NO329789B1 - Anvendelse av DSPA alfa 1 for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker - Google Patents
Anvendelse av DSPA alfa 1 for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker Download PDFInfo
- Publication number
- NO329789B1 NO329789B1 NO20042262A NO20042262A NO329789B1 NO 329789 B1 NO329789 B1 NO 329789B1 NO 20042262 A NO20042262 A NO 20042262A NO 20042262 A NO20042262 A NO 20042262A NO 329789 B1 NO329789 B1 NO 329789B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dspa
- stroke
- treatment
- fibrin
- mice
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 60
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 title claims description 57
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)([O-])=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M 0.000 title claims 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 241000288900 Desmodus rotundus Species 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 124
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 124
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 121
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 45
- VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N alpha-Kainic acid Natural products CC(=C)C1CNC(C(O)=O)C1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N kainic acid Chemical compound CC(=C)[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)[C@H]1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N 0.000 description 38
- 229950006874 kainic acid Drugs 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 37
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 34
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 33
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 33
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 32
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 32
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 31
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 22
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 20
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 20
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 17
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 17
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 14
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 13
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 12
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 12
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 12
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 12
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 12
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 12
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 12
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 12
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 12
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 12
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 12
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 11
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 10
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 230000003492 excitotoxic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 9
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 8
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 8
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 8
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 231100000063 excitotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 231100000501 nonneurotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 6
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 5
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 5
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 4
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 4
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 4
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- VOROEQBFPPIACJ-UHFFFAOYSA-N 5-Phosphononorvaline Chemical compound OC(=O)C(N)CCCP(O)(O)=O VOROEQBFPPIACJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 3
- RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-M CDP-choline(1-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-M 0.000 description 3
- 108091005462 Cation channels Proteins 0.000 description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 229960001284 citicoline Drugs 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 102000047823 human PLAT Human genes 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 108010087750 lysyl-plasminogen Proteins 0.000 description 3
- 230000006724 microglial activation Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 3
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 3
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950010883 phencyclidine Drugs 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N (7-aminophenothiazin-3-ylidene)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C=C2SC3=CC(N)=CC=C3N=C21 PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000288921 Desmodus Species 0.000 description 2
- 239000012848 Dextrorphan Substances 0.000 description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102100039731 Interferon-induced transmembrane protein 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710087402 Interferon-induced transmembrane protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010076830 Thionins Proteins 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- -1 amino acids aspartate Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- JAQUASYNZVUNQP-PVAVHDDUSA-N dextrorphan Chemical compound C1C2=CC=C(O)C=C2[C@@]23CCN(C)[C@@H]1[C@H]2CCCC3 JAQUASYNZVUNQP-PVAVHDDUSA-N 0.000 description 2
- 229950006878 dextrorphan Drugs 0.000 description 2
- QLTXKCWMEZIHBJ-PJGJYSAQSA-N dizocilpine maleate Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C12=CC=CC=C2[C@]2(C)C3=CC=CC=C3C[C@H]1N2 QLTXKCWMEZIHBJ-PJGJYSAQSA-N 0.000 description 2
- 239000000928 excitatory amino acid agonist Substances 0.000 description 2
- 231100000318 excitotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 1
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSPNNACSFGGPJW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-phosphonoheptanoic acid Chemical compound CCC(P(O)(O)=O)CCC(N)C(O)=O HSPNNACSFGGPJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 7-N,N-Dimethylamino-1,2,3,4,5-pentathiocyclooctane Chemical compound CN(C)C1CSSSSSC1 KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ICZWAZVKLACMKR-CIUDSAMLSA-N Asp-His-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CN=CN1 ICZWAZVKLACMKR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003347 Atropine Natural products 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000271064 Calloselasma rhodostoma Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- ASNFTDCKZKHJSW-UHFFFAOYSA-N DL-Quisqualic acid Natural products OC(=O)C(N)CN1OC(=O)NC1=O ASNFTDCKZKHJSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038199 Desmoplakin Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014498 Embolic stroke Diseases 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 1
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N Hyosciamin-hydrochlorid Natural products CN1C(C2)CCC1CC2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229940095474 NMDA agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000010826 Nissl staining Methods 0.000 description 1
- 102220611095 Putative uncharacterized protein PIK3CD-AS1_R15E_mutation Human genes 0.000 description 1
- ASNFTDCKZKHJSW-REOHCLBHSA-N Quisqualic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CN1OC(=O)NC1=O ASNFTDCKZKHJSW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 241001635169 Tachia Species 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000037849 arterial hypertension Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N atropine Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)N2C)C(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N 0.000 description 1
- 229960000396 atropine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000005110 dorsal hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 229940124645 emergency medicine Drugs 0.000 description 1
- 239000004060 excitotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 239000003825 glutamate receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 108010017446 glycyl-prolyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000003706 n methyl dextro aspartic acid receptor stimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 230000001067 neuroprotector Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000006959 non-competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 108010077752 pallidipin Proteins 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 108010003641 statine renin inhibitory peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 108010000201 triabin Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
- A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
- A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21068—Tissue plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av DSPA alfa 1 for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker.
Ulike kliniske tilstander inngår i uttrykket "slag", og de korrelerer når det gjelder deres kliniske symptomer. Ifølge de respektive patogenesene er en første differensiering mellom disse kliniske tilstandene i såkalte iskemiske og blødende traumer mulig.
Iskemiske traumer (iskemi) erkarakterisert veden reduksjon i eller et avbrudd av blodsirkulasjonen i hjernen forårsaket av en mangel på arteriell blodtilførsel. Ofte er dette forårsaket av trombose i et arteriosklerotisk forsnevret blodkar eller av arterioarterielle embolismer og hjerterelaterte embolismer.
Blødningstraumer er blant annet basert på perforering av arterier som forsyner hjernen og som er skadet på grunn av arteriell hypertoni. Kun omtrent 20 % av alle cerebrale traumer er likevel forårsaket av blødningstraumer. Dermed er slag som skyldes trombose langt mer relevant.
Sammenlignet med andre vevsiskemier forekommer iskemi i de nevronale vevene ofte sammen med nekrose i de rammede cellene. Den høyere forekomsten av nekrose i nevronalt vev kan bli forklart med den nye forståelsen av fenomenet "eksitotoksisitet" som er en kompleks kaskade som omfatter et flertall av reaksjonstrinn. Kaskaden blir initiert av iskemiske nevroner som er rammet av oksygenmangel og som dermed straks mister ATP og depolariserer. Dette fører til en økt postsynaptisk frigjøring av nevrot-ransmitteren glutamat som aktiverer membranbundne glutamatreseptorer som regulerer kationkanaler. På grunn av den økte glutamatfrigj øringen blir glutamatreseptorer overaktiverte. Glutamatreseptorer regulerer spenningsavhengige kationkanaler som blir åpnet når glutamat bindes til reseptoren. Dette fører til en influks i cellen av Na<+>og Ca<2+>noe som massivt forstyrrer den Ca -avhengige cellulære metabolismen. Spesielt kan aktiveringen av de Ca<2+->avhengige katabole enzymene være grunnen til den etterfølgende celledøden (Lee, Jin-Mo et al., " The changing landscape of ischaemic brain injury mechanisms", Dennis W. Zohl " Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system").
Selv om mekanismen for glutamatmediert nevrotoksisitet ennå ikke helt ut er klarlagt er det enighet om at den bidrar sterkt til den nevronale celledøden som følger av cerebral iskemi (Jin-Mo Lee, et al.).
Ved siden av å beskytte vitale funksjoner og stabilisere fysiologiske parametere har gjenåpningen av det lukkede blodkaret prioritet i behandlingen av akutt cerebral iskemi. Gjenåpningen kan bli utført på ulike måter. Den rene mekaniske åpningen, som for eksempel PTCA etter hjerteinfarkt, har så langt ikke ført til tilfredstillende resultater. Bare med en vellykket fibrinolyse kan en akseptabel forbedring av den fysiske tilstanden hos pasienter bli oppnådd. Dette kan bli oppnådd med en lokal applikasjon ved å benytte et kateter (PROCAT, en studie av prourokinase). På tross av de første positive resultatene har denne fremgangsmåten likevel ennå ikke blitt offisielt godkjent som en farmasøytisk behandling.
Den naturlig forekommende fibrinolysen er basert på den proteolytiske aktiviteten til serinproteasen plasmin som har sitt utspring i sin inaktive forløper ved katalyse (aktivering). Den naturlige aktiveringen av plasminogen blir katalysert av plasminogenaktivatorene u-PA (urokinase-type plasminogenaktivator) og t-PA (vevsplasmino-genaktivator) som naturlig forekommer i kroppen. I motsetning til u-PA danner t-PA et såkalt aktivatorkompleks sammen med fibrin og plasminogen. Dermed er den katalytiske aktiviteten til t-PA fibrinavhengig og blir økt omtrent 550 ganger i dens nærvær. Ved siden av fibrin kan også fibrinogen stimulere t-PA-mediert katalyse av plasminogen til plasmin, selv om det skjer i mindre grad. I nærværet av fibrinogen blir t-PA-aktiviteten bare økt 25 ganger. Også kløyvingsproduktene av fibrin (fibrindegraderingsprodukter (FDP)) stimulerer t-PA.
Tidlige forsøk på trombolytisk behandling av akutt slag går tilbake til 1950-årene. Første omfattende kliniske utprøvinger med streptokinase, som er et fibrinolytisk middel fra betahemolyserende streptokokker, ble først satt i gang i 1995. Sammen med plasminogen danner streptokinase et kompleks som katalyserer andre plasminogen-molekyler til plasmin.
Behandlingen med streptokinase har alvorlige ulemper siden den er en bakteriell protease og kan derfor utløse allergiske reaksjoner i kroppen. På grunn av en tidligere streptokokkinfeksjon med påfølgende produksjon av antistoffer kan pasienten utvise en såkalt streptokinaseresistens, noe som gjør behandlingen vanskeligere. Ved siden av dette tydet kliniske studier i Europa (Multicenter Acute Stroke Trial of Europe (MAST-E), Multicenter Acute Stroke of Italy (MAST-I)) og Australia (Australian Streptokinase Trial (AST)) på en økt dødelighetsrisiko og en høyere risiko for intracerebral blødning (intracerebral blødning, ICH) etter at pasienter var blitt behandlet med streptokinase. Disse undersøkelsene måtte tidlig avsluttes.
Alternativt kan urokinase, som også er et klassisk fibrinolytisk middel, bli benyttet. I motsetning til streptokinase utviser den ikke antigene karakteristika siden den er et enzym som forekommer naturlig i ulike kroppsvev. Den er en aktivator av plasminogen og uavhengig av kofaktor. Urokinase blir dannet i nyrecellekulturer.
Omfattende erfaring med terapeutisk trombolyse er tilgjengelig for vevs-type plasminogenaktivator, den såkalte rt-PA (se EP 0093619, US 4,766,075), som blir produsert i rekombinante hamsterceller. 1 1990-årene ble flere kliniske undersøkelser utført i hele verden ved å benytte t-PA, med akutt hjerteinfarkt som hovedindikasjon, noe som førte til delvis uforståtte og motstridende resultater. I den såkalte European Acute Stroke Trial (ECASS) ble pasienter behandlet intravenøst med rt-PA innenfor en tids-ramme på 6 timer etter at de første symptomene på et slag var registrert. Etter 90 dager ble dødeligheten i tillegg til Barthel-indeksen undersøkt som en indeks på den tapte funksjonsevnen eller den uavhengige levedyktigheten til pasienter. Ingen signifikant forbedring i levedyktigheten ble rapportert men en økning i dødelighet, selv om denne ikke var signifikant. Dermed kan det bli konkludert med at en trombolytisk behandling av pasienter med rt-PA, som er individuelt valgt ut på bakgrunn av deres respektive tilstands-historie rett etter starten på slaget, muligens kan være fordelaktig. En generell anvendelse av rt-PA innenfor tidsrommet på 6 timer etter begynnelsen på slag var likevel ikke anbefalt siden en benyttelse i løpet av denne tiden øker risikoen for intracerebral blødning (ICH) (C. Lewandowski C og William Barsan, 2001: Treatment of Acute Stroke, i: Annals of Emergency Medicine 37:2, s.202 ff).
Den trombolytiske behandlingen av slag var også tema for en klinisk under-søkelse som ble foretatt av the National Institute of Neurologic Disorder and Stroke (såkalt NINDS rtPA Stroke Trial) i USA. Denne undersøkelsen konsentrerte seg om effekten av intravenøs rt-PA-behandling innenfor bare tre timer etter at symptomene var registrert. Pasienter ble undersøkt tre måneder etter behandlingen. På grunn av de observerte positive effektene av denne behandlingen på levedyktigheten til pasienter ble rt-PA-behandling innenfor dette begrensede tidsrommet på tre timer anbefalt, selv om de ansvarlige fant en høyere risiko for ICH.
To ytterligere undersøkelser (ECASS II Trial: Altaplase Thrombolysis for Acute Noninterventional Therapy in Ischaemic Stroke (ATLANTIS)) undersøkte hvorvidt de positive effektene av rt-PA-behandling innenfor tre timer etter starten på slag kunne bli gjentatt selv med en behandling innefor seks timer. Dette spørsmålet kunne likevel ikke bli besvart bekreftende siden ingen forbedring av de kliniske symptomene eller nedgang i dødelighet ble observert. Den høyere risikoen for ICH var fortsatt til stede.
De delvis motstridende resultatene har ført til en høy aktsomhet ved bruken av rt-PA. Allerede i 1996 pekte en publikasjon i the American Heart Association på den sterke skepsisen blant doktorer med hensyn på trombolytisk behandling av slag, mens det ikke foreligger en slik skepsis med hensyn på fibrinolytika i behandlingen av hjerteinfarkt (van Gijn J., MD, FRCP, 1996, Circulation 1996, 93:1616-1617).
En begrunnelse for denne skepsisen ble først gitt i en oppsummering av alle slagundersøkelser som ble publisert i 1997 (oppdatert i mars 2001). Ifølge den oppsum-meringen førte alle trombolytikabehandlinger (urokinase, streptokinase, rt-PA eller rekombinant urokinase) til en signifikant høyere dødelighet innenfor de første 10 dagene etter slaget mens det totale antallet av enten døde eller funksjonssvekkede pasienter ble redusert når trombolytika ble benyttet innenfor seks timer etter starten på slag. Disse effektene skyldes i hovedsak ICH. Den utbredte anvendelsen av trombolytika i behandlingen av slag ble derfor ikke anbefalt.
Selv før dette ga slike resultater grunnlag for noen andre forfattere av publikasjoner sin mer eller mindre sarkastiske uttalelse om at slagpasienter hadde valget mellom å enten dø eller overleve som krøplinger (SCRIP 1997:2265-26).
Så langt er likevel behandlingen med rt-PA er den eneste behandlingen for akutt cerebral iskemi som er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) i USA. Behandlingen er likevel begrenset til en anvendelse av rt-PA innenfor tre timer etter begynnelsen på slag.
Godkjenningen av rt-PA ble nådd i 1996. Før dette, i 1995, ble de første tilkjennegivelsene omkring negative bivirkninger av t-PA kjent, noe som tilveiebringer et forklarende grunnlag for dens dramatiske effekter når den benyttes i slagbehandling utenfor tidsrammen på tre timer. Likeledes produserer mikrogliceller og nevronale celler i hippocampus t-PA som bidrar til den glutamatmedierte eksitotoksisiteten. Dette er konkludert med ut i fra en sammenligningsundersøkelse på henholdsvis t-PA-manglende og villtype mus når glutamatagonister ble injisert i deres hippocampus. De t-PA-manglende musene viste en signifikant høyere motstand mot eksternt (intratekalt) tilført glutamat (Tsirka SE et al., Nature, Vol. 377, 1995, " Excitoxin- induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator"). Disse resultatene ble bekreftet i 1998 da Wang et al. var i stand til å bevise nesten en dobbelt så stor mengde med nekrotisk nevronalt vev i t-PA-manglende mus når t-PA ble injisert intravenøst. Denne negative effekten av ekstern t-PA på villtypemus var bare omtrent 33 % (Wang et al., 1988, Nature " Tissueplasminogen activator ( t- PA) increases neuronal damage after focal cerebral ischaemia in wild type and t- PA deficient mice".).
Ytterligere resultater fra stimuleringen av eksitotoksisitet av t-PA ble publisert av Nicole et al. i begynnelsen av 2001 (Nicole O., Docagne F. Ali C, Margaill I, Carmeliet P., MacKenzie ET., Vivien D. og Buisson A., 2001: The proteolytic activity of tissueplasminogen activator enhances NMDA receptor- mediated signaling, i Nat. Med. 7, 59-64). De kunne bevise at t-PA som ble frigjort av depolariserte kortikonevroner virker sammen med den såkalte NR1-subenheten på glutamatreseptoren av NMDA-typen, noe som fører til en kløyving av NR1. Dette øker reseptorens aktivitet og fører til større vevsødeleggelse etter at glutamatagonist NMDA ble benyttet. NMDA-agonisten induserte eksitotoksisitet. Dermed utviser t-PA en nevrotoksisk effekt ved å aktivere glutamatreseptoren av NMDA-typen.
Ifølge et annet forklarende konsept stammer nevrotoksisiteten til t-PA indirekte fra omdannelsen av plasminogen til plasmin. Ifølge denne modellen er plasmin igangsetteren av nevrotoksisitet (Chen, Z.L. og Strickland, S., 1997: Neuronal Death in the hippocampus is promoted byplasmin- catalysed degradation oflaminin. Cell: 91, 917-925).
En oppsummering av den tidsavhengige nevrotoksiske effekten til t-PA er gitt i figur 9. Der blir også den økte toksisiteten til det rekombinante t-PA sammenlignet med endogent t-PA åpenbar. Dette skyldes sannsynligvis at rt-PA er i stand til å trenge inn i vev i høyere konsentrasjoner.
På tross av sine nevrotoksiske bivirkninger og sin økende effekt på dødeligheten ble t-PA godkjent av FDA. Dette kan bare forklares med mangelen på ufarlige og effektive alternativer, og skyldes dermed en svært pragmatisk kostnadstjenelig analyse. Derfor er det fremdeles et behov for trygge behandlingsmåter. Hvis de likevel fremdeles blir basert på trombolytika, i tilfellet det ikke er mulig å finne alternativer til trombolyse, må problemet med nevrotoksisitet bli overveid (se for eksempel Wang et al., a.a.O., Lewandowski og Barson, 2001 a.a.O).
Derfor ble videre undersøkelser av kjente trombolytika inkludert DSPA ( Desmodus- rotundiis- plasminogenaktivator) for å utvikle nye legemidler mot slag avsluttet, selv om i prinsipp alle trombolytika potensielt er passende. Spesielt i tilfellet med DSPA ble dennes potensielle anvendbarhet for denne medisinske indikasjonen påpekt tidelig (Medan, P., Tatlisumak, T., Takano, K., Carano, R.A.D., Hadley, S.J., Fisher, M.: Thrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogen activator ( rDSPA) in a rat embolic stroke modell, i: Cerebrovasc. Dis. 1996:6, 175-194 (4. inter-nasjonale symposium på Thrombolic Therapy in Acute Ischaemic Stroke). DSPA er en plasminogenaktivator med høy homologi (likhet) med t-PA. Derfor, og i tillegg til de knuste illusjonene som et resultat av de nevrotoksiske bivirkningene av t-PA, var det ingen forventninger om at DSPA skulle være et passende legemiddel til behandling av slag.
Nye strategier rettet mot å prøve å forbedre kjente trombolytiske behandlinger prøver isteden å anvende de trombolytiske midlene intra-arterielt, og ikke intravenøst, direkte via et kateter nært opp til den intravaskulære tromben. En første erfaring med rekombinant fremstilt urokinase er tilgjengelig. Dermed kan muligens den nødvendige dosen for trombolyse, og dermed negative bivirkninger, bli redusert. Denne applikasjonen krever likevel et høyt teknisk forbruk og er ikke tilgjengelig overalt. Videre må pasientene klargjøres i en tidkrevende prosedyre. Tiden til dette er svært ofte begrenset. Dermed tilveiebringer klargjøringen en ytterligere risiko.
På det nåværende tidspunkt blir nye konsepter rettet mot antikoagulerende midler slik som heparin, aspirin eller ankrod, som er det aktive stoffet i giften til Calloselasma rhodostoma. To andre kliniske undersøkelser som undersøkte effektene av heparin (International Stroke Trial (IST) og Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST)) viser likevel ikke en signifikant forbedring i dødelighet eller en forebygging av slag.
En ytterligere ny behandling fokuserer verken på tromber eller på blodfortynning eller antikoagulering med forsøker å øke vitaliteten til celler som er skadet av oppholdet i blodforsyning (WO 01/51613 Al og WO 01/51614 Al). For å oppnå dette blir antibiotika fra gruppen av kinoner, aminoglykosider eller kloramfenikol benyttet. Av tilsvarende grunner er det videre foreslått å begynne med anvendelsen av citicholin direkte etter starten på et slag. Citicholin blir kløyvd til cytidin og cholin i kroppen. Kløyvings-produktene utgjør en del av den nevronale cellemembranen og hjelper dermed til i gjenoppbyggingen av skadet vev (US 5,827,832).
Nyere forskning på trygg behandling er basert på det nye funnet av at en del av de fatale konsekvensene av slag bare indirekte skyldes avbrudd i blodforsyning men direkte skyldes eksitotoksisiteten eller nevrotoksisiteten inkludert overaktiverte glutamatreseptorer. Denne effekten blir økt av t-PA (se ovenfor). Et konsept for å redusere eksitotoksisitet er derfor å benytte såkalte nevrobeskyttere. De kan bli benyttet separat eller i kombinasjon med fibrinolytiske midler for å minimalisere nevrotoksiske effekter. De kan føre til en redusert eksitotoksisitet enten direkte for eksempel som en glutamat-reseptorantagonist eller indirekte ved å hemme spenningsavhengige natrium- eller kalsiumkanaler (Jin-Mo Lee et al., a.a.O.).
En konkurrerende hemming (antagonistisk virkning) av glutamatreseptoren av NMDA-type er mulig for eksempel med 2-amino-5-fosfonvalerat (APV) eller 2-amino-5-fosfonheptanoat (APH). En ikke-konkurrerende hemming kan bli oppnådd for eksempel med stoffer som binder til fensyklidinsiden på kanalene. Slike stoffer kan være fensyklidin, MK-801, dekstrorfan eller cetamin.
Så langt har ikke behandling med nevrobeskyttere oppfylt den forventede suksessen, muligens fordi nevrobeskyttere har måttet bli kombinert med trombolytiske midler for at de skal kunne utøve sine beskyttende effekter. Dette gjelder for andre stoffer (se også figur 10).
Til og med en kombinasjon av t-PA og nevrobeskyttende midler fører bare til en begrenset skade. Allikevel blir ikke den ufordelaktige nevrotoksisiteten til de fibrinolytiske midlene unngått.
Det er derfor et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et nytt terapeutisk konsept for behandling av slag hos mennesker.
Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av DSPA alfa 1 for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker etter utløpet av 3 timer etter starten på slaget, uten kombinasjon med andre terapeutiske midler.
Den sentrale idé ifølge oppfinnelsen er anvendelsen av en plasminogenaktivator i behandlingen av slag, der det modne plasminogenaktivatorenzymet utviser en aktivitet som selektivt blir økt av fibrinmangfoldiggjøring, nemlig mer enn 650 ganger.
Anvendelsen av plasminogenaktivatorene ifølge oppfinnelsen er basert på følgende funn: På grunn av vevsskade i hjernen forårsaket av slag blir barrieren mellom hjerne og blod skadet eller ødelagt. Dermed kan fibrinogen som sirkulerer i blodet trenge inn i det nevronale vevet i hjernen. Der aktiverer det t-PA som indirekte ved å aktivere glutamatreseptoren eller plasminogen fører til ytterligere vevsskade. For å unngå denne effekten foreslås anvendelsen av en plasminogenaktivator som er svært fibrinselektiv, og, som et omvendt argument, har en redusert evne til å bli aktivert av fibrinogen. Dermed blir ikke denne plasminogenaktivatoren, eller sammenlignet med t-PA iallfall i vesentlig mindre grad, aktivert av fibrinogen som trenger inn fra blodet og inn i nevronalt vev som et resultat av skadet barriere mellom blod og hjerne, siden t-PAs aktivator fibrin ikke kan trenge inn i nevronalt vev på grunn av sin størrelse. Plasminogenaktivatorene ifølge oppfinnelsen er derfor ikke-nevrotoksiske.
I henhold til en foretrukket utførelsesform blir ikke-toksiske plasminogenaktivatorer benyttet, som omfatter minst ett element av den såkalte zymogentriaden. En sammenlignbar triade er kjent fra det katalytiske senteret i serinproteaser i kymotrypsinfamilien der den består av de tre samvirkende aminosyrene aspartat 194, histidin 40 og serin 32. Denne triaden eksisterer likevel ikke i t-PA som også tilhører kymotrypsinfamilien slik som serinproteaser. Allikevel er det kjent at den rettede mutagenesen mot nativt t-PA, med formålet å introdusere minst én av aminosyrene ovenfor i en passende posisjon, fører til en redusert aktivitet for proenzymet (enkeltkjede-t-PA) og til en økt aktivitet for det modne enzymet (dobbeltkjede-t-PA) i nærværet av fibrin. Derfor kan introduseringen av minst én aminosyre fra triaden, eller av en aminosyre med den respektive funksjonen i triaden, øke zymogeniteten til t-PA (d.v.s. forholdet mellom aktiviteten til det modne enzymet og aktiviteten til proenzymet). Som et resultat blir fibrinspesifisiteten påfallende økt. Dett skyldes konformasjonssamvirkning mellom den introduserte aminosyreresidien og /eller aminosyreresidier i villtypesekvensen.
Det er kjent at mutagenesen av nativ t-PA der Phe305 er substituert med His (F305H) og der Ala292 er substituert med Ser (A292S) fører til en 20 ganger økning i zymogeniteten, der varianten F305H alene allerede fører til 5 ganger høyere zymogenitet (E.L. Madison, Kobe, A., Gething, M-J., Sambrook, J.F., Goldsmith, E.J., 1993: Converting Tissue Plasminogen Activator to a Zymogen: A regulatory Triad ofAsp- His-Ser, Science: 262, 419-421). I nærværet av fibrin viser disse t-PA-mutantene en aktivitetsøkning på henholdsvis 30.000 ganger (F305H) og 130.000 ganger (F305H, A292S). I tillegg omfatter disse mutantene en substitusjon av Arg275 til R275E for å forhindre kløyving fra plasmin på kløyvingssetet Aug275-Ile276, og dermed konvertere enkeltkjede-t-PA til den dobbeltkjedede formen. Det mutante setet R275E alene fører til 6900 ganger økning i fibrinspesifisiteten til t-PA (K., Tachias, Madison, E.L., 1995: Variants ofTissue- type Plasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulationby Fibrin, i: Journal of Biological Chemistry 270, 31:18319-18322).
Posisjonene 305 og 292 på t-PA er homologe med posisjonene His40 og Ser32 på den kjente triaden på de kymotryptiske serinproteasene. Med de tilsvarende substitu-sjonene for å introdusere histidin eller henholdsvis serin kan disse aminosyrene interagere med aspartat477 på t-PA, noe som fører til en funksjonell triade i t-PA-mutantene (Madison et al., 1993).
Disse t-PA-mutantene kan bli benyttet i behandlingen av slag fordi de ikke viser, eller sammenlignet med villtype-t-PA, vesentlig redusert nevrotoksisitet på grunn av deres økte fibrinspesifisitet. For formålet av avsløring av de nevnte t-PA-mutantene F305H, F305H, A292S alene eller i kombinasjon med R275E, tar vi med publikasjonene til Madison et al., (1993) og Tachias og Madison (1995).
Økningen i fibrinspesifisitet hos plasminogenaktivatorer kan alternativt bli oppnådd med punktmutasjon av Aspl94 (eller en aspartat på en homolog posisjon). Plasminogenaktivatorer tilhører gruppen av serinproteaser i kymotrypsinfamilien og omfatter derfor den konserverte aminosyren Asp 194 som er ansvarlig for stabiliteten til den katalytisk aktive konformasjonen til den modne proteasen. Det er kjent at Aspl94 interagerer med His40 i den zymogene formen av serinproteaser. Etter at zymogenet er aktivert med kløyving blir denne spesifikke interaksjonen avbrutt og sidekjeden på
Asp 194 roterer omtrent 170° for å kunne danne en ny saltbro med Ilel6. Denne saltbroen bidrar i hovedsak til stabiliteten til oksyanionlommen i det katalytiske senteret på de modne serinproteasene. Den er også til stede i t-PA.
Introduseringen av en punktmutasjon som bytter ut Asp 194 prima fade sinker dannelsen eller henholdsvis stabiliteten av den katalytiske konformasjonen hos serinproteaser. På tross av dette viser de muterte plasminogenaktivatorene en signifikant økning i aktivitet i nærværet av deres kofaktor fibrin, spesielt sammenlignet med den modne villtypeformen, noe som bare kan forklares med at interaksjonen med fibrin tillater en konformasjonsendring som fremmer katalytisk aktivitet (L., Strandberg, Madison, E.L., 1995: Variants ofTissue- type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Response and Selectivity towards Fibrin co- factors, i: Journal of Biological Chemistry 270,40:2344-2349).
I konklusjon viser Aspl94-mutantene av plasminogenaktivatorene en stor økning i aktivitet i nærvær av fibrin, noe som muliggjør deres anvendelse ifølge oppfinnelsen.
I en foretrukket utførelsesform blir en mutant t-PA benyttet, der Asp 194 er substituert med glutamat (D194E) eller henholdsvis med asparagin (D194N). I disse mutantene er aktiviteten til t-PA redusert fra 1 til 2000 ganger i fraværet av fibrin, mens en økning i aktivitet med en faktor på 498.000 til 1.050.000 kan bli oppnådd i nærværet av fibrin. Disse mutantene kan videre omfatte en substitusjon av Arg 15 til R15E, noe som forhindrer kløyvingen av enkeltkjede-t-PA på peptidbindingen Argl5-Ilel6 fra plasmin, noe som fører til den dobbeltkjedede formen av t-PA. Denne mutasjonen alene øker aktiveringen av t-PA fra fibrin med en faktor på 12.000.
En økning i fibrinavhengigheten hos plasminogenaktivatorer kan også bli oppnådd ved introduseringen av punktmutasjoner i den såkalte "autolyseløkken". Dette elementet er kjent fra trypsin, det kan også bli funnet som en homolog del i serinproteaser og er spesieltkarakterisert vedtre hydrofobe aminosyrer (Leu, Pro og Phe). Autolyse-løkken i plasminogenaktivatorer er ansvarlig for interaksjonen med plasminogen. Punktmutasjoner i dette området kan ha den effekten at protein-protein-interaksjonen mellom plasminogen og plasminogenaktivatorer ikke lenger kan bli effektivt dannet. Disse mutasjonene er bare funksjonelt relevante i fraværet av fibrin. I nærværet av fibrin derimot, er de ansvarlig for en økt aktivitet hos plasminogenaktivatorene (K., Song-Hua, Tachias, K., Lambda, D., Bode, W., Madison, E.L., 1997: Identification of a Hydrofobic exocite on Tissue Type Plasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen, i: Journal of Biological Chemistry 272: 3, 1811-1816).
I en foretrukket utførelsesform blir t-PA som viser punktmutasjoner i posisjonene 420 til 423 benyttet. Hvis disse residiene blir substituert ved hjelp av rettet mutagenese øker dette fibrinavhengigheten til t-PA med en faktor på opp til 61.000 (K., Song-Hua et al.). Song-Hua et al. undersøkte punktmutasjonene L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A og F423E.
Ifølge en annen fordelaktig utførelsesform blir en modifisert plasminogenaktivator med en aminosyresekvens som i SEQ ID NO. 1 (figur 13) benyttet. Denne modifiserte t-PA skiller seg fra villtype-t-PA med utbyttingen av de hydrofobe aminosyrene i posisjon 420 til 423 i autolyseløkken som følger: His420, Asp421, Ala422 og Cys423. Denne t-PA inneholder fortrinnsvis en fenylalanin på posisjonen 194. Videre kan posisjonen 275 være okkupert av glutamat. Fordelaktig er posisjonen 194 okkupert av fenylalanin.
Videre kan en modifisert urokinase bli benyttet ifølge oppfinnelsen. Urokinasen ifølge oppfinnelsen kan omfatte aminosyresekvensen i SEQ ID NO. 2 (figur 14) der de hydrofobe aminosyrene i autolyseløkken er substituert med Val420, Thr421, Asp422 og Ser423. Fordelaktig inneholder urokinasen en Ile275 og en Glul94. Denne mutanten viser, sammenlignet med villtypeurokinase, 500 ganger økt fibrinspesifisitet.
Begge mutanter, urokinase og t-PA, ble analysert i semikvantitative tester og viste en økt fibrinspesifisitet sammenlignet med villtype-t-PA.
Plasminogenaktivatoren (DSPA) fra spyttet til vampyrflaggermusen ( Desmodus rotundus) viser også svært økt aktivitet i nærværet av fibrin, det vil si en 100.000 ganger økning. Dermed kan den foretrukket bli benyttet ifølge oppfinnelsen. Uttrykket "DSPA" omfatter fire ulike proteaser som fyller en essensiell funksjon for vampyrflaggermusen, nemlig en økt varighet av blødning fra sårene som blir påført byttet (Cartwright, 1974). Disse fire proteasene (DSPAal, DSPAa2, DSPA6, DSPAy) utviser en stor likhet (homologi) med hverandre og med human t-PA. De viser også liknende fysiologiske aktiviteter, noe som fører til en felles klassifisering under uttrykket DSPA. DSPA blir tilkjennegitt i patentene EP 0 352 119 Al og US 6,008,019 og 5,830,849.
DSPAa er så langt den best analyserte proteasen fra denne gruppen. Den har en aminosyresekvens med en homologi som er større enn 72 % sammenlignet med den kjente aminosyresekvensen for human t-PA (Kratzschmar et al., 1991). Det er likevel to essensielle forskjeller mellom t-PA og DSPA. For det første har alle DSPA full protease- aktivitet som et enkeltkjedemolekyl siden det i motsetning til t-PA ikke blir konvertert til en dobbeltkjedet form (Gardell et al., 1989, Kratzschmar et al., 1991). For det andre er den katalytiske aktiviteten til DSPA nesten helt avhengig av fibrin (Gardell et al., 1989, Bringmann et al., 1995, Toschie et al., 1988). For eksempel blir aktiviteten til DSPal økt 100.000 ganger i nærværet av fibrin mens t-PA-aktiviteten bare øker 550 ganger. I motsetning til dette er DSPA-aktivitet vesentlig mindre sterkt indusert av fibrinogen siden den bare viser en 7 til 9 ganger økning (Bringmann et al., 1995). I konklusjon er DSPA vesentlig mer avhengig av fibrin og mye mer fibrinspesifikk enn t-PA som bare aktiveres 550 ganger av fibrin.
På grunn av sine fibrinolytiske karakteristika og den store likheten med t-PA er DSPA en interessant kandidat i utviklingen av et trombolytisk middel. På tross av dette ble den terapeutiske anvendelsen av DSPA som et trombolytisk middel begrenset til behandlingen av hjerteinfarkt i det forutgående, noe som skyldes t-PA sitt bidrag til den glutamatinduserte nevrotoksisiteten, og ingen forhåpninger forelå om at en plasminogenaktivator som er beslektet med t-PA med fornuft kunne bli benyttet i en behandling av akutt slag.
Overraskende har det blitt vist at DSPA ikke har noen nevrotoksiske effekter selv om den viser stor likhet (homologi) med t-PA, og selv om de fysiologiske effektene til molekylet i stor grad er sammenlignbare. Konklusjonen ovenfor førte til idéen om at DSPA tross alt kan bli vellykket benyttet som et trombolytisk middel i behandlingen av slag uten at det fører til alvorlige risiko for nevronal vevsødeleggelse. Spesielt interessant er det faktum at DSPA også kan bli benyttet senere enn 3 timer etter starten på slagsymptomer.
En ytterligere avsløring som utviklet seg fra funnene beskrevet ovenfor vedrører muligheten til å modifisere eller produsere ytterligere plasminogenaktivatorer på en slik måte at de avslører de essensielle karakteristika ved DSPA, spesielt mangelen på nevrotoksisiteten til t-PA. Grunnlaget for dette er den undersøkte sammenhengen mellom struktur og biokjemiske effekter, noe som gjør det mulig å transformere nevrotoksiske plasminogenaktivatorer til ikke-toksiske plasminogenaktivatorer og dermed å fremstille ikke-nevrotoksiske plasminogenaktivatorer på grunnlag av kjente eller nylig oppdagede nevrotoksiske plasminogenaktivatorer.
Den nye avsløringen er basert på sammenlignende undersøkelse in vivo av den nevronedbrytende effekten til t-PA på den ene siden og DSPA på den andre siden, noe som blir utført ved å benytte den såkalte kainsyremodellen og en modell for undersøkelse av NMDA-indusert lesjon i striatum.
Kainsyremodellen (også kalt kainsyreskademodellen) er basert på stimuleringen av den nevrotoksiske glutamatkaskaden med den eksterne anvendelsen av kainsyre (KA) som en agonist for glutamatreseptoren av kainsyretypen (KA-type) og for NMDA- og AMPA-glutamatreseptorene. Ved å benytte en t-PA-manglende musestamme som en eksperimentell modell var det mulig å vise at sensitiviteten til laboratoriedyrene overfor kainsyre bare nådde nivået for villtypemus etter at eksternt t-PA ble tilført. I motsetning til dette gjenoppretter ikke en infusjon av en ekvimolar konsentrasjon av DSPA ved de samme eksperimentelle betingelser sensitiviteten overfor kainsyre (KA). Det ble konkludert med at den nevrotoksiske effekten av t-PA ikke ble indusert av DSPA. En oppsummering av disse resultatene er vist i tabell 2.
Kvantitative undersøkelser basert på denne modellen avslørte at selv en 10 ganger økning av DSPA-konsentrasjonen kunne ikke gjenopprette sensitiviteten til de t-PA-manglende musene til KA-behandlingen mens allerede en 10 ganger lavere t-PA-konsentrasjon førte til KA-indusert vevsødeleggelse. Dette fører til konklusjonen om at DSPA innehar i det minste ett 100 ganger lavere nevrotoksisk potensial i forhold til t-PA med hensyn på stimuleringen av nevronedbrytningen etter KA-behandling (se også figur 11 og 12).
I den andre modellen med nevronedbrytning ble de mulige effektene av t-PA i tilegg til DSPA på stimuleringen av NMDA-avhengige nevronedbrytningen sammenlignet med villtypemus. Til dette formålet ble NMDA (som en agonist for glutamatreseptoren av NMDA-typen) injisert i villtypemus alene eller i kombinasjon med enten t-PA eller DSPA. Denne modellen tillater sammenligningen av effektene av disse proteasene under betingelser som alltid fører til en nevronedbrytning og til en influks av plasmaproteiner på grunn av nedbrytning av barrieren mellom blodet og hjernen (Chen et al., 1999).
Mens det ble arbeidet med denne modellen førte injeksjonen av NMDA til reproduserbare lesjoner i striatum hos mus. Volumet på lesjoner ble økt med en kombinert injeksjon av t-PA og NMDA med minst 50 %. I motsetning til dette førte koinjiseringen av DSPAal ikke til en økning eller forlenging av lesjonene forårsaket av NMDA. Selv i nærværet av plasmaproteiner som fritt kan diffusere i området ved lesjonen som er indusert av NMDA førte ikke DSPA til en økning i nevronedbrytning (se også tabell 3).
Disse resultatene viser at fibrinfritt DSPA i motsetning til t-PA oppfører seg som en nesten inert protease i sentralnervesystemet hos et pattedyr og også hos et menneske, og bidrar derfor ikke til de nevrotoksiske effektene som forårsakes av KA eller NMDA. På tross av forutinntattheten mot den terapeutiske anvendelsen av t-PA-liknende proteiner ved slag gjør denne manglende nevrotoksisiteten DSPA til et passende trombolytisk middel i behandlingen av akutt slag.
De første resultatene fra kliniske undersøkelser viser også overførbarheten for disse resultatene på behandling av slag hos mennesker. Det ble funnet at signifikante forbedringer kan bli oppnådd hos pasienter etter en vellykket perfusjon (forbedring med 8 poeng NIHSS eller NHISS-score 0 til 1). Tabell 1 viser dataene.
Den manglende nevrotoksisiteten for DSPA og for de andre ikke-nevrotoksiske plasminogenaktivatorene (se ovenfor) utgjør en spesiell fordel i behandling av slag idet anvendelsen av disse plasminogenaktivatorene i motsetning til villtype-t-PA ikke er begrenset til en kort maksimal periode på kun 3 timer etter begynnelsen på et slag. Behandlingen kan bli satt i gang senere, for eksempel etter 6 timer eller enda senere, siden det nesten ikke er noen risiko for å stimulere eksitotoksiske responser. De første kliniske prøvene med DSPA beviser en trygg behandling av pasienter selv i et tidsområde på over 6 til 9 timer etter starten på symptomer på slag.
Denne muligheten for en tidsubegrenset behandling med ikke-nevrotoksiske
aktivatorer er av spesiell viktighet siden den for første gang tillater at pasienter med akutte slagsymptomer kan bli behandlet trygt selv når diagnosen blir forsinket eller når starten på et slag ikke kan bli bestemt med tilstrekkelig sikkerhet. I kjent teknikk ble denne gruppen av pasienter ekskludert fra trombolytisk behandling med plasminogenaktivatorer på grunn av uhensiktsmessig risikoberegning. Dermed er en essensiell motindikasjon for den autoriserte anvendelsen av et trombolytisk middel mot slag eliminert.
DSPA i tillegg til andre ikke-nevrotoksiske plasminogenaktivatorer viser ingen vevsødeleggende bivirkninger. Det kan likevel være fordelaktig å benytte dem i kombinasjon med et nevrobeskyttende middel i behandlingen av slag for å begrense vevsødeleggelser som induseres av glutamat som forekommer naturlig i menneske-kroppen. Nevrobeskyttende midler som kompetitivt eller ikke-kompetitivt hemmer glutamatreseptoren kan bli benyttet. Nyttige kombinasjoner er for eksempel med de kjente hemmerene av glutamatreseptorene av NMDA-typen, kainsyretypen eller quisqualat-typen, som for eksempel APV, APH, fensyklidin, MK-801, dekstrorfan eller cetamin.
En kombinasjon med kationer kan videre være fordelaktig siden kationer, spesielt Zn-ioner, blokkerer kationkanalen som er regulert av glutamatreseptoren og kan dermed redusere nevrotoksiske effekter.
I en ytterligere fordelaktig utførelsesform kan ikke-nevrotoksiske plasminogenaktivatorer bli kombinert med minst ett ytterligere terapeutisk middel eller med en farmasøytisk tolererbar bærer. Kombinasjonen med et terapeutisk middel som støtter reduksjonen av vevsødeleggelse ved å vitalisere cellene er spesielt fordelaktig siden det bidrar til regenereringen av allerede skadet vev eller virker for å forhindre ytterligere slagtilfeller. Fordelaktige eksempler er kombinasjoner med antibiotika som kinoner, antikoagulerende midler som heparin eller hirudin i tillegg til citicholin eller acetylsalisyl-syre.
En kombinasjon med minst én trombinhemmer kan også være fordelaktig. Foretrukket kan trombomodulin og trombomodulinanaloger som for eksempel solulin, triabin eller pallidipin bli benyttet. Andre kombinasjoner med anti-innflammatoriske stoffer er fordelaktige siden de påvirker infiltreringen av leukocytter.
Sammenligning av t-PA og DSPA er fremgangsmåtene:
1. Dyr
Villtypemus (c57/Black 6) og t-PA-manglende mus (t-PA-/-mus) (c57/Black 6)
(Carmeliet et al., 1994) ble tilveiebrakt av Dr. Peter Carmeliet, Leuven, Belgia.
2. Proteinekstrahering fra hjernevev
Vurdering av proteolytisk aktivitet i hjernevev etter infusjon av enten t-PA eller DSPAal ble utført med zymografisk analyse (Granelli-Piperno og Reich, 1974). Etter en infusjon inn i hippocampus over en periode på syv dager ble musene bedøvd, deretter ble de transkardialt dynket med PBS og hjernene ble fjernet. Hippocampusregionen ble fjernet, overført til eppendorfrør og inkubert i et likt volum (w/v) (omtrent 30-50 um) med 0,5 % NP-40-lyseringsbuffer som ikke inneholdt proteasehemmere (0,5 % NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Hjerneekstraktene ble homogenisert ved hjelp av en håndholdt glasshomogenisator og satt på is i 30 minutter. Prøvene ble deretter sentrifugert og supernatanten ble fjernet. Mengden av proteiner til stede ble bestemt (Bio-Rad-reagens).
3. Zymografisk analyse av proteasene
Den proteolytiske aktiviteten i prøvene og i hjernevevsekstraktene ble bestemt med zymografisk analyse i henhold til fremgangsmåten i Granelli, Piperno og Reich
(1974). Prøvene med rekombinante proteiner (opp til 100 nM) eller hjernevevsekstraktene (20 ug) ble utsatt for en (10 %) SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser. Gelene ble fjernet fra platene, vasket med 1 % triton-X-100 i 2 timer og deretter lagt over på en agarosegel inneholdende polymerisert fibrinogen og plasminogen (Granelli, Piperno og Reich, 1974). Gelene ble inkubert ved 37 °C i et fuktighetskammer inntil proteolyserte soner fremkom.
4. Intra-hippocampus-infusjon av t-PA, DSPA og etterfølgende injeksjon av kainsyre
Kainsyreskademodellen var basert på studier av Tsirka et al., (1995). Dyrene ble intraperitonalt (i.p.) injisert med atropin (4 mg/kg) og deretter bedøvd med en i.p.- injeksjon av natriumpentobarbitol (70 mg/kg). Etterpå ble mus plassert i en stereotaksisk ramme og en mikro-osmotisk pumpe (Alzet-modell 1007D, Alzet CA., USA) inneholdende 100 (il av enten PBS eller rekombinant human t-PA (0,12 mg/ml, 1,85 uM) eller DSPAal (1,85 uM) ble implantert subkutant mellom skulderbladene. Pumpene ble koplet sammen med sterile slanger til en hjernekanyle og innført gjennom en burr-åpning som ble laget gjennom skallen med koordinater bregma -2,5 mm, midiolateral 0,5 mm og dorsoventral 1,6 mm for å kunne føre inn væsken nær midtlinjen. Kanylen ble festet på den ønskede posisjonen og pumpene ble tillatt å pumpe inn de respektive løsningene med en hastighet på 0,5 ul per time i totalt 7 dager.
To dager etter infusjon av proteasene ble musene bedøvd på nytt og igjen plassert i den stereotaksiske rammen. Etterpå ble 1,5 nmol kainsyre (KA) i 0,3 ul PBS injisert unilateralt inn i hippocampus. Koordinatene var: bregma -2,5 mm, medial-lateral 1,7 mm og dorsoventral 1,6 mm. Eksitotoksinet (KA) ble levert i 30 sekunder. Etter kainsyrebe-handlingen forble injeksjonsnålen plassert på disse koordinatene i ytterligere 2 minutter for å forhindre refluks av væsken.
5. Hjerneprosesseringsprosedyre
Fem dager etter KA-injeksjon ble dyrene bedøvd og transkardialt dynket med 30 ml PBS etterfulgt av 70 ml av en 4 % paraformaldehydløsning som var postfiksert i det samme fiksativet etterfulgt av inkubering i 30 % sukrose i ytterligere 24 timer. Koronale seksjoner (40 um) av hjernen ble deretter skåret på en frysende mikrotom og enten tilbakefarget med tionin (BDH, Australia) eller prosessert for immunhistokjemisk undersøkelse som beskrevet nedenfor.
6. Kvantifisering av nevronalt tap i hippocampus
Kvantifiseringen av nevronalt tap i hippocampusregionene CA1-CA3 ble utført som beskrevet tideligere (Tsirka et al., 1995, Tsirka et al., 1996). Fem konsekutive deler av dorsal hippocampus fra alle behandlingsgrupper ble preparert, samtidig som det ble sørget for at delene virkelig omfattet stedet for CA-injeksjonen og lesjonsområdet. Hippocampusregionene (CA1-CA3) av disse seksjonene ble sporet ved hjelp av camera-lucida-tegninger av hippocampus. Hele lengden av regionene ble målt ved å sammenligne med 1 mm-standarder som var sporet under samme forstørrelse. Lengdene av vev med levedyktige pyramidale nevroner (som har normal morfologi) og lengder av vev uten nevroner (ingen celler til stede, ingen tioninfarging) ble bestemt. Lengdene, som representerer intakte nevroner, og nevronalt tap i hver hippocampusregion ble gjort om til et gjennomsnitt over regionene og standardavvikene ble beregnet.
7. Intra-striatale NMDA-eksitotoksiske lesjoner med eller uten t-PA eller DSPA
Villtypemus (c57/Black 6) ble bedøvd og plassert i en stereotaksisk ramme (se ovenfor). Mus mottok deretter en unilateral injeksjon med 50 nmol NMDA i venstre striatum, injisert alene eller i kombinasjon med enten 46 uM rt-PA eller 46 uM DSPAal. Som kontroller ble også t-PA og DSPA injisert alene (begge med en konsentrasjon på 46 uM). Injeksjonskoordinatene var: bregma -0,4 mm, midiolateral 2,0 mm og dorsoventral 2,5 mm. Løsningene (1 ul totalvolum for alle behandlinger) ble overført over en periode på 5 minutter med en hastighet på 0,2 ul/min og nålen ble latt stående på plass i ytterligere 2 minutter etter injeksjonen for å minimalisere refluksen av fluidum. Etter 24 timer ble musene bedøvd og dynket transkardialt med 30 ml PBS etterfulgt av 70 ml av en 4 % paraformaldehydløsning som var postfiksert i det samme fiksativet i 24 timer etterfulgt av inkubering i 30 % sukrose i ytterligere 24 timer. Hjerner ble deretter skåret (40 urn) på en frysende mikrotom og montert på gelatindekte glass.
8. Kvantifisering av lesjonsvolumet etter NMDA-injeksj on
Kvantifiseringen av striatalesjonsvolumet ble utført ved å benytte fremgangsmåten beskrevet av Callaway et al., (2000). Ti konsekutive koronale seksjoner som dekte hele lesjonsområdet ble preparert. Lesjonsområdet ble visualisert ved å benytte Callaway-fremgangsmåten og lesjonsvolumet ble kvantifisert ved hjelp av en mikrobereg-ningssynligjøringsinnretning (MCID, Imaging Research Inc., Brock University, Ontario, Canada).
9. Immunhistokjemi
Immunhistokjemi ble utført ved å benytte standardfremgangsmåter. Koronalseksjoner ble senket ned i en løsning av 3 % H202og 10 % metanol i 5 minutter etterfulgt av en inkubering i 5 % normalt geiteserum i 60 minutter. Seksjonene ble inkubert over natt enten med et anti-GFAP-antistoff (1:1000, Dako, Carpinteria, CA, USA) for påvisning av astrocytter, med et anti-MAC-1 -antistoff (1:1000, Serotec, NC, USA) for påvisning av mikroglier eller med polyklonale anti-DSPA-antistoffer (Schering AG, Berlin). Etter skylling ble seksjonene inkubert med de passende biotinylerte sekundære antistoffene /Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Dette ble fulgt med en siste inkubering med avidin/biotin-kompleks (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) i 60 minutter før visualisering med 3,3'-diaminbebcidin/0,03 % H2O2. Seksjoner ble deretter montert på gelatindekte glass, tørket, dehydrert og dekt med permount.
B. Resultater
1. Infusjon av t-PA eller DSPA dispergerer inn i hippocampus hos t-PA -/- mus og opprettholder proteolytisk aktivitet
Utgangseksperimentene ble designet for å bekrefte at både DSPA og t-PA opprettholdt deres proteolytiske aktivitet i 7-dagers perioden for infusjonen. Like volumer av t-PA og DSPA (100 nmol) ble inkubert ved 37 °C og ved 30 °C i 7 dager på et vannbad. For å kunne bestemme den proteolytiske aktiviteten ble 5-gangers seriefor-tynninger av probene kjørt på SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser og proteolytisk aktivitet ble vurdert med zymografisk analyse. Et volum av t-PA og DSPA som hadde blitt holdt nedfrosset for en periode på 7 dager ble benyttet som en kontroll. Som det blir vist i figur 1 var det bare et mindre tap av DSPA- eller t-PA-aktivitet ved en inkubering ved enten 30 °C eller 37 °C over denne tidsperioden.
2. T-PA- og DSPA-aktivitet blir gjenvunnet i ekstrakter av hippocampus som er preparert fra t-PA-/-mus etter infusjon
Først måtte det bli bekreftet at de infuserte proteasene var til stede i hjernen til de infuserte dyrene og også om de opprettholdt deres proteolytiske aktivitet mens de var til stede her. For å gjøre noe med dette ble t-PA-/- infusert i syv dager med enten t-PA eller DSPA (se ovenfor). Mus ble deretter transkardialt dynket med PBS og hjernene ble fjernet. De ipsilaterale og kontralaterale hippocampusregionene ble isolert i tillegg til en region fra cerebellum (tatt som en negativ kontroll). Vevsprøver (20 ug) ble satt på SDS-PAGE og zymografisk analyse ble utført ifølge beskrivelsen i fremgangsmåtedelen. Som det kan bli sett i figur 2 ble både t-PA- og DSPA-aktivitet påvist i den ipsilaterale regionen av hippocampus, mens noe aktivitet også ble påvist på den kontralaterale siden. Dette tyder på at de infuserte proteasene ikke bare opprettholdt deres aktivitet i hjernen men at de også hadde diffundert i hippocampusregionen. Som en kontroll ble ingen aktivitet påvist i ekstraktet preparert fra cerebellum.
3. Immunhistokjemisk vurdering av DSPA
For ytterligere å bekrefte at DSPA virkelig diffunderte inn i hippocampusregionen ble koronale hjerneseksjoner fra t-PA-/-mus analysert immunhistokjemisk etter DSPA-infusjon. DSPA-antigen ble påvist i hippocampuregionen med sterkest farging i området rundt infusjonsstedet. Disse resultatene bekrefter at det infuserte DSPA er løselig og virkelig er til stede i hippocampus.
4. DSPA-infusjon gjenoppretter ikke kainsyremediert nevronedbrytning in vivo
t-PA-/-mus er karakteristisk resistente mot kainsyre (KA)-mediert nevronedbrytning. Intrahippocampusinfusjon av rt-PA gjenopprettet likevel fullstendig sensitiviteten overfor KA-mediert skade. For å bestemme hvorvidt DSPA kunne bli byttet med t-PA i denne modellen ble t-PA-/-mus infusert intrahippocampisk med enten t-PA eller DSPA ved å benytte en miniosmotisk pumpe. For begge grupper ble 12 mus testet. 2 dager senere ble dyrene injisert med kainsyre og hensatt slik at de kunne hente seg inn. 5
dager senere ble dyrene avlivet og hjernene ble fjernet og preparert (se ovenfor). Som kontroller ble t-PA-/-mus også infusert med PBS før KA-behandling (N=3).
Koronale hjerneseksjoner ble preparert og nevronene ble påvist med Nissl-farging. Som vist i figur 4 var t-PA-/-mus som ble infusert med PBS resistente mot etterfølgende virkning av KA. Infusjon av rekombinant t-PA gjenopprettet likevel sensitivitet overfor KA-behandling. I motsetning til dette endret ikke infusjon av den samme konsentrasjonen med DSPA inn i hippocampusregionen sensitiviteten til dyrene overfor KA.
En kvantifisering av disse resultatene var basert på data fremskaffet fra 12 mus i hver gruppe. 12 av de 12 musene som ble infusert med DSPA ble en liten grad av nevronedbrytning observert. Grunnen til det er uklar og er muligens ikke relatert til tilstedeværelsen av DSPA. De kombinerte dataene tar hensyn til denne mindre effekten som ble observert i tilfellet med disse 2 dyrene. Alle 12 mus som ble behandlet med t-PA var sensitive overfor KA-behandlingen. Disse resultatene viser at i tilfellet med en infusjon av t-PA eller DSPAal i ekvimolare konsentrasjoner så førte bare administrer-ingen av t-PA til gjenoppretting av sensitivitet overfor KA-indusert nevronedbrytning.
5. DSPA-infusjon fører ikke til mikrogliaktivering
Gjenopprettingen av KA-sensitiviteten til t-PA-/-musene forårsaket av en t-PA-infusjon resulterte også i mikrogliaktivering (Rogove et al., 1999). For å vurdere graden av mikrogliaktivering etter infusering av t-PA eller DSPA og etterfølgende KA-behandling ble koronale seksjoner fra mus utsatt for immunhistokjemisk farging av aktiverte mikrogliceller ved å benytte Mac-1-antistoffet. Gjenopprettingen av KA-sensitivitet etter t-PA-infusjon resulterte i en klar økning av Mac-1-positive celler. Dette ble ikke observert hos mus som var infusert med DSPA. Dermed resulterer ikke tilstedeværelsen av DSPA i aktiveringen av mikrogliceller etter KA-behandling.
6. Titrering av DSPA og t-PA i hippocampusregionen hos mus
Konsentrasjonen av t-PA som ble benyttet i infusjonen var basert på konsentrasjonen beskrevet av Tsirka et al., (1995) (100 ul av 0,12 mg/ml [1,85 uM]). KAskade-eksperimentene ble gjentatt ved å benytte en 10-ganger lavere mengde av t-PA (0,185 uM) og en 10-ganger høyere mengde med DSPA (18,5 uM). Den lavere t-PA-konsentrasjonen var fremdeles i stand til å gjenopprette sensitiviteten overfor KA-behandling (n=3). Av spesiell interesse var funnet av at infuseringen av en 10-ganger økt DSPA-konsentrasjon bare forårsaket et lite nevronalt tap etter KA-behandling. Disse dataene peker sterkt mot at DSPA ikke fører til en økning i sensitivitet overfor KA.
7. Effekt av t-PA og DSPA på NMDA-avhengig nevronedbrytning i villtypemus
Effektene av t-PA og DSPA ble også undersøkt i en modell med nevronedbrytning i villtypemus. Injeksjonen av t-PA i striatum hos disse musene førte beviselig til en økning av de nevronedbrytende effektene som var forårsaket av glutamatanalogen NMDA (Nicole et al., 2001).
NMDA ble injisert i striataregionen hos villtypemus i nærvær av t-PA eller DSPA (hver med 46 uM) med et totalvolum på 1 ul. Etter 24 timer ble hjernene fjernet og størrelsen på lesjonene ble kvantifisert ifølge Callaway-fremgangsmåten (Callaway et al., 2000) (se ovenfor). Som vist i figur 7 forårsaket injeksjon av NMDA alene en reproduser-bar lesjon i alle behandlede mus (N=4). Når t-PA og NMDA ble benyttet sammen ble størrelsen på lesjonene økt omtrent 50 % (P<0,01, n=4). I klar motsetning til dette førte ikke koinjiseringen av NMDA og den samme konsentrasjonen av DSPA til en økning i lesjonsstørrelse sammenlignet med NMDA alene.
Injeksjon av t-PA eller DSPA alene førte ikke til påviselig nevronedbrytning. Den manglende effekten til t-PA når det ble administrert alene er i overensstemmelse med resultatene i Nicole et al., (2001). Disse dataene viser at tilstedeværelsen av DSPA ikke øker nevronedbrytning selv under en nevronedbrytende hendelse.
For å bekrefte at injeksjonen av DSPA virkelig hadde spredt seg inn i hippocampusregionen ble immunhistokjemi utført på koronale seksjoner ved å benytte DSP-antistoffet. Undersøkelsen viste at DSPA virkelig trengte inn i striataregionen.
Kinetisk analyse av plasminogenaktiveringen med indirekte kromogen testing
Indirekte kromogene tester av t-P A-aktiviteten ble utført ved å benytte substratet Lys-plasminogen (American Diagnostica) og spektrocyme-PL (American Diagnostica) i henhold til Madisan, E.L., Goldsmith, E.J., Gerard, R.D., Gething, M.-J., Sambrook, J.F.,
(1989), Nature, 339, 721-724, Madison, E.L.O., Goldsmith, E.J., Gething, MJ, Sambrook, J.F. og Bassel-Duby, R.S., (1990), Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 87, 3530-3533 i tillegg til Madison, E.L., Goldsmith, E.J., Gething, M.J., Sambrook, J.F. og Gerard, R.D., (1990), J. Biol. Chem., 265, 21423-21426. Tester ble utført både i nærvær og i fravær av kofaktoren DESAFIB (American Diagnostica). DESAFIB er en fremstilling av løselige fibrinmonomerer fremskaffet ved kløyvingen av svært rent humant fibrinogen med proteasen batroxobin. Batroxobin kløyver Arg16-Gly 17-bindingen i Aa-kjeden i fibrinogen og frigjør dermed fibrinopeptid-A. Det resulterende des-AA-fibrinogenet som representerer fibrin-I-monomerer er løselig i fråværet av peptidet Gly-Pro-Arg-Pro. Konsentrasjonen av Lys-plasminogen ble variert fra 0,0125 opp til 0,2 uM i nærvær av DESAFIB og fra 0,9 til 16 uM i fravær av kofaktoren.
Indirekte kromogene tester i nærvær av ulike stimuli
Indirekte kromogene standardtester ble utført i henhold til publikasjonene nevnt ovenfor. Prober med 100 ul totalvolum inneholdende 0,25-1 ng enzym, 0,2 uM Lys- plasminogen og 0,62 mM spektrocyme-PL ble benyttet. Testene ble utført enten i nærvær av buffer, 25 ug/ml DESAFIB, 100 ug/ml cyanogenbromidfragmenter av fibrinogen (American Diagnostica) eller 100 ug/ml av det stimulatoriske, 13 aminosyre lange, peptidet P368. Analysen ble utført i mikrotiterplater og den optiske tettheten ble bestemt ved en bølgelengde på 405 nm hvert 30. sekund i 1 time i en "Molecular Devices Thermomax". Reaksjonstemperaturen var 37 °C.
Claims (4)
1. Anvendelse av DSPA alfa 1 for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker etter utløpet av 3 timer etter starten på slaget, uten kombinasjon med andre terapeutiske midler.
2. Anvendelse ifølge krav 1, for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker etter utløpet av 6 timer etter starten på slaget.
3. Anvendelse ifølge krav 1, for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker etter utløpet av 9 timer etter starten på slaget.
4. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der DSPA alfa 1 isoleres fra Desmodus rotundus.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10153601A DE10153601A1 (de) | 2001-11-02 | 2001-11-02 | DSPA zur Behandlung von Schlaganfall |
EP01130006A EP1308166B1 (de) | 2001-11-02 | 2001-12-17 | Nicht-neurotoxische Plasminogen Aktivierende Faktoren zur Behandlung von Schlaganfällen |
PCT/EP2002/012204 WO2003037363A2 (de) | 2001-11-02 | 2002-10-31 | Nicht-neurotoxische plasminogen aktivierende faktoren zur behandlung von schlaganfall |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20042262L NO20042262L (no) | 2004-06-01 |
NO20042262D0 NO20042262D0 (no) | 2004-06-01 |
NO329789B1 true NO329789B1 (no) | 2010-12-20 |
Family
ID=7704253
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20042262A NO329789B1 (no) | 2001-11-02 | 2004-06-01 | Anvendelse av DSPA alfa 1 for fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av slag hos mennesker |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US20050048027A1 (no) |
EP (4) | EP1308166B1 (no) |
JP (2) | JP5004407B2 (no) |
KR (3) | KR100816221B1 (no) |
CN (2) | CN101156948A (no) |
AT (3) | ATE440614T1 (no) |
AU (1) | AU2002350660C1 (no) |
BR (1) | BR0213856A (no) |
CA (1) | CA2465792C (no) |
CY (3) | CY1108446T1 (no) |
DE (3) | DE10153601A1 (no) |
DK (3) | DK1308166T3 (no) |
EA (3) | EA013707B1 (no) |
ES (3) | ES2332576T3 (no) |
HK (1) | HK1057328A1 (no) |
HR (1) | HRP20040383B1 (no) |
HU (1) | HU230163B1 (no) |
IL (1) | IL205695A0 (no) |
MX (1) | MXPA04004155A (no) |
NO (1) | NO329789B1 (no) |
NZ (2) | NZ545414A (no) |
PL (1) | PL208343B1 (no) |
PT (3) | PT1308166E (no) |
SG (1) | SG148034A1 (no) |
SI (2) | SI1997510T1 (no) |
WO (1) | WO2003037363A2 (no) |
ZA (1) | ZA200403285B (no) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10153601A1 (de) | 2001-11-02 | 2003-05-22 | Paion Gmbh | DSPA zur Behandlung von Schlaganfall |
WO2004096267A1 (de) * | 2003-05-02 | 2004-11-11 | Paion Gmbh | Intravenöse injektion nicht-neurotoxischer plasminogen-aktivatoren zur behandlung von schlaganfall |
PL1622639T3 (pl) * | 2003-05-02 | 2013-06-28 | Lundbeck H As | Dożylne wstrzyknięcie nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu do leczenia udaru mózgu |
US20060135425A1 (en) * | 2003-05-02 | 2006-06-22 | Paion Deutschland Gmbh | Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke |
US20080057050A1 (en) * | 2003-05-02 | 2008-03-06 | Paion Deutschland Gmbh | Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke |
US20080213244A1 (en) * | 2003-05-05 | 2008-09-04 | Wolfgang Sohngen | Glutamate Receptor Antagonists as Neuroprotectives |
DE10342518A1 (de) * | 2003-09-12 | 2005-05-12 | Paion Gmbh | Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität |
JP2006241109A (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Paion Deutschland Gmbh | ヒトPセレクチンおよびDSPAα1に対する抗体を含む融合タンパク質 |
TWI482628B (zh) * | 2007-10-18 | 2015-05-01 | Lundbeck & Co As H | 新穎之血栓溶解病患次群 |
EP2558580A2 (en) | 2010-04-16 | 2013-02-20 | H. Lundbeck A/S | Method for the manufacture of recombinant dspa alpha1 |
WO2012093132A1 (en) * | 2011-01-05 | 2012-07-12 | Thrombogenics Nv | Plasminogen and plasmin variants |
AU2012296884B2 (en) | 2011-08-12 | 2015-02-05 | Thrombogenics N.V. | Plasminogen and plasmin variants |
AU2019413431A1 (en) | 2018-12-28 | 2021-07-08 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use |
US11613744B2 (en) | 2018-12-28 | 2023-03-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use |
Family Cites Families (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4766075A (en) | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
GR79202B (no) | 1982-05-05 | 1984-10-22 | Genentech Inc | |
US5244806A (en) * | 1985-08-26 | 1993-09-14 | Eli Lilly And Company | DNA encoding novel tissue plasminogen activator derivatives having kringles 1 and 2 deleted, vectors and host cells |
DE3643158A1 (de) | 1986-04-21 | 1987-11-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogen-aktivator(tpa) - derivat und seine herstellung |
JPH087179B2 (ja) * | 1986-09-27 | 1996-01-29 | 日本碍子株式会社 | ガスセンサ |
WO1988005081A2 (en) * | 1986-12-30 | 1988-07-14 | Cetus Corporation | Novel plasminogen activator |
IL87276A (en) * | 1987-08-03 | 1995-07-31 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Analog of a tissue plasminogen activator containing the Pringle 2 and protease regions only, DNA encoding it, processes for its preparation, and pharmaceutical preparations containing it |
EP0386240B1 (en) * | 1987-10-29 | 1995-07-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co. Ltd. | Novel polypeptide compounds |
US5094953A (en) | 1988-03-21 | 1992-03-10 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator variants |
IE69054B1 (en) * | 1988-07-20 | 1996-08-07 | Schering Ag | Vampire bat salivary plasminogen activators |
DE3825253A1 (de) | 1988-07-25 | 1990-02-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | T-pa-derivat und seine herstellung |
US5714145A (en) * | 1988-09-02 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
JPH0273774A (ja) * | 1988-09-09 | 1990-03-13 | Nec Corp | ファクシミリ装置 |
GB8901422D0 (en) * | 1989-01-23 | 1989-03-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | New tissue plasminogen activator |
DE3903581A1 (de) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogenaktivator-derivat |
US5676947A (en) * | 1989-02-07 | 1997-10-14 | Boehringer Manneheim Gmbh | Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins |
DE3917949A1 (de) * | 1989-05-30 | 1991-01-24 | Schering Ag | Neues thrombolytikum |
AU642404B2 (en) * | 1989-02-13 | 1993-10-21 | Schering Aktiengesellschaft Berlin Und Bergkamen | Novel thrombolytic |
US6008019A (en) * | 1989-02-13 | 1999-12-28 | Schering Aktiengesellschaft | Plasminogen activator from saliva of the vampire bat |
DE3904580A1 (de) | 1989-02-13 | 1990-08-16 | Schering Ag | Neues thrombolytikum |
JPH04506148A (ja) * | 1989-04-07 | 1992-10-29 | カンサーフォースクニングスフォンデン・アフ・1989(フォンデン・チル・フレメ・アフ・エクスペリメンテル・カンサーフォースクニング) | ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター |
US5891664A (en) * | 1989-04-07 | 1999-04-06 | Cancerforskningsfondet Af 1989 | Vectors and methods for recombinant production of uPA-binding fragments of the human urokinase-type plasminogen receptor (uPAR) |
JPH0352119A (ja) * | 1989-07-19 | 1991-03-06 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 光学式記録再生装置 |
NL8902454A (nl) | 1989-10-03 | 1991-05-01 | Stichting Centraal Lab | Mutanten van de humane plasminogeen activator inhibitor 1 (pai-1), hun bereiding en toepassing, en recombinante polynucleotiden die voor deze mutanten coderende genetische informatie omvatten. |
US5326700A (en) * | 1990-11-06 | 1994-07-05 | Eli Lilly And Company | DNA sequences encoding t-PA derivatives with cleavable sites |
ES2082465T3 (es) * | 1991-04-16 | 1996-03-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Unidad farmaceutica de envasado que contiene activadores de plasminogeno para la administracion multiple de bolos. |
DE4123845A1 (de) * | 1991-07-18 | 1993-01-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pharmazeutische verpackungseinheit enthaltend plasminogenaktivatoren zur mehrfachbolusgabe |
US5595736A (en) * | 1991-04-22 | 1997-01-21 | Eli Lilly And Company | Compounds and methods for treatment of thromboembolic disorders |
NL9101520A (nl) * | 1991-09-09 | 1993-04-01 | Stork Fibron Bv | Werkwijze voor het vervaardigen van een eetbaar produkt. |
JP3696617B2 (ja) | 1991-12-16 | 2005-09-21 | ジェネンテク,インコーポレイテッド | フィブリン特異性が改善されたt‐PA置換変異体 |
DK0677107T3 (da) * | 1992-12-04 | 1998-03-16 | Schering Ag | Thrombininhibitor fra protostomispyt |
US5510330A (en) * | 1994-03-25 | 1996-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Combinations of thrombolytically active proteins and non-heparin anticoagulants, and uses thereof. |
GB9412131D0 (en) * | 1994-06-17 | 1994-08-10 | British Bio Technology | Thrombolytic composition |
DE4423574A1 (de) | 1994-07-05 | 1996-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nicht-glykosylierte Plasminogenaktivator-Derivate und ihre Verwendung bei erhöhtem Blutungsrisiko |
US5827832A (en) | 1995-03-06 | 1998-10-27 | Interneuron Pharmaceuticals, Inc. | Method of protecting brain tissue from cerebral infarction subsequent to ischemia |
US5786187A (en) * | 1995-09-21 | 1998-07-28 | The Research Foundation Of State University Of New York | Method for reducing neuronal degeneration associated with seizure |
US5945432A (en) * | 1995-12-22 | 1999-08-31 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Thrombolytic agents and thienopyridine derivatives in acute stroke |
US20020081294A1 (en) * | 1996-01-23 | 2002-06-27 | Genentech, Inc. | Co-administration of a thrombolytic and an anti-CD18 antibody in stroke |
US5731186A (en) * | 1996-02-05 | 1998-03-24 | Schering Aktiengesellschaft | Method for the production of rDSPA α1 |
US6235947B1 (en) * | 1997-04-14 | 2001-05-22 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | D-mannitol and its preparation |
US5830349A (en) * | 1996-07-22 | 1998-11-03 | Dana Corporation | Flow inverter for filters |
JP2001501824A (ja) | 1996-10-01 | 2001-02-13 | ユニバーシティー オブ ジョージア リサーチ ファウンデーション,インコーポレイテッド | 昆虫特異的ダニ毒素遺伝子を発現する生物学的昆虫防除剤、方法および組成物 |
US6008109A (en) * | 1997-12-19 | 1999-12-28 | Advanced Micro Devices, Inc. | Trench isolation structure having a low K dielectric encapsulated by oxide |
KR20010069066A (ko) * | 2000-01-12 | 2001-07-23 | 이종원 | 저산소 농도하에서 생존이 가능하도록 하는 동물세포의배양방법 |
DE10008646A1 (de) | 2000-02-24 | 2001-09-13 | Kempten Elektroschmelz Gmbh | Beschichteter Formkörper aus Siliciumnitrid |
GB0025473D0 (en) * | 2000-10-17 | 2000-11-29 | Pfizer Ltd | Pharmaceutical combinations |
US20020089179A1 (en) * | 2000-12-30 | 2002-07-11 | Levon Guyumjan | Hose coupling apparatus and method |
DE10153601A1 (de) | 2001-11-02 | 2003-05-22 | Paion Gmbh | DSPA zur Behandlung von Schlaganfall |
PL1622639T3 (pl) | 2003-05-02 | 2013-06-28 | Lundbeck H As | Dożylne wstrzyknięcie nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu do leczenia udaru mózgu |
WO2004096267A1 (de) | 2003-05-02 | 2004-11-11 | Paion Gmbh | Intravenöse injektion nicht-neurotoxischer plasminogen-aktivatoren zur behandlung von schlaganfall |
US20080057050A1 (en) | 2003-05-02 | 2008-03-06 | Paion Deutschland Gmbh | Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke |
US20060135425A1 (en) | 2003-05-02 | 2006-06-22 | Paion Deutschland Gmbh | Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke |
US20080213244A1 (en) | 2003-05-05 | 2008-09-04 | Wolfgang Sohngen | Glutamate Receptor Antagonists as Neuroprotectives |
US20050085478A1 (en) | 2003-08-22 | 2005-04-21 | Pharmacia Corporation | Compositions of a cyclooxygenase-2 selective inhibitor and a low-molecular-weight heparin for the treatment of central nervous system damage |
DE10342518A1 (de) | 2003-09-12 | 2005-05-12 | Paion Gmbh | Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität |
TWI482628B (zh) | 2007-10-18 | 2015-05-01 | Lundbeck & Co As H | 新穎之血栓溶解病患次群 |
-
2001
- 2001-11-02 DE DE10153601A patent/DE10153601A1/de not_active Ceased
- 2001-12-17 AT AT01130006T patent/ATE440614T1/de active
- 2001-12-17 EP EP01130006A patent/EP1308166B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-17 ES ES01130006T patent/ES2332576T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-17 DE DE50115077T patent/DE50115077D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-17 DK DK01130006T patent/DK1308166T3/da active
- 2001-12-17 PT PT01130006T patent/PT1308166E/pt unknown
-
2002
- 2002-10-31 WO PCT/EP2002/012204 patent/WO2003037363A2/de active Application Filing
- 2002-10-31 EA EA200801714A patent/EA013707B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-10-31 PL PL369872A patent/PL208343B1/pl unknown
- 2002-10-31 EP EP08012976A patent/EP1997510B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-31 DK DK08012976.0T patent/DK1997510T3/da active
- 2002-10-31 US US10/494,004 patent/US20050048027A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-31 HU HU0402165A patent/HU230163B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-10-31 PT PT08012976T patent/PT1997510E/pt unknown
- 2002-10-31 JP JP2003539706A patent/JP5004407B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-31 SI SI200230980T patent/SI1997510T1/sl unknown
- 2002-10-31 AU AU2002350660A patent/AU2002350660C1/en not_active Ceased
- 2002-10-31 KR KR1020047006691A patent/KR100816221B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-10-31 SI SI200230745T patent/SI1441757T1/sl unknown
- 2002-10-31 EP EP02785348A patent/EP1441757B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-31 AT AT08012976T patent/ATE547115T1/de active
- 2002-10-31 DK DK02785348T patent/DK1441757T3/da active
- 2002-10-31 SG SG200604427-5A patent/SG148034A1/en unknown
- 2002-10-31 AT AT02785348T patent/ATE401910T1/de active
- 2002-10-31 ES ES08012976T patent/ES2382224T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-31 KR KR1020077017712A patent/KR20070087248A/ko active Application Filing
- 2002-10-31 PT PT02785348T patent/PT1441757E/pt unknown
- 2002-10-31 NZ NZ545414A patent/NZ545414A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-10-31 BR BR0213856-5A patent/BR0213856A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-10-31 EA EA200400624A patent/EA010858B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-10-31 CA CA2465792A patent/CA2465792C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-31 NZ NZ532903A patent/NZ532903A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-10-31 EA EA201000386A patent/EA201000386A1/ru unknown
- 2002-10-31 ES ES02785348T patent/ES2311070T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-31 EP EP10011603A patent/EP2368567A1/de not_active Withdrawn
- 2002-10-31 DE DE50212548T patent/DE50212548D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-31 MX MXPA04004155A patent/MXPA04004155A/es active IP Right Grant
- 2002-10-31 CN CNA2007101051509A patent/CN101156948A/zh active Pending
- 2002-10-31 KR KR1020097025518A patent/KR20090128583A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-10-31 CN CNB028234782A patent/CN100446810C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-11-07 HK HK03108108.9A patent/HK1057328A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-04-30 HR HRP20040383AA patent/HRP20040383B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-04-30 ZA ZA200403285A patent/ZA200403285B/en unknown
- 2004-06-01 NO NO20042262A patent/NO329789B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-12-20 US US11/311,475 patent/US20060142195A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-06-27 US US12/163,828 patent/US8071091B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-22 US US12/196,785 patent/US8119597B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-23 CY CY20081101193T patent/CY1108446T1/el unknown
-
2009
- 2009-01-05 JP JP2009000322A patent/JP2009137983A/ja not_active Withdrawn
- 2009-11-19 CY CY20091101206T patent/CY1109648T1/el unknown
-
2010
- 2010-05-11 IL IL205695A patent/IL205695A0/en unknown
-
2012
- 2012-02-10 US US13/370,706 patent/US20130039902A1/en not_active Abandoned
- 2012-04-30 CY CY20121100407T patent/CY1112957T1/el unknown
-
2014
- 2014-01-09 US US14/151,390 patent/US20140199287A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-03-24 US US15/079,550 patent/US20170051268A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8119597B2 (en) | Non-neurotoxic plasminogen activating factors for treating of stroke | |
NO337485B1 (no) | Anvendelse av en ikke-neurotoksiske plasminogenaktivatorer fra Desmodus rotundus DSPA-alfa-1, for fremstillingen av et terapeutisk medikament for intravenøst anvendelse ved behandling av cerebralt slag | |
JP2006525270A5 (no) | ||
JP2012077090A (ja) | 脳梗塞の処置のための非神経毒性プラスミノーゲン活性剤の静脈内注射 | |
US20060135425A1 (en) | Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke | |
US20080057050A1 (en) | Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke | |
AU2008201735A1 (en) | Non-neurotoxic plasminogen activating factors for treating stroke | |
Pugsley et al. | A new hope for stroke? Evidence for the use of rDSPAα1 (desmoteplase) in acute ischemic stroke | |
MXPA05011761A (en) | Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |