HUT52558A - Process for production of derivatives of prouroquinase with small molecule mass and medical compositions containing them as active substance - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás a prourokináz /egyláncu, urokináz-tipusu plazminogén-aktivátor (scu- PA2/ kimolekulatömegű származékai előállítására rekombináns DNS-technikával, valamint eljárás hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

A találmány szerinti eljárással előállított származékok jelentős, és előnyös gyógyászati hatást mutatnak. Különösen trombolitikus aktivitású szerek hatóanyagaként használhatók.

A prourokinázt (más néven scu-PA-t) kódoló humán gén módosítására hely-specifikus mutagén módszereket alkalmazunk, és a mutáns gént rekombináns E. coli törzsekben fejezzük ki. A módosításokat azzal a céllal választjuk meg, hogy kismolekulatömegü származékokat nyerjünk.

A találmány szerinti eljárással előállított uj prourokináz-származékokat tisztítjuk, és biokémiai és biológiai tulajdonságaikat meghatározzuk. A találmány szerinti eljárással előállított származékok megtartják a vad-tipusu prourokinázra jellemző specifikus aktivitást és szelektív vérrög-lizáló tulajdonságot, azonban elvesztik a prourokináz sejthez kötődő tulajdonságát, ezáltal a keringési rendszerben megnövekedik a féléle ttartamuk.

Ezenkívül, ezeket a vegyületeket hatékonyabban tudjuk előállítani rDNS-technológiai módszerrel, és igy a trombózis-ellenes szerek előállítási költségeit csökkenthetjük.

A fiziológiás folyamatokban végbemenő fibrinolizist szabályozó molekuláris kölcsönhatások egyre nagyobb mértékű megismerése a vérrög-cldódás mechanizmusának megértésében, és ez

- 3 által a trombolitikus hatású gyógyszerek kifejlesztésében jelentős haladást eredményezett.

A humán fibrinolitikus rendszer proenzimje, a plazminogén, különféle tipusu plazminogén-aktivátorokkal aktiválható az aktív enzimmé, vagyis plaminná /Collen D., és.Lijnen H.R.: The fibrinolytic system in mán, CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, 4(3), 249 (1986); Verstraete M. és Collen

D.: Thrombolytic tberapy in the Eighties, Blood, 67(6), 1529 (1986)_/. A plazmin a legfontosabb proteáz, amely a vérrög fibrin-komponensének lebontásáért felelős /Rákóczi I., Wiman B., Collen D.: On the biological significance of the specific interactions between fibrin, plasminogen and antiplasmin, Biochim. Biopbys. Acta 540, 295 (1978); Robbins K.C., Summaria L.,'Hsieb

B. és Sbah R.S.: The peptide cbains of humán plasmin. Mechanism of activation of humán plasminogen to plasmin, J. Bioi. Chem. 242, 2333 (1967); Widman B.: Primary structure of the B chain of humán plasmin, Eur. J. Biocbem. 76, 129 (1977)7.

A plazmin azonban sok plazma-proteinre, többek között a koagulációs mechanizmus komponenseire, igy a fibrinogénre, V faktorra és VII faktorra is proteolitikus hatást fejthet ki /Collen D. és Lijnen H.R.: The fibrinolytic system in mán, CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, 4(3), 249 (1986); Verstraete M. és Collen D.: Thrombolytic tberapy in the Eighties, Blood 67(6) 1529 (1986); Wiman B., Lijnen H.R. and Collen D.: On the specific interaction between the lysine-binding sites in plasmin and complementary sites in alpha2~antiplasmin and in fibrinogen, Biochim. Biopbys. Acta, 579, 142 (1979^/.

- 4 A plazminogén aktiválása a szervezetben a keringési rendszerbe plazmint juttat, amit az alfag-antiplazmin gyorsan semlegesít, és igy az a fibrinolizishez nem áll rendelkezésre ÁP°llen D. és lijnen H.R.: The fibrinolytic system in mán, CRC Critical Review3 in Oncology/Hematology, 4(5), 249 (1986); Verstraete M. és Collen D.: Thrombolytic therapy in the Eighties, Blood, 67(6), 1529 (19862,/. Ha az alfa₂-antiplazmin-szint jelentősen csökken, a plazmin kevésbé gyorsan semlegesitődik, és igy nemcsak a fibrinre, hanem a vér-koagulációs proteinekre is kifejtheti proteolitikus hatását, amint azt fent említettük. A fibrinogén, V faktor és VIII faktor plazma-koncentrációjának jelentős csökkenése - a fibrinogén bomlási termékek vérzéscsillapító folyamatokra, vérlemezke-aggregációra és fibrin-polimerizációra kifejtett gátlóhatásával együtt - a vérzéscsillapitás hiányához, és ennek következtében az elvérzés veszélyéhez vezet /Latallo Z.S., Ipaciuk S.: New approach to thrombolytic therapy: the use of defibrase in connection with streptokinase, Thrombos. Diath. Haemoth. 56, 255 (1975); Totty W.G., Gilula L.A., McClennman M., Ahmed P., és Sherman 1.: Low dose intravascular fibrinolytic therapy, Rádiology, 145, 59 (1982j/. Másrészről a plazminogén aktiválódása fibrin-szinten is végbemehet (fibrin-kötött plazminogén aktiválás), ami fibrin-kötött plazmint eredményez /Collen D. és lijnen H.R.: The fibrinolytic system in mán, CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, 4(5), 249, (1986); Verstraete M. és Collen D.: Thrombolytic therapy in the Eighties , Blood, 67(6) , 1529 (19862/, amit azonban nem befolyásol az alfa₂-antiplazmin, és nem tud a szervezetben fibrinogenolizist indukálni.

A humán trombolitikus terápiában leggyakrabban alkalmazott plazminogén aktivátorok, az urokináz és sztreptokináz, nem mutatnak fibrinnel szembeni specifikus aktivitást. Mindkét fenti vegyület viszonylag megkülönböztetés nélkül aktiválja a keringésben lévő, vagy fibrinhez kötött plazminogént /Zamarron

C., Lijnen H.R., Van Hoef B., Collen D.: Biological and thrombolytic properties of proenzyme and active forms of humán urokinase. I. Fibrinolytic and fibrinogenolytic properties in humán plasma in vitro of urokinase obtained from humán urine or by recombinant DNA technology, Throm. Haemostas., 52, 19 (1984); Samama M., Kher A.: Fibrinolytic and Antifibrinolytic Agents, Sem.Hop. Paris, 61(20), 1423 (1985)3· Ezért sztreptokinázzal és urokinázzal végzett kezelés esetén gyakran előfordul, hogy a szervezetben a véralvadás leáll, és az elvérzés fokozott rizikója gyakran gátolja ezeknek a trombolitikus hatóanyagoknak széleskörű klinikai alkalmazását, bizonyított klinikai hatékonyságuk ellenére /Samama M. , Kher A.: Fibrinolytic and Antifibrinolytic Agents, Sem. Hop. Paris, 61(2Q), 1423 (1985); Maizei A.S., Bookstein J.J.: Streptokinase, urokinase and tissue plasminogen activator, pharmaco-kinetics, relatíve ad van tagé s and methods fór maximizing rates and consistency of lysis, Cardiovasc. Intervent. Rádiói., 9, 236 (1986); BellW.R.: Streptokinase and urokinase in the treatment of pulmonary emboli, Thromb, Haemostas. 35, 57 (1976); Acar J., Vahanian A., Michel P.L., Slama M, Cormier B., Roger V.: Thrombolytic treatment in acute myocardial infarction, Seminars in Thromb. and Haemost. 15(2), 186 (1987); Gruppé Italiano per lo stúdió della Streptochinasi nell infarto miocardico (GISSI) Effectiveness of intravenous tbrombo

- 6 lytic treatment in acute myocardial infarction, Láncét 1, 397 (1986)7.

Ezzel szemben a szöveti tipusu plazminogén aktivátorról (t-PA) /Hoylaerts M., Ryken D.C., Lijnen H.R. és Collen E.: Kinetics of activation of plasminogen by humán tissue plasminogen activator. Role of fibrin, J. Bioi. Chem. 257 (6), 2912 (1982)/ és újabban a prourokinázról (proUK) is /Húsain S.S. , Gurewhich V.: Purification and partial characterization of a single chain, high molecular weigbt form of urokinase in humán urine, Arch. Biochem. Biophys. 220, 31 (1983)7 kimutatták, hogy mindkét fenti, természetes protein gyengén gátolja a keringő plazminogént, viszont erősen aktiválja a fibrinhez kötött plazminogént, anélkül, hogy a szervezetben a véralvadást leállítaná vagy fogyasztaná, az alfa₂~antiplazmint vagy plazminogént, igy ezek klinikai alkalmazásakor kisebb az elvérzés veszélye.

A t-PA fibrin-specifikus tromboli tikus aktivitását azzal magyarázzák, hogy képes a molekula hármas diszulfid-kötött, úgynevezett kringle-részén elhelyezkedő specifikus lizin-kötő helyeken keresztül megkötni a fibrint. Ennek következtében a fibrin-kötött plazminogén a véralvadás jelentős leállása nélkül aktiválható /Collen D., Lijnen H.R.: Tissue plasminogen activator. Mechanism of action and thrombolytic properties, Haemostasis 16(3), 25 (1986)/. Ugyanakkor a proUK- amelyet egyláncu, urokináz-tipusu plazminogén aktivátornak (scu-PA-nak) is neveznek - nem kötődik a fibrinhez, noha fibrin-specifikus tromboli tikus aktivitást mutat,a szervezet véralvadásának megszűnése nélkül /Pannell R., Gurewich V.: Pro-Urokinase. A study of its stability in plasma and cf mechanism of its selective fibri

- 7 nolytic effect, Blood, 67, 1215 (1986); Gurewich V. és Pannell R.: Fibrin binding and zymogenic properties of single chain urokinase (Pro-Urokinase), Seminars in Thromb, and Haemostat, 13(2), 146 (1987); Lijnen H.R., Zamarron C., Blaber M. , Winbler M.E. és Collen D.: Activation of plasminogen by pro-urokinase. I. Mechanism, J. Bioi. Chem. 261, 1253 (1986)/·

Intenzív kutatómunka folyt a fenti proteineket kódoló humán gének izolálására és jellemzésére, majd rekombináns DNS-módszerrel való előállításukra ^Colién D., Stassen J.M., Marfino B.J., Builder Jr. S., De Cock F., Ogez J. , Tajiri B. , Pennica D, Bennett W.T., Salwa T., és Hoyng C.F.: Biological properties of humán tissue-type plasminogen activator obtained by expression of recombinant BNA in mammalian cells, J. Pharmacol. Exp. Ther. 231(1), 146 (1984); Holmes W.E., Pennica B. , Blaber M. , Rey M.W. , Gunzler W.A. , Steffens G.J. és Heynecker H.L.: Cloning and expression of the gene fór pro-urokinase in Escherichia coli, Biotechnology 3, 923 (1985V.

A rekombináns t-PA-t több klinikán is vizsgálták akut szívizom-infarktusos betegeken, és azt tapasztalták, hogy az elzáródott szivkoszoru-verőér újból átjárhatóvá tételére jelentős mértékben hatásosabb a streptokináznál ^The European Cooperative Study Grcup fór Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator, Randomized trial of intravenous recombinant tissuetype plasminogen activator versus intravenous streptokinase in acute myocardial infarction, láncét 1, 842 (1985); Sheehan F.H., Braunwald E., Canner P., Doodge H.T., Gore J., Van Natta P., Passamani E.R., Williams D.O., Zárét B.: The effect of intravenous tbrombolytic therapy on left ventricular function: a report on tissue-type plasminogen activator and streptokinase írom the thrombolysis in myocardial infarction (TIMI Pbase i), Circulation 75(4), 817 (1987/7A prourokináz jelenleg a klinikai vizsgálatok U, fázisában van, és legalább olyan hatásosnak tartják trombolitikus aktivitását és alkalmazásának biztonságát tekintve, mint a t-PA-t /Van de Werf F. , Nobuhara M., Collen D.: Coronary thrombolysis with humán single-chain, urokinase-type plasminogen áctivator (pro-Urokinase) in patients with acute myocardial infarction, Annals of Internál Medicine 104, 545 (1986); Van de Werf F. , Vanhaecke J., De Geest H., Verstraete M. és Collen

D.: Coronary thrombolysis with recombinant single-chain urokinase-type plasminogen activator in patients with acute myocardial infarction, Circulation 74(5), 1066 (1986)/.

Az urokináz-tipusu plazminogén aktivátorok (u-PA-k) hspr lább3 különböző formában találhatók az emberi vizeletben, plazmában és különféle sejtvonalakból származó, kondicionált tenyészetekben.

Az u-PA-ként jellemezhető első forma.410 aminosavat tartalmazó, fibriuolitikus aktivitású polipeptidbői áll, amelynek látszólagos móltömege 54 000, és két diszulfid-hiddal összekapcsolt láncot tartalmaz /Gunzler W.A., Steffens G.J. , Oetting

F. , Kim S.M.A., Frankus E. és Flohe L.: The primary structure of high molecular mass’urokinase from humán urine. The complete amino acid sequence of the A chain. Hoppe-Seyler»s z. Phisiol. Chem. 363, 1155 (1982)7. Az A-lánc vagy könnyű lánc 157 aminosavat tartalmaz, és egy hármas diszulfid-kötött kringle” szerkezetet. Ez a lánc egy receptor-kötő területet is tartalmaz nor- mái és rákos sejtek (monociták, monocita-szerü sejtek és A 431 epidermoid sejtek) számára. A B-lánc vagy nehéz lánc (látszólagos móltömege 30 000) 253 aminosavból áll, és ez tartalmazza a katalitikus régiót. Az u-PA-nak ezt a molekuláris formáját általában urokináznak (UK), két-láncú urokináznak (TC-UK) vagy nagymóltömegű, urokináznak (HMW-UK) nevezik /Gunzler W.A. , Steffens

G.J. , Otting F. , Bűze G. , ÍJohe 1.: StructuráL relationship between higb and low molecular mass urokinase, Hoppe-Seyler’s z. Pbisiol. Chem. 363, 133 (1982)7·

Az u-PA második formájának móltömege 33 000, és a HMW-forma plazminnal vagy tripszinnel való proteolitikus lebontásakor keletkezik. Kismóltömegü urokináznak (IMW-UK) is nevezik. A protein szekvenciameghatározás eredménye szerint a 1MW-UK azonos a HMW-UK-zal, azzal az eltéréssel, hogy a plazmin vagy tripszin által lehasított N-terminális 135 aminosav hiányzik ^Steffens G.J., Gunzler W.A., Otting F., Frankens E., és Flohe L.: The complete amino acid sequence of low molecular weight urokinase from humán urine, Hoppe-Seyler’s Z. Phisiol. Chem. 363, 1043 (1982)7·

Az u-PA harmadik formája a prourokináz (proUK), ami egyláncu, 54 000 móltömegü urokináz-forma, és amelyet ezért szintén egyláncu urokináz-tipusu plazminogén aktivátornak (scu-PA) neveznek.

Az urokináz-tipusu plazminogén aktivátor mindhárom fenti molekulaformáját előállították már rekombináns DNS technikával /Z^amarron C., Dijnen H.R., Van Hoef B., és Collen D.: Biological and thrombolytic properties of proenzyme and active forms of humán usokinase. I. Fibrinolytic and fibrinogenolytic

properties in humán plasma in vitro of urokinase obtained from humán urine or by recombinant DNA technology, Thromb. Haemostas. 52, 19 (1984); Holmes W.E., Pennica D., Blaber M. , Rey M.W. , Gunzler W.A. , Steffens G.J. és Heyneoker H.L.: Cloning and expression of the gene fór pro-urokinase in Escherichia coli, Biotechnology 3, 923 (1985); Gunzler W.A. , Henninger W. , Hennies

H.H., Otting F., Schneider J., Friderichs E., Giertz H. , Flohe L. , Blaber H. és Winkler M.: Functional characterization of humán urokinase produced in bacteria as compared to urokinase obtained from humán urine, Haemostasis 14, 60 (19842/·

A prourokinázt kódoló humán génből kiindulva hely-specifikus mutagenezis segítségével szerkesztettünk egy sor módosított gént, melyek az egyláncu urokináz-tipusu plazminogén aktivátor uj és eredeti származékait kódolják. Ezek a származékok kisebb mó1tömegű'analógok, amelyekben az első 162 aminosavból különböző méretű szekvencia-részek hiányoznak.

A módosított géneket rekombináns E. coli törzsekben expresszáljuk, és az uj rekombináns termékeket egyláncu formában tisztítjuk és jellemezzük specifikus fibrin-rög oldó tulajdonságuk szempontjából.

A találmány tárgya tehát eljárás a fenti uj, természetben nem található vegyületek .előállítására. Ezek az egyláncu, kismolekulatömegű prourokináz-származékok fibrin-specifikus proteolitikus aktivitással rendelkeznek, és a natív vagy rekombináns proUK helyett használhatók a gyakorlatban. A vizsgálatok szerint félélettartamuk hosszabb, ami hosszabb gyógyászati aktivitásban nyilvánul meg.

• · • · *· ·*·· • * · ·· • · · • · · · ·

- 11 A találmány szerinti eljárással előállítható egyrészt egy olyan kimolekulatömegü humán prourokináz-származék, amely az érett prourokináznak legalább a 163. aminosavtól a

4-11. aminosavig tartó szekvenciáját tartalmazza, egyláncu formában .

A származék még előnyösebben az érett prourokináznak legalább a 151. aminosavtól 411. aminosavig; a 141. aminosavtól a 411. aminosavig tartó szekvenciáját vagy az 1-10. aminosavból álló szekvenciát az érett prourokinaz 136 - 411. aminosavjából álló szekvenciához kapcsolva tartalmazza.

A találmány szerinti eljárással előállítható olyan származék is, amelyből hiányzik az érett prourokináz 48 - 135. aminosav-szekvenciájában található kringle régió; vagy a receptor-kötő régió vagy sejt-kötő régió,. amely az érett prourokináz 11 - 47. aminosav-szekvenciájában található.

A találmány tárgykörébe tartozik a fenti származékokból aminosav-delécióval, inzercióval vagy szubsztitúcióval vagy legalább még egy aminosav hozzáadásával módosított származékok előállítása is.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti származékokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, és a származékok előállítására használt DNS-szekvenciák, vektorok és transzformált gazdasejtek előállítására.

Érett prourokináz alatt teljes hosszúságú prourokináz t értünk.

A találmány szerinti eljárással olyan származékokat állíthatunk elő, amelyekből az érett prourokináznak legalább egy alábbi régiója hiányzik:

- ”kringle régió,

- receptor-kötő vagy sejt-kötő régió.

A találmány szerinti eljárással előállított származékok a polipeptid amino-terminális végén egy további metionin-maradékot is tartalmazhatnak, vagy tartalmazhatnak ezenkívül legalább egy glükozidos oldalláncot is. Ezenkívül a fenti származékok tartalmazhatnak legalább egy tetszőleges eredetű aminosav-szekvenciát is.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek közé tartoznak azok a származékok is, amelyek a fenti származékok plazminos kezelésével nyerhetők.

A találmány szerinti eljárással előállított származékokból gyógyászati készítményeket állíthatunk elő, úgy, hogy a fenti származékokat gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük. Az igy kapott készítmények tromboli tikus szerként használhatók.

A találmány szerinti eljárással előállított uj proUK származékok molekuláris tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük.

Az uj proUK származékokat oligonukleotid-irányitott mutagenezis segítségével állítjuk elő. Közelebbről, olyan oligonukleotid okát tervezünk és szintetizálunk, amelyek a proUK gén kódoló régióiban deléciót okoznak. Ennek a módszernek az elve, hogy a proUK gént egy vektorba klónozzuk, amely vektor egyszálu formában van, ilyen például az M15 fág vektor. A rekombináns egyszálu DNS-t a kívánt kódoló szekvenciát tartalmazó, és a törölni kívánt szekvenciát nem tartalmazó, komplementer szintetikus cligodezcxiribonukleo tiddal hőkezeljük.

- 13 Ezután az uj szálat DNS-polimerázzal meghosszabitjuk ás ligázzal cirkuláris DNS-sé kapcsoljuk. Az igy előállított uj heteroduplex DNS-t olyan sejtvonalba transzformáljuk, amelyben az képes replikálódni, olyan utódokat eredményezve, amelyekben a vad-tipusu gént hordozó és a kívánt delécióval rendelkező gént hordozó fág két különböző molekulaí’ajtává különül el. A kiindulási mutagén oligonukleotidokát használhatjuk ezután szondaként a mutált gén felismerésére.

A mutált géneket ezt követően E. coli expressziós vektorokba illesztjük, amelyek képesek az uj proUK-szármázékok szintézisének irányítására. A rekombináns molekulákat végül tisztítjuk és jellemezzük.

A találmány szerinti eljárással előállított uj proUK-származékokat az alábbiak szerint foglalhatjuk össze:

(a) Λ125 jelzésű forma (látszólagos móltömege kb. 31 000), amelyet úgy állítunk elő, hogy a proUK génből töröljük a 11 - 135. aminosavakat kódoló szekvenciát. Ebből a 286 aminosavat tartalmazó proUK-származékból hiányzik a kringle régió, ugyanakkor a proteolitikus régió megmarad. Egyláncu formában izoláljuk, és plazminnal kétláncu formává alakíthatjuk. A Λ125 plazminnal végzett kezelés után amidolitikus aktivitást mutat.

(b) £140 jelzésű forma (látszólagos móltömege kb. 30 000), ame- lyet úgy állítunk elő, hogy a proUK-ból töröljük az első 140 aminosavat. Ezt a 271 aminosavból álló származékot egyláncu konfigurációban izoláljuk. A Δ140 plazminos kezeléssel amid ölitikusan aktiv kétláncu formává alakítható.

(c) Λτ5ⁿ jelzésű forma (látszólagos móltömege kb. 29 000), ame lyet úgy állítunk elő, hogy a proUK első 150 aminosavját töröljük. Ez a 261 aminosavat tartalmazó származék egyláncu konfigurációban amid ölitikusan inaktív. Plazminos kezelés után a Δ150 teljesen aktívvá válik.

(d) Δ162 jelzésű forma (látszólagos móltömege kb. 27 000), amelyet úgy állítunk elő, hogy a proUK első 162 aminosavját töröljük. Ez a csak 249 aminosavat tartalmazó származék azonos az urokináz B-lánccal, az első 4 aminosav nélkül.

A találmány szerinti eljárással előállított uj származékok sematikus összefoglalása az 1. ábrán látható. Megfelelő specifikus aktivitásaik az 1. táblázatban találhatók.

In vitro jelzett fibrin-rög—lizis és fibrinogenolitikus aktivitás vizsgálata

A találmány szerinti eljárással előállított proUK-származékok néhány képviselőjének relatív fibrinolitikus és fibrinogenolitikus aktivitását in vitro rendszerben határozzuk meg, amely citrátot tartalmazó humán plazmába merített, ^yldal jelzett humán plazma-rögöket tartalmaz, a vizsgálatot Matsuo 0., Ryken D.C. és Collen D.módszere szerint végezzük /Comparison of the relatíve fibrinogenolytic, fibrinolytic and thrombolytic properties of tissue plasminogen activator and urokinase in vitro, Throm. Haemost. 45, 225 (19812/· összehasonlító anyagként vad-tipusu proUK-t és humán vizeletből származó kétláncu urokinázt használunk.

125

A I-dal jelzett plazma-rögoket az összegyűjtött plazma 2,0 ml-es alikvotjaihoz adjuk, mérjük, és 37 °C-on, vízfürdőn 150 NE/ml urokináz-tipusu plazminogén aktivá tor jelenlétében • ·

- 15 illetve TC-UK esetén 50 NE/ml TC-UK jelenlétében, vagy annak távollétében (kontroll) 4 órán keresztül inkubáljuk. Ezután a . 125 plazmából mintát veszünk, merjük a I-tartalmat, es a. szolubilizált radioizotópból meghatározzuk a lizis %-os értékét. Ezenkívül minden egyes mintában meghatározzuk a plazma-fibrinogén szintet /yermylen C., De Vreker R. , és Verstraete M.: A rapid enzymatic method fór assay of fibrínogen:fibrin polymerization time (FPT-test) , Clin. Chim. Acta 8, 418 (1963//, amelyet az.alapérték (kontroll minta) %-ában fejezünk ki.

Az urokináz—tipusu plazminogén aktivátorok stabilitását (proUK és kismóltömegü származékai esetén 150 NE/ml, TC-UK esetén 50 NE/ml koncentrációban) plazmában szobahőmérsékleten, 14 órán keresztüli . előinkubálást alkalmazva határozzuk meg. A preinkubálást követően minden egyes vizsgált elegyhez frissen készített ^^I-dal jelzett plazma-rögöket adunk, és 37 °C-on inkubáljuk az elegyeket. Meghatározzuk a lizis sebességét és a fentiek szerint, három párhuzamos mérés eredményéből végezzük a számítást.

A kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, kimóltömegü származékok majdnem teljes plazmarög-lizáló aktivitást mutatnak, jelentős fibrinogenolizis nélkül. A találmány szerinti eljárással előállított, kismóltömegü proUK-szármázékok nagymértékben fibrin-specifikus rög-lizáló aktivitást mutatnak.

A fentieken túlmenően, a találmány szerinti eljárással előállított kismóltömegü származékok rög-lizáló aktivitásukat humán plazmában való 24 órás inkubálás után is megőrzik, je lezvén, hogy ezek a vegyületek a vad-tipusu proUK-hoz (de nem a TC-UK-hoz) viszonyítva plazmában stabilabbak.

Uj proUK-származékok farmakokinetikai profilja

A találmány szerinti eljárással előállított proUK-származékok néhány képviselőjének farmakokinetikai profilját egyetlen intravénásán adott 80 000 NE/kg dózisu injekció után patkányban határozzuk meg.

A kezelés előtt meghatározzuk az urokinázzal kapcsolatos antigén-szinteket és az euglobin frakció fibrinolitikis aktivitását, majd ezeket az értékeket a kezelés után 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 és 30 perc múlva is mérjük.

Az eredményeket a 2. ábrán szemléltetjük.

A fenti eredményekből arra következtethetünk, hogy az u-PA-val kapcsolatos antigén eltűnése a plazmából sokkal lassabb (kezdeti felezési idő 25 perc) a 4125 származék esetén, mint a természetes, vad-tipusu proUK esetén (kezdeti felezési idő 5 percnél kisebb).

Ezenkívül, az euglobin-frakció fibrinolitikus aktivitása párhuzamosan változik a plazma-u-PA antigén-szinttel.

Uj proUK származékok kölcsönhatása he párinnal

A he parin az antikoagulációs terápiában szokásos olazma-koncentrációban (0,01 és 1 NE/ml között) kimutathatóan igen jelentős mértékben potencirozza in vitro bizonyos uj kimóltömegü származékok (4125) plazmin általi aktiválásának sebességét (3. ábra).

Ezt árhatást - noha sokkal kisebb mértékben - vad-tipusu proUK esetén is észleljük.

A fenti vizsgálatok eredményeit az alábbiak szerint ····

-17értékeljük.

A találmány szerinti eljárással előállított uj, megvizsgált származékok (Δ125, Δ140 és AL50) amidolitikus viselkedése arra utal, hogy bármely olyan molekula, amelyben megvan a prourokináz utolsó 261 aminosavja egyláncu konfigurációban, teljes amidolitikus aktivitást fejt ki plazmin aktiválásra, kétláncu konfigurációba való alakulással (1. táblázat).

A be parin - olyan koncentrációkban, amelyek a plazmában a trombolitikus terápiával együtt alkalmazott terápiás antikoaguláció során elérhetők (0,01 - 1 NE/ml) - igen jelentős mértekben stimulálja az uj kimóltömegü származékok egyikénék (a A125~nek) kétláncu konfigurációba való alakulását plazmin hatására. Ugyanezt a hatást vad-tipusu proUK-t alkalmazva is kimutattuk, csak sokkal kisebb mértékben (2. ábra).

Másrészről, a I-dal jelzett humán fibrin-rögök csaknem teljes lizise elérhető a találmány szerinti eljárással előállított uj kismóltömegü származékokkal, jelentős fibrinogenolizis nélkül, ami nem mondható el a kétláncu urokináz esetén.

. 125

Ezenkívül, ez a hatas akkor is megmarad, . ha a Irdal jelzett humán fibrin-rög hozzáadása előtt az uj származékokat a plazmában legalább 24 órán keresztül inkubáljuk (2. táblázat). Ezz$L szemben a TC-UK fibrin-rög-lizáló aktivitása teljesen eltűnik, ha azt a plazmában hosszabb időn keresztül előinkubáljuk.

Végül, az egyik uj származékot (2\ 125) egyszeri dózisban intravénásán patkányba injektálva a vérben jelentősen hosszabb félélettartamot mutatunk ki (3. ábra).

A fenti eredményekből arra következtethetünk, hogy

- a találmány szerinti eljáeással előállított uj, kismolekulatömegii származékok megtartják a vad-tipusu proUK intrinsic amid ölitikus aktivitását, és plazminnal aktiválva teljes mértékben amid öli tikusan aktív kétláncu formává aktiválhatok;

a találmány szerinti eljárással előállított uj, kismolekulatömegü származékok plazminos aktiválását és az azt követő, amid ölitikusan aktív kétláncu konfigurációjú formába való alakulását a heparin jelentős mértékben stimulálja. Mivel a heparin a trombolitikus terápiában a klinikai gyakorlatban mindig jelen van, az uj proUK-származékokra kifejtett fenti stimuláló hatás még jobb trombolitikus aktivitáshoz vezethet;

- a találmány szerinti eljárással előállított uj, kismolekulatömegü származékok inkább fibrin-specifikus rög-lizáló aktivitást mutatnak a TC-UK-hoz viszonyítva, amely teljesen aspecifikus. Ezért minden proUK-származékot, amely egyláncu formában tartalmazza a 151 - 411. aminosavból álló aminosav-szekvenciát, a TC-UK-hoz képest jobb trombolitikus hatóanyagnak tekinthetünk, mivel a vérzékenység rizikója ezek alkalmazása esetén kisebb;

ezenkívül, az urokináz-tipusu plazminogén aktivátorokbán a 13. és a 30. aminosav között lokalizált sejt-kötő régió ^Appela

E. , Robinson E.A., Ullricb S.J., Stoppelli M.P., Corti A., Cassani G. és Blasi F.: The receptor binding sequence of urokinase, J. Bioi. Chem. 262(10) , 4437 (1987)_7 hiánya következtében az uj proUK-szármázékok félélettartama a keringésben lényegesen hosszabb, mint a vad-tipusu proUK-é és TC-UK-é.

így a találmány szerinti eljárással előállított uj, kismolekulatömegű prourokináz-származékok fibrin-specifikus trom19 bolitikus tulajdonságai - párosulva a hatás lehetséges növekedésével az együttes heparin-terápia alkalmazásakor, és meghosszabodott félélettartamukkal a keringésben - kifejezett terápiás' előnyöket eredményeznek a kétláncu urokinázzal és a vad-tipusu prourokinázzal szemben.

A találmányt közelebbről az alábbiakban ismertetjük.

Mutagenezis

A humán preprourokinázt kódoló .gént a Weizman Intézetben (Izrael) klónozták, ismert eljárással (Maniatis T. , Fritsch E.F. és Sambrook J.: Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbour 1982).

A kívánt mutagenezis létrehozására megfelelő restrikciós fragmentumokat választunk és M13 fág vektorokba klónozzuk /Zoller M.J. és Smitb M.: Ologonucleotide-direc ted mutagenesis using M13-derived vectors; an efficient and generál procedure fór the production of point mutations in any fragment of DNA, Nucelic Acid Research, 101, 6487 (1982)7·

Az egyszálu rekombináns fág vektorokat ismert módon növeljük. 20 ng fenti M13 egyszálu DNS-t 95 °C-on 10 mmól/1 Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mmól/1 EDTA, 50 mmól/1 NaCl jelenlétében 5 percen keresztül melegítünk, és megfelelő olígonukleotidokkal hőkezeljük úgy, hogy fokozatosan szobahőmérsékletre hütjük. Egymás után hozzáadjuk az alábbi komponenseket: ATP-t 0,4 mmól/1 végkoncentrációban; dCTP-t, dGTP-t, dTTP-t 0,12 mmól/1 koncentrációban, dATP-t 0,04 mmól/1 koncentrációban; 1 egység E. coli DNS-polimeráz i Klenow-fragmentumot és 0,5 egység T4 ligázt • « • · ·

- 20 (Boehringer Mannbeim). A végtérfogat 50 yul, amely 35 mmól/1 Tris-HCl-t (pH 7,5), 0,1 mmól/1 EDTA-t, 6 mmól/1 MgClg-ot és 0,006 mmól/1 DTT-t tartalmaz. Az elegyet 15 °C-on 12 órán keresztül inkubáljuk, majd a DNS-sel ismert módon transzfektáljuk az

E. coli JM 101 sejteket /Zoller M.J. és Smith M.: Oligonucleotidedirected mutagenesis using M13-derived vectors; an efficient and generál procedure fór the production of point mutation in any fragment of DNA, Nucleic Acid Research 101, 6487 (1982j_/.

A kívánt deléciót okozó oligonukleotidokat radioaktivan jelezzük 150 yuCi (γ-^^Ρ)ΑΤΡ-1 (New England Nuclear, 6000 Ci/mmól) alkalmazva 70 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferben (pH 8) , amely 10 mmól/1 MgC^-t, 5 mmól/1 DTT-t és 10 egység T4 polinukleotid kinázt (Boehringer Mannheim) tartalmaz, 50 térfogatban, 37 °C-on 30 percen keresztül inkubálva. A /U1 végjelze tt oligonukleotidokat használjuk ezután a mutagenizált fág-DNS-sel plakk-hibridizálásra.

A hibridizálást.65 °C-on egy éjszakán keresztül végezzük 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferben (pH 8), amely háromszoros töménységű SSC-t, 0,1 % SDS-t, 10-szeres töménységű Denhart-oldatot és 0,2 mg/ml denaturált lazacsperma DNS-t tartalmaz. A nitro-cellulóz szűrőket 30 percen keresztül mossuk 0,4szeres töménységű, 0,1 % SDS-t tartalmazó SSC-ben, 65 °C-on, a mosófolyadékot többször cserélve, majd egy éjszakán keresztül röntgenfilmmel exponáljuk. A pozitív hibridizációt jelző plakkokat kiválasztjuk Sanger-féle didezoxinukleotid-szekvenálásra, amelyet Amersham M13 szekvenáló készlettel végzünk.

A mutált géneket ezután szokásos expressziós plazmidokat (Maniatis T., Fritsch E.F. és Sarabrook J.: Molecular cloning,

- 21 A laboratory manual, Cold Spring Harbour 1982) alkalmazva rekombináns E. coli törzsben fejezzük ki, amelyet a kivánt molekula termelésére alkalmas közegben tenyésztünk.

Rekombináns molekulák tisztitása

A baktériumok lizisét követően a rekombináns termékek az oldhatatlan frakcióban találhatók. Az üledéket 0,1 % Triton XlOO-at tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 8,5) mossuk, majd az oldhatatlan anyagot 6 mól/1 guanidin—hidrogén-kloridot, 0,1 mól/1 β-merkapto-etanolt tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferben (pH 8,5) ujraszuszpendáljuk. A szuszpenziót 4 °C-on 16 órán keresztül rázzuk, majd centrifugáljuk, és a felüluszót 1 : 25 arányban hozzáadjuk a következő összetételű feltáró pufferhez: 10 mmól/1 Tris-HCl (pH 8), 2,5 mól/1. karbamid, 8 mmól/1 EDTA. Az oldatot 24 órán keresztül 15 °C-on tartjuk. Az ionerősség csökkentésére a feltáró oldatot először ultraszüréssel 10-szeresére koncentráljuk, majd négyszeresére hígítva beállítjuk az alábbi végösszetételű puffért: 10 mmól/1 Tris-HCl (pH 7,8), 2,5 mól/1 karbamid, 8 mmól/1 EDTA.

A reaktivált fibrinolitikus anyagot ezután ioncserélő kromatográfiás eljárással S-Sepharose gyors oszlopon (Pharmacia) 0-1 mól/l-ig változó lineáris nátrium-klcrid-gradienssel tisztítjuk. Az aktiv frakciókat összegyűjtjük, egyesitjük, G—25 Sephadéxen (Pharmacia), 50 mmól/l^ammónium-hidrogén-karbonáttal szemben gélszüréssel sómentesitjük és fagyasztva szárítjuk. A végső tisztaság 80 és 98 % között változik.

A találmány szerinti eljárás értelmében a kismolekulatömegü származékokat szignál-peptiddel együtt is expresszálhatjuk, • · *

ekkor a kívánt terméket a felüluszóból nyerhetjük ki.

Ur ok i n áz - ti pu su ami d o li tikus aktivitás

A TC-UK (Serono; gyártási szám 870402), a proUK (Sero Institute; gyártási szám OD01205100) és a találmány szerinti eljárással előállított, kismolekulatömegü származékok (Δ125,Δ14Ο és AL50) amidolitikus aktivitását S-2444 kromogén szubsztrátot (Glu-Gly-Arg-pNA; Kabi Vitrum) alkalmazva határozzuk meg. A vizsgálat a Tc-UK intrinsic amid ölitikus aktivitásán és azon alapul, hogy ez az aktivitás az egyláncú urokináz-típu sú plazminogén aktivátorokban is kialakul plazminos aktiválás hatására. Az urokináz-tipusu plazminogén aktivátorok és a kromogén szubsztrát reakciójával keletkezett pNA mennyiségét spektrofotometriásán mérjük, 410 ntn-en, mikrolemez-leolvasót (minireader II, Dynatech) használva.

A plazminos aktiválást úgy végezzük, hogy a plazminogén aktivátorokat növekvő koncentrációban (1 ng/ml-től 100 ^ug/ml-ig változó koncéntráció-tartományban) 0,038 mól/1 nátrium-kloridot, 0,01 % Tween 80-at tartalmazó 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferben (pH 8,8) inkubáljuk 37 °C-on, 15 percen keresztül

12,5 ug/ml plazmin jelenlétében

Természetesen felelő kontrollokat (plazmin nélkül) is készítünk. A fenti meginkubálási szakasz után minden egyes inkubált elegyből 20 ?ul-t adunk 180

szubsztrát-old a thoz amely 0,25 mg/ml S-2444-et és

100 KNE/ml aprotinint tartalmaz Tris-HCl-pufferben (pH 8,8).

Az igy kapott elegyeket 37 °C-on további 30 percen keresztül inkubáljuk. A reakciót 50 /Ul 50 %-os vizes ecetsavoldat hozzáadásával állítjuk le.

Ugyanezt a vizsgálatot elvégezzük nemzetközi összehasonlító urokináz készítménnyel (n. 66/46) is, amelyet dr. p.

J. G-affney bocsátott rendelkezésünkre (National Institute fór

Biological Standard s and Control, London, Nagy-Britannia) , és felvesszük a kalibrációs görbét.

Minden egyes vegyületnél NE/ml-re számítjuk át az optikai sűrűség mért értékeit a fenti kalibrációs görbe segítségével.

A specifikus aktivitásokat (NE/ing protein) az egyes urokináz-tipusu plazminogén aktivátorok protein-tartalmának meghatározása után számítjuk ki, Bradford microassay-t (Bio-rad, standard II, BSA) használva. Az S-2444 vizsgálat és a protein-meghatározás ismert /Pannell R. és G-urewich V.: Activation of plasminogen by single-chain urokinase or by two chain urokinase. A deminstration that single-chain urokinase has a low catalytic activity (Prourokinase), Blood 69(1), 22 (1987); Bradford M.M.: A rapid and sensitive method fór tbe quantitation of microgram quantities of proteins utilising tbe principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)/.

Urokináz-tipusu amid öli ti kus aktivitás he parin jelenlétében

Vad-tipusu prcUK-t (végkoncentrációja 1000 NE/ml) és az uj proUK-származékot (Δ125, végkoncentrációja 1000 NE/ml) 0,038 mól/1 nátrium-kloridot és 0,01 % Tv/een 80-at tartalmazó 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferben (pH 7,4) plazminnal (végkoncentrációja 10 mg/ml) kezelünk, heparin távollétében, illetve 0,001 - 10 NE/ml heparin jelenlétében. Különböző időpon24 tokban (5., 10., 15. perc) a reakcióé légyből azonos térfogatnyi mintát veszünk, és meghatározzuk a keletkezett kétláncu, urokináz-tipusu amid ölitikus aktivitást S-2444 kromogén szubsztrátot alkalmazva, a fentiekben ismertetett módon.

Urokináz-tipusu plazminogén aktivá.torok vérrög-lizáló aktivitása

A vizsgálatot Matsuo 0., Ryken D.C. és Collen D. módszerével végezzük /Comparison of the relatíve fibrinogenolytic, fibrinolytic and thrombolytic properties of tissue plasminogen activator and urokinase in vitro, Thromb. Haemost. 45, 225 (1981//.

A vérlemezkékben szegény normál plazmát (PPP-t) 10 mmól/1 trinátrium-citrátot tartalmazó vérkonzerv 3000 g-vel 4 °C-on 10 percen át tartó centrifugálásával nyajük.

A ¹²^I-jelzett humán fibrinogént (10000 cpra, Amersham) tartalmazó 0,5 ml citrátos humán PPP-t 25 mmól/1 végkoncentrációban adott CaClg-dal és 2 NIH/ml végkoncentrációban adott humán trombinnal koaguláltatjuk. Az elegyet ezután 4 mm belső átmérőjű szilikoncsövekbe felszivatjuk és 30 percen keresztül 37 °C-on tartva koaguláltatjuk. A csövet 1,5 cm-es hosszúságú darabokra vágjuk. A vérrögöket Petri-csészékbe öntjük és többszöri cserével 0,15 mól/1 koncentrációjú nátrium-klórid-oldattal szobahőmérsékleten 5 percen keresztül mossuk.

A rádioizotópos számlálás után a vérrögöket azonnal 2 ml PPP-ben és 50 yul, 0,058 mól/1 nátrium-kloridot és 0,01 % Tween 80-at tartalmazó 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferben (pH 7,4) inkubáljuk, 37 °C-on.

• · ···« ·· ···· • · · ·· ·* · · ····

- 25 Hozzáadjuk az urokináz-tipusu plazminogén aktivátorokat (a proUK-t, A125-öt, ^140-et és AL5O-et 150 NE/ml, a T0-UK-t 50 NE/ml végkoncentrációban) vagy a puffért /0,03 mól/1 nátrium-kloridot és 0,01 % Tween 80-at tartalmazó 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl puffer (pH 7,4)/.

Az trombolizis mértékét 37 °C-on 4 órán keresztüli inkubélás után a vérrögből szabaddá vált és a plazmából visszanyert radioaktív izotóp mennyiségéből számítjuk ki, három párhuzamos mérés eredményéből. Az eredményeket az alapérték (fibrinolitikus hatónyag nélkül mért érték) %-ában fejezzük ki.

Urokináz-tipusu plazminogén aktivátorok stabilitása

NE/ml TC-UK-t, illetve 150 NE/ml proUK-t vagy annak kismolekulatömegű származékait szobahőmérsékleten, 24 órán keresztül inkubálunk normál, humán eredetű citrátos PPP-ben. Ez125 után hozzáadjuk a frissen készített I-dal jelzett humán plazmarögöket, és a trombolizis mértékét a fent ismertetett módon mérjük /Matsuo 0., Ryken D.C. és Collen D.: Comparison of the relatíve fibrinogenolytic, fibrinolytic and thrombolytic properties of tissue plasminogen activator and urokinase in vitro, Thromb. Haemost. 45, 225 (1981/7.

Plazma fibrinogén szintje

Az egyes urokináz-tipusu plazminogén aktivátorokat a 125j_jelzett humán plazmarögökkel 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáljuk, majd a plazmából 50 yul-es alikvotokat veszünk és meghatározzuk a fibrinogén-tartalmat fibrinogén-fibrin polimerizációs vizsgálattal /Vermylen C., Vreker R. és Verstraete M.: A

- 26 rapid enzymatic method fór assay of fibrinogén:fibrin polymerization time (FPT-test), Clin. Chira. Acta 8, 418 (1963)7·

Farinak oki ne tikai vizsgálatok

A vizsgálatokat 150 - 250 g-os him Spargue-Dawley (Charles River) patkányokon végezzük.

Az állatokat egy éjszakán keresztül éhezte tjük, és a kísérlet napján 50 mg/kg ip. adott pentobarbitállal altatjuk.

A farok-vénába egyszeri dózisban 80000 ΝΞ/kg vad-tipusu proUK-t és Δ125 -jelzésű uj, kismóltömegü proUK-származékot injektálunk. A kontroll állatok fiziológiás sóoldatot kapnak. Különböző időpontokban, azaz a kísérlet megkezdése előtt (0. percben), majd az intravénás injekció utáni 0,5., 1., 2., 5., 10., 20 és 30 percben a has-aortából vérmintát veszünk, és 0 - 0,11 mól/1 végkoncentrációban adott trinátrium-citráttal meggátoljuk a koagulálást. Minden egyes vegyületet minden egyes időpontban legalább 3 állaton vizsgálunk. A vérmintákat 2000 g-vel 15 percen keresztül 4 °C-on centrifugáljuk, és a plazmában mérjük az euglobin-frakció fibrinolitikus aktivitását fibrin-lemez módszerrel ^Atrup

T. és Muellertz S.: Arch. Biochem. Biophys. 40, 346 - 351 (1952)/; valamint meghatározzuk az urokinázzal kapcsolatos antigén-szintet enzim-kötött immunszorbens vizsgálati módszert /Elisa/ alkalmazva, a kalibrálást vad-tipusu proUK belső standard készítménnyel végezzük /Grondahl, Hansen J., Agerlin N., Munkholm, Larsen P. , Bach F., Nielsen L.S., Dombernowsky P. és Dano K.: Sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay fór urokinase-type plasminogen activator and its application to plasma írom pátiénts with breast cancer, J. Láb. Clin. Med. 111(1), 42-51 (1988//.

1. táblázat: Kismólekulatömegű prourokináz-származékok urokináz-

-tipusu amid öli tikus aktivitása

Vegyület Amid ölitikus aktivitás (NE/mg/^x plazmin nélkül plazminnal

Δ125	nem	mutatható	ki	96	000
Δ140	nem	mutatható	ki	85	000
Δ15Ο	nem	mutaiható	ki	105	OOC
proUK	nem	mutatható	ki	98	000
TC-UK	128 000		128	000

x az urokináz-tipusu amid ölitikus aktivitást a plazminnal (12,5 /Ug/ml) végzett kezelés előtt és után S-2444 kromogén szubsztráttal határozzuk meg /Pannell R., Gurewich V.;

Activation of plasminogen by single-chain urokinase or by two chain urokinase. A. Demonstration that single-chain urokinase has a low catalytic activity (pro-urokinase), Blood, 69(1), 22 (1987)7

A proUK és kimolekulatömeg származékai, valamint a humán kétláncu urokináz (TC-UK) specifikus aktivitásait a dr.

P. J. Gaffney-től (National Institute fór Biological Standards and Control, London, Nagy-Britannia) beszerzett nemzetközi összehasonlító urokináz-készitménpyel végzett kalibráció alapján határozzuk meg.

Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.

• · · · ·· • ·♦· • ·

- 28 ·«·

2. táblázat: Kismolekulatömegii prourokináz-szármáz ék ok fibrino-

Jitikus és fibrinogenolitikus aktivitása

Vegyület ^^I-jelzett vérFibrinogén

Stabilitás rög-lizáló aktivikoncen tráció plazmában* tás plazmában (%) falapért ék-térfogat %-ában) (%)

4125	95	85	90
Δ140	85	90	90
Δ150	100	50	85
proUK	100	85	80
TC-UK	100	10	0

125 x· I-jelzett vérrög-lizáló aktivitás %-a 24 órás inkubálás után

Claims (18)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás a humán prourokináz kismolekulatömegű származékai előállítására, amelyek az érett prourokináznak legalább a 163 - 4-11. aminosavjáig tartó aminosav-szekvenciát tartalmazzák egyláncú konfigurációban, azzal jellemezve , hogy a humán prourokinázt kódoló génben hely-specifikus mutagenezist hajtunk végre, a kapott DNS-szekvenciát expressziós vektorba illesztjük, az expresszós vektorral egy gazdasejtet transzformálunk, majd a transzformált gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztve a proteint kifejezzük.
2. 2. Eljárás a humán prourokináz kismolekulatömegü származékai előállítására, amelyek az érett prourokináznak legalább a 151 - 411. aminosavjáig tartó aminosav-szekvenciát tartalmazzák egylánu konfigurációban, azzal jellemezve , hogy a humán prourokinázt kódoló génben hely-specifikus mutagenezist hajtunk végre, a kapott DNS-szekvenciát expressziós vektorba illesztjük, az expressziós vektorral egy gazdasejtet transzformálunk, majd a transzformált gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztve a proteint kifejezzük.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan származékok előállítására, amelyekből az érett prourokináz 48 135. aminosavjáig tartó szekvenciájában található úgynevezett kringle-régió hiányzik, azzal jellemezve, hogy a hely-specifikus mutációt a megfelelő helyen hajtjuk végre.
4. 4. Az 1 - 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan származékok előállítására, amelyekből legalább az érett prourokináz 11 - 47. aminosavjáig tartó szekvenciájában található receptor-kötő hely vagy sejt-kötő hely hiányzik, azzal jellemezve, hogy a hely-specifikus mutációt a megfelelő helyen hajtjuk végre.
5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás ólján származék előállítására, amelyben az érett prourokináz 136 - 411. aminosavjáig tartó aminosav-szekvenciához az érett prourokináz 1 - 10. amincsav-szekvenciája van kapcsolva, azzal jellemezve , hogy a hely-specifikus mutációt a megfelelő helyen hajtjuk végre.
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan származék előállítására, amely, az érett prourokináz 141 - 411. aminosavjáig tartó aminosav-szekvenciából áll, azzal jellemezve , hogy a hely-specifikus mutációt a megfelelő helyen hajtjuk végre.
7. 7. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan származék előállítására, amely az érett prourokináz 151 - 411. aminosavjáig tartó aminosav-szekveneiából áll, azzal jellemezve , hogy a hely-specifikus mutációt a megfelelő helyen hajtjuk végre.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan származék előállítására, amely az érett prourokináz 163 - 411. aminosavjáig tartó aminosav-szekvenciából áll, azzal jellemezve , hogy a hely-specifikus mutációt a megfelelő helyen hajtjuk végre.
9. 9. Az 1 - 8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amino-terminálishoz egy pótlólagos metionin-maradékot is kapcsolunk.
10. 10. Az 1 - 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott származékhoz legalább egy glükozidos oldalláncot is kapcsolunk.
11. 11. Az 1 - 10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott származékon aminsav deléciót, szubsztitúciót vagy inzerciót hajtunk végre, vagy legalább még egy aminosavból álló szekvenciát kapcsolunk hozzá.
12. 12. Eljárás kismolekulatömegű, származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1 - 11. igénypontok szerinti előállított származékot plazminnal kezeljük.
13. 13. Eljárás az 1. ábrán ismertetett kismolekulatömegű származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szekvenciát használjuk.
14. 14. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1 - 13. igénypontok bármelyike szerint előállított származékot a gyógyszerkészitésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé formáljuk.
15. 15. Eljárás az 1 - 13. igénypontok bármetyike szerinti származékot kódoló DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a prourokinázt kódoló humán génen ·· ·»·· ·· ···· • · · · · · ·· · · · ·«· • · · · · · *· · «· ··· hely-specifikus mutagenezist hajtunk végre.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a hely-specifikus mutagenezist olyan szintetikus oligodezoxiribonukleotidot használva hajtjuk végre, amelyből hiányzik a törlendő szekvencia, és a szekvenciát marker rescue módszerrel kiegészítjük.
17. 17. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerint előállított DNS-t megfelelő vektorba illesztjük.
18. 18. Eljárás transzformált mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazda-mikroorganizmust a 17. igénypont szerinti eljárással előállított expressziós vektorral transzformáljuk.