミドｐＵＣ−ＧＡＰ　ｔ　ｅ
　ｒとした。このプラスミドを制限酵素５ａｌＩで処理
して開裂させた後、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウフラ
グメント）により切口をフィルインし、これにＢａｍＨ
Ｉリンカ−を導入して再度環状化した。次にこのプラス
ミドを制限酵素ＰｓｔＩで処理し、上記と同様にＤＮＡ
ボリメラセで反応させた後、Ｘｈｏｌ　’Ｊンカーを導
入した。これによりＧＡＰターミネータ−のすぐ上流ニ
Ｂａｍ８１　部位とＸｈｏ　１部位が導入されたプラス
ミドｐＵｃ−ＧＡＰ　ｔ　ｅ　ｒ　（ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏｌ）を得た。

このプラスミドを制限酵素Ｒｓａ　Ｉで処理し、アガロ
ース電気泳動によりＧＡＰターミネータ−を含む約１．
４ｋｂｐの遺伝子断片を得た。これをさらに制限酵素Ｘ
ｈｏ　Ｉで処理した後、上記と同様の模作を行い、ＧΔ
Ｐターミネータ−を含むＲｓａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉフラ
グメントを得た。

この遺伝子と上記で調製したｐΔＭ８２由来のＸｈｏｌ
−ＰｖｕＩＩフラグメントを、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合させることにより、酵母−大腸菌シャトル
ベクターｐＰＳ　ｌを得た。このシャトルベクターは、
外来遺伝子用の発現調節遺伝子としてＰｈｏ５プロモー
ターおよびＧＡＰターミネータ−を有し、さらに酵母−
大腸菌シャトルベクターとして機能するために、酵母由
来遺伝子としてａｒｓｌ、２μｏｒｉおよびロイシン産
生遺伝子（Ｌａｕ２＞を、大腸菌由来の遺伝子としてア
ンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２のｏｒｉｇｉ
ｎを有する外来遺伝子高発現用ベクターである（第２図
参照）。

（３）　ＣＰ　Ｂ　−Ｉ発現プラスミドの構築上記（υ
で得られたＣＰＢ−１−ｃＤＮＡを制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ
およびＳａｃ　Ｉで処理し、ＣＰＢ−１の全構造遺伝子
を含むＮｃｏ　Ｉ　−３ａｃ　Ｉ断片を得たく第１図参
照）。

このＣＰＢ−Ｉ−ｃＤＮＡ　　Ｎｃｏｌ−３ａｃＩ断片
を上記シャトルベクターｐＰｓ１のＸｈｏ　Ｉ　−Ｂａ
ｍｔｌ　Ｉ部位に組み込むために、第３図に示した２種
の異なる合成リンカ−を下記の通り作製した。ＤＮＡ合
成機（アブライドバイオシステムズ３８１Ａ）を用いて
下記の４種のＤＮＡを合成した。

ＤＮＡＩ：ＴＣＧ八ＧへＡＧＡＧＣＡＡＧＣＡＡＡＴＴ
ＣＧＡＧＡＴＴＡＣＣＤ　　Ｎ　　Ａ　　２　　：　　
ＣＡＴＣＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴ八ＡＧＣＴＣＴＡ八ＴＧ
ＧＧへＡＣＤ　Ｎ　Ａへ３　：　ＡＡＧ［ｌ’ＴＴＣＴ
ＣＧＡＧＤ　Ｎ　Ａ　　４　　：　　ＴＣＧＡＴＴＣＧ
八ＡＧＡＧＣＴへＣＴ八Ｇ上記ＤＮＡへとＤＮＡ２を混
合しアニーリングすることにより、第３図にリンカ−Ａ
として示す合成リンカ−を得た。このリンカ−は、制限
酵素Ｘｈｏ　Ｉ　Ｌ！：Ｎｃａ　Ｉで切断された切口の
異なる２つのＤＮＡ断片を結合させるものであり、リン
カ−全体としての塩基配列は、Ｐｈｏ５プロモーターの
機能低下を防ぐべく、本来Ｐｈｏ５プロモーターのリー
ディング配列のＤＮＡ配列と極めて近い配列になるよう
にデザインされている。

さらにＤＮＡ３とＤＮＡ４を混合してアニーリングする
ことにより、第３図にリンカ−Ｂとして示す合成リンカ
−を得た。この合成リンカ−は、制限酵素Ｓａｃ　Ｉと
ＢａｍＨＩで切断された２つのＤＮＡ断片を結合させる
ものであり、その途中のＤＮＡ配列には制限酵素１１ｉ
ｎｄｌおよびＸｈｏ　Ｉの制限酵素認識配列を有する。

ＣＰＢ−１−ｃＤＮＡ　　Ｎｃｏｌ−３ａｃＩ遺伝子断
片、合成リンカ−Δ、合成リンカ−Ｂおよびシャトルベ
クターｐｐｓ　１を、制限酵素Ｘｈｏ　ＩおヨヒＢａｍ
１ｌ　Ｉで処理することにより得られた４種の遺伝子断
片を混合し、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼにて反応させた。

この反応液を、フェノール処理、エタノール沈澱させた
のち、これを用いて大腸菌）１８２０１コンピテント細
胞の形質転換を行った。得られた形質転換クローンのプ
ラスミドＤＮＡを回収し、適当な制限酵素で処理して、
アガロースゲル電気泳動からの切断パターンを分析する
ことにより、シャトルベクターｐｕｓ　１のＸｈｏ　Ｉ
　、ＢａｍＨＩ部位にＣＰＢ−Ｉ−ｃＤＮＡ　　Ｎｃｏ
ｌ−５ａｃｌ断片が組み込まれた所望のＣＰＢ−Ｉ発現
プラスミドｐＡＰｃＰＢ−Ｉ（第４図参照）を持つ大腸
菌クローンを得た。このクローンから常法に従いプラス
ミドｐＡＰＣＰＢ−１を調製した。

（４）　ＣＰ　Ｂ　−Ｉを発現する形質転換酵母の調製
宿主酵母としてサツカロマイセス・セレビシェＡｔ１２
２　Ｐｈｏ８０　（微工研条寄第５０８号）を用い、こ
れをＹＰＤ培地（２％ポリペプトン、１％イーストエキ
ス、２％グルコース）１００ｍｌ！に接種し、３０℃で
５−７×１０６まで培養した後、遠心して集菌し洗浄し
た後、１−のリチウム溶液に廿濁した。３０℃で１時間
振とぅ後、その１０分の１量（１００，ｕＡ）に約２　
ｐｇＯ組換えＤＮＡ　（プラスミドｐＡＰＣＰＢ−Ｉ）
を加えて３０℃で３０分間振とうした。これに０．７ｍ
ｌ！のポリエチレングリコール溶液を加え、３０℃で９
０分間静置した。

４２℃で５分間熱処理後、滅菌水で２回洗浄した。

０．１−の最小培地（０，７％イーストニトロゲンベー
スアミノ酸、２％グルコース、２０＃ｇ／ｍ！！ヒスチ
ジン、２％寒天）に細胞を懸濁させ同最小培地プレート
に塗布した。３０℃で培養してロイシン非要求性のコロ
ニーを得た。このコロニーヲ２０１量ｇ／ｄヒスチジン
を含むバルクホルダーミニマム培地にて培養し、形質転
換酵母サツカロマイセス・セレビシェｐＡＰｃＰＢ−Ｉ
を得た。

（５）酵母によるＣＰＢ−１の発現 上記形質転換酵母を３０℃で３日間振とう培養し、遠心
（３５００ｒｐｍ、５分間）により酵母菌体を集めた後
、１／１０培養液量の溶菌液（２５ｍＭＨＯＴ＾−２５
ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４））に懸濁し、グ
ラスビーズを加えミキシングすることにより酵母菌に物
理的衝撃を加えて酵母菌を破砕した。これを遠心して、
グラスビーズおよび酵母破砕断片を除去し、遠心土浦を
得た。

この上清について、抗ＣＰＢ−Ｉモノクローナル抗体を
用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡによりＣＰＢ−Ｉの活性を測定し
た。このＥＬＩＳＡは、下記の操作からなる。

まず、ポリスチレン製９６穴ＥＬ　Ｉ　ＳＡ用マイクロ
プレートに、−次抗体として抗ＣＰＢ−Ｉマウスモノク
ローナル抗体をコーティング用緩衝液［０，０５Ｍ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）ＩテＩＯρｇ／−に希
釈し、各ウェルに１００ｐ６ずつ注入する。２５℃で２
時間静置し、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＩＩｌ
に対してＴｗｅｅｎ２０を０．５−溶解する）で洗浄し
た後、各ウェルにＣＰＢ−Ｉ標準溶液および検体を１０
０ｐＩ２ずつ注入し、２５℃−夜反応させる。

その後ｐ　３３５−Ｔｗｅｅｎにて洗浄した後、西洋ワ
サビ・パーオキシダーゼ標識Ｆａｂ’抗ＣＰＢＩ抗体を
Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで希釈して各ウェルに１００μ
／ずつ注入し、２５℃２時間以上反応させる。３回洗浄
した後、ＯＰＤ溶液を酵素基質溶液として１００ｐｌず
つ添加する。暗所にて２５℃３０分間反応サセた後す４
．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を５Ｄｐｉずつ添加し、ミキサーで
混合して反応を停止させる。これを４９２ｎｍの吸光度
を測定し、ＣＰＢ−１標準品の吸光度から検量線を求め
、各検体のＣＰＢ−１量を定量する。

その結果、１１の酵母培養液から約１５０ｍｇのＣＰＢ
−Ｉが得られていることが確言忍された。また、この結
果と酵母破砕液中の撚回溶化蛋白質を測定した結果とか
ら、本発明においては撚回溶化蛋白質のうち約４０％も
の割合でＣＰＢ−１を得ることが可能であることが判明
した。

次に、この酵母破砕液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により解析した。すなわち、１０％ポリアク
リルアミドゲルにより検体を電気泳動し、これをコマ−
ジ−ブリリアントブルー（ＣＢＢ）にて染色した。その
結果、他の酵母由来の蛋白質のバンドと比較して、きわ
めて大量であることを示すＣＰＢ−１（分子量的３４．
０００）のバンドが確認された。その結果の模式図を第
５図に示す。

（６）工業的規模の大量培養によるＣＰＢ−ｒの生産前
記（４）で得られた形質転換酵母を、最小培地にて３０
℃、２１のスケールで培養した。次いでこれを３０１の
最小培地に接種し、３０℃７１時間培養した。これを１
７０１の半合成培地（培地１β中にショ糖４０ｇ１酵母
工キス５ｇ、硫酸アンモニウＡ５ｇ、硫酸マグネシウム
・７水和物０．５ｇ、消泡剤としてポリオキシエチレン
ポリオキシプロピレンエーテル０．０２５−）にて　３
０℃、２４時間培養した。最終培養後の酵母菌体に存在
するＣＰＢ−１の量を前記ＥＬ　Ｉ　ＳＡにて測定した
ところ、選択能力のない半合成培地においても、選択合
成培地（最小培地）での発現量と同等のＣＰＢ−Ｉの存
在を確認した。

このことは、本形質転換株が継代培養においてもきわめ
て発現の安定性がよいことを示している。

さらに、発現量についても前記（４）の小スケールでの
発現実験において得られた発現量と同等のしベルでＣＰ
Ｂ−Ｉの発現が維持されていることが確Ｊ忍された。

（７）　ＣＰ　Ｂ　−１の大量精製 上記で大量培養した培養菌液より０．　ＩＩＭのメンブ
ランフィルタ−を用いて紐換え酵母菌を集菌し、フレン
チプレス型細胞破砕機により物理的刺激を加えて酵母菌
態を破砕した。その後、濾過を行い、得られた粗抽出液
を限外濾過器により濃縮した。

これに酢酸を加えて等電点沈澱（ｐＨ４，５）を行った
後、生成した沈澱物を遠心により除去し、上清をアンモ
ニアによりｐＨを７．０に調整し、次いでＱＡＥ−トヨ
バール５５０Ｃ（トーソー社製）を用いる陰イオン交換
クロマトグラフィーに供した。

すなわち、７０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ！Ｊ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したカラムに粗抽出
液をアプライし、同緩衝液で洗浄後、３００ｍＭ塩化す
）ＩＪウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
で溶出した。得られたＣＰＢ−１を含む両分を限外濾過
器により濃縮した後、１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１
０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７、４）で平衡化したＴＳ
Ｋ６３０００カラム（トーソー社製）によりゲル濾過を
行った。その後ＣＰＢ−Ｉを含む両分を、再度７０ｍＭ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７
，４）テ平衡化したＱＡＥ　）　ｍｌバー４５５０Ｃに
アプライし、洗浄後、７０ｍＭより３００ｍＭまでの塩
化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出し、精製ＣＰＢ−Ｉ
を得た。

（８）酵母により産生されたＣＰＢ−Ｉの物性（Ａ）　
Ｎ末端アミノ酸配列分析： 酵母由来ＣＰＢ−Ｉ　　５．６ｍｇを、６Ｍグアニジン
を含む０．２Ｍ）！Ｉス塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）に溶
解し、ジチオスレイトール５　ｍｇを加え、室温で３０
分間反応させた後、ヨード酢酸５０ｍｇを加え室温で３
０分間反応させてＳ−カルボキシメチル−ＣＰＢ−Ｉを
得た。

これを２Ｍ尿素を含む２０ｍＭ）Ｕス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）に溶解し、トリプシン１１００ｐを加えて３７
℃、２４時間消化させた後、逆相クロマトグラフィーに
よりペプチドの分離を行った。

クロマトカラムとしてコスモシル５Ｃ１゜３００オング
ストローム（直径１０ｍｍｘ長さ２５０ｍｍ、牛丼化学
社製）を用い、溶離液として０．１％トリフルオロ酢酸
溶液及び０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセト
ニトリル溶液を用いて直線濃度勾配により流速１−７分
で溶出した。

検出は２１４ｎｍの紫外吸収により行った。得られた各
ペプチドについてピコダグアミノ酸分析装置（ミリボア
リミテッド社製）によりアミノ酸組成分析を行い、Ｎ末
端ペプチドを含む画分を同定した。このＮ末端ペプチド
は、アルギニンとグルタミン酸、アラニン、バリン、ロ
イシンの５個のアミノ酸から構成されていることを確認
した。

次いでアミノ酸配列解析を行った結果、Ｎ末端アミノ基
はブロックされていた。更に、ＦＡＢ−ＭＡＳＳ分析装
置（日本電子社製ＪＭＳ−０３００）により分析した結
果、分子量は６２７であった。

以上の結果からＮ末端はアセチル化されており、以下の
配列を有すると判断した。

Ａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−八ｒ
ｇ（Ｂ）胎盤抽出ＣＰＢ−１との抗血液凝固活性の北本
発明酵母由来ＣＰＢ−１とヒト胎盤由来ＣＰＢ−Ｉの抗
血液凝固活性を比較した。すなわち、０．５ｍｇ／Ｉｎ
！！のＰＴ試薬（リオプラスチ：／、持田製薬社製）１
００μ！および各種濃度の試料１００μｌを混和し、３
分後に生理食塩水で２倍に希釈した標準液２００μｌを
添加し血液凝固時間を測定した。

酵母由来ＣＰＢ−Ｉとヒト胎盤由来ＣＰＢ−Ｉの抗血液
凝固作用を比較した表１から判るように、本発明酵母由
来ＣＰＢ−Ｉとヒト胎盤由来ＣＰＢ−１とは、はぼ同じ
血液凝固時間（ＰＴ）の延長効果を示した。

以下余白 表　　１

【図面の簡単な説明】

第１図は、先に出願人よりクローニングされたＣＰＢ−
Ｉ　−ｃＤＮＡの全塩基配列を示す図である。翻訳開始
コドンＡＴＧのＡを１番目として番号を付した。 第２図は、本発明に用いたシャトルベクタｐｐｓ　１の
構造を示す図である。 第３図は、プラスミドｐＡＰＣＰＢ−１の構築の際に使
用した合成リンカ−の構造を示す図である。 第４図は、本発明のＣＰＢ−Ｉ発現プラスミドｐＡＰＣ
ＰＢ−１の構造を示す図である。 第５図は、本発明の形質転換体によるＣＰＢＩの発現を
示す、酵母破砕液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の
パターンを示す模式図である。 レーンｌは分子量マーカーで、上から２００Ｋ、９７に
、　６８に、　４３に、　２９に、　１８．４に、　１
４．３にダルトンを示す。レーン２〜４は、本発明のＣ
ＰＢ−Ｉ産生形質転換体破砕液の泳動パターンである。 レーン５は、本発明のプラスミドを有さない宿主酵母菌
の破砕液の泳動パターンである（陰性対照）。 以上 第 ２ 図 第 図 第 図 リンカ 　Ａ リンカ Ｂ ｈｏｌ ａｃｒ ）１ｉｎｄＩＩＩ ａｍＨＩ 手続補正書（自発） ６゜ 補正の対象 明細書の 「発明の詳細な説明」 の欄 平成２年１２月４日 ７゜ 補正の内容 （１） 明細書中、 第７頁、第２行 １゜ 事件の表示 ＴｈｙＪ とあるを ＴｈｒＪ と訂正する。 平成２年特許願第１５５５９号 ２゜ 発明の名称 ＣＰＢ−Ｉの製造方法並びにこれに用いる組換えプラス
ミドおよび形質転換酵母 ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）酵母由来の遺伝子と大腸菌プラスミド由来の遺伝
   子を有するシャトルベクターであって、さらにＰｈｏ５
   プロモーター、ＣＰＢ−Ｉ−ｃＤＮＡおよびＧＡＰ−Ｄ
   ＨターミネーターからなるＣＰＢ−Ｉ発現遺伝子断片を
   有することを特徴とする組換えプラスミド。（２）酵母
   由来の遺伝子が、２μｏｒｉ、ａｒｓ１および形質転換
   酵母用選択マーカー遺伝子を有するものである請求項（
   １）記載の組換えプラスミド。 （３）大腸菌由来の遺伝子が、プラスミドｐＢＲ３２２
   由来のｏｒｉｇｉｎおよび薬剤耐性遺伝子を有するもの
   である請求項（１）記載の組換えプラスミド。 （４）請求項（１）記載の組換えプラスミドを酵母に導
   入することにより得られる形質転換酵母。 （５）宿主酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
   ｅｖｉｓｉａｅである請求項（４）記載の形質転換酵母
   。 （６）請求項（４）または（５）記載の形質転換酵母を
   培養し、該培養物よりＣＰＢ−Ｉを採取することを特徴
   とするＣＰＢ−Ｉの製造方法。