JP2003521222A - 高度結晶性ウロキナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本開示は、生物学的に活性な修飾されたウロキナーゼ及び高分解能結晶型の修飾されたウロキナーゼを記載する。修飾されたウロキナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び修飾されたウロキナーゼを作成するための方法も、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本願は、１９９８年３月６日に出願された米国特許出願第０９／０３６，３６
１号に基づく優先権を主張する。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、ポリペプチド、結晶型のこれらポリペプチド、及びポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに関する。より詳細には、本発明は、高分解能結晶
を形成することができる修飾されたウロキナーゼに関し、さらに、修飾されたウ
ロキナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び修飾されたウロキナーゼを作製
するための方法に関する。

【０００３】 （発明の背景） 尿プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、ウロキナーゼ又はＵＫとしても知ら
れる）は、単一のペプチド結合の開裂を触媒することによりプラスミノーゲンを
プラスミンに変換する、高度に特異的なセリンプロテアーゼである（Ｌ．Ｓｕｍ
ｍａｒｉａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２（１９）：４２７９−４２８
３［１９６７］）。ｕＰＡは、プロウロキナーゼ（プロＵＫ）又はプロｕＰＡと
呼ばれる４１１アミノ酸の単鎖チモーゲンとして、細胞により分泌される。プロ
ｕＰＡの活性化は、Ｌｙｓ^１５８−Ｉｌｅ^１５９結合の酵素的開裂を必要とする
。活性型の（即ち、開裂された）タンパク質は、Ｃｙｓ残基１４８及び２７９で
ジスルフィド結合を介して接合されたＮ末端の「Ａ鎖」（配列番号：１のアミノ
酸残基１〜１５８）及びＣ末端の「Ｂ鎖」（アミノ酸残基１５９〜４１１）を含
有する（Ｗ．Ａ．Ｇｕｅｎｚｌｅｒら，Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｄ．３６３，Ｓ１３３−１４１［１９８２］）。ｕ
ＰＡのＡ鎖は、「増殖因子ドメイン」と呼ばれる約４０アミノ酸残基の３重ジス
ルフィド領域及びそれよりも大きい３重ジスルフィド・クリングルを含む。Ｂ鎖
は、セリンプロテアーゼに典型的な触媒三つ組残基（即ち、Ｈｉｓ^２０４、Ｓｅ
ｒ^３５６、及びＡｓｐ^３５０）を有するセリンプロテアーゼ・ドメインを含む。
ｕＰＡは、アミノ酸残基３０２にグリコシル化部位も保有する。

【０００４】 ｕＰＡは、細胞表面におけるプラスミノーゲンの活性化を担っており、細胞へ
吸着されたプラスミノーゲンに対するその作用を大きく増強する、自己の高親和
性受容体ｕＰＡＲを有するという点で特徴的である。ｕＰＡＲはまた、細胞間接
着部分、及び浸潤細胞の先端部に局在している。このように、ｕＰＡは、癌の浸
潤及び転移、並びに血管新生にとって必要なプロテアーゼ活性の方向性のあるカ
スケードにおいて中心的な役割を果たすよう、空間的かつ代謝的に位置している
。ｕＰＡ及び／又はｕＰＡＲの上昇は、悪性組織、及び癌における悪い臨床的予
後と強く相関している。腫瘍細胞浸潤実験及び動物転移実験から、ｕＰＡを遮断
することにより、腫瘍の増殖及び転移、並びにｕＰＡによる血液供給の誘発の遅
延が起こることを示唆する実質的な証拠が存在する。このように、ウロキナーゼ
タンパク質活性部位におけるリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と相互作用し、Ｌ
ＢＤへの天然の基質の導入を遮断する阻害剤は、これらの状態の処置において治
療的に有用である可能性がある。

【０００５】 単結晶Ｘ線回折が、原子レベルでのタンパク質構造の決定、及びこれらのタン
パク質構造の薬物発見過程への組み込みを可能にすることは、十分に確立されて
いる。タンパク質の３次元構造は、タンパク質活性部位におけるＬＢＤの同定を
可能にする。さらに、ＬＢＤにおけるリガンドと結合溝（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｌ
ｅｆｔｓ）との関係及び／又は機能性の同定は、リガンドとタンパク質との共結
晶化により解明され、酵素阻害剤、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのリガ
ンド（この場合には薬物候補）の潜在的有効性を評価するために用いることがで
きる。共結晶構造は、薬物候補のいずれの部位を誘導体化すべきか、又はすべき
でないかを示し、さらに、効力の増加、即ちＬＢＤにおけるより良好な結合をも
たらす可能性が高い官能基の性質及びサイズを示す。

【０００６】 構造を基盤とした薬物発見の最良の実施形態は、接近可能な空の結合部位を有
し、再現可能に高分解（＜２．０Å）に回折する高品質のタンパク質結晶を必要
とする。当分野において周知のように、空の結合部位は、タンパク質が結晶性で
ある間、目的のリガンドのＬＢＤへの導入を可能にし、高分解能回折はリガンド
とＬＢＤとの相互作用の正確な同定を可能にする。

【０００７】 低分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子−阻害剤複合体が、当分
野において既知である（Ｓｐｒａｇｇｏｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：６８１
−６９１［１９９５］）。しかしながら、得られたデータは分解能が低く（３．
１Å）、結晶が、ＬＢＤに不可逆的に結合した阻害剤を含んでいた。共結晶化法
を用いてＬＢＤと共に他の阻害剤を取り込む試みは、低品質の結晶のみを提供し
た。

【０００８】 このように、リガンド結合データを集めることができる高品質のウロキナーゼ
結晶が必要とされている。

【０００９】 （発明の概要） 本発明は、（ａ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０４位、（
ｂ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０５位、（ｃ）配列番号：
１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０６位、（ｄ）配列番号：１のアミノ酸１
５９位からアミノ酸４０７位、（ｅ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミ
ノ酸４０８位、（ｆ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０９位、
（ｇ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１０位、及び（ｈ）配列
番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１１位からなる群より選択されるア
ミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する生物学的に活性な修飾された尿
型プラスミノーゲン活性化因子（ｍｏｄ−ｕＰＡ）をコードする（一つ又は複数
の）ポリヌクレオチドを提供する。前記（ａ）〜（ｈ）において、２７９位（Ｘ
ａａ^２７９）及び３０２位（Ｘａａ^３０２）のＸａａと名付けられたアミノ酸残
基は、任意のアミノ酸でありうる。好ましい実施態様において、２７９位のＸａ
ａ残基はＡｌａである。もう一つの好ましい実施態様において、３０２位のＸａ
ａ残基はＧｌｎである。さらに好ましい実施態様において、２７９位及び３０２
位のＸａａ残基は、それぞれＡｌａ及びＧｌｎである。

【００１０】 もう一つの実施態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む組換え
ベクターを提供する。好ましい実施態様において、ベクターは、Ｘａａ残基２７
９にＡｌａを有し、Ｘａａ残基３０２にＧｌｎを有する前記ポリヌクレオチドの
うちの一つを含む。本発明は、組換えベクターを含む宿主細胞をさらに提供する
。

【００１１】 さらにもう一つの実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号：１のアミノ
酸１５９位からアミノ酸４０４位、（ｂ）配列番号：１のアミノ酸１５９位から
アミノ酸４０５位、（ｃ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０６
位、（ｄ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０７位、（ｅ）配列
番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０８位、（ｆ）配列番号：１のアミ
ノ酸１５９位からアミノ酸４０９位、（ｇ）配列番号：１のアミノ酸１５９位か
らアミノ酸４１０位、及び（ｈ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸
４１１位からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を
有する生物学的に活性なグリコシル化されていない修飾された尿型プラスミノー
ゲン活性化因子（ｍｏｄ−ｕＰＡ）を提供する。ただし、該ｍｏｄ−ｕＰＡがグ
リコシル化されている場合には残基２７９はＣｙｓを除く任意のアミノ酸残基で
あり、かつ該ｍｏｄ−ｕＰＡがグリコシル化されていない場合には残基２７９は
任意のアミノ酸残基である。好ましいｍｏｄ−ｕＰＡは、２７９位のＸａａ残基
がＡｌａであるものである。より好ましいｍｏｄ−ｕＰＡは、３０２位のＸａａ
残基がＧｌｎであるものである。さらに好ましい実施態様において、２７９位及
び３０２位のＸａａ残基は、それぞれＡｌａ及びＧｌｎである。もう一つの実施
態様において、本発明は、一次構造が前記ポリペプチドの構造を有する結晶型の
ｍｏｄ−ｕＰＡを提供する。結晶型の一次構造も、前記の好ましい実施態様を有
する。

【００１２】 本発明は、（ａ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドの産生を可能にする条件下で本
発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｂ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドを回収
する工程を含む、ｍｏｄ−ｕＰＡを作成するための方法をさらに提供する。

【００１３】 （図面の簡単な説明） 図１は、２７９位及び３０２位のアミノ酸残基がＸａａにより示されるという
修飾を有するヒト尿型プラスミノーゲン（ｕＰＡ）のアミノ酸配列（配列番号：
１）を示す。天然型ｕＰＡにおいては、アミノ酸２７９位におけるＸａａはＣｙ
ｓであり、アミノ酸３０２位におけるＸａａはＡｓｎである。（配列番号：１に
おいて、残基−１〜−２０はヒトｕＰＡの天然型リーダー配列を表す。） 図２は、好ましいポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

【００１４】 （発明の詳細な説明） 本発明の実施は、別途示さない限り、当業者の能力の範囲内である分子生物学
、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術の一般的な技術を使用する。そのような技術
は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ
＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版（１
９８９）；ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ
．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；シリーズ、酵素学の方法（ｔｈｅ ｓｅｒ
ｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃ
ｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
；Ｓｃｏｐｅｓ，タンパク質精製：原理及び実際（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（第２版
，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）；及びＰＣＲ：実際の手法（ＰＣＲ：Ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編（１９９１
）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。

【００１５】 前記であれ下記であれ、本明細書に引用された全ての特許、特許出願、及び出
版物は、参照して本明細書に完全に組み込まれる。

【００１６】 この明細書及び添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、
「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを指図していない
限り、複数の指示を含む。

【００１７】 Ｉ．定義： 本発明の記載において、以下の用語が使用され、下記のように定義されるもの
とする。

【００１８】 本明細書において用いられるように、「ポリヌクレオチド」という用語は、リ
ボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドいずれかの、任意の長さの重合体
型ヌクレオチドをさす。その用語は、分子の一次構造のみをさす。従って、その
用語は、二本鎖及び一本鎖のＤＮＡを含み、さらに二本鎖及び一本鎖のＲＮＡを
含む。それは、メチル化及び／又はキャップ構造付加などによる修飾、並びに未
修飾型のポリヌクレオチドも含む。

【００１９】 「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いら
れ、ペプチド結合を介して連結したアミノ酸の分子鎖を示す。その用語は、特定
の長さの産物をささない。従って、ペプチド及びオリゴペプチドは、ポリペプチ
ドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシ
ル化、アセチル化、リン酸化などもさすものとする。さらに、タンパク質断片、
アナログ、ムテイン、融合タンパク質などが、ポリペプチドの意味に含まれる。
本発明のポリペプチド及びタンパク質は、当業者に既知の任意の手段により作成
されうる（即ち、それらは、単離されるか、又は組換え、合成、もしくは半合成
の技術により作成されうる）。

【００２０】 本明細書において用いられるように、「アナログ」という用語は、本明細書に
提供された開示されたｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドと類似の生物学的活性を示す
ポリペプチドをさす。ポリペプチドの生物学的機能を実質的に変更することなく
修飾及び変化が作成されうることは、当分野において周知である。そのような変
化の作成において、側鎖置換基の相対的類似性、例えば、サイズ、電荷、疎水性
、親水性などに基づき、類似のアミノ酸残基の置換がなされうる。記載された型
の変更は、ポリペプチドの効力又は酵素分解に対する安定性又は薬物動態を増強
するためになされうる。従って、本発明の範囲内であると考えられる配列は、前
記の基本的性質及び生物学的活性を変更させない、アミノ酸残基配列又は型の変
化により特徴付けられる類似配列を含む。

【００２１】 一般に、「類似性」とは、アミノ酸が同一であるか、又は電荷もしくは疎水性
のような類似の化学的及び／もしくは物理的特性を保有する、適当な場所におけ
る２つ又はそれ以上のポリペプチドのアミノ酸とアミノ酸との正確な比較を意味
する。「類似率」は、当分野において周知の技術を用いて、比較されたポリペプ
チド配列間で決定されうる。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド
配列又はポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチドとヌクレオチド、又はアミ
ノ酸とアミノ酸との正確な一致を意味する。２つ又はそれ以上のポリヌクレオチ
ド配列は、「同一率」を決定することにより比較されうる。２つのアミノ酸配列
も、同様に、「同一率」を決定することにより比較されうる。

【００２２】 核酸及びアミノ酸の配列同一性、並びにアミノ酸配列類似性を決定するための
技術は、当分野において周知である。例えば、核酸及びアミノ酸の配列同一性を
決定するための一つの方法は、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を（通
常ｃＤＮＡ中間体を介して）決定すること、及びそれにコードされたアミノ酸配
列を決定すること、及びこれを第二のアミノ酸配列と比較することを含む。ウィ
スコンシン配列解析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ
ｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で利用可能なプログラム、例えばＧＡＰプログ
ラム（デフォルト又は他のパラメーターを含む）は、２つのポリヌクレオチド間
の同一性、並びに２つのポリペプチド配列間の同一性及び類似性の両方をそれぞ
れ計算することができる。配列間の同一性又は類似性を計算するための他のプロ
グラムも、当分野において既知である。

【００２３】 「縮重異型」又は「構造的に保存された変異」という用語は、縮重異型の由来
元であるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする、挿入、欠失、又は置換のような変化をそ
の核酸配列内に含有するポリヌクレオチドをさす。

【００２４】 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」
、及び単独細胞実体として培養された微生物又は高等真核細胞系を意味する他の
そのような用語は、組換えベクターもしくは他の転移ＤＮＡの受容細胞として用
いられうる、又は用いられている細胞をさす。ここで、ＤＮＡが細胞へ導入され
る方法、又は細胞のその後の配置は重要ではない。これらの用語は、トランスフ
ェクトされた原細胞の継代細胞を含む。本明細書において用いられるように、「
レプリコン」とは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律性単位として行動する
、プラスミド、染色体、又はウイルスのような任意の遺伝要素を意味する。

【００２５】 「ベクター」は、接着したセグメントの複製及び／又は発現などを引き起こ
すための、別のポリヌクレオチド・セグメントが接着しているレプリコンである
。その用語は、発現ベクター、クローニング・ベクターなどを含む。

【００２６】 「調節配列」という用語は、それがライゲートしたコーディング配列の発現を
行うポリヌクレオチド配列をさす。そのような調節配列の性質は、宿主生物によ
り異なる。原核生物においては、そのような調節配列は一般的にプロモーター、
リボソーム結合部位、及びターミネーターを含み、真核生物においては、そのよ
うな調節配列は一般的にプロモーター、ターミネーター、及び場合によってエン
ハンサーを含む。このように、「調節配列」という用語は、発現のために存在す
る必要がある最少の全成分を含むものとし、存在が有利である付加的な成分、例
えばリーダー配列も含みうる。

【００２７】 「コーディング配列」は、適当な制御配列の調節下に置かれたときに、ｍＲＮ
Ａに転写され、かつ／又はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列であ
る。コーディング配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドン及び３’末端の翻訳
終止コドンにより決定される。コーディング配列は、これらに限定されないが、
ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、及び組換えポリヌクレオチド配列を含みうる。変
異体又はアナログは、コーディング配列の一部の欠失、配列の挿入、及び／又は
配列内の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換により調製されうる。部位特異
的突然変異誘発のようなヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当業者に周
知である。例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前記；ＤＮＡクロー
ニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）第Ｉ及びＩＩ巻、前記；核酸ハイブリダイゼ
ーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、前記を
参照のこと。

【００２８】 「機能的に連結した」とは、記載された成分が、意図された様式でそれらが機
能することを可能にする関係にある状況をさす。従って、例えば、コーディング
配列に「機能的に連結した」調節配列は、コーディング配列の発現が調節配列と
適合する条件下で達成されるような様式で、ライゲートしている。コーディング
配列は、ポリヌクレオチドが宿主細胞において発現するよう、ポリヌクレオチド
の転写を指図する調節配列と機能的に連結しうる。

【００２９】 「オープン・リーディング・フレーム」又は「ＯＲＦ」という用語は、ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域をさす。この領域は、コーディ
ング配列の一部、又は全コーディング配列を表すことができる。

【００３０】 「形質転換」という用語は、挿入のために用いられる方法、又は挿入されるポ
リヌクレオチドの分子型に関わらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿
入をさす。例えば、注入、直接取り込み、形質導入、及びｆ接合が含まれる。さ
らに、ポリヌクレオチドそのものの挿入、並びに外因性ポリヌクレオチドを含む
プラスミド又はベクターの挿入が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、細胞に
より直接転写及び翻訳され、ゲノムに組み込まれないベクター、例えばプラスミ
ドとして維持されるか、又は宿主ゲノムに組み込まれる。

【００３１】 本明細書において用いられるように、「単離された」という用語は、その最初
の環境（例えば、それが天然に存在するものであれば、天然の環境）から材料が
除去されていることを意味する。例えば、動物生体内に存在する天然に存在する
ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において
共存する材料の一部又は全部から分離されている同ポリヌクレオチド又はＤＮＡ
又はポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクタ
ーの一部であってよく、かつ／又はそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチドは、組成物の一部であってよく、それでも、ベクター又は組成物はその天
然の環境の一部ではないため、それらは単離されている。

【００３２】 「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列と相補的であり、標的ヌ
クレオチド配列とハイブリダイズするために用いられる特定のオリゴヌクレオチ
ド配列を意味し、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素の
いずれかにより触媒されるヌクレオチド重合の開始点としてはたらく。

【００３３】 本明細書において用いられるように、「組換えポリペプチド」とは、元来、又
は操作によって、天然において相関しているポリペプチドの全部もしくは一部と
相関していない、かつ／又は天然において連結しているポリペプチドを除くポリ
ペプチドと連結している、少なくとも一つのポリペプチドを意味する。組換え、
又は誘導されたポリペプチドは、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない
。それは、化学合成又は組換え発現系の発現を含む任意の様式で生成しうる。

【００３４】 本明細書において用いられるように、「合成ペプチド」という用語は、当業者
に周知の方法により化学的に合成されうる、任意の長さの重合体型アミノ酸を意
味する。これらの合成ペプチドは、様々な適用において有用である。

【００３５】 「精製されたポリヌクレオチド」とは、本質的に独立である、即ち、そのポリ
ヌクレオチドが天然に相関しているタンパク質の約５０％未満、好ましくは約７
０％未満、より好ましくは約９０％未満を含有する、目的のポリヌクレオチド又
はその断片をさす。目的のポリヌクレオチドを精製するための技術は、当分野に
おいて周知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞のカオトロピック
剤による破壊、並びにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマト
グラフィー、及び密度に従った沈降による、（一つ又は複数の）ポリヌクレオチ
ド及びタンパク質の分離を含む。従って、「精製されたポリペプチド」とは、本
質的に独立である、即ち、目的のポリペプチドが天然に相関している細胞成分の
約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含有す
る、目的のポリペプチド又はその断片を意味する。精製のための方法は当分野に
おいて既知である。

【００３６】 「精製された産物」とは、その産物が通常相関している細胞構成成分から単離
された産物の調製物をさす。

【００３７】 ＩＩ．試薬 ａ．ポリペプチド：本発明は、 （ａ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０４位、 （ｂ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０５位、 （ｃ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０６位、 （ｄ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０７位、 （ｅ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０８位、 （ｆ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０９位、 （ｇ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１０位、及び （ｈ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１１位 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む修飾されたウロキナーゼ・ポリペ
プチド（以後「ｍｏｄ−ｕＰＡ」と呼ぶ）を提供する。ただし、該ｍｏｄ−ｕＰ
Ａがグリコシル化されている場合には残基２７９（Ｘａａ^２７９）はＣｙｓを除
く任意のアミノ酸残基であり、かつ該ｍｏｄ−ｕＰＡがグリコシル化されていな
い場合には残基２７９は任意のアミノ酸残基であり、かつポリペプチドは、ヒト
・ウロキナーゼと類似の生物学的活性（例えば、触媒活性及び／又は免疫学的活
性）を有する。図２（配列番号：２）に示された好ましい実施態様において、Ｘ
ａａ^２７９はＡｌａであり、かつＸａａ^３０２はＧｌｎである。本発明のポリペ
プチドは、そのような活性を保持する配列番号：１のアナログ及び変異型もしく
は異型タンパク質も含む。一般的に、ｍｏｄ−ｕＰＡのポリペプチド・アナログ
は、前記（ａ）〜（ｈ）と少なくとも約６０％の同一性、好ましくは約７０％の
同一性、より好ましくは約７５〜８５％の同一性、さらに好ましくは約９０％の
同一性、最も好ましくは約９５％又はそれ以上の同一性を有するであろう。従っ
て、アミノ酸残基の一つ又は複数が、保存された又は保存されていないアミノ酸
残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）と置換されているポリペプチドは
、本発明の範囲内であり、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号により
コードされるものであっても、そうでなくてもよい。残基Ｈｉｓ^２０４、Ａｓｐ ^２５５ 、Ａｓｐ^３５０、及びＳｅｒ^３５６（さらに、Ｃｙｓ^２７９を除くＢ鎖内
の他のシステイン残基）が生物学的活性を保護するために必要であることが当分
野において既知であるため、当業者は、得られるｍｏｄ−ｕＰＡの活性に影響を
与えることなく変更されうる様々な残基を容易に確認することができる。

【００３８】 「保存的変化」とは、典型的には、置換されたアミノ酸が類似の構造的又は化
学的特性を有する、約１から５アミノ酸の範囲の変化、例えば、ロイシンとイソ
ロイシン、又はトレオニンとセリンとの交換である。対照的に、非保存的変化と
は、置換されたアミノ酸が元の残基と構造的又は化学的に異なっている変化、例
えばグリシンとトリプトファンとの交換である。類似の微小の変動は、アミノ酸
の欠失又は挿入又はその両方を含みうる。生物学的又は免疫学的活性を変化させ
ることなく置換、挿入、又は欠失されうるアミノ酸の種類及び数の決定における
指針は、当分野において周知のコンピューター・プログラム、例えばＤＮＡＳＴ
ＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用い
て見出されうる。

【００３９】 本発明は、アミノ酸残基の一つ又は複数が、置換基を含むか、又はポリペプチ
ドの半減期を増加させるための化合物のような別の他の化合物（例えば、ポリエ
チレングリコール）と融合している、前記ポリペプチドのいずれかをさらに提供
する。又は、それは、リーダーもしくは分泌配列、又はポリペプチドの精製のた
め使用される配列、又はプロタンパク質配列のような付加的なアミノ酸がポリペ
プチドに融合しているものであってもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、
グリコシル化されていてもよいし、又はされていなくてもよい。

【００４０】 本発明のポリペプチドは、単離、又は組換え、合成、もしくは半合成の技術の
ような当業者に既知の任意の手段により作成されうる。さらに、当業者には明ら
かであるように、Ｘａａ２７９位及び３０２位のために選択される残基の型、並
びにポリペプチド作成の様式は、ポリペプチドがグリコシル化されるか否かによ
って異なるであろう。例えば、グリコシル化されない場合には、組換え作成され
た本発明のポリペプチドが望ましく、使用者はＸａａ^２７９及びＸａａ^３０２の
ために任意のアミノ酸を選択することができる。さらに、この場合には、使用者
は、タンパク質をグリコシル化しない（原核生物宿主のような）組換え宿主を選
択しなければならない。対照的に、使用者が本発明のポリペプチドがグリコシル
化されることを望む場合には、Ｘａａ^２７９のアミノ酸残基はＣｙｓを除くもの
でなければならない。この状況において、組換え技術により（即ち、組換えポリ
ヌクレオチド構築物を介して）タンパク質を作製することを望むものは、タンパ
ク質をグリコシル化しない大腸菌のような原核細胞ではなく、タンパク質をグリ
コシル化する宿主細胞（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）のような真核細胞）に
おいてその構築物を発現させることを承知するであろう。さらに、組換え生成ポ
リペプチドが、天然型ヒトｕＰＡから作成され、Ｃｙｓ^２７９を含有することを
意図する場合には、ヒトｕＰＡをコードするポリヌクレオチド構築物を、Ｃｙｓ ^１４８ とＣｙｓ^２７９との間のジスルフィド結合の形成が抑制されるよう修飾し
なければならない。この結果を達成するためには、配列番号：１のＣｙｓ１４８
残基（Ｃｙｓ^１４８）が修飾された構築物を調製しなければならない。さらに、
そのような構築物は、タンパク質をグリコシル化しない宿主細胞において発現さ
れなければならない。当業者には明らかなように、本発明のタンパク質をこの様
式で作成することを望むものは、インビトロ又はインビボのいずれかでＢ鎖から
Ａ鎖を開裂させなければならない。

【００４１】 反対に、組換え生成ポリペプチドが、天然型ｕＰＡから生成し、配列番号：１
の２７９位にＣｙｓ以外の残基を有することを意図する場合には、Ｃｙｓ^２７９ 位が修飾されており、Ｃｙｓ^１４８位は影響を受けないままであるポリヌクレオ
チド構築物を生成させなければならない。この変異及び他の変異を生成させるた
めの方法は、前記のようなポリペプチドを作製するための他の全ての技術と同様
に、当業者の通常の技術範囲内であると考えられる。

【００４２】 本発明は、本明細書に記載の高分解能結晶型のポリペプチドも提供する。本発
明の結晶型のポリペプチドを作成する方法は、周知であり（例えば、１２月１２
日に発行された米国特許第４，８８６，６４６号を参照のこと）、当業者の通常
の技術レベル内であると考えられる。従って、本明細書に記載のポリペプチド、
ポリヌクレオチド、及び方法を用いて、Ｘ線結晶学のような分析実験を実施する
ための高分解能結晶を生成させるために十分な量の本発明の組換えポリペプチド
が利用可能にされうる。

【００４３】 ｂ．ポリヌクレオチド：本発明は、前記の生物学的に活性なｍｏｄ−ｕＰＡポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドのような試薬も提供する。本発明のポ
リヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又はＤＮＡの形態でありうる。ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡ、及び合成ＤＮＡの形態のＤＮＡが、本発明の範囲内である。ＤＮＡは、二
本鎖であっても又は一本鎖であってもよく、一本鎖である場合、コーディング（
センス）鎖であっても又は非コーディング（アンチセンス）鎖であってもよい。
ポリペプチドをコードするコーディング配列は、本明細書に提供されたコーディ
ング配列と同一であってもよいし、又は遺伝暗号の重複もしくは縮重の結果とし
て、本明細書に提供されたＤＮＡと同一のポリペプチドをコードする異なるコー
ディング配列であってもよい。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：２（図
２に示されている）である。本明細書に開示された配列は、ｍｏｄ−ｕＰＡの作
成及び精製のために用いられうる特別なポリヌクレオチドを表している。

【００４４】 本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドのコーディング配列のみ、又はポ
リペプチドのコーディング配列及びリーダーもしくは分泌配列もしくはプロタン
パク質配列のような付加的なコーディング配列、又はポリペプチドのコーディン
グ配列（及び場合により付加的なコーディング配列）及びポリペプチドのコーデ
ィング配列の５’及び／もしくは３’の非コーディング配列のような非コーディ
ング配列を含むことができる。

【００４５】 さらに、本発明は、ポリヌクレオチドの欠失、置換、又は付加のような修飾を
含有する異型ポリヌクレオチド、及び異型ポリヌクレオチド配列から得られた任
意のポリペプチド修飾を含む。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に提供さ
れたコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子異型であるコーディング配列
を有していてもよい。

【００４６】 さらに、ポリペプチドのコーディング配列は、宿主細胞からのポリペプチドの
発現及び分泌を補助するポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプチド
の輸送を調節するための分泌配列として機能するリーダー配列と、同一のリーデ
ィング・フレームで融合していてもよい。リーダー配列を有するポリペプチドは
、プレタンパク質であり、宿主細胞により開裂されポリペプチドを形成するリー
ダー配列を有するであろう。従って、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質
、又はプレ配列（リーダー配列）を有するタンパク質をコードしうる。

【００４７】 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマー
カー配列とインフレームで融合したコーディング配列を有していてもよい。マー
カー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーと融合したポリペプチドの精製を提
供するためのｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサ・ヒスチジン・タグで
あってよく、又は例えば哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞が用いられる場合
には、マーカー配列はヘマグルチニン（ＨＡ）タグでありうる。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ・ヘマグルチニン・タンパク質に由来するエピトープに相当する。
例えば、Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）を参照のこ
と。多様な発現ベクターが、この目的のため商業的に利用可能であり、本発明の
範囲内であるものとする。

【００４８】 ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと配列との間に少なくとも５０％、好
ましくは少なくとも７０％の同一性が存在する場合、本明細書に提供された配列
とハイブリダイズすると考えられるであろうことが意図される。

【００４９】 ＩＩＩ．組換え技術 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞及び発現ベクター、並び
にそれらがコードするポリペプチドの作製のための組換え法を提供する。そのよ
うな方法は、ｍｏｄ−ｕＰＡポリヌクレオチドの発現に適した条件下で宿主細胞
を培養すること、及び細胞培養物からｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドを回収するこ
とを含む。

【００５０】 本発明の（一つ又は複数の）ポリヌクレオチドは、組換え技術により（一つ又
は複数の）ポリペプチドを作製するために使用されうる。従って、ポリヌクレオ
チド配列は、ポリペプチドを発現するための多様な発現媒体のうちのいずれか、
特にベクター又はプラスミドに含まれうる。そのようなベクターは、染色体、非
染色体、及び合成ＤＮＡの配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、フ
ァージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせ由
来のベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス（ｆｏｗｌ ｐｏｘ
ｖｉｒｕｓ）、及び偽狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）のようなウイルス
ＤＮＡを含む。この実施態様の好ましい局面において、ベクターは、配列と機能
的に連結した制御配列、例えばプロモーターをさらに含む。

【００５１】 適当なＤＮＡ配列は、多様な手順によりベクターに挿入されうる。一般に、Ｄ
ＮＡ配列は、当分野において既知の手順により適当な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。そのような手順及びその他は、当業者の範囲内であると考えら
れる。

【００５２】 極めて多くの適当なベクター及びプロモーターが、当業者に既知であり、商業
的に利用可能である。例えば、以下のベクターが提供されている。細菌：ｐＳＰ
ＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，
ＭＤ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ｐｈ
ａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ
ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５
４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２
ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３
、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。また、原核生物及び
真核生物の宿主と共に用いるための適当なクローニング・ベクター及び発現ベク
ターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記により記載されている。

【００５３】 前記のような適当なＤＮＡ配列を含有する（一つ又は複数の）発現ベクターは
、適当な宿主を形質転換し、宿主がタンパク質を発現することを可能にするため
に使用されうる。宿主細胞は、クローニング・ベクター又は発現ベクターであり
うる本発明のベクターで遺伝子操作（形質導入、又は形質転換、又はトランスフ
ェクト）される。例えば、そのような構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カル
シウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクシ
ョン、又はエレクトロポレーションにより行われうる（Ｌ．Ｄａｖｉｓら，「分
子生物学における基本的な方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，第２版，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎ
ｇ，Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ，
ＣＴ（１９９４））。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化及び形質転
換体の選択のため適宜修飾された一般的な栄養培地で培養されうる。温度、ｐＨ
などのような培養条件は、発現のため選択された宿主細胞と共に従来用いられて
いるものであり、当業者には明らかであろう。適当な宿主の選択は、本明細書に
提供された教示から、当業者の範囲内であると考えられる。

【００５４】 さらなる実施態様において、本発明は、前記構築物を含有する宿主細胞を提供
する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、もしくは酵母細胞のよ
うな下等真核細胞であってもよいし、又は宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞
であってもよい。適当な宿主の代表例は、大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のような細菌細胞；ストレ
プトミセスｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）；ピキアｓｐ．（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｓｐ．）のような酵母細胞；ショウジョウバエ及びＳｆ９のような昆
虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、又はボーズ黒色腫（Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）
のような動物細胞；植物細胞などを含む。

【００５５】 宿主細胞内の構築物は、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を作製する
ため一般的な様式で用いられうる。タンパク質は、適当なプロモーターの調節下
で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、又はその他の細胞で発現されうる。無細胞翻訳
系を使用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いて、そのようなタ
ンパク質を作製することもできる。又は、本発明のポリペプチドは、一般的なペ
プチド合成機により合成的に作製されうる。

【００５６】 適当な宿主株の形質転換、及び宿主株の適当な細胞密度への増殖の後、選択さ
れたプロモーターが適当な手段（例えば、温度シフト又は化学的誘導）により脱
抑制され、さらなる時間、細胞が培養される。細胞は、典型的には遠心分離によ
り収集され、物理的又は化学的手段により破壊され、得られた粗抽出物がさらな
る精製のため保持される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、
凍結解凍反復、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の便
利な方法により破壊されうる。そのような方法は当業者に周知である。

【００５７】 ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドは、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、
酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスフォセルロー
ス・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシア
パタイト・クロマトグラフィー、又はレクチン・クロマトグラフィーを含む既知
の方法により、組換え細胞培養物から回収され、精製される。低濃度（およそ０
．１〜５ｍＭ）のカルシウム・イオンが精製中に存在することが好ましい（Ｐｒ
ｉｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７［１９６９］）。タンパク
質の配位の完成において、必要に応じて、タンパク質再折り畳み工程が用いられ
うる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程
のため使用されうる。

【００５８】 ＩＩＩ．薬物設計 合理的薬物設計の目標は、生物学的に活性な目的のポリペプチド、又はそれら
が相互作用するアゴニスト、アンタゴニスト、もしくは阻害剤を含む小分子の構
造アナログを作製することである。そのような構造アナログは、活性又は安定性
がより高い型のポリペプチドである薬物、又はインビボでポリペプチドの機能を
増強もしくは妨害する薬物を作出するために用いられうる。（Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏ
ｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１（１９９１）を参照のこと
）。

【００５９】 例えば、一つの手法において、結晶性ポリペプチド又はポリペプチド−阻害剤
複合体の３次元構造が、Ｘ線結晶学、コンピューター・モデリング、又は最も典
型的には２つの手法の組み合わせにより決定される。構造を解明し、分子の（一
つ又は複数の）活性部位を決定するためには、ポリペプチドの形状及び電荷の両
方が確認されなければならない。頻度は低いが、相同タンパク質の構造に基づい
たモデリングにより、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が取得されうる。
いずれの場合においても、類似ポリペプチド様分子を設計するため、又は有効な
阻害剤を同定するため、関連のある構造情報が用いられる。

【００６０】 合理的薬物設計の有用な例は、Ｓ．Ｂｒａｘｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ３１：７７９６−７８０１（１９９２）により示されたような、改良され
た活性もしくは安定性を有する分子、又はＳ．Ｂ．Ｐ．Ａｔｈａｕｄａら，Ｊ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１３（６）：７４２−７４６（１９９３）に
より示されたような、天然型ペプチドの阻害剤、アゴニスト、もしくはアンタゴ
ニストとして作用する分子を含みうる。

【００６１】 以上本発明を一般的に記載してきたが、完全な理解は、以下の特定の実施例を
参照することにより得られうる。以下の実施例は、本発明の様々な実施態様を例
示する目的のため与えられ、決して本発明を制限するものではない。

【００６２】 実施例１．ｕＰＡの突然変異誘発解析 ヒトｕＰＡの変異体を、二シストロン性細菌発現ベクターｐＢＣＦＫ１２（Ｐ
ｉｌｏｔ−Ｍａｔｉａｓ，Ｔ．Ｊ．ら，Ｇｅｎｅ １２８：２１９−２２５［１
９９３］）にクローニングした。ＰＣＲにより様々なｕＰＡ変異体を生成させる
ため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。

【００６３】

【化１】

【００６４】 以後ＬＭＷ−ｕＰＡ（Ｌ１４４−Ｌ４１１）と名付けられる低分子量ｕＰＡの
一次クローニングは、標準的なＰＣＲ反応において、ヒトｕＰＡ ｃＤＮＡを鋳
型として、そして配列番号：３及び４をプライマーとして用いて実施した。（ヒ
トｕＰＡの核酸及びタンパク質の配列は、１９９２年５月１２日に発行された米
国特許第５，１１２，７５５号に見出すことができる）。ＰＣＲ増幅されたＤＮ
Ａをゲル精製し、制限酵素ＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次に、消化
された産物を、同一の二つの酵素で予め切断されたｐＢＣＦＫ１２にライゲート
させ、発現ベクターｐＢＣ−ＬＭＷ−ｕＰＡを生成させた。ベクターをＤＨ５α
細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ
）に形質転換し、単離し、ＤＮＡ配列決定により配列を確認した。細菌における
ＬＭＷ−ｕＰＡの産生を、ｕＰＡによるプラスミノーゲン活性化を測定する、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィー（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ，Ａ
．ａｎｄ Ｒｅｉｃｈ．Ｅ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８：２２３−２３４
，（１９７８））により分析した。クーマシーブルー染色されたゲルで示された
ように、ＬＭＷ−ｕＰＡ（Ｌ１４４−Ｌ４１１）は大腸菌で発現し、ザイモグラ
フィー・アッセイにおいて活性であった。

【００６５】 大腸菌におけるＬＭＷ−ｕＰＡの迅速な発現及び検出の成功により、その最少
機能構造を決定するため、ｕＰＡの突然変異誘発解析を実施することが可能とな
った。Ｃｙｓ^２７９がＡｌａ^２７９に交換された一つの変異体を、ＰＣＲにより
配列番号：４及び５を用いて作成した。ＰＣＲ産物をＡｖｉＩＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断し、ｐＢＣ−ＬＭＷ−ｕＰＡ構築物内のＡｖｉＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片と交換するために用いた。得られたＬＭＷ−ｕＰＡ−Ａ^２７９構築物は大腸
菌で発現し、その産物はザイモグラフィーにおいて活性であることが示された（
データは示していない）。以下のように名付けられたオリゴヌクレオチドを用い
て、Ｎ末端又はＣ末端が短縮された、さらなる変異体をＰＣＲにより生成させた
。

【００６６】 変異体 ＬＭＷ−ｕＰＡとの比較における変異体の特徴 配列番号： ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ｎ５ Ｎ末端の５アミノ酸が欠失 ６及び２ ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ｎ７ Ｎ末端の７アミノ酸が欠失 ７及び２ ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ｎ１５ Ｎ末端の１５アミノ酸が欠失 ８及び２ ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ｎ１６ Ｎ末端の１６アミノ酸が欠失 ９及び２ ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ｃ５ Ｃ末端の５アミノ酸が欠失 １０及び１ ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ｃ６ Ｃ末端の６アミノ酸が欠失 １１及び１ ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ｃ７ Ｃ末端の７アミノ酸が欠失 １２及び１ 全ての変異体構築物が前記のように大腸菌で発現し、得られた合成ポリペプチ
ドはザイモグラフィー・アッセイにおいてＬＭＷ−ｕＰＡの活性と類似の活性を
有することが示された。これらの実験の結果より、Ｃｙｓ^２７９がＡｌａに交換
されたヒトｕＰＡのアミノ酸１５９〜４０４からなる、機能性の修飾されたｕＰ
Ａが作成されうることが示された。

【００６７】 実施例２．バキュロウイルスにおけるｍｉｃｒｏ−ｕＰＡ［ｕＰＡ（Ｉ１５９ −Ｋ４０４）Ａ２７９Ｑ３０２］のクローニング及び発現 ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡ（即ち、配列番号：１のアミノ酸Ｉｌｅ^１５９−Ｌｙｓ^{４ ０４} を含有し、かつＣｙｓ^２７９がＡｌａに、Ａｓｎ^３０２がＧｌｎに置換され
た短縮型ｕＰＡ）を、以下のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いてＰＣＲに
より生成させた。

【００６８】

【化２】

【００６９】 ｕＰＡ内の唯一のグリコシル化部位（Ａｓｎ^３０２）を変異させるため、オリ
ゴヌクレオチド・プライマー配列番号：１３及び１５、並びに配列番号：１４及
び１７を、ｐＢＣ−ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ａｌａ^２７９を鋳型として用いた２つのＰ
ＣＲ反応において用いた。２つのＰＣＲ産物を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートさせ、ＬＭＷ−ｕＰＡ−Ａｌａ^２７９−
Ｇｌｎ^３０２を生成させるための鋳型として用いた。天然型ｕＰＡ ｃＤＮＡを
鋳型として用い、配列番号：１６及び１８を用いたＰＣＲにより、天然型ｕＰＡ
リーダー配列を直接Ｉｌｅ^１５９に融合させた。このＰＣＲ産物を、ＬＭＷ−ｕ
ＰＡ−Ａｌａ^２７９−Ｇｌｎ^３０２ＤＮＡを鋳型として用いた新たなＰＣＲ反応
において、配列番号：１７と共にプライマーとして用い、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡ
ｃＤＮＡを生成させた。ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡをＮｈｅＩで切断し、同酵素で切断
されたバキュロウイルス転移ベクターｐＪＶＰ１０ｚ（Ｖｉａｌａｒｄら，Ｊ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６４（１）：３７−５０［１９９０］）へライゲートさせた
。得られた構築物、ｐＪＶＰ１０ｚ−ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを、標準的なＤＮＡ配
列決定技術により確認した。

【００７０】 ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のバ
キュロゴールド・キット（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｋｉｔ）を用いたリン酸カル
シウム沈殿法により、構築物ｐＪＶＰ１０ｚ−ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡをＳｆ９細胞
にトランスフェクトした。培養培地中に活性なｍｉｃｒｏ−ｕＰＡ活性が検出さ
れた。ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを発現する単一組換えウイルスは標準的な方法により
精製されるプラークであった。大量のウイルス・ストックを作成した。

【００７１】 ８０ｒｐｍで振とうしながら２８℃の温度で、２リットル・フラスコ中のエク
セル（Ｅｘｃｅｌ）４０５無血清培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅ
ｎｅＸａ，ＫＳ）で増殖する懸濁液中の別の昆虫細胞系、ハイファイブ（Ｈｉｇ
ｈ−Ｆｉｖｅ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）におい
て、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡの大規模発現を実施した。ハイファイブ細胞を、２×１
０^６細胞／ｍＬに増殖させ、組換えｍｉｃｒｏ−ｕＰＡウイルスを０．１ＭＯＩ
（感染多重度）で添加し、培養を３日間継続した。精製（以下の実施例４を参照
のこと）のための出発材料として培養上清を採取した。培養上清中のｍｉｃｒｏ
−ｕＰＡの活性を、色原性ｕＰＡ基質Ｓ２４４４のアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙ
ｓｉｓ）（Ｃｌａｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７：７６
，１９７８）により測定したところ、６〜１０ｍｇ／Ｌであった。

【００７２】 実施例３．ピキア・パストリスにおけるｍｉｃｒｏ−ｕＰＡの発現 ピキアにおいてｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを発現させるため、（１９９７年５月５日
に出願された米国特許出願第０８／８５１，３５０号に記載のような）合成リー
ダー配列を有する発現ベクターを用いた。組換えタンパク質の分泌のための合成
リーダー配列を含むようベクターｐＨｉｌ−Ｄ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修
飾することにより、ピキア発現ベクターｐＨｉｌ−Ｄ８を構築した。リーダー配
列、配列番号：１９（以下に示す）は、ＫＥＸ２開裂のためのプロペプチド配列
（太字）と機能的に連結したＰＨＯ１分泌シグナル（単一下線）をコードする。
ｐＨｉｌ−Ｓ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はＰＨＯ１をコードする配列を含有す
るため、このベクターを鋳型として用い、ｐＨｉｌ−Ｓ１のヌクレオチド５０９
〜５３０に相当する順向きプライマー（配列番号：２０）、並びにＰＨＯ１分泌
シグナルの後方部分（配列番号：１９のヌクレオチド４５〜６６）及びプロペプ
チド配列（配列番号：１９のヌクレオチド６７〜１０８）をコードするヌクレオ
チド配列を有する逆向きプライマー（配列番号：２１）を用いて、ｐＨｉｌ−Ｄ
８を構築するためＰＣＲを実施した。（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡから入手された）プライマー配列は、以下の
通りであった。

【００７３】

【化３】

【００７４】 増幅は、標準的なＰＣＲ条件下で実施した。ＰＣＲ産物（およそ５００ｂｐ）
をゲル精製し、ＢｌｐＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同酵素で切断されたｐＨｉｌ
−Ｄ２にライゲートさせた。ＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１細胞に形質転換し、陽性
クローンを制限酵素消化及び配列分析により同定した。適切な配列を有する一つ
のクローンをｐＨｉｌ−Ｄ８と名付けた。

【００７５】 次に、以下の２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、ｐＨｉｌ−Ｄ
８へのクローニングのためｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを増幅した。

【００７６】

【化４】

【００７７】 配列番号：２２及び２３を用い、ｐＪＶＰ１０ｚ−ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを鋳型
として用いて、ＰＣＲ産物が得られた。増幅産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切
断し、同一の二つの酵素で切断されたｐＨｉｌ−Ｄ８にライゲートさせた。得ら
れたプラスミドｐＨｉｌＤ８−ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡをＤＮＡ配列決定により確認
し、供給元の指示に従いピキア株ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転
換するために用いた。形質転換されたピキアのコロニーを、供給元（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）により詳細に示されているようにして、ＢＭＧＹ培地における増殖
及びＢＭＭＹ培地における発現により、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡ発現についてスクリ
ーニングした。ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡの活性を色原性基質Ｓ２４４４を用いて測定
した。ピキアにおけるｍｉｃｒｏ−ｕＰＡ発現レベルは、バキュロウイルス・ハ
イファイブ細胞において見られたレベルよりも高く、３０〜６０ｍｇ／Ｌの範囲
であった。

【００７８】 実施例４．ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡの精製 本発明の範囲内でｕ−ＰＡを精製することができる２つの適当な方法が存在し
、以下の４ａ及び４ｂに記載する。

【００７９】 ４ａ．ハイファイブ細胞又はピキアいずれかの培養上清を、２０リットルの容
器にプールした。プロテアーゼ阻害剤、ヨードアセトアミド、ベンズアミジン、
及びＥＤＴＡを、それぞれ１０ｍＭ、５ｍＭ、及び１ｍＭの最終濃度で添加した
。次に、５ｍＭのヘルペス緩衝液ｐＨ７．５を添加することにより上清を５倍に
希釈し、１．２μ及び０．２μのフィルター膜を通過させた。５０〜１００ｍＬ
／分の流速で膜を通過させることにより、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡをサートリウス・
メンブレン・アドソーバーＳ１００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ａｄｓｏｒｂｅｒ Ｓ１００）に捕捉した。１０ｍＭヨードアセトアミド、５ｍ
Ｍベンズアミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭヘルペス緩衝液ｐＨ７
．５で充分に洗浄した後、１０ｍＭヘルペス緩衝液ｐＨ７．５、１０ｍＭヨード
アセトアミド、５ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡ中のＮａＣｌ勾配（２
０ｍＭから５００ｍＭ、２００ｍＬ）を用いて、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡをＳ１００
膜から溶出させた。溶出物（約１００ｍｌ）を、阻害剤を含む１０ｍＭヘルペス
緩衝液で１０倍に希釈し、Ｓ２０カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ
Ａ）にロードした。２０倍カラム容量のＮａＣｌ勾配（２０ｍＭから５００ｍＭ
）を用いて、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを溶出させた。溶出緩衝液中には阻害剤を用い
なかった。次に、溶出物を１０ｍＭヘルペス緩衝液ｐＨ７．５で５倍に希釈し、
ヘパリン・アガロース（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）カラムにロード
した。１０ｍＭから２５０ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを
溶出させた。ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡのヘパリン・カラム溶出物（約５０ｍＬ）を、
１０ｍＭヘルペス緩衝液ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化されたベン
ズアミジン−アガロース（ＳＩＧＭＡ）カラム（４０ｍＬ）へ適用した。次に、
カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出させた。限界濾過によりｍｉｃｒｏ−ｕＰＡ溶出物（
約３０ｍＬ）を４ｍＬに濃縮し、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（登録商標）
Ｇ−７５カラム（２．５×４８ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に適用した。ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを含
有する単一の主要ピークを収集し、最終産物として凍結乾燥させた。精製された
材料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一の主要なバンドとして出現した。

【００８０】 ４ｂ．工程１．調整培地からのｍＵＫの捕捉 ２つの代替的工程のうちのいずれかが、一次捕捉に用いられうる。選択は規模
の問題である。小規模精製の場合、ｍＵＫは、ハイプロピル（ＨｉＰｒｏｐｙｌ
）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）又は等価物のような疎水性相互作用クロマトグラフィ
ーを用いて捕捉され、大規模精製の場合には、Ｓセファロース・ファースト・フ
ロー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ）樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）又は等価物を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより
捕捉されうる。

【００８１】 小規模工程の場合、最終容量において１．１Ｍ酢酸ナトリウムの最終溶液を与
えるため、特定の量の４．５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．０の添加により、培地の
イオン強度を増加させる。この試料を、１．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．０で予
め平衡化されたハイプロピル・カラムに適用する。この様式において、所望のｍ
ＵＫはカラムに結合し、他のタンパク質は結合しない。少なくとも５カラム容量
の１ｍＭｐ−アミノベンズアミジン（ｐＡＢＡ）を含有する１．１Ｍ酢酸ナトリ
ウムｐＨ７．０ですすぐことにより、未結合タンパク質をカラムから洗浄除去す
る。１０カラム容量で勾配を展開することにより、カラムから、５０ｍＭトリス
、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ｐＡＢＡである緩衝液Ｂへ、ｍＵＫが放出され
る。勾配中のｍＵＫの位置は、収集された画分の酵素アッセイにより見出され、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認される。これから、画分プールを作成し、工程２の
準備のため、１０容量の緩衝液Ｃ（５０ｍＭトリス、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ｐＡＢＡ、ｐＨ７．５）に対して透析する。

【００８２】 大規模過程の場合、水への希釈により培地のイオン強度を減少させ、必要に応
じて１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０（緩衝液Ｄ）の添加により、ｐＨをｐＨ５．
０からｐＨ５．５の範囲に調整する。この希釈された試料を、緩衝液Ｄで予め平
衡化されたＳセファロース・ファースト・フロー・カラムに適用する。この様式
において、所望のｍＵＫはカラムに結合し、他のタンパク質は結合しない。１Ｍ
ＮａＣｌを含む１０カラム容量の勾配を展開することにより、ｍＵＫがカラム
から緩衝液Ｄへ溶出される。勾配中のｍＵＫの位置は、収集された画分の酵素ア
ッセイにより見出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認される。これから、画分プ
ールを作成し、工程２の準備のため、１０容量の緩衝液Ｃ（５０ｍＭトリス、０
．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ｐＡＢＡ、ｐＨ７．５）に対して透析する。

【００８３】 工程２．炭水化物修飾型ｍＵＫの除去 工程１からの透析された材料を、緩衝液Ｃで予め平衡化されたコンカナバリン
Ａセファロース（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムへ適用する。十分な時間を可能にするた
め、カラム流は遅く、グリコシル化型ｍＵＫの樹脂への十分な結合能を提供し、
所望の非グリコシル化型ｍＵＫがカラムを素通りすることを可能にするため、カ
ラム容量は大きい。このカラムに結合しない所望のｍＵＫの位置は、収集された
画分の酵素アッセイにより見出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認される。

【００８４】 工程３．ｐＡＢＡを除去するための透析 工程２からの画分プールを、２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５の添加によりｐＨ
５．０に調整する。ｐＡＢＡの濃度が一晩で大きく減少するように数時間後に透
析物を一回交換し、４Ｃで１００容量の１０ｍＭ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ
ｐＨ５．０に対して２回このプールを透析する。透析の終了後、工程４の直前に
、１Ｍトリス塩基ｐＨ８．０の添加により、透析物のｐＨをｐＨ７．５に上昇さ
せる。

【００８５】 工程４．ベンズアミジン・セファロースにおけるインタクト活性型ｍＵＫのア
フィニティ選択 ｐＨ調整された透析物中のｍＵＫは、インタクト活性型ｍＵＫ分子のみならず
、ベンズアミジン・セファロース（Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に対する親和性が比較的低い、比
較的活性が低く部分的に損傷を受けた型のＵＫを含む。活性型ｍＵＫが、５０ｍ
Ｍトリス、０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５（緩衝液Ｅ）で予め平衡化されたカ
ラムに結合するよう、工程５からのｐＨ７．５透析物を、ベンズアミジン・セフ
ァロース・アフィニティ・カラムに適用する。１．５カラム容量の緩衝液Ｅで未
結合のタンパク質をカラムから洗浄除去し、その後、緩衝液Ｅ中の１Ｍアルギニ
ンの１０カラム容量の勾配によりインタクト活性型ＵＫを溶出させ、ｐＨ７．５
に再調整する。勾配の展開中、損傷を受けたｍＵＫ分子は、インタクト活性型分
子よりも早い勾配で溶出する。インタクト活性型ｍＵＫの位置は、収集された画
分の酵素アッセイにより見出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認される。

【００８６】 工程５．透析によるアルギニンの除去 ｐＡＢＡの濃度が一晩で大きく減少するように数時間後に透析物を一回交換し
、４Ｃで１００容量の５０ｍｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５に対して２回、インタ
クト活性型ＵＫのプールを透析する。

【００８７】 実施例５．ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡの共結晶化 ａ．方法：メニガス（Ｍｅｎｉｇａｔｈ）ら（Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ，２：２４９−２５９［１９８９］）により記載された阻害剤ε−ア
ミノカプロン酸ｐ−カルボエトキシフェニルエステルクロリド（ε−ａｍｉｎｏ
ｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｐ−ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔ
ｅｒ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の存在下で、（本質的に、１９８９年１２月１２日に
発行された米国特許第４，８８６，６４６号に記載されているような）つり下げ
滴蒸気拡散法（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｖａｐｏｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ）により、ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡを結晶化した。タンパク質溶液は、
１０ｍＭクエン酸ｐＨ４．０中の６ｍｇ／ｍＬ（０．２１４ｍＭ）ｍｉｃｒｏ−
ｕＰＡ、及び１％ＤＭＳＯ共溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）中の３ｍＭε−アミ
ノカプロン酸ｐ−カルボエトキシフェニルエステルクロリドからなっていた。タ
ンパク質溶液の作成において、阻害剤（３００〜４００ｍＭ ＤＭＳＯストック
溶液）を、およそ３ｍＭ（１％ＤＭＳＯ）の最終阻害剤濃度でｍｉｃｒｏ−ｕＰ
Ａに添加した。典型的なウェル溶液は、０．１５Ｍ Ｌｉ_２ＳＯ_４、２０％ポリ
エチレングリコール（ＭＷ４０００）及びコハク酸緩衝液（ｐＨ４．８〜６．０
）からなっていた。カバー・スリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐ）上でウェル溶液
（２μＬ）をタンパク質溶液（２μＬ）と混合し、スリップでウェルを密封した
。１８〜２４℃で、リンブロ・トレー（Ｌｉｎｂｒｏ ｔｒａｙｓ）（Ｈａｍｐ
ｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）中で結晶を成
長させた。これらの条件下で、結晶化が２４時間以内に起こった。

【００８８】 ｍｉｃｒｏ−ｕＰＡは阻害剤の非存在下では結晶化しないため、共結晶化実体
は阻害剤：ｕＰＡ複合体であると考えられる。共結晶化過程において用いられた
阻害剤の存在下で成長した結晶の３次元Ｘ線構造は、酵素活性部位に阻害剤が残
存しないことを示すため、理論上、この化合物は準安定である、即ち、それは活
性部位のセリン（配列番号：１のアミノ酸残基３５６）をアシル化し、その後酵
素的に脱アシル化される。阻害剤が結晶から解離する実際のメカニズムは不明で
あるが、得られたｍｉｃｒｏ−ｕＰＡは空の活性部位を有する酵素からなる。

【００８９】 ｂ．結果：前記の条件下で得られた結晶は、ａ＝５５．１６Å、ｂ＝５３．０
０Å、ｃ＝８２．３０Å、及びα＝β＝γ＝９０の単位胞寸法を有する空間群Ｐ
２_１２_１２_１に属する。それらはハウス内で１．５Åを超えて回折し、ニューヨ
ーク州イサカのカーネル・ハイ・エネルギー・シンクロトロン・ソース（Ｃｏｒ
ｎｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）
のＣＣＤ検出器で１．０３Å分解能の生データ・セットが収集された。プログラ
ム・パッケージＤＥＮＺＯ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７６，１９９６）により、データを
処理した。１．０３Åデータ・セットのデータ・クオリティを要約するパラメー
タを、以下の表１に要約する。表１は、Ｉ／σが１．７８である１．０４〜１．
０Å分解能のデータ・シェル（ｄａｔａ ｓｈｅｌｌ）において、入射（ｍｅｒ
ｇｉｎｇ）Ｒｓｙｍが０．６３１と高かったが、データが８５．９％完全であっ
たことを示している。従って、１．０８〜１．０４Åデータ・シェルにおいては
Ｉ／σが２．６７でＲｓｙｍが０．４６３であったため、精密化サイクル中に取
り込むデータは１．０４Åでカットした。

【００９０】

【表１】

【００９１】 スプラゴン（Ｓｐｒａｇｇｏｎ）ら（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：６８１−６９
１（１９９５），ＰＤＢ ｅｎｔｒｙ １ ＬＭＷ）のウロキナーゼ構造を検索
プローブとして用い、プログラムＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．Ａｃｔａ Ｃ
ｒｙｓｔ．，Ａ５０：１５７−１６３［１９９４］）を用いた分子交換法（ｔｈ
ｅ ｍｅｌｏｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）により位相
を決定した。回転及び翻訳のファンクションは、５Åと３０Åの間の分解能のデ
ータを用いて実施され、正確な溶液がトップ・ピークに含まれていた。剛体（ｒ
ｉｇｉｄ ｂｏｄｙ）と模擬焼なまし最大確率精密化（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ａ
ｎｎｅａｌｉｎｇ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｒｅｆｉｎｅｍｅ
ｎｔ）と最大確率位置精密化（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｐｏｓ
ｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）との組み合わせにより、プログラム・
パッケージＸＰＬＯＲを用いて構造を精密化した（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｘ−Ｐ
ＬＯＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１）Ｍａｎｕａｌ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，１９９０）。プログラム・パッケージＱＵＡ
ＮＴＡ９７を用いたシリコン・グラフィクス（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃ
ｓ）ＩＮＤＩＧＯ２ワークステーションで、電子密度マップを検査した（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｑｕａｎｔａ Ｇｅｎｅ
ｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９
９７）。タンパク質構造のモデル構築のサイクルは、２．０Å分解能、１．５Å
分解能、及び１．０３Å分解能で起こった。１．０３Å分解能においては、強制
的な個々の温度因子の精密化も改良サイクルに含めた。モデル構築及び代替側鎖
コンフォメーションの追加の後、水分子及び結合イオン追加のサイクルも、ノイ
ズよりも少なくとも４σ高いＦｏ−Ｆｃマップ中の陽性ピークの同定を通して起
こった。現在のモデルのＲ因子は０．２３３であり、Ｒフリー（Ｒ−ｆｒｅｅ）
は０．２８７である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】 ２７９位及び３０２位のアミノ酸残基がＸａａにより示されるという修飾を有
するヒト尿型プラスミノーゲン（ｕＰＡ）のアミノ酸配列（配列番号：１）を示
す。

【００９２】

【図１ｂ】 ２７９位及び３０２位のアミノ酸残基がＸａａにより示されるという修飾を有
するヒト尿型プラスミノーゲン（ｕＰＡ）のアミノ酸配列（配列番号：１）を示
す。

【００９３】

【図２】 好ましいポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，Ｍ Ｘ (72)発明者 ヘンキン，ジヤツク アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイ ランド・パーク、リンカーン・アベニユ ー・サウス・1370 (72)発明者 スミス，リチヤード・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、フオレスト・ノル・217 (72)発明者 ウオールター，カール・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、ストラトフオード・コート・ 3333、スイート・３・イー (72)発明者 セーバリン，ジーン・エム アメリカ合衆国、イリノイ・60083、ワー ズワース、ミツドランド・レイン・4160 (72)発明者 エツダルジ，ローヒントン アメリカ合衆国、イリノイ・60083、ワー ズワース、ワーズワース・ロード・14230 (72)発明者 ジヨンソン，ロバート・ダブリユ，ジユニ ア アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ウエスト・ソールズベリ・17858 (72)発明者 ホルツマン，トーマス アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、タマラツク・レイン・1112 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA16 CA02 CA06 DA02 DA12 EA02 EA04 GA11 HA01 HA03 4B050 CC04 DD11 EE10 FF05E FF11E FF12E FF14E LL03 4B065 AA77X AA90X AA93Y AA95X AB01 AC14 BA02 CA33 CA46

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０４
   位、 （ｂ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０５位、 （ｃ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０６位、 （ｄ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０７位、 （ｅ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０８位、 （ｆ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０９位、 （ｇ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１０位、及び （ｈ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１１位 からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する生
   物学的に活性な修飾された尿型プラスミノーゲン活性化因子（ｍｏｄ−ｕＰＡ）
   をコードするポリヌクレオチドであって、２７９位及び３０２位のアミノ酸残基
   （Ｘａａ^２７９及びＸａａ^３０２）が任意のアミノ酸である、ポリヌクレオチド
   。
2. 【請求項２】 Ｘａａ^２７９残基がＡｌａである、請求項１のポリヌクレオ
   チド。
3. 【請求項３】 Ｘａａ^３０２残基がＧｌｎである、請求項２のポリヌクレオ
   チド。
4. 【請求項４】 請求項１のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項２のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
7. 【請求項７】 バキュロウイルス・ベクターである、請求項５の組換えベク
   ター。
8. 【請求項８】 バキュロウイルス・ベクターである、請求項３の組換えベク
   ター。
9. 【請求項９】 請求項４のベクターを含む宿主細胞。
10. 【請求項１０】 請求項５のベクターを含む宿主細胞。
11. 【請求項１１】 請求項６のベクターを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 （ａ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０
    ４位、 （ｂ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０５位、 （ｃ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０６位、 （ｄ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０７位、 （ｅ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０８位、 （ｆ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０９位、 （ｇ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１０位、及び （ｈ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１１位 からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する生
    物学的に活性な修飾された尿型プラスミノーゲン活性化因子（ｍｏｄ−ｕＰＡ）
    であって、ただし、該ｍｏｄ−ｕＰＡがグリコシル化されている場合には残基２
    ７９がＣｙｓを除く任意のアミノ酸残基であり、かつ該ｍｏｄ−ｕＰＡがグリコ
    シル化されていない場合には残基２７９が任意のアミノ酸残基である、ｍｏｄ−
    ｕＰＡ。
13. 【請求項１３】 ２７９位のＸａａ残基がＡｌａである、請求項１２のｍｏ
    ｄ−ｕＰＡ。
14. 【請求項１４】 ３０２位のＸａａ残基がＧｌｎである、請求項１３のｍｏ
    ｄ−ｕＰＡ。
15. 【請求項１５】 一次構造が、 （ａ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０４位、 （ｂ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０５位、 （ｃ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０６位、 （ｄ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０７位、 （ｅ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０８位、 （ｆ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４０９位、 （ｇ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１０位、及び （ｈ）配列番号：１のアミノ酸１５９位からアミノ酸４１１位 からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する結
    晶型のｍｏｄ−ｕＰＡであって、ただし、該ｍｏｄ−ｕＰＡがグリコシル化され
    ている場合には残基２７９がＣｙｓを除く任意のアミノ酸残基であり、かつ該ｍ
    ｏｄ−ｕＰＡがグリコシル化されていない場合には残基２７９が任意のアミノ酸
    残基である、結晶型のｍｏｄ−ｕＰＡ。
16. 【請求項１６】 ２７９位のＸａａ残基がＡｌａである、請求項１５の結晶
    性ｍｏｄ−ｕＰＡ。
17. 【請求項１７】 ３０２位のＸａａ残基がＧｌｎである、請求項１６の結晶
    性ｍｏｄ−ｕＰＡ。
18. 【請求項１８】 （ａ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドの産生を可能にする条
    件下で請求項４の宿主細胞を培養する工程、及び （ｂ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドを回収する工程 を含む、ｍｏｄ−ｕＰＡを作成するための方法。
19. 【請求項１９】 （ａ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドの産生を可能にする条
    件下で請求項５の宿主細胞を培養する工程、及び （ｂ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドを回収する工程 を含む、ｍｏｄ−ｕＰＡを作成するための方法。
20. 【請求項２０】 （ａ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドの産生を可能にする条
    件下で請求項６の宿主細胞を培養する工程、及び （ｂ）ｍｏｄ−ｕＰＡポリペプチドを回収する工程 を含む、ｍｏｄ−ｕＰＡを作成するための方法。