PT1997510E - Activador do plasminogénio salivar de desmodus (dspa) para tratamento do acidente vascular cerebral - Google Patents

Description

ΡΕ1997510 1 DESCRIÇÃO "ACTIVADOR DO PLASMINOGÉNIO SALIVAR DE DESMODUS (DSPA) PARA TRATAMENTO DO ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL" A invenção refere-se a uma utilização terapêutica de activadores do plasminogénio não neurotóxicos, em especial da saliva de Desmodus rotundus (DSPA), preferencialmente para o tratamento do acidente vascular cerebral.

Sob o termo "acidente vascular cerebral" são reunidos diferentes quadros de doenças, que se assemelham na sua sintomática clinica. É possivel uma primeira diferenciação destes quadros de doença a partir das respectivas patogéneses nas assim denominadas lesões isquémicas e lesões hemorrágicas.

Nas lesões isquémicas (isquémia) trata-se de uma diminuição ou interrupção da irrigação do cérebro devido à falta de fornecimento de sangue arterial. Isto é causado frequentemente por uma trombose de um vaso estenosado por aterosclerose, mas também por embolias artério-arteriais ou cardíacas.

As lesões hemorrágicas por outro lado têm origem entre outros numa perfuração das artérias que irrigam o cérebro danificadas por hipertonia arterial. De todas as 2 ΡΕ1997510 lesões cerebrais, no entanto somente aproximadamente 20% são causadas por esta forma de hemorragias, de forma que os acidentes vasculares cerebrais causados por trombose têm um significado muito maior. A isquémia de tecido neuronal implica - em comparação com isqémias de outros tecidos - uma proporção especial de necrose das células afectadas. A incidência de necrose aumentada pode ser explicada com base nos novos conhecimentos, pelo fenómeno da assim chamada excitotoxi-cidade, a qual se trata de uma complexa cascata de uma multiplicidade de passos de reacções. Esta é por conseguinte desencadeada por os neurónios isquémicos sofrendo falta de oxigénio, perderem rapidamente ATP e despolarizarem. Isto leva a uma libertação pós-sináptica aumentada do neurotransmissor glutamato, que por seu lado activa receptores do glutamato ligados à membrana que regulam os canais de catiões. Como consequência da elevada libertação de glutamato, os receptores do glutamato são no entanto hiper-excitados.

Os receptores de glutamato regulam por seu lado canais de catiões dependentes de voltagem, que são abertos com a ligação do glutamato aos seus receptores. Assim inicia-se uma corrente de entrada de Na+ e de Ca2+ para dentro da célula, que leva a uma perturbação maciça do metabolismo celular dependente de Ca2+ - inclusivamente do metabolismo da energia. Para a morte celular que ocorre de seguida, pode ser responsável especialmente a activação das 3 ΡΕ1997510 enzimas catabólicas dependentes de Ca2+ (Lee, Jin-Mo et al., "The changing landscape of isquemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamat neurotoxicity and deseases of the nervous system").

Mesmo apesar do mecanismo da neurotoxicidade mediada por glutamato actualmente ainda não ser conhecido em detalhe, parece existir no entanto concordância que este fenómeno contribui substancialmente para a morte celular neuronal após uma isquémia cerebral (Jin-Mo Lee et. al.).

No tratamento da isquémia cerebral aguda está em primeiro plano, juntamente com o salvaguardar das funções vitais e a estabilização de parâmetros fisiológicos, primeiro o intuito da reabertura do vaso fechado. Existem diferentes preparações com esta finalidade. A reabertura puramente mecânica não teve até agora nenhuns resultados satisfatórios, como por exemplo a PTCA no enfarte cardíaco. Somente com fibrinólise bem sucedida pôde ser conseguido até agora uma melhoria suficiente do estado dos doentes. Isto pode ocorrer por administração local através de catéter (PROCAT, um estudo com pró-uroquinase), este método no entanto não obteve autorização de uma substância farmacêutica, apesar dos primeiros resultados positivos. A fibrinólise própria do organismo baseia-se na actividade proteolítica da plasmina serino-protease, que tem origem numa catálise (activação) do precursor inactivo plasminogénio. A activação natural do plasminogénio ocorre 4 ΡΕ1997510 através dos activadores do plasminogénio do próprio organismo u-PA (activador do plasminogénio tipo-uroquinase) e t-PA (Tissue Plasminogen Activator). 0 último forma - ao contrário do u-PA - juntamente com fibrina e plasminogénio um assim chamado complexo activador. A actividade catalítica do t-PA é por conseguinte dependente da fibrina e verifica-se na presença de fibrina um aumento aproxima-damente de 550 vezes. Juntamente com a fibrina, o fibri-nogénio também pode estimular a catálise mediada por t-PA de plasmina em plasminogénio - mesmo que numa proporção muito menor. Assim a actividade do t-PA é aumentada somente em 25 vezes na presença do fibrinogénio. Os produtos de degradação da fibrina (fibrin degradation products (FDP)) estimulam por seu lado também a actividade do t-PA.

Os ensaios iniciais do tratamento trombolítico do acidente vascular cerebral agudo são dos anos 1950. No entanto apenas a partir de 1995 foram realizados os primeiros ensaios clínicos de grande envergadura com estreptoquinase, um fibrinolítico de streptococcus beta-hemolítico. A estreptoquinase forma com o plasminogénio um complexo, que é capaz de converter outras moléculas de plasminogénio em plasmina. O tratamento com estreptoquinase está no entanto associado a desvantagens substanciais, pois a estreptoquinase como protease bacteriana pode desencadear no corpo reacções alérgicas. Também pode existir uma assim chamada resistência à estreptoquinase devido a infecção por 5 ΡΕ1997510 streptococcus anterior com a formação de anticorpos respectivos, o que dificulta um tratamento. Para além disso ensaios clinicos na Europa (Multicenter Acute Stroke Trial of Europe (MAST-E), Multicenter Acute Stroke Trial of Italy (MAST-I)) e Austrália (Australien Streptokinase Trial (AST)) indicaram de tal forma um risco de mortalidade aumentado e o perigo considerável de hemorragias intra-cerebrais (intracerebral hemorrhage, ICH) após o tratamento de doentes com estreptoquinase, que estes estudos tiveram até de ser interrompidos prematuramente.

Num ensaio terapêutico alternativo é administrado uroquinase - também um fibrinolitico "clássico", que ao contrário de estreptoquinase não apresenta propriedades antigénicas, pois trata-se neste caso de uma enzima própria do organismo presente em numerosos tecidos. Representa um activador do plasminogénio independente de co-factor. A uroquinase é produzida em cultura de células renais.

Existe experiência de grande envergadura na área da trombólise terapêutica com o activador do plasminogénio do tipo tecidular - o assim chamado rt-PA - (ver EP 0 093 619, patente US 4 766 075), que é produzido em células recombinantes de Hamster. Com t-PA foram - juntamente com a indicação principal enfarte agudo no miocárdio - realizados mundialmente nos anos 1990 uma série de ensaios clinicos com resultado em parte ainda não compreendidos e discrepantes. Assim foram primeiro, no assim chamado European Acute Stroke Trial (ECASS), tratados doentes no 6 ΡΕ1997510 espaço de um período de tempo de 6 horas após o inicio dos sintomas de acidente vascular cerebral intravenosamente com rt-PA e determinado a taxa de mortalidade assim como o índice de Barthel após 90 dias como medida de incapacidade ou de independência funcional na vida diária dos doentes. Verificou-se que não havia nenhuma melhoria significativa da funcionalidade na vida diária, mas sim um - mesmo quando não significativo - aumento da mortalidade. Isto permitiu a conclusão que um tratamento trombolítico com rt-PA poderia ser possivelmente vantajoso para doentes escolhidos individualmente segundo a sua história clinica, imediatamente após o inicio do acidente vascular cerebral. Com base nos riscos aumentados observados de uma hemorragia intra-cerebral (ICH) após apenas poucas horas após o inicio do acidente vascular cerebral foi no entanto desaconselhado uma utilização generalizada de rt-PA no espaço do período de tempo investigado de seis horas após o inicio do acidente vascular cerebral (assim C. Lewandowski C e Wiliam Barsan, 2001: Treatment of Acute Strocke; in: Annals of Emergency Medicine 37:2; pág. 202 e seguintes). O tratamento trombolítico do acidente vascular cerebral foi mais tarde também objecto de estudo de um ensaio clínico do National Institute of Neurologic Disorder and Stroke (assim chamado NINDS rtPA Stroke Trial) nos EUA. No entanto a investigação do efeito de um tratamento rt-PA intravenoso no espaço de um período de tempo de apenas três horas após o inicio dos sintomas, tinha em primeiro plano o estado de saúde dos doentes após três meses. Apesar dos 7 ΡΕ1997510 autores verificarem também aqui um risco aumentado para ICH, é recomendado no entanto o tratamento com rt-PA no espaço deste periodo de tempo limitado de três horas com base nos efeitos positivos também reconhecidos neste estudo deste tratamento na funcionalidade na vida diária dos doentes.

Em dois outros estudos (ECASS II Trail; Alteplase Thrombolysis for Acute Noninterventional Therapy in Ischemic Stroke (ATLANTIS) foi investigado, se esta afirmação positiva sobre o efeito do tratamento com rt-PA no espaço de três horas após o inicio do acidente vascular cerebral também era comprovado num tratamento num periodo de tempo de seis horas. Esta questão não pôde no entanto ser respondida de forma positiva, pois com um tratamento neste periodo de tempo, além do risco aumentado de ICH, não foi observado nenhuma melhoria dos sintomas clinicos ou uma diminuição da mortalidade. Estes resultados em parte contraditórios levaram a uma grande cautela na utilização do rt-PA. Assim foi já constactado em 1996 numa publicação do American Heart

Association, que predominava entre os médicos um cepticismo marcado relativamente ao tratamento trombolitico do acidente vascular cerebral, que não se verificava relativamente ao tratamento do enfarte do miocárdio com f ibrinolí ticos (van Gijn J, MD, FRCP, 1996 - Circulation 1996, 93: 1616-1617). ΡΕ1997510

Uma justificação para este cepticismo é encontrada, publicado pela primeira vez em 1997 e actualizada em Março de 2001, numa sintese de todos os "Stroke Trials". Segundo esta, todos os tratamentos com trombolíticos (uroquinase, estreptoquinase, rt-PA ou uroquinase recombinada), levavam especialmente devido a ICH, a uma mortalidade significativamente aumentada no espaço dos primeiros dez dias após o acidente vascular cerebral, enquanto que o tratamento num periodo de tempo de seis horas reduzia o número total ou dos doente mortos ou incapacitados. É assim desaconselhado uma larga utilização de trombolíticos no tratamento do acidente vascular cerebral.

Estes resultados levaram já anteriormente outros autores à afirmação bastante sarcástica, que os doentes com acidente vascular cerebral teriam agora a escolha de morrer ou sobreviver incapacitados (SCRIP 1997: 2265, 26). Não obstante, o tratamento com rt-PA representa actualmente o único método de tratamento autorizado pela Food and Drug Administration (FDA) nos EUA para a isquémia cerebral aguda. Esta é no entanto limitada ao tratamento com rt-PA no espaço de três horas após o inicio do acidente vascular cerebral. A autorização do rt-PA ocorreu em 1996. Imediatamente antes, nomeadamente no ano 1995, foram conhecidos os primeiros indícios dos efeitos secundários prejudiciais do 9 ΡΕ1997510 rt-PA, que levou à hipótese de explicação dos efeitos dramáticos do rt-PA no tratamento do acidente vascular cerebral fora do período de tempo de tratamento de três horas. Após isso, as células microgliais e as células neuronais do hipocampo produzem t-PA próprio do organismo, que participa na excitotoxicidade mediada pelo glutamato. Esta conclusão surgiu através de uma comparação de ratos com deficiência de t-PA e ratos do tipo selvagem, nos quais foi respectivamente injectado agonistas de glutamato no hipocampo. Os ratos com deficiência de t-PA demonstraram uma resistência claramente aumentada contra o glutamato aplicado externamente (intratecal) (Tsirka SE et. al., Nature, Vol. 377, 1995, "Exzitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator"). Estes resultados foram confirmados no ano 1998, quando Wang et al. pôde comprovar em ratos com deficiência de t-PA quase uma duplicação do tecido neuronal necrótico após a injecção intravenosa de t-PA. Este efeito negatico do t-PA externo era no entanto em ratos do tipo selvagem apenas aproximadamente 33% (Wang et al., 1998, Nature, "Tissue plasminogen activator (t-PA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild type and t-PA deficient mice").

Nicole et al. publicaram mais resultados sobre a estimulação da excitotoxicidade através de t-PA no início do ano 2001 (Nicole O; Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET; Vivien D e Buisson A, 2001: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator 10 ΡΕ1997510 enhances NMDA receptor-mediated signalling; in: Nat Med 7, 59-64) . Eles puderam provar que o t-PA libertado pelos neurónios corticais despolarizados interage com a assim chamada sub-unidade NR1 do receptor do glutamato do tipo NMDA e a dissocia. Esta modificação leva a um aumento da actividade dos receptores, que por sua vez é responsável pela lesão tecidular aumentada após a administração do NMDA agonista do glutamato através de uma excitotoxicidade induzida. 0 t-PA actua assim de forma neurotóxica através da activação do receptor do glutamato do tipo NMDA.

De acordo com uma outra hipótese de explicação, a neurotoxicidade do t-PA deve-se indirectamente à activação da plasmina do plasminogénio. O determinante em si da neurotoxicidade é assim, de acordo com este modelo, a plasmina (Chen ZL e Strickland S, 1997: Neuronal Death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalysed degradation of laminin. Cell: 91, 917-925).

Uma descrição condensada dos efeitos neurotóxicos dependentes do tempo do t-PA é mostrada na fig. 9. Ai além disso é claro a toxicidade aumentada do t-PA recombinante em comparação com o t-PA endógeno, que provavelmente se deve ao facto de o rt-PA entrar no tecido em concentrações mais elevadas.

Que apesar destes indicios dos efeitos secundários neurotóxicos do t-PA e apesar do aumento comprovado da mortalidade pelo t-PA, tivesse havido no entanto a 11 ΡΕ1997510 autorização legal do medicamento pela FDA, pode porventura ser explicado apenas pela falta de alternativas inócuas e eficazes - e uma análise custo-beneficio muito pragmática. Permanece no entanto como antes a necessidade de tratamentos seguros, em que no desenvolvimento de novos trom-bolíticos - contando que portanto não é de se afastar totalmente da trombólise - tem de ser considerado o problema da nerotoxicidade (assim p.ex. Wang et al a.a.O.; Lewandowski e Barsan 2001 a.a.O.).

Por este motivo não se efectuaram mais investigações de trombolíticos conhecidos, inclusive com o DSPA (activador do plasminogégio de Desmodus rotundus) , para o desenvolvimento de uma nova terapêutica para o acidente vascular cerebral, apesar de em principio todos os trombolíticos poderem ser apropriados e por exemplo no caso do DSPA já ter sido referido numa primeira publicação sobre a sua possível mais valia para esta indicação (Medan P; Tatlisumak T; Takano K; Carano RAD; Hadley SJ; Fisher M: Thrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogen activator (rDSPA) in a rat embolic stroke model; in Cerebrovasc Dis 1996: 6; 175-194 (4th International Symposium on Thrombolic Therapy in Acute Ishemic Stroke)). Precisamente no caso do DSPA, trata-se no entanto de um activador do plasminogénio com elevada homologia (semelhança) com o t-PA, de forma que - simultaneamente com a desilusão sobre os efeitos secundários do t-PA - também não foi colocado no DSPA mais nenhumas esperanças. 12 ΡΕ1997510

Pelo contrário ultimamente é, entre outros, seguida a estratégia para melhoria do actual tratamento do acidente vascular cerebral trombolítico, não administrar mais intravenosamente mas intra-arterial através de um catéter directamente no trombo intravascular. As primeiras experiências têm sido obtidas com a uroquinase recombi-nante. Desta forma pode ser possivelmente reduzida a dose necessária para a trombólise e assim uma parte dos efeitos secundários. Esta forma de aplicação no entanto exige um alto dispêndio técnico e por isso não está à disposição em todo o sitio. Além disso exige um determinado tempo para a preparação minuciosa do doente, que nem sempre está à disposição e representa um risco adicional.

Além disso é investido actualmente em anticoagu-lantes como heparina, aspirina ou ancrod, o principio activo do veneno da vibora da sub-familia Crotalinae da Malásia. Dois estudos clinicos (International Stroke Trial (IST) e Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST)) dirigidos, entre outros, também à investigação do efeito da heparina, não indicam no entanto para uma melhoria significativa da mortalidade e um impedimento de um novo acidente vascular cerebral.

Um outro tipo novo de método de tratamento, não equaciona a intervenção quer no trombo quer na liquefação do sangue ou anticoagulantes, mas sim tenta aumentar a vitalidade das células lesionadas pela interrupção do fornecimento de sangue (WO 01/51613 AI e WO 01/51614 Al). 13 ΡΕ1997510

Para isso são administrados antibióticos do grupo das quinolonas, aminoglicosideos ou cloranfenicol. Devido a um motivo semelhante é proposto além disso iniciar imediatamente após o acidente vascular cerebral com a administração de citicolina, que é dissociada no organismo em citidina e colina. Estes produtos de dissociação são componentes da membrana celular e podem assim favorecer a regeneração do tecido lesado (patente US 5 827 832).

Novos esforços na procura de métodos de tratamento seguros baseiam-se nos novos conhecimentos, que uma parte das consequências fatais do acidente vascular cerebral se devem apenas indirectamente à interrupção do fornecimento de sangue mas também directamente à excitotoxi-cidade ou neurotoxicidade com participação do receptor do glutamato hiper-excitado, o que por seu lado é intensificado especialmente também pelo t-PA (ver acima). Uma forma de diminuição desta excitotoxicidade é assim a aplicação dos assim chamados neuroprotectores. Estes podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com fibrinolí-ticos, de forma a assim minimizar os seus efeitos neuro-tóxicos. Eles podem levar a uma atenuação da excitotoxicidade, ou directamente por exemplo como antagonistas dos receptores do glutamato ou indirectamente através do bloqueio de canais de sódio ou de cálcio dependentes de voltagem (Jin-Mo Lee et. al. a.a.O.)

Uma inibição competitiva (antagonização) do receptor do glutamato do tipo NMDA é possivel por exemplo com 14 ΡΕ1997510 2-amino-5-phosphonovalerato (APV) ou 2-amino-5-fosphono-heptanoato (APH). Uma inibição não competitiva pode ser alcançada por exemplo com substâncias que se ligam ao lado fenciclidina dos canais, como fenciclidina, MK-801, dextrorfano ou quetamina.

Até à data os tratamentos com neuroprotectores não tiveram no entanto o sucesso desejado, possivelmente porque eles têm de ser combinados com trombolíticos, de forma a desenvolver o seu efeito protector. Isto é válido da mesma forma para outros princípios activos (ver fig. 10) .

Mesmo com uma combinação de t-PA e um neuro-protector é possível no entanto no máximo um sucesso no sentido da limitação das lesões. As desvantagens da neurotoxicidade do fibrinolítico utilizado em si não são no entanto evitadas. A presente invenção tem assim como objectivo, pôr à disposição uma nova preparação terapêutica para o tratamento do acidente vascular cerebral nos humanos.

Este objectivo é atingido através da utilização de DSPA alfa 1 de acordo com a reivindicação principal para o tratamento terapêutico do acidente vascular cerebral. Outras utilizações vantajosas são respectivamente objecto das outras sub-reivindicações. 15 ΡΕ1997510 A utilização segundo a invenção deste activador do plasminogénio baseia-se no conhecimento, que a neurotoxicidade do activador do plasmogénio tecidular (t-PA) se deve a que devido à destruição tecidular no cérebro provocado pelo acidente vascular cerebral, a barreira hematoencefálica é lesionada ou destruída e assim o fibrinogénio que circula no sangue pode penetrar no tecido neuronal do cérebro. Ai activa t-PA que - indirectamente através da activação do receptor do glutamato ou através da activação do plasminogénio - leva a lesões tecidulares adicionais. Para evitar este efeito é então utilizado segundo a invenção um activador do plasminogénio que apresenta uma selectividade à fibrina aumentada e - em conclusão invertida - uma capacidade de activação diminuída pelo fibrinogénio. Daí resulta que o activador do plasminogénio segundo a invenção não é activado - ou numa medida claramente reduzida em comparação com o t-PA - na passagem do fibrinogénio do sangue para o tecido neuronal na sequência da barreira hematoencefálica danificada, pois o seu activador fibrina não consegue penetrar no tecido neuronal devido ao seu tamanho. Os activadores do plasminogénio segundo a invenção são assim não neurotóxicos. 0 activador do plasminogénio DSPA da saliva do morcego-vampiro (Desmodus rotundus) apresenta um elevado aumento da actividade na presença de fibrina - nomeadamente um aumento na grandeza de 100.000. Sob o termo DSPA são reunidas quatro proteases diferentes que satisfazem uma 16 ΡΕ1997510 necessidade fundamental do morcego-vampiro, nomeadamente o tempo de hemorragia aumentado das feridas das presas provocadas por estes animais (Cartwright, 1974). Estas quatro proteases (DSPAai, DSPAa2, DSPAP, DSPAY) apresentam identicamente uma elevada semelhança (homologia) com o t-PA humano. Elas também apresentam actividades fisiológicas semelhantes ou análogas, que justificam o seu agrupamento sob o termo genérico DSPA. DSPA é objecto da EP 0 352 119 AI assim como a patente US 6 008 019 e 5 830 849 que por este meio são referidas em todo o seu alcance para fins de revelação. A DSPAd trata-se da protease mais bem investigada até à data deste grupo. Ela apresenta na sua sequência de aminoácidos uma homologia de acima de 72% relativamente à sequência de aminoácidos do conhecido t-PA humano (Kràtzschmar et al., 1991). No entanto existem entre a t-PA e DSPA duas diferenças essenciais. Primeiro nomeadamente a DSPA representa como cadeia única relativamente a substratos peptidicos uma molécula completamente activa, que não - como o t-PA - é convertida numa forma de duas cadeias (Gardell et al, 1989; Kràtzschmar et al., 1991). Segundo, a actividade catalítica do DSPA apresenta uma dependência practicamente absoluta da fibrina (Gardell et al., 1989; Bringmann et al., 1995; Toschi et al. , 1998) . Assim por exemplo a actividade do DSPAoii, na presença de fibrina aumenta 100.000 vezes, enquanto que a actividade do t-PA apenas aumenta em aproximadamente 550 vezes. A actividade do DSPA é pelo 17 ΡΕ1997510 contrário induzida de forma menos forte pelo fibrinogénio; apresenta apenas um aumento de 7 - 9 vezes (Bringmann et al., 1995). 0 DSPA é assim consideravelmente mais dependente da fibrina e especifico para a fibrina do que o t-PA do tipo selvagem, que é apenas activado em aproximadamente 550 vezes pela fibrina.

Devido às suas propriedades fibrinoliticas e a sua grande semelhança com o t-PA, o DSPA representa assim um candidato interessante para o desenvolvimento de um trombolitico. Contudo o desenvolvimento do DSPA como trom-bolítico no passado foi limitado ao tratamento do enfarte do miocárdio, pois - devido à participação do t-PA na neu-rotoxicidade dependente do glutamato - não existiam esperanças legitimas, de empregar com sucesso um activador do plasminogénio aparentado do t-PA no tratamento do acidente vascular cerebral agudo.

No entanto agora demonstrou-se surpreendentemente, que o DSPA apesar da elevada semelhança (homologia) com o t-PA e apesar da extensa concordância da sua acção fisiológica com o t-PA, ao contrário deste não apresenta nenhum efeito neurotóxico. Com esta observação implica o reconhecimento, que o DSPA afinal pode ser utilizado como trombolitico no tratamento do acidente vascular cerebral, sem que assim esteja associado um risco adicional de lesão do tecido neuronal. Isto significa em especial, que o DSPA também pode ser utilizado mais tarde do que três horas após o inicio dos sintomas de um acidente vascular cerebral. 18 ΡΕ1997510

Outra aprendizagem da presente invenção é a possibilidade resultante do conhecimento anteriormente descrito de também modificar ou produzir outros activadores do plasminogénio de tal forma, que eles apresentem esta caracteristica do DSPA ou seja não apresentem a neuroto-xicidade do t-PA. Fundamento para isso é a relação do efeito descoberto, que permite no futuro converter activadores do plasminogénio neurotóxicos em activadores do plasminogénio não neurotóxicos ou produzir com base em activadores do plasminogénio neurotóxicos conhecidos ou descobertos em activadores do plasminogénio não neurotóxicos . 0 novo conhecimento baseia-se em investigações de comparação in vivo do efeito neurodegenerativo do t-PA por um lado e do DSPA por outro lado, que foram realizados com o auxilio do assim chamado "modelo do ácido caínico", assim como um modelo para investigação das lesões do striatum induzidas pelo NMDA. 0 modelo do ácido cainico (também modelo de lesão do ácido cainico) baseia-se no facto que a cascada do glutamato neurotóxica ser estimulada através da administração de ácido cainico (KA) externo como agonista do receptor do glutamato do tipo do ácido cainico (tipo-KA) assim como dos receptores do glutamato NMDA e AMPA. Através da utilização de uma linhagem de ratos com deficiência de t-PA como modelo de experiência pôde ser assim mostrado que 19 ΡΕ1997510 a sensitividade dos animais teste relativamente ao ácido cainico apenas atingia o nivel dos ratos do tipo selvagem através de uma administração adicional de t-PA externo. Em compensação uma infusão de uma concentração equimolar de DSPA sob as mesmas condições experimentais não foi capaz de restabelecer a sensitividade relativamente ao ácido cainico (KA). 0 efeito do t-PA não pôde assim ser substituído pelo DSPA. Um resumo destes resultados está representado na tabela 2.

Tabela 2

Comprimento do hipocampo intacto (mm) Grupo de Número de Lado contralateral Lado ipsilateral Percentagem tratamento animais média (SEM) média (SEM) remanescente Infusão t-PA (1,85 μΜ) + KA 12 15,99 (0,208) 3,63 (0,458) 22,7* Infusão DSPA (1,85 μΜ) + KA 11 16, 07 (0, 124) 13,8 (0,579) 85,87 Infusão t-PA (1,85 μΜ) + PBS 3 16,75 (0,381) 17,08 (0,363) 101,97 Infusão DSPA (1,85 μΜ) + PBS 3 15,75 (0,629) 15,83 (0,363) 100,50 Infusão t-PA (0,185 μΜ) + KA 3 15,60 (0,702) 5, 07 (1, 09) 32,5 Infusão DSPA (18,5 μΜ) + KA 3 16,06 (0,176) 13,80 (1,22) 85,93 * P < 0,0001

Investigações quantitativas neste modelo mostraram que mesmo um aumento de 10 vezes da concentração de 20 ΡΕ1997510 DSPA não restaurava a sensitividade dos ratos com deficiência de t-PA face ao tratamento com KA, enquanto que no entanto já uma concentração de t-PA 10 vezes mais baixa levava a lesões do tecido induzido por KA. Daí conclui-se que no desenvolvimento da neurodegeneração após tratamento com KA, o DSPA apresenta uma actividade pelo menos 100 vezes menor que o t-PA (ver também figuras 11 e 12).

Num segundo modelo da neurodegeneração, foram comparados os possíveis efeitos do t-PA assim como do DSPA no desenvolvimento da neurodegeneração dependente de NMDA em ratos do tipo selvagem. Para isso os ratos do tipo selvagem foram injectados com NMDA (como agonista do receptor do glutamato do tipo NMDA) isoladamente ou em combinação com t-PA ou DSPA. Este modelo permite a investigação do efeito destas proteases em condições, sob as quais ocorre mesmo assim uma neurodegeneração e é provocado devido ao colapso da barreira hematoencefálica uma entrada de proteínas plasmáticas (Chen et al., 1999).

Ao trabalhar com este modelo a injecção de NMDA levou a lesões reproduzíveis no striatum dos ratos. O volume destas lesões foi aumentado através da injecção concomitante de t-PA e NMDA em pelo menos 50% Pelo contrário uma co-injecção com D S P Aa i levou a nenhum agravamento do aumento das lesões provocadas pela injecção de NMDA. Até na presença de proteínas plasmáticas, que devido à neurodegeneração dependente de NMDA puderam 21 ΡΕ1997510 difundir para a área de lesão, o DSPA não levou a um aumento da neurodegeneração (ver também tabela 3).

Tabela 3

Grupo de tratamento Número de ratos do Volume de lesão tipo selvagem médio (mm3) (SEM) NMDA isoladamente 8 1,85 (0,246) NMDA + t-PA 8 3,987 (0,293)* NMDA + DSPA 8 1,656 (0,094)** t-PA isoladamente 3 0,20 (0,011) DSPA isoladamente 3 0,185 (0,016) ** não significativo

Estes resultados mostram que o DSPA no sistema nervoso central de um mamífero - e assim também no humano -representa uma protease essencialmente inerte e - ao contrário de t-PA - não provoca um aumento da neuro-toxicidade induzida por KA ou NMDA. Esta ausência de neurotoxicidade torna o DSPA contrariamente às expectativas um trombolítico apropriado para o tratamento do acidente vascular cerebral agudo.

Os primeiros resultados de estudos clínicos mostram a transmissibilidade destes resultados também para o tratamento do acidente vascular cerebral nos humanos. Assim é verificado em doentes após perfusão bem sucedida claras melhorias (melhoria em 8 pontos NIHSS ou valor NIHSS 0-1). A tabela 1 torna isto evidente. ΡΕ1997510 22

Tabela 1

Doente NIHSS Referência inicial Pós tratamento Dia 7 Dia 30 Dia 90 sAEs 1001 12 7 4 4 k Re-infarte 1002 8 9 2 0 0 1003 8 10 12 10 k 1004 8 4 2 0 0 1005 11 11 4 5 k 1006 9 7 1 k k 1007 14 6 k k k 2001 19 20 — — — ICH, morte 2002 15 21 — — — ICH, morte 3001 8 7 6 5 :k 3002 15 16 9 8 k 3003 10 19 21 :k — Morte dia 39

Devido à ausência de neurotoxicidade do DSPA assim como dos restantes activadores do plasminogénio também não neurotóxicos (ver acima) resulta como especialmente vantajoso para o tratamento do acidente vascular cerebral o facto, que a utilização destes activadores do plasminogénio - diferente dos do t-PA do tipo selvagem -não está limitado apenas à janela de tempo estreita de até três horas após o inicio do acidente vascular cerebral. Pelo contrário o tratamento pode ocorrer também num período de tempo mais tarde - assim também após seis horas ou ainda mais tarde sem que se confronte - como no t-PA - com o risco de um desenvolvimento da excitotoxicidade. As 23 ΡΕ1997510 primeiras investigações clinicas com o DSPA comprovam até o tratamento sem inconvenientes de doentes num periodo de tempo de mais de 6 ou 9 horas após o inicio dos sintomas.

Esta opção de tratamento temporalmente ilimitado com activadores do plasminogénio não neurotóxico é justamente por isso tão significativa, pois assim é possível pela primeira vez um tratamento sem hesitação de doentes com acidente vascular cerebral agudo, nos quais o inicio do acidente vascular cerebral não pôde ser determinado temporalmente com suficiente segurança. Este grupo de doentes era excluído até agora por razões de precaução e da avaliação do risco da trombólise com activadores do plasminogénio. Assim é suprimido uma contra-indicação fundamental para a utilização permitida de um trombolítico no acidente vascular cerebral. 0 DSPA assim como os restantes activadores do plasminogénio não neurotóxicos não apresentam em si nenhum efeito secundário neurotóxico. Pelo contrário pode ser vantajoso administrá-los no tratamento de um acidente vascular cerebral em combinação com um neuroprotector, de forma a limitar o mais possível assim a lesão tecidular provocada pelo glutamato próprio do organismo. Para isso podem servir neuroprotectores inibidores competitivos ou não-competitivos do receptor do glutamato. Combinações convenientes são por exemplo com os inibidores conhecidos dos receptores do glutamato do tipo do NMDA, do tipo do 24 ΡΕ1997510 ácido cainico ou do tipo do quisqualato, assim p.ex. com APV, APH, fenciclidina, MK-801, dextrorfano ou quetamina.

Também pode ser vantajosa uma combinação com catiões, pois os catiões, especialmente os iões Zn, bloqueiam os canais de catiões regulados pelo receptor do glutamato e podem assim reduzir os efeitos neurotóxicos.

Numa outra forma de execução vantajosa os activadores do plasminogénio não neurotóxicos podem ser combinados com pelo menos uma outra terapêutica ou com um adjuvante farmaceuticamente sem inconvenientes. Especialmente vantajoso é a combinação com uma terapêutica, que através da vitalização das células ajuda a evitar a lesão tecidular, contribui para uma regeneração do tecido já lesionado ou serve para evitar acidentes vasculares cerebrais posteriores. Vantajoso podem ser p.ex. combinações com antibióticos como quinolonas, anticoagulantes como heparina ou hirudina assim como com citicolina ou aspirina.

Vantajoso pode ser além disso também uma combinação com pelo menos um inibidor da trombina. Preferencialmente podem ser utilizados trombomodulina, análogos da trombomodulina, como p.ex. solulina, triabina ou paldipina. Também são vantajosas as combinações com substâncias anti-inflamatórias, que influenciam as infiltrações de leucócitos. 25 ΡΕ1997510

INVESTIGAÇÕES COMPARATIVAS DE T-PA E DSPA A. Métodos 1. Animais

Ratos do tipo selvagem (c57/Black 6) e ratos com deficiência de t-PA (ratos t-PA -/-) (c57/Black 6) (Carmeliet et al., 1994) foram colocados à disposição pelo Dr. Peter Carmeliet, Leuven. 2. Extracto proteico do tecido cerebral A determinação da actividade proteolítica no tecido cerebral após a infusão de t-PA ou DSPAai ocorreu através da análise zimográfica (Granelli-Piperno e Reich, 1974). Após uma duração de infusão de 7 dias no hipocampo, os ratos foram anestesiados, de seguida perfundidos trans- cardiacamente com PBS e os cérebros foram retirados. A região do hipocampo foi retirada, adicionado a tubos Eppendorf e : incubado com os mesmos volumes (w/v) (apro- ximadamente 30-50 μΐ) de 0, 5% NP-40 tampão de lise sem inibidores da protease (0, 5% NP-40, 1OmM tris -HC1 pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, lmM EDTA). Os extractos do cérebro foram homogeneizados através de um homogeneizador de vidro manual e deixado em gelo durante 30 min. As amostras foram de seguida centrifugadas e o sobrenadante removido. As quantidades de proteína presentes foram determinadas (reagente Bio-Rad). 26 ΡΕ1997510 3. Análise zimográfica das proteases A actividade proteolítica nas amostras ou nos extractos do tecido cerebral foi determinada através de análise zimográfica de acordo com o método de Granelli-Piperno e Reich (1974) . As amostras da proteina recombinante (até 100 nmol) ou do extracto do tecido cerebral (20 pg) foram submetidas a SDS-PAGE a 10 % sob condições não-reductoras. Os géis foram retirados das placas, lavados durante duas horas com 1% Triton x 100 e de seguida colocados num gel de agarose com fibrinogénio e plasminogénio polimerizado (Granelli-Piperno e Reich, 1974) . Os géis foram incubados a 37° C numa câmara húmida até serem reconhecíveis zonas proteolisadas. 4. Infusão intra-hipocampo de t-PA, DSPA e injecção subsequente com ácido caínico 0 modelo de lesão- ácido caínico baseia-se na preparação de Tsirka et al. (1995) . Os animais foram injectados intraperitonealmente (i.P.) com atropina (4 mg/kg), depois anestesiados com uma injecção i.p. de pen-tobarbital de sódio (70 mg/kg). De seguida foram colocados num suporte estereotáctico, de forma que uma bomba microosmótica (Alzet model 1007D, Alzet CA. USA) com 100 μΐ PBS ou t-PA humano recombinante (0,12 mg/ml); 1,85 μΜ) ou DSPAai (1,85 μΜ) pôde ser implantada subcutaneamente entre as omoplatas. As bombas foram ligadas através de tubinhos 27 ΡΕ1997510 estéreis a uma cânula cerebral e através de uma abertura no crânio colocado nas coordenadas bregma -2,5 mm, médio-lateral 0,5 mm e dorsoventral 1,6 mm, de forma a introduzir o liquido próximo da linha média. As cânulas foram de seguida coladas na posição desejada e as bombas foram abertas, de forma a infundir as soluções correspondentes a uma taxa de fluxo de 0,5 μΐ por hora ao longo de sete dias.

Dois dias depois da infusão das proteases os ratos foram de novo anestesiados e introduzido no suporte estereotáctico. 1,5 nmol ácido cainico em 0,3 μΐ PBS foi de seguida injectado unilateralmente no hipocampo. As coordenadas eram: bregma 2,5 mm, médio-lateral 1,7 mm e dorsoventral 1, 6 mm. A excitoxina (KA) foi introduzida durante 30 seg. Após o tratamento com ácido cainico a agulha permaneceu durante mais 2 min nestas coordenadas, de forma a impedir o refluxo do liquido. 5. Exame do cérebro

Cinco dias após a injecção de KA os animais foram anestesiados e perfundidos transcardiacamente com 30 ml PBS, seguido de 7 0 ml de uma solução de paraformaldeido a 4%, fixado durante 24 horas no mesmo fixador, seguido de uma incubação em 30 % sucrose durante mais 24 horas. Cortes coronais (40 pm) do cérebro foram de seguida cortados com um micrótomo de congelação, ou corado com tionina (BDH, Austrália) ou preparado para o exame imuno-histoquimico. 28 ΡΕ1997510 6. Quantificação da taxa de perda neuronal no hipocampo A quantificação da perda neuronal nos sub-campos do hipocampo CA1-CA3 foi realizado como anteriormente descrito (Tsirka et al. 1995; Tsirka et al. 1996). Foram preparados 5 cortes uns a seguir aos outros do hipocampo dorsal de todos os grupos tratados, em que os cortes abrangiam efectivamente o local de injecção de KA e a região da lesão. Os sub-campos do hipocampo (CA1-CA3) destes cortes foram seguidos através de reproduções da camera lúcida do hipocampo. 0 comprimento total destes sub-campos foi medido em comparação com padrões de 1 mm, que foram seguidos com o mesmo aumento. Foi determinado o comprimento dos cortes de tecido com neurónios piramidais vitais (com morfologia normal) e o comprimento dos cortes de tecido sem neurónios (nenhumas células presentes, nenhuma coloração tionina) Foi representado os comprimentos, os neurónios intactos e as perdas neuronais na região de cada sub-campo do hipocampo, foram determinadas as médias entre os cortes e determinado o desvio padrão.

7. Lesões-excitotoxicidade NMDA intra-estriatal com ou sem t-PA ou DSPA

Ratos do tipo selvagem (c57/Black6) foram anestesiados e colocados num suporte estereotáctico (ver acima). Os ratos receberam de seguida uma injecção unilateral no stratum esquerdo com 50 nmol NMDA isoladamente ou 29 ΡΕ1997510 em combinação com 4 6 μΜ rt-PA ou 4 6 μΜ DSPAai. Como controlo foram além disso injectados t-PA e DSPA„i isoladamente numa concentração de 46 μΜ como controles. As coordenadas de injecção foram: bregma -0,4mm, médio-lateral 2,0 mm e dorsoventral 2,5 mm. As soluções (1 μΐ volumes totais para todos os tratamentos) foram administradas num periodo de tempo de 5 minutos a 0,2 μΐ/min, em que a agulha permaneceu no local de injecção 2 min adicionais após a injecção, para minimizar o refluxo de liquido. Após 24 horas os ratos foram anestesiados e perfundidos transcar-diacamente com 30 ml PBS, seguido de 70 ml de uma solução de paraformaldeido a 4%, fixado durante 24 horas no mesmo fixador, seguido de uma incubação em 30 % sucrose durante mais 24 horas. Foram então cortados cortes coronais (40 pm) com um micrótomo de congelação, e colocados sobre lâminas revestidas com gelatina.

8. Quantificação do volume lesionado após injecção de NMDA A quantificação do volume lesionado estriatal foi realizado de acordo com o método descrito por Callaway et al. (2000). Foram preparados 10 cortes coronais uns a seguir aos outros, que abrangiam a área da lesão. A região lesada foi visualizada de acordo com o método Callaway e o volume lesionado foi quantificado através da utilização de um Micro Computer Imaging Device (MCID, Imaging Research Inc., Brock University, Ontario, Canada). 30 ΡΕ1997510 9. Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica foi realizada de acordo com métodos padrão. As secções coronais foram submetidas a uma imersão numa solução de 3% H2C>2 / 10% metanol durante 5 minutos, seguido de uma incubação com soro de cabra a 5% durante 60 minutos. Os cortes foram então incubados durante a noite ou com um anticorpo anti-GFAP (1:1.000; Dako, Carpinteria, Ca, USA) para comprovação de astrócitos, com um anticorpo anti-MAC-1 (1:1.000; Serotec, Raleigh, NC, USA) para comprovação de microglia ou anticorpos policlonais anti-DSPA (Schering AG, Berlin). Após a lavagem os cortes foram incubados com anticorpos secundários biotinilizados apropriados (Vector Laboratories, Burlin-game, CA, USA). Depois seguiu-se uma incubação subsequente com um complexo avidina/biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) durante 60 minutos antes da coloração final com 3, 3' -diaminobenzidina/0,03% H2O2. Os cortes foram então colocados sobre lâminas revestidas com gelatina, desidratados e cobertos com permount. B. Resultados 1. Infusão de t-PA ou DSPA é distribuído pelo hipocampo de ratos t-PA -/- e conserva a sua actividade proteolítica

As primeiras experiências foram concepcionadas para comprovar, que tanto o DSPA como também o t-PA 31 ΡΕ1997510 conservam a sua actividade proteolítica ao longo dos 7 dias de infusão. Para este fim foram incubados aliquotas de t-PA e DSPA (100 nmol) tanto a 37°C como também a 30°C durante sete dias num banho de água. Para determinar a actividade proteolitica, as diluições 5 vezes seriadas das amostras foram submetidas a uma SDS-PAGE em condições não-reductoras e medida a actividade proteolitica através de análises zimográficas. Respectivamente uma aliquota de t-PA e de DSPA que permaneceram congeladas durante estes sete dias, foram utilizadas como controle. Como é visivel da figura 1, houve apenas uma pequena perda da actividade do DSPA ou do t-PA, tanto na incubação a 25°C como também a 37°C durante este periodo de tempo. 2. A actividade t-PA e DSPA é também encontrada após infusão nos extractos do hipocampo em ratos t-PA -/-

Primeiro teve de ser determinado, que as prote-ases administradas com a infusão estavam realmente presentes no cérebro dos animais tratados e também ai conservavam a sua actividade proteolitica. Para isso os ratos t-PA -/- receberam durante sete dias infusões com t-PA ou DSPA (ver acima) . Os ratos foram de seguida mortos com perfusão transcardiaca com PBS e os cérebros foram retirados. As regiões do hipocampo ipsilateral e contrala-teral foram isoladas, assim como uma região do cerebelo (como controlo negativo). Amostras dos tecidos (20 pg) foram submetidas a uma SDS-PAGE e análise zimográfica de 32 ΡΕ1997510 acordo com a descrição na parte do método. Como é visivel na figura 2, foram medidas as actividades tanto do t-PA como também do DSPA na região ipsilateral do hipocampo, em que além disso foi medido alguma actividade no lado contralateral. Isto demonstrou que as proteases infundidas não só conservam a sua actividade no cérebro, como também se tinham distribuido pela região do hipocampo. No controle não foi demonstrada nenhuma actividade nos extractos preparados do cerebelo.

3. Prova imuno-histoquimica do DSPA

Para comprovar que o DSPA se tinha realmente distribuido pela região do hipocampo, foram analisados imuno-histoquimicamente cortes cerebrais coronais de ratos t-PA -/- após a infusão de DSPA. Foram comprovados antigénios DSPA na região do hipocampo, em que a zona circundante ao local de infusão apresentava a coloração mais forte. Este resultado confirma que o DSPA infundido é solúvel e está realmente presente no hipocampo. 4. Infusão de DSPA não restabelece a sensitividade relativamente à neurodegeneração dependente de ácido cainico in vivo

Ratos t-PA -/- são resistente relativamente à neurodegeneração dependente de ácido cainico. Pelo contrário uma infusão de rt-PA no hipocampo leva a um 33 ΡΕ1997510 completo restabelecimento da sensitividade relativamente à lesão dependente do ácido cainico. Para responder a questão, se o DSPA pode substituir o t-PA neste efeito, ratos t-PA -/- receberam através de uma bomba miniosmótica infusões com t-PA ou DSPA no hipocampo. Para ambos os grupos foram utilizados 12 ratos. Dois dias mais tarde os animais receberam injecções de ácido cainico num periodo de repouso subsequente. Cinco dias depois os animais foram mortos. Os cérebros foram retirados e trabalhados (ver acima) Como controle foram além disso infundidos ratos t-PA -/- com PBS antes do tratamento com KA (n=3).

Foram preparados cortes do cérebro coronais e os neurónios foram detectados através de coloração com Nissl. Tornou-se evidente que os ratos t-PA -/- após infusão de PBS eram resistentes relativamente ao KA. Pelo contrário as infusões com o t-PA recombinante levaram ao restabelecimento da sensitividade relativamente ao tratamento com KA. Em oposição a isso as infusões com a mesma concentração de DSPA não alteravam na região do hipocampo a sensitividade destes animais relativamente ao KA (ver fig. 4a e 4b).

Uma quantificação destes resultados ocorreu com a utilização de 12 animais em cada grupo. Em 2 dos 12 ratos infundidos com DSPA observámos alguma neurodegeneração de pouca importância. 0 motivo para isso é ainda pouco claro e possivelmente independente da presença de DSPA. Os dados combinados levaram em consideração o efeito de pouca impor- 34 ΡΕ1997510 tância que foi observado em ambos estes animais. Todos os 12 ratos tratados com t-PA eram sensíveis relativamente ao tratamento com KA. Estes resultados mostram que com uma infusão de t-PA ou DSPAd em concentrações equimolares, apenas a adição de t-PA leva a um restabelecimento da sensi-tividade relativamente à neurodegeneração induzida por KA. 5. Infusão de DSPA não provoca a activação da microglia 0 restabelecimento da sensitividade ao KA em ratos t-PA -/- após a infusão de t-PA resultou compro-vadamente numa activação da microglia (Rogove et al., 1999). De forma a determinar a dimensão da activação da microglia após infusão de t-PA ou de DSPA e subsequente tratamento com KA, foram submetidos cortes coronais dos ratos a uma coloração imuno-histoquimica para células da microglia activadas com a utilização do anticorpo Mac-1. 0 restabelecimento da sensitividade KA após a infusão de t-PA resultou num claro aumento das células positivas para Mac-1. Isto não foi observado nos ratos que receberam infusões de DSPA. Assim a presença de DSPA não leva a uma activação das células microglia após o tratamento com KA. 6. Titulação de DSPA e t-PA na região do hipocampo dos ratos A concentração de t-PA que foi utilizada na 35 ΡΕ1997510 infusão baseia-se na concentração descrita por Tsirka et al (1995) (100 μΐ de 0,12 mg/ml [1,85 μΜ] . Nós repetimos as experiências de carga de KA com a utilização de uma quantidade de t-PA 10 vezes mais baixa (0,185 μΜ) e uma quantidade mais elevada de DSPA (18,5 μΜ) . A concentração de t-PA mais baixa ainda tinha a capacidade de restabelecer a sensitividade relativamente ao tratamento com KA (n=3). De especial interesse foi que a infusão da concentração de DSPA 10 vezes mais alta apenas provocava uma pequena perda neuronal após tratamento com KA. Estes dados reforçam a indicação de que o DSPA não aumenta a sensitividade relativamente ao KA. 7. Efeito de t-PA e DSPA na neurodegeneração dependente de NMDA em ratos do tipo selvagem

Os efeitos de t-PA e DSPA foram investigados além disso num modelo da neurodegeneração em ratos do tipo selvagem. A injecção de t-PA no striatum destes ratos leva comprovadamente a um aumento dos efeitos neurodegenerativos provocados pelo NMDA análogo ao glutamato (Nicole et al., 2001).

Para isso foram administradas injecções de NMDA num volume total de Ιμΐ na região do striatum em ratos do tipo selvagem na presença de t-PA ou DSPA (respectivamente 46 μΜ) . Após 24 horas os cérebros foram retirados e o tamanho das lesões foi quantificado de acordo com o método 36 ΡΕ1997510

Callaway (Callaway et al, 2000) (ver acima). Como é visível na figura 7, a injecção de NMDA isoladamente provocou uma lesão reproduzível em todos os ratos tratados (n=4). Se no entanto fosse injectado t-PA e NMDA conjuntamente, o tamanho das lesões aumentava em aproximadamente 50% (P<0,01, n=4) . Em oposição evidente, as co-injecções de NMDA e as mesmas concentrações de DSPA não provocavam nenhum aumento do tamanho das lesões em comparação com NMDA isoladamente.

Injecções de t-PA ou DSPA isoladamente não levavam a uma neurodegeneração comprovável. A falta de efeito do t-PA em administrações isoladas é consistente com os resultados de Nicole et al. (2001) . Estes dados mostram que a presença de DSPA não aumenta mais a neurodegeneração mesmo durante um processo neurodegenerativo.

De forma a confirmar que a injecção de DSPA realmente se tinha distribuído na região do hipocampo, foram realizadas investigações em cortes coronais com a utilização do anticorpo para DSPA. As investigações mostram que o DSPA realmente penetrou na região estriatal.

Análise cinética da activação do plasminogénio através de teste de cromogénio indirecto

Testes de cromogénio indirectos da actividade do t-PA utilizam os substratos Lys-plasminogénio (American 37 ΡΕ1997510

Diagnostica) e Spectrozyme PL (American Diagnostica) e foram realizados de acordo com Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.-J., Sambrook J.F. (1989) Nature 339 721-724; Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.J., Sambrook J.F. e Bassel-Duby R.S. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87, 3530-3533 assim como Madison E.L., Goldsmith E.J., Gething M.J., Sambrook J.F. e Gerard R.D. (1990) J. Biol. Chem. 265, 21423-21426. Os testes foram realizados tanto na presença como também na ausência do co-factor DESAFIB (American Diagnostica). DESAFIB, uma preparação de monómeors de fibrina solúveis, foi obtido através da dissociação de fibrinogénio humano altamente purificado pela protease batroxobina. Batroxobina dissocia a ligação Arg16-Gly17 na cadeia Aoí do fibrinogénio e liberta assim fibrinopeptideo A. O fibrinogénio des-AA resultante sob a forma de monómeros de fibrina I é solúvel na presença do peptídeo Gly-Pro-Arg-Pro. A concentração do Lys-plasminogénio foi variada na presença de DESAFIB de 0,0125 até 0,2 μΜ, na ausência do co-factor de 0,9 a 16 μΜ.

Teste de cromogénio indirecto na presença de diferentes estimuladores

Testes padrão de cromogénio indirecto foram realizados de acordo com as publicações acima citadas. Foram utilizadas preparações de 100 μΐ de volume total com 0,25 - 1 ng enzima, 0,2 μΜ Lys-plasmogénio e 0,62 mM Spectrozym PL. Os testes foram realizados na presença de ou 38 ΡΕ1997510 tampão, 25 yg/ml DESAFIB, 100 yg/ml fragmentos cianogénio brometo de fibrinogénio (American Diagnostica) ou 100 yg/ml do peptideo de 13 aminoácidos estimulador P368. As analises foram realizadas em placas de Mikrotiter e medida a densidade óptica a comprimentos de onda de 405 nm durante 1 h todos os 30 seg num "Molecular Devices Thermomax". A temperatura reaccional era de 37°C.

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Lisboa, 8 de Maio de 2012

Claims (5)

1. ΡΕ1997510 1 REIVINDICAÇÕES 1. DSPA alfa 1 para tratamento terapêutico do acidente vascular cerebral em humanos depois de decorrer três horas após o início do acidente vascular cerebral.
2. 2. DSPA alfa 1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tratamento ocorrer depois de decorrer seis horas após o início do acidente vascular cerebral.
3. 3. DSPA alfa 1 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o tratamento ocorrer depois de decorrer nove horas após o início do acidente vascular cerebral.
4. 4. DSPA alfa 1 de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o DSPA alfa 1 poder ser isolado de Desmodus rotundus.
5. 5. DSPA alfa 1 de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o DSPA alfa 1 ser isolado de Desmodus rotundus. Lisboa, 8 de Maio de 2012