PT90298B

PT90298B - Processo para a preparacao de derivados de pro-uroquinase de baixo peso molecular e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT90298B
Application number: PT90298A
Authority: PT
Inventors: Jacqueline Lansen; Guy Mazue; Paolo Sarmientos; Anna Brandazza
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1988-04-18
Filing date: 1989-04-18
Publication date: 1994-09-30
Also published as: GB8809093D0; CN1037360A; AU617459B2; HU892527D0; JPH03500125A; PT90298A; DE68920900D1; KR900700598A; IL90011A; PH27586A; YU79189A; ATE118033T1; NZ228791A; IL90011A0; ZA892829B; MY105110A; EP0338409B1; AU3414989A; WO1989010402A1; FI896003A0

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90 298

REQUERENTE: FARMITALIA CARLO ERBA S.r.l., italiana, com sede em Via Cario Imbonati, 24, 1-20159 Milano, Itália.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS

DE PRO-UROQUINASA DE BAIXO PESO MOLECULAR E DE COMPOSIÇQES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM

INVENTORES: Anna Brandazza, Jacqueline Lansen, Guy Mezue e Paolo Sarmientos.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Grã-Bretanha, em 18 de Abril de 1988,sob o n- . 88 09093.1.

INP1. MOD. 113 R F 15732

EARMITALIA CARLO ERBA 5.Γ.Ι.

DERIVADOS DE PRO-UROQUINASE DE BAIXO

PESO MOLECULAR E PROCESSO PARA A PREPARAÇRO DE COMPOSIÇOES FARMACÊUTICAS

QUE OS CONTEM

A presente invenção refere-se a derivados de pró-uroquinase, de baixo peso molecular £ activador do plasminogénio de tipo uroquinase de cadeia simples (scu-PA)J7; e à preparação de tais derivados, segundo métodos de ADN recombinante.

Os derivados que a presente invenção proporciona, apresentam propriedades farmacológicas melhoradas e com interesse. São particularmente úteis, como agentes possuidores de actividade trombolítica.

Utilizaram-se técnicas de mutagénese dirigida de um sítio para modificar o gene humano que codifica a pró-uroquinase (também designado por scu-PA) e expre£ saram-se os genes que sofreram mutação em estirpes recombinantes de E. coli. Escolheram-se as modificações com o objectivo de se obterem derivados de peso molecular mais baixo.

Depois, purificaram-se as novas formas moleculares da pró-uroquinase, que constituem o objectivo da presente invenção e caracterizara-se as suas propriedades bioquímicas e biológicas. Estas formas conservam actividades específicas e propriedades selectivas de lise de coágulo semelhantes às da pró-uroquinase selvagem, embora tenham perdido o domínio de ligação celular da pró-uroquinase e, por isso, podem apresentar um aumento do tempo médio de vida na circulação.

Para além disso, podem produzir-se mais eficazmente segundo a tecnologia do rADN e permitir a preparação de agentes trombolíticos a baixo custo.

- 2/Introdução conhecimento cada vez maior das interacções moleculares que regulam a fibrinólise fisiológica conduziu a importantes implicações na compreensão do mecanismo que dissolve os coágulos sanguíneos e no desenvolvimento de novos agentes trombolíticos.

No sistema fibrinolítico humano, um pró-enzima, o plasminogénio, pode ser activado para a enzima activa, a plasmina, através de diversos tipos de activadores do plasminogénio (Collen, D. e Lijnen, H. R. The fibrinolytic system in man. CRC Criticai Reviews in oncoloqy/hematology, 4_. NS 3, (1986),249; Verstraete, M. e Collen, D., Thrombolytic therapy in the Eiqhties Blood, 67, NS 6, (1986), 1529. A plasmina é a maior protease responsável pela degradação do componente fibrina de um coágulo de sangue (Rakoczi, I., Wiman, B., e Collen, D., £ On the biological significance of the specific interactions between fibrin, plasminogen and antiplasminJ, Biochim., Biophys. Acta, 540, (1978),295; Robbins, K. C., Summaria, L., Hsieh, B., e Shah, R. 5.; /The peptide chains of human plasmin. Mechanism of, activation of human plasminogen to plasmi J. Biol. Chem., 242, (1967), 2333; Widman, B., [ Primary structure of the B chain of human plasminJ, Eur. J. Biochem., 76, (1977), 129.

A plasmina pode, no entanto, exercer o seu efeito proteolítico sobre diversas proteínas plasmáticas entre as quais se encontram, os componentes da via de coagulação, fibrinogénio, factor V e factor VII (Collen, D. e Lijnen, H. R., The bibrinolytic system in man, CRC Criticai Reviews in oncoloqy/hematology. 4j NS 3, (1986), 249; Verstraete, M. e Collen, D.: Thrombolytic therapy in the Eiqhties Blood, 67, NS 6, (1986), 1529; Wiman, Β., B., Lijnen, H. R. e Collen, D., /On the specific interaction between the lysine-binding sites in plasmin and complementary sites in alfa 2-antiplasmin and in fibrinogen_7, Biochim. Biophys. Acta, 579, (1979), 142.

A activação do plasminogénio pode ocorrer a nível sistémico, levando à circulação da plasmina que é rapidamente neutralizada pela anti-plasmina alfa 2, não se encontrando, por esse motivo, disponível para a fibrinólise (Collen, D. e Lijnen, H. R., The fibrinolytic systero in man. CRC Criticai Reviews in oncoloqy/hematoloqy, 4, NQ 3, (1986), 249; Verstraete, M. e Collen, D. , Thrombolytic therapy in the Eiqhties Blood, 67, NQ 6, (1986), 1529. Quando o nível de anti-plasmina alfa 2 é marcadamente reduzido, a plasmina é neutralizada de um modo mais lento e pode exercer os seus efeitos proteolíticos não apenas sobre a fibrina, mas, também, sobre as proteínas da coagulação sanguínea, conforme anteriormente descrito. Um abaixamento excessivo, no plasma, das concentrações plasmáticas de fibrinogénio, factores V e VIII, conjuntamente com os efeitos inibidores exercidos por alguns dos produtos da degradação do fibrinogénio no processo hemostático, na agregação plaquetária e sobre a polimerização da fibrina conduzem a uma deficiência hemostática e, subsequentemente, a um alto risco de hemorragia (Latallo, Z. S., and Lpaciuk, 5., /New approach to thrombolytic therapy: the use of defibrase in connection with streptokinase_7> Thrombos. Diath. Haemouh., 56, (1973), 253; Totty, W. G., Gilula, L. A., Mc. Clennman, M., Ahmed, P., e Sherman L., /_ Low dose intravascular fibrinolytic therapy, Radioloqy, 143, (1982), 59J. Por outro lado, a activação do plasminogénio pode ocorrer ao nível da fibrina (activação do plasminogénio ligado à fibrina) conduzindo a uma plasmina ligada à fibrina (Collen, D. e Lijnen, H. R., The fibrinolytic System in man. CRC Criticai Reviews in oncoloqy/hematoloqy, 4., NQ 3, (1986), 249; Verstraete, M. e Collen, D., Thrombolytic therapy in the Eiqhties Blood,

67, NQ 6, (1986), 1529), a qual, não é afectada pela antiplasmina alfa 2 e não pode induzir fibrinogenólise sistémica.

A uroquinase e a estreptoquinase, os activadores do plasminogénio mais vulgarmente utilizados na terapia trombolítica convencional, no ser humano, não possui actividade especifica para a fibrina. Ambos os compostos activam, de um modo relativamente indiscriminado, quer o fibrogénio circulante, quer o fibrogénio ligado ã fibrina. (Zamarron, C., Lijnen, H. R., Van Hoef, B., e Collen, D., Biological and thrombolytic properties of proenzyme and active forms of human urokinase. I. Fibrinolytic and Fibrinogenolytic properties in human plasma in vitro of urokinase obtained from human urine or by recombinant DNA technology;

- 4 Throm. Haemostas., 52, (1984), 19; Samama, M., e Kher, A., Fibrinolytic and Antifibrinolytic Aqents, Sem. Hop. Paris, 61, NS 20, (1985), 1423). Por conseguinte, a ruptura do sistema hemostático que se observa muitas vezes durante o tratamento com estreptoquinase e uroquinase e, por consequência, o elevado risco de hemorragia, têm obstruído, muitas vezes o uso clínico mais alargado destes agentes trombolíticos, apesar da sua eficácia clínica já demonstrada (Samama, M., e Kher, A., Fibrinolytic and Antifibrinolytic Agents, Sem. Hop. Paris, 61, NS 20, (1985), 1423; Maizel, A. S., e Bookstein, J. J., Streptokinase, urokinase and tissue plasminogen activator, Pharmaco-kinetics, relative advantages and methods for maximizing rates and consistency of lysis, Cardiovasc. Intervent. Radiol., 9, (1986), 236; Bell, W. R-, Streptokinase and urokinase in the treatment of pulmonary emboli, Thromb. Haemostas., 35, (1976),

57; Acar, J., Vahanian, A., Michel, P. L., Slama, M., Cormier, B. e Roger, V., Thrombolytic treatment in acute Myocardial Infarction, Seminars in Thromb. and Haemost., 13, NS 2, (1987), 186; Gruppo Italiano per lo studio delia Streptochinasi nell'infarto miocardico (GISSI) Effectiveness of intravenous thrombolytic treatment in acute myocardial infarction, Lancet, _1, (1986),397).

Pelo contrário, o activador do plasminogénio de tipo tecidular (t-PA) (Hoylaerts, M., Ryken, D. C., Lijnen, H. R. e Collen, D., Kinetics of activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator; role of fibrin, J. Biol. Chem., 257, N26, 1982, 2912) e, mais recentemente, a pró-uroquinase (proUK) (Husain, S. S., e Gurewhich, V., Purification and partial characterization of a single chain, high molecular weight form of urokinase in human urine. Arch. Brochem. Biophys., 220, 1983, 31), ambos proteínas naturais, demonstraram ser fracos activadores do plasminogénio circulante e, inversamente, poderosos activadores do plasminogénio ligado à fibrina, sem ruptura do sistema hemostático ou consumo de anti-plasmina alfa 2 e plasminogénio, pelo que o seu uso clínico pode originar menores riscos de hemorragia.

A actividade trombolítica de t-PA, especifica para a fibrina, tem sido explicada através da sua capacidade de se ligar à fibrina através de locais específicos de ligação da lisina, localizados nos domínios de Kringle de ligação tripla dissulfureto, da molécula. Como consequência, pode activar-se o plasminç? génio ligado à fibrina sem ruptura hemostática significativa (Collen, D., e Lijnen, H. R., Tissue Plasminogen Activator, Mechanism of action and thrombolytic properties, Haemostasis, 16, N93, 1986, 25). Por outro lado, a proUK (também denominada activador do plasminogénio de tipo uroquinase de cadeia simples, scu-PA) não se liga à fibrina, embora apresente actividade trombolítica específica para a fibrina sem consumo do sistema hemostático (Pannell, R., e Gurewich, V., Pro-Urokinase. A study of its stability in plasma and of the mechanism of its selective fibrinolytic effect, Blood, 67, 1986, 1215;

Gurewich, V., e Pannell, R., Fibrin binding and zymogenic properties of single chain urokinase (Pro-Urokinase), Seminars in Thromb. and Haemostat., 13, N9 2, 1987, 146; Lijnen, H. R., Zamarron, C., Blaber, Μ., Winbler, Μ. E., e Collen,

D., Actiuation of plasminogen by pro-urokinase I. Mechanism J. Biol. Chem.,

261, 1986, 1253).

Realizou-se uma pesquisa exaustiva para isolamento e caracterização dos genes humanos que codificam estas proteínas e a sua subsequentemente produção de acordo com a tecnologia do ADN recombinante (Collen, D., Stassen, J. Μ., Marafino, B. J., Builder, JR. S., De Cock, F., Ogez, J., Tajiri, D., Pennica, D., Bennett, W. T., Salwa, T., e Hoyng, C. F. Biological properties of human tissue-type plasminogen activator obtained by expression of recombinant DNA in mammalian cells. J. Pharmacol. Exp. Ther., 231, N9 1, 1984, 146; Holmes, W. E., Pennica, D., Blaber, M., Rey, M. W., Gunzler, W. A., Steffens, G. J. e Heynecker, H. L., Cloning and expression of the gene for pro-urokinase in Escherichia coli Biotechnoloqy, 3_, 1985, 923).

Submeteu-se o t-PA recombinante a experiências clínicas multicentralizadas em pacientes com enfarte agudo do miocárdio e verificou-se ser significativamente mais eficaz do que a estreptoquinase na recanalização das artérias coronárias obstruídas (The European Cooperative Study Group for Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator, Randomized trial of intravenous recombinant tissue-type

- 6 plasminogen activator versus intravenous streptokinase in acute myocardia infarction, Lancet, _1, 1985, 842; Sheehan, F. H., Braunwald, E., Canner, P., Doodge, Η. T., Gore, J., Van Natta P., Passamani, E. R., Williams, D. 0., Zaret,

B.. The effect of intravenous thrombolytic therapy on left ventricular function: a report on tissue-type plasminogen activator and streptokinase from the Thrombolysis in myocardial Infarction (TIMI Phase I), Circulation, 75, 4 1987, 817).

A pró-uroquinase encontra-se, presentemente, nas experiências clínicas de fase II e pensa-se que seja, pelo menos, tão eficaz como t-PA em termos de actividade trombolítica e segurança (Van de Werf, F., Nobuhara, M., and Collen, D Coronary Thrombolysis with Human single-chain, urokinase type Plasminogen Activator (Pro-Urokinase) in Patients with Acute Myocardial Infarction. Annals of Internai Medecine, 104, 1986, 345; Van de Werf, F., Vanhaecke, J., De Geest, H., Verstraete, M., e Collen, D. Coronary Thrombolysis with recombinant single-chain urokinase-type plasminogen activator in patients with acute myocardial infarction. Circulation, 74, N- 5, 1986, 1066).

Antecedentes da Invenção

Descobriram-se os activadores do plasminogénio de tipo uroquinase (u-PAs) sob, pelo menos, três formas diferentes, na urina humana, plasma e meio de cultura condicionado, a partir de uma diversidade de linhas de células. A primeira forma que se caracterizou como u-PA consistia em peptido fibrinoliticamente activo de 410 aminoácidos, com um peso molecular aparente de 54 000 daltons, contendo duas cadeias de ligação dissulfureto (Gunzler, W. A., Steffens, G. J., Oetting, F., Kim, SM. A., Frankus, E., e Flohe, L. The primary structure of high molecular mass urokinase from human urine. The complete amino acid sequence of the A chain. Hoppe - Seyler's Z. Phisiol. Chem., 363, 1982, 11 55).

A cadeia A ou cadeia leve, contem 157 aminoácidos e uma estrutura tripla

Kringle ligada por dissulfureto. Esta cadeia contém, também, um domínio de

ligação do receptor para as células normais e neoplásicas (monócitos, células semelhantes a monócitos e células epidermóides A 431). A cadeia B ou cadeia pesada (30 000 daltons) consiste de 253 aminoácidos e contém o domínio catalítico.

Esta forma molecular de u-PA é, geralmente, denominada uroquinase (UK), uroquinase de cadeia dupla (TC-UK) ou uroquinase de elevado peso molecular (HMW-UK) (Gunzler, W. A., Steffens, G. J., Otting, F., Buze, G., e Fohe, L., Structural relationship between high and low molecular mass urokinase, Hoppe-Seyler's Z. Phisiol. Chem., 363, 1982, 133).

A segunda forma de u-PA possui um peso molecular de 33 000 daltons e resulta da de gradação proteolítica da forma HMW pela plasmina ou pela tripsina. Denomina-se uroquinase de baixo peso molecular (LMW-UK). A determinação sequencial das proteínas revelou que LMW-UK é idêntica a HMW-UK, excepto no que se refere à ausência dos 135 aminoácidos da extremidade NH£ que foram removidos de modo especifico, pela acção do plasmina ou da tripsina (Steffens, G. 0., Gunzler,

W. A., Otting., F., Frankens, F., e Flohe, L. The complete amino acid sequence of low molecular weight urokinase from human urine. Hoppe-Seyler's Z.

Physiol. Chem., 363, 1982, 1043).

A terceira forma de u-PA que se identificou foi a pró-uroquinase (proUK), uma forma de uroquinase de cadeia simples (54 000 daltons) que por esse motivo também se designa por activador do plasminogénio de tipo uroquinase de cadeia simples (scu-PA).

Todas estas formas moleculares de actiuadores do plasminogénio de tipo uroquinase foram já obtidas segundo a tecnologia do ADN recombinante (Zamarron,

C., Lijnen, H. R., Van Hoef, B., e Collen, D., Biological and thrombolytic properties of proenzyme and active forms of human urokinase. I. Fibrinolytic and Fibrinogenolytic properties in human plasma in vitro of urokinase obtained from human urine or by recombinant DNA technology, Thromb. Haemostas., 52,

1984, 19; Holmes, W. E., Pennica, D., Blaber, M., Rey, M. W., Gunzler, W. A.,

Steffens, G. J. e Heynecker, H. L. Cloning and expression of the gene for pro-urokinase in Escherichia coli, Biotechnoloqy, _3, 1985, 923; Gunzler, W. A.,

- 8 Henninger, W., Hennies, Η. H., Otting, F., Schneider, J., Friderichs, E., Giertz, H., Flohe, L., Blaber, H. e Winkler M. Functional characterization of human urokinase produced in bactéria as compared to urokinase obtained from human urine, Haemostasis, 14, 1984, 60).

Tomando como ponto de partida o gene humano que codifica a pró-uroquinase construiu-se, por mutagenese específica de um sítio, um conjunto de genes modificados que codificam os novos e originais derivados dos activadores do plasminogénio de tipo uroquinase de cadeia simples. Estes derivados são análogos de peso molecular mais baixo que perderam porções de sequências de diferentes tamanhos, nos primeiros 162 aminoácidos.

Expressaram-se os genes modificados em estirpes recombinantes de E. coli, purificaram-se os novos produtos recombinantes, sob a forma de cadeia simples, e caracterizaram-se quanto à sua capacidade para dissolver, especificamente, os coágulos de fibrina.

Estas novas entidades moleculares nunca anteriormente descobertas na natureza, constituem o objectivo da presente invenção. Estes derivados de pró-uroquinase de baixo peso molecular e de cadeia simples possuem actividade trombolítica específica para a fibrina, e oferecem uma alternativa prática para a proUK nativa ou recombinante. Os ensaios indicam que possuem um tempo de vida médio mais longo, de que resulta uma actividade farmacológica mais prolongada.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um derivado de baixo peso molecular de pró-uroquinase humana que compreende, pelo menos, a sequência que se estende do aminoácido 163 ao aminoácido 411 da pró-uroquinase madura numa configuração de cadeia simples.

De um modo preferencial, o derivado compreende, pelo menos, a sequência compreendida entre o aminoácido 151 e o aminoácido 411, o aminoácido 141 e o 411, ou entre o aminoácido 1 e o aminoácido 10 da pró-uroquinase madura unida aos aminoácidos de 136 a 411 da pró-uroquinase madura.

A presente invenção pode compreender, para além disso, um derivado em que falta o domínio de Kringle da pró-uroquinase madura incluindo na sequência

aminoácida 48-135, ou o domínio de ligação do receptor ou o domínio de ligação celular incluídos na sequência de aminoácidos 11-47.

A presente invenção também contempla os derivados anteriores posteriormente modificados por eliminação, inserção ou substituição de aminoácidos ou derivados que compreendem também, pelo menos um aminoácido adicional.

A presente invenção compreende, ainda, composições farmacêuticas contendo os derivados anteriormente referidos, assim como as sequências de ADN, hospedei ro transformado e hospedeiro vector para a preparação das mesmas.

Deve considerar-se a pró-uroquinase madura como a pró-uroquinase na sua extensão total.

Noutros aspectos, proporcionam-se derivados em que falta, pelo menos, um dos seguintes domínios da pró-uroquinase madura:

- o domínio de Kringle

- o domínio de ligação do receptor, ou o domínio de ligação celular.

De acordo com outro aspecto, os derivados podem incluir um resíduo adicional de metionina na extremidade NH2 do polipeptido, ou, podem incluir, para além disso, pelo menos uma cadeia lateral glicosídica. Ds derivados podem incluir, adicionalmente, pelo menos uma sequência de aminoácidos, qualquer que seja a sua origem.

Podem produzir-se os derivados de acordo, com mais um aspecto da presente invenção por tratamento dos derivados anteriormente referidos com plasmina.

Podem proporcionar-se os derivados da presente invenção sob a forma de uma composição farmacêutica em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições são úteis como agentes trombolíticos.

Características moleculares dos novos derivados de proUK

Construiram-se os novos derivados de proUK por mutagénese comandada de um oligonucleótido. Os oligonucleótidos foram especialmente concebidos e sintetizados para originar eliminação das regiões de código dos gene da proUK.

- 10 Este método tem como princípio a subclonagem do gene de proUK num vector que pode obter-se na forma de cordão simples, tal como o baceriófago vector M13. Junta-se o cordão simples recombinante com um oligo-desoxi-ribonucleótido complementar, de síntese, contendo a sequência de código desejada e, que não possui a sequência que se pretende eliminar. Depois, utiliza-se ADN polimerase e liga-se para estender o novo cordão e ligá-lo de forma circular. Utilizou-se o ADN heterólogo de cordão duplo, recentemente criado, para transformar uma linha celular na qual este se pode replicar e proporcionar uma progénie onde o bacteriófago portador do gene de tipo primitivo ou do gene com a carência desejada segregará duas espécies moleculares diferentes. Assim, podem utilizar-se os oligonucleótidos mutagénicos de partida como sondas para reconhecimento dos genes que sofreram mutação.

Depois, inseriram-se os genes que sofreram mutação em vectores de expressão de E. coli os quais podem dirigir a síntese de novos derivados de proUK. Purificaram-se,então e, caracterizaram-se as moléculas recombinantes.

Podem resumir-se, os novos derivados da proUK, que constituem o objecto da presente invenção, conforme se segue:

a) uma forma denominada Δ125, (de peso molecular aparente de cerca de 31 Kd), que se obteve por eliminação no gene da proUK da sequência de ADN que codifica desde o aminoácido 11 até ao aminoácido 135. Este derivado de proUK, constituído por 286 aminoácidos, perdeu o domínio Kringle embora conserve o domínio proteolítico. Isolou-se na sua forma de cadeia simples e, pode converter-se por acção da plasmina na sua configuração de cadeia dupla. A forma Δ125 é amidoliticamente activa após tratamento com plasmina.

b) uma forma denominada Δ 140 (de peso molecular aparente de cerca de 30 Kd), que se obteve por eliminação dos primeiros 140 aminoácidos de proUK. Este derivado, constituído por 271 aminoácidos, foi isolado na sua configuração de cadeia simples. Pode converter-se a forma Δ 140 na forma de cadeia dupla amidoliticamente activa por tratamento com plasmina.

c) uma forma denominada Δ 150 (de peso molecular aparente de cerca de 29 Kd), que se obteve por eliminação dos primeiros 150 aminoácidos de proUK. Este derivado de 261 aminoácidos é amidoliticamente inactivo na sua configuração de cadeia simples. Após tratamento com plasmina, a forma /^150 torna-se completamente activa.

d) uma forma denominada fa 162 (de peso molecular aparente de cerca de 27 Kd), que se obteve por eliminação dos primeiros 162 aminoácidos da proUK. Este derivado, constituído por apenas 249 aminoácidos, é equivalente à uroquinase de cadeia 8 sem os primeiros 4 aminoácidos.

Na Fig. 1 apresenta-se um resumo esquemático, descrevendo todos estes novos derivados. No Quadro 1 indicam-se as suas respectivas actividades específicas.

Lise do coágulo de fibrina marcada com 125j _e actividade fibrinogenolítica in vitro.

Determinaram-se as propriedades fibrinogenolíticas e fibrinolíticas relativas de alguns derivados representativos da proUK num sistema in vitro, que consistia em coágulos de plasma humano marcados com ^5j mergulhados em plasma humano tratado com citrato, conforme anteriormente descrito (Hatsuo, 0., Ryken,

D. C., e Collen, D. Comparison of the relative fibrinogenolytic, fibrinolytic and thrombolytic properties of tissue plasminogen activator and urokinase in vitro, Throm. Haemost., 45, 1981, 225). Consideraram-se como produtos de referência a proUK de tipo selvagem e a uroquinase de cadeia dupla da urina humana.

Adicionaram-se os coágulos de plasma marcados com ^25j _a aliquotas de 2,0 ml de plasma agregado, efectuou-se a contagem e incubaram-se a 57°C, em banho-maria, na ausência (controlo) ou na presença de 150 i.u./ml de cada um dos activadores do plasminogénio de tipo uroquinase, com excepção de TC-UK que se estudou a 50 i.u./ml. Após um período de incubação de 4 horas, removeram-se as amostras de plasma, mediu-se o conteúdo de _e> determinou-se a percentagem de lise a partir do rádio-isótopo solubilizado. Para além disto, determinaram-se os níveis do fibrinogénio plasmático (Vermylen, C., De Vreker, R., e Verstraete, M.

L· f «

A rapid enzymatic method for assay of fibrinogen: fibrin polymerization time (FPT-test) Clin. Chim. Acta, J3, 1963, 418), em cada uma das amostras e expressaram-se como uma percentagem do valor inicial (amostras de controlo).

Mediu-se a estabilidade dos activadores do plasminogénio de tipo uroqui* nase (150 i.u./ml para a proUK e os seus derivados LMW; 50 i.u./ml para TC-UK) no plasma após um período de 14 horas de incubação prévia, à temperatura ambiente. Após esta pré-incubação, adicionaram-se coágulos de plasma marcados com 125j_?recentemente preparados, a cada uma das misturas e colocaram-se a 37°C. Mediram-se as percentagens de lise e calcularam-se conforme anteriormente descrito, em amostras triplas.

No Quadro 2 resumem-se os resultados obtidos. Estes indicam que todos os derivados de baixo peso molecular ensaiados induzem de um modo quase completo a lise do coágulo sem fibrinogenólise significativa. Os derivados de proUK de baixo peso molecular, da presente invenção, demonstram uma actividade altamente eficaz de lise do coágulo específica para a fibrina.

Para além disto, os derivados de baixo peso molecular da presente invenção conservaram a sua eficácia na lise do coágulo mesmo após 24 horas de incubação em plasma humano o que indica que estas moléculas, de modo idêntico à proUK de tipo selvagem, mas não à TC-UC, são mais estáveis em plasma.

Características Farmacocinéticas dos novos derivados de proUK

Determinaram-se as características farmacocinéticas de alguns derivados representativos de proUK, da presente invenção, em ratazanas normais após uma única injecção intravenosa de 80 000 IU/Kg.

Determinaram-se os níveis de antigenos semelhantes a uroquinase e a actividade fibrinolitica da fracção euglobina antes de qualquer tratamento e, após 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 minutos.

Na Figura 2 apresentam-se os resultados obtidos.

Estes resultados indicam que a proporção de desaparecimento do plasma do antigeno relacionado com u-PA é mais lenta (t 1/2 inicial de 25 min) para o derivado Δ 125 em comparação com a prollK natural de tipo selvagem(t1/2 inicial inferior a 5 min.).

Para além disto, a ctividade fibrinolítica da fracção euglobulina encontra-se correlacionada com o nível antigénico de u-PA no plasma.

Interacção dos novos derivados de prollK com a heparina

A heparina em doses farmacológicas que se encontram convencionalmente no plasma na terapia anti-coagulante (entre D,01 e 1 IU/ml) demonstrou potenciar in vitro a um nível altamente significativo a proporção de activação pela plasmina de alguns novos e representativos derivados de LMW ( Δ125) (Figura 3).

Também se podem observar tais efeitos, mas numa extensão muito menor com a proUK de tipo selvagem.

Discussão e conclusões comportamento amidolítico observado, nos novos derivados da presente invenção, que se ensaiaram, 125, Δ 140 e Δ 150 indicaram que qualquer molécula que conserve os últimos 261 aminoácidos da pro-uroquinase com a configuração de cadeia simples se podem tornar amidoliticamente activos, após activação pela plasmina, por conversão numa configuração de cadeia dupla (Quadro 1).

A heparina, em concentrações que se podem detectar no plasma durante a terapêutica anti-coagulante (0,01-1 IU/ml) em simultâneo com a terapia trombolítica demonstrou estimular a um nível significativamente elevado a conversão, pela plasmina, de um dos novos derivados de LMW, da presente invenção (Δ125) na sua configuração de cadeia dupla. Pode, também, obter-se este efeito, utilizando proUK de tipo selvagem mas numa extensão muito menor (Figura 2).

Por outro lado, obteve-se a lise quase completa dos coágulos de fibrina 125 humana marcados com I, com os novos derivados LMW sem qualquer fibrogenolise consistente, o que não é o caso da uroquinase de cadeia dupla.

Para além disto, este efeito manteve-se após, pelo menos, 24 horas de incubação dos novos derivados em plasma antes da adição dos coágulos de fibrina

125 humana marcados com I (Quadro 2). Pelo contrário, a actividade de lise do coágulo de TC-UK desapareceu completamente após um período longo de incubação

prévia em plasma humano.

Finalmente, observou-se um tempo de semi-vida significativamente mais longo, no sangue, após a administração de uma injecção intravenosa de um dos novos derivados (Δ125) da presente invenção em ratazanas (Figura 3).

Pode concluir-se que:

- os novos derivados de baixo peso molecular, da presente invenção, conservam a actividade amidolitica intrínseca da pro-UK de tipo selvagem e podem ser completamente activados na sua forma de cadeia dupla amidoliticamente activa, mediante activação pela plasmina.

- A activação pela plasmina dos derivados de novo peso molecular, da presente invenção e a sua conversão subsequente na sua configuração de cadeia dupla completamente activa é altamente estimulada pela heparina.

Como a heparina se encontra sempre associada à terapia trombolítica, em situações clínicas, este efeito estimulante sobre os novos derivados da ProUK, da presente invenção, podem levar a unaperfeiçoamento da actividade trombolítica.

- Os derivados de novo peso molecular da presente invenção, apresentam uma maior actividade na lise do coágulo específica para a fibrina quando comparada com TC-UK que possui uma especificidade completa. Por este motivo, todos os derivados de ProUK, que conservam a sequência de aminoácidos da posição 151 à posição 411, numa configuração de cadeia simples podem considerar-se como agentes trombolíticos aperfeiçoados, em relação a TC-UK, com um menor risco de hemorragia.

- Para além disto, a ausência do domínio de ligação celular dos activadores do plasminogénio do tipo uroquinase localizados entre os resíduos de 13-30 (Appela,

E. Robinson, E.A., Ulhich, S.J. Stoppelli, M.P., Corti, A. Cassani, G., e Blasi,

F. , The receptor binding sequence of urokinase J. Biol. Chem., 262, N9. 10,

1987, 4437) nos novos derivados de proUK podem prolongar significativamente o seu tempo de semi-vida na circulação, em comparação com a ProUK e TC-UK de tipo selvagem. Deste modo, as propriedades trombolíticas específicas para a fibrina dos novos derivados de baixo peso molecular da pro-uroquinase, da presente invenção, conjuntamente com o potencial acréscimo deste efeito após heparinoterapia

simultânea e o potencial prolongamento do seu tempo de semi-vida, na circulação, resultam em vantagens terapêuticas consistentes destas moléculas sobre as da uroquinase de cadeia dupla e da proUK de tipo selvagem.

Métodos

Mutagênese

Efectuou-se a clonagem do gene que codifica a pré-pró-uroquinase humana no Weizmann Institute (Israel) de acordo com técnicas publicadas (Maniatis T., Fritsch E.F. e Sambrook J., Molecular clonqinq,A laboratory manual, Cold Spring Habour, 1982). No sentido de se levar a efeito a mutagênese desejada, escolheram-se fragmentos de restrição convenientes e subclonaram-se em bacteriófagos vectores M13 (Zoller M.J. e Smith M. Oligonucleotide-directed mutagenesis using Μ-13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA, Nucleic Acid Research, 101, 1982, 6487).

Desenvolveram-se as formas de cordão simples dos vectores bacteriófagos recombinantes, de acordo com os métodos publicados. Aqueceram-se a 95°C, 20 ng destes ADNs de cordão simples de M13, em Tris-HCL 10 mM, a pH 7,5, EDTA 0,1 mM, NaCl 50 mM, durante 5 minutos e ligaram-se aos oligonucleótidos convenientes por arrefecimento gradual, até à temperatura ambiente. Adicionaram-se, sucessivamente, os seguintes componentes: ATP numa concentração final de 0,4 mM; dCTP, dGTP, dTTP até 0,12 mM, dATP até 0,04 nM; 1 unidade do fragmento Klenow da ADN polimerase I da E. coli e 0,5 unidades de ADN ligase T4 (Boehringer Mannheim). 0 volume final era de 50^«tl de Tris-HCL 35 mM, a pH 7,5, EDTA 0,1 mM, MgCl₂ 6mM, DTT 0,006 mM. Após incubação, durante 12 horas a 15°C, utilizou-se o ADN para efectuar a transfecção das células E. coli JM 101, de acordo com procedimentos publicados (Zoller M.J. e Smith Μ., Oligonucleotidedirected mutagenesis using M13-derived vectors; an efficient and general procedure for the production of point mutations in any

-fragment of DNA, Nucleic Acid Research, 101, 1982, 6487).

Marcaram-se radioactivamente os oligonucleotidos utilizados para originar 32 as eliminações pretendidas, utilizando 150yi£i Qf- P) de ATP (New England Nuclear, 6000 Ci/mmole, em Tampão Tris-HCL 70 mM, a pH 8, contendo MgCl^ 10 mM, DTT 5 mM e, 10 unidades de Polinucletidoquinase T4 (Boehringer Mannheim) numa mistura reaccional de 50/Uá que se incubou, durante 30 minutos a 37°C. Utilizaram-se então os oligonucleótidos marcados radioactivamente para hibridação em placa dos ADNs dos fagos, que sofreram mutagénese.

A hibridação prosseguiu durante a noite a 65°C, em Tris-HCL 10 mM a pH 8, contendo 3XSSC, 5DS a 0,1%, 10X de Denhart e 0,2 mg/ml de ADN desnaturado de esperma de salmão. Lavaram-se os filtros de nitrocelulose, durante 30 minutos em SSC a 0,4%, SDS a 0,1% a 65°C com diversas mudanças e expuseram-se durante a noite a películas de raios X. Sellecionaram-se as placas que indicaram uma hibridação positiva, por sequenciação didesoxi-nucleotidica de Sanger utilizando o Conjunto de Sequenciação Amersham M13.

Utilizando plasmidos de expressão tradicionais (Maniatis T., Fritsch E.F. e Sambrook J., Molecular cloninq, A laboratory manual, Cold Spring Harbour, 1982), expressaram-se, então os genes que sofreram mutação em estirpes recombinantes de E. coli que se cultivaram depois para permitir a produção das moléculas desejadas .

Purificação de moléculas recombinantes

A seguir à lise das bactérias, descobriram-se os produtos recombinantes na fracção insolúvel. Após lavagem do agregado em Tris-HCl 10 mM, a pH 8,5 e Triton X100 a 0,1%, voltou a efectuar-se uma suspensão do material insolúvel em guanidina HC1 6M,^-mercaptoetanol 0,1 M e Tris-HCl 10 mM, a pH 8,5. Agitou-se a suspensão a 4°C, durante 16 horas e centrifugou-se para proporcionar um sobrenadante que se adicionou, então, numa proporção de 1:25, ao tampão de reforço: Tris-HCl 10 mM a pH 8, Ureia 2,5 M e EDTA 8 mM. Manteve-se a solução a 15°C durante 24 horas. Para reduzir a força iónica, concentrou-se primeiro a solução de

- 17 reforço, 10 vezes por ultra-filtração e diluiu-se, depois, 4 vezes num tampão final de Tris-HCl 10 mM, a pH 7,8, Ureia 2,5 M e EDTA 8 mM. Purificou-se então, o agente fibrinolítico reactivado, por cromatografia de permuta iónica numa coluna de S-Sepharose de caudal rápido (Pharmacia) através de um gradiente linear de Nacl (de 0 a 1M). Recolheram-se as fracções activas, agregaram-se, dessalinizaram-se por filtração em gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia contra NH^HCO^ 50 mM e liofilisaram-se. A pureza final encontrava-se compreendida entre 8055 e

98%.

Como um método alternativo, os derivados de acordo com a presente invenção podem expressar-se conjuntamente com um peptido principal, pelo que pode recolher-se o derivado a partir do sobrenadante.

Actividade amidolitica de tipo uroquinase

Determinou-se a actividade amidolitica de TC-UK (Serono; lote N?.870402), proUK (Sero Institute, lote 0D01205100) e dos derivados de baixo peso molecular da presente invenção (Δ125, ZS140, Δ.150) utilizando o substracto cromogénico

S-2444 (Glu-Gly-Arg-pNA, Kabi Vitrum). Este ensaio baseia-se na actividade amidolitica intrínseca de TC-UK e da geração desta actividade após activação de activadores do plasminogénio de tipo uroquinase de cadeia simples pela plasmina.

A quantidade de pNA originada após reacção de activadores do plasminogénio de tipo uroquinase com o substracto cromogénico avaliou-se espectrofotométricamente, a 410 nm, utilizando um leitor de micro-placas (mini-reader II, Dynatech).

Para a activação da plasmina, incubaram-se durante 15 minutos, a 37°C, na presença de plasmina (12,5^|tg/ml), concentrações crescentes de cada um dos activadores do plasminogénio (intervalo: 1 ng/ml a 100y4g/ml) em tampão Tris-HCl, a pH 8,8 contendo Tris 0,05 M, NaCl 0,038 M, Tween 80 a 0,01%. Incluiram-se controlos adequados (sem activação da plasmina). Decorrido este período de incubação, adicionaram-se 20ytl de cada uma das misturas de activação a 180 Jil de uma solução

- 18 de substracto contendo 0,25 mg/ml de S-2444 e 100 KIU/ml de aprotinina em tampão

Tris-HCl a pH 8,8.

Incubaram-se, depois, estas misturas, a 37°C, durante 30 minutos. Interrompeu-se a reacção adicionando 50^tl de uma solução aquosa de ácido acético a

50%.

Adoptou-se o mesmo procedimento para a Preparação de Uroquinase de Referência Internacional (nS. 66/46) que se obteve através do Dr. P.J. Gaffney, National Institute for Biological Standards e estabeleceram-se as curvas de controlo (Londres, UK) e de calibração.

Para cada produto, converteram-se os resultados da densidade óptica em IU/ml utilizando a curva de calibração referida antes. Calcularam-se as actividades específicas (IU/mg de proteína) após ter-se medido o teor de proteína de cada uma das preparações de activador do plasminogénio de tipo uroquinase utilizando o micro-ensaio de Bradford, dos Bio-rad (Standard II, BSA). Descreveram-se, já, o teste S-2444 e os ensaios de proteínas (Pannell, R., e Gurewich, V., Activation of plasminogen by single-chain urokinase or by two chain urokinase. A demonstration that single-chain urokinase has a low catalytic activity (Prourokinase), Blood, 69, No. 1, 1987, 22; Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilising the principie of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 1976, 248).

Actividade amidolítica de tipo uroquinase na presença de heparina

Trataram-se com plasmina ( a uma concentração final de 10 mg/ml) na ausência ou na presença de concentrações crescentes de heparina (0,001, 10 IU/ml) a proUK de tipo selvagem (a uma concentração final de 1000 IU/ml) e o novo deriavdo da proUK, 2^125 (a uma concentração final de 1000 IU/ml em tampão Tris-HCl 0.05 M, a pH 7,4, contendo NaCl 0,030 M e Tween 80 a 0,01%, a 37°C. removeram-se alíquotas, a intervalos de tempo diferentes (5,10,15 minutos) e mediu-se, com o substrato

- 19 cromogénico S-2444, conforme préviamente descrito, a actividade amidolítica de tipo uroquinase de cadeia dupla, que se originou.

Actividade de lise do coágulo dos activadores do plasminogénio de tipo uroquinase (Matsuo, 0., Ryken, D.C., e Collen, D., Comparison of the relative fibrinogenolytic, fibrinolytic and thrombolytic properties of tissue plasminogen actívator and urokinase in vitro, Thromb. Haemost., 45, 1981, 225).

Obteve-se o plasma normal pobre em plaquetas (PPP) por centrifugação de sangue (recolhido em citrato de tri-sódio 10 mM a 4°C, durante 10 minutos, a 3000 g.

Efectuou-se a coagulação de alíquotas de PPP humano tratado por citrato 125 (0,5 ml), contendo o fibrinogénio humano marcado com I (10 000 cpm, Amersham), pela adição de CaCl₂ (a uma concentração final de 25 mM) e de trombina humana (a uma concentração final de 2 NHI/ml). Aspiraram-se, então as misturas em tubos de silicone (4 mm de diâmetro interno) e deixou-se coagular durante 30 minutos, a 37°C. Cortaram-se porções de 1,5 cm de comprimento. Colocaram-se os coágulos em placas de Petri e lavaram-se em NaCl 0,15 M, durante 5 minutos» à temperatura ambiente, com diversas mudanças.

Após ter-se efectuado a contagem do radio-isótopo, incubaram-se, imediatamente, os coágulos a 37°C, em 2 ml de PPP e 50ytl de um tampão de Tris-HCl 0,05 M, a pH 7,4, contendo NaCl 0,038 M e Tween 80 a 0.01 %.

Adicionaram-se soluções de activadores do plasminogénio de tipo uroquinase (a uma concentração final de 150 IU/ml para a prollK, Δ125,Δ 140, Δ 150 e de 50 IU/ml para TC-UK) ou tampão (tampão Tris-HCl 0.05 M, a pH 7,4, contendo NaCl 0.038 M e Tween 80 a 0.01 25).

Calculou-se a extensão da trombólise após 4 horas de incubação a 37°C, a partir da quantidade de radioisótopo libertada a partir do coágulo e recuperada no plasma em amostras em triplicado. Expressaram-se os resultados como uma percentagem dos valores de partida (sem o agente fibrinolitico).

Estabilidade dos activadores do plasminogénio de tipo uroquinase

-20'Incubaram-se em PPP humano, normal, tratado por citrato, durante 24 horas à temperatura ambiente, TC-UK (50 IU/ml), Pro-UK e os seus derivados LMW (150 IU/ml). Depois, adicionaram-se coágulos de plasma humano marcados com recentemente preparados, e mediu-se a extensão da trobólise conforme descrito antes (Matsuo, 0., Ryken, D. C., e Collen, D., Comparison of the relative fibrinogenolytic, fibrinolytic and thrombolytic properties of tissue plasminogen activator and urokinase in vitro, Ihromb. Haemost., 45, 1981, 225).

Níveis plasmáticos de fibrinogénio

Após ter-se incubado durante 4 horas, a 37°C, coágulos de plasma humano marcados com ^5j, _{com ca}q_{a um} dos activadores do plasminogénio de tipo uroquinase, recolheram-se aliquotas (50JLl e, mediu-se o seu teor em fibrinogénio, de acordo com o ensaio de polimerização de fibrinogénio-fibrina (Vermylen, C., De Ureker, R., e Verstraete, Μ., A rapid enzymatic method for assay of fibrinogenzfibrin polymerization time (FPT-test), Clin. Chim. Acta, 8^, 1963, 418).

Estudo farmacocinético

Utilizaram-se ratazanas normais, (Sprague Dawley; Charles River) , machos, com peso compreendido entre 150 e 250 grs.

Prenderam-se todos os animais, durante a noite e, anestesiaram-se com pentobarbital (50 mg/kg ip.) no dia em que se efectuou a experiência. Injectaram-se por via intravenosa (veia da cauda) pro-UK de tipo selvagem e o novo derivádd de proUK de LMW, 125, numa dose única de 80 000 IU/Kg.

Ministrou-se uma solução salina aos animais de controlo. Recolheram-se amostras de sangue da aorta abdominal a diferentes intervalos de tempo, 0 (antes do tratamento) 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 e 30 minutos (após a injecção intravenosa) e arti-coagularam-se com citrato de tri-sódio (numa concentração final de 0-0,11 moles/1). Incluiram-se, pelo menos, 3 animais para cada um dos produtos e para cada um dos intervalos de tempo. Centrifugaram-se as amostras de sangue (2000

-Í21

x g; 15 minutos; 4°C) e utilizou-se o plasma para medir a actividade fibrinolítica da fracção euglobina, de acordo com o método de placa de fibrina (Atrup. I. e Muellertz, S., Arch. Biochem. Biophys., 4D, 1952, 346-351) assim como para se determinar os níveis antigénicos relacionados com a uroquinase utilizando um ensaio de imuno-absorção ligado a uma enzima (Elisa) calibrado por comparação com uma preparação interna, normalizada, de proLIK de tipo selvagem (Grondahl, Hansen J., Agerlin N., Munkholm, Larsen P., Bach F., Nielsen L. S., Dombernowsky P. e Dano K., Sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay for urokinase-type plasminogen activator and its application to plasma from patients with breast câncer, J. Lab. Clib. Med., 111, 1, 1988, 42-51).

QUADRO 1

Actividade amidolítica de tipo uroquinase dos derivados da pró-uroquinase, de baixo peso molecular

Molécula	actividade amidolítica	(i.u./mg)*
	sem plasmina	com plasmina
A 125	não detectável	96000
A 140	não detectável	85000
A 150	não detectável	105000
pro-UK	não detectável	98000
1C-UK	não detectável	1 28000

*

Determinou-se a actividade amidolítica de tipo uroquinase antes e depois do tratamento com plasmina (12,5^Cg/ml), com o substrato cromogénico S-2444 (Pannell,

R., e Gurewich, V.,Activation of plasminogen by single-chain urokinase or by two chain urokinase. A. demonstration that single-chain urokinase has a low catalytic activity (Pro-urokinase), Blood, 69, N9 1, 1987,22).

Determinaram-se as actividades específicas da pró-uroquinase e dos seus derivados de baixo peso molecular assim como as da uroquinase humana de cadeia dupla (TC-UK) por calibração em função da Preparação de Uroquinase de Referência Internacional obtida através do Dr. P. J. Gaffney, National Institute for Biological Standards and Control, Londres, UK.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a preparação de derivados de prõ-uroquinase humana de baixo peso molecular, caracterizado pelo facto de se submeter a técnicas de mutagénese dirigida local para modificar o gene que codifica para a prõ-uroquinase e de se exprimir os genes modificados em estirpes recombinantes de E.coli, incluindo pelo menos a sequência do aminoácido 163 ao aminoácido 411 de prõ-uroquinase madura numa configuração de cadeia única.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se incluir pelo menos a sequência do aminoácido 151 ao aminoácido 411 de pró-uroquinase madura numa configuração de cadeia única.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de faltar o domínio Kringle de prõ-uroquinase madura incluído na sequência de aminoácidos 48-135.
4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de faltar pelo menos o domínio que liga o receptor ou o domínio que liga a célula da prõ-uroquinase madura incluído na sequência de aminoácidos 11-47.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se incorporar os aminoácidos de 1 a 10 de prõ-uroquinase madura ligados aos aminoácidos de 136 a 411 de prõ-uroquinase madura.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se incorporar adicionalmente um resíduo de metionina no terminal amino.
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda pelo menos uma cadeia lateral glicosídica.
8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o derivado obtido constituir uma proteína obtida por anulação, substituição ou inserção de aminoácidos, ou por adicionalmente se incorporar pelo menos uma sequência aminoacídica de qualquer tipo.
9.- Processo para a preparação de derivados de baixo peso /

^-25molecular, caracterizado pelo facto de se tratar um derivado obtido pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores com plasmina.
10. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se incorporar um derivado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em associação com um veículo farmacêutico aceitável.
11. - Processo para a preparação de um agente trombolítico, caracterizado pelo facto de se misturar com os agentes auxiliares de formulação apropriados uma quantidade eficaz de um derivado de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9.
12. - Processo para produzir uma sequência de DNA que codifica um derivado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se orientar a mutagénese específica de sítio no gene humano que codifica para a pró-uroquinase.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se efectuar a mutagénese específica de sítio utilizando um oligodesoxi-ribonucleotido sintético sem a sequência a ser anulada e de se completar a sequência pela técnica de recuperação do marcador.
14.-2614. - Processo para a preparação de um vector de expressão, caracterizado pelo facto de se incorporar uma sequência de DNA preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 12.
15. - Microrganismo hospedeiro transformado por um vector de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de in ’ corporar adicionalmente um promotor Ptrp e a sequência Shine-Dalgarno do fago MS-2