PL176971B1

PL176971B1 - Dwufunkcyjne warianty urokinazy, plazmidy stosowane do otrzymywania dwufunkcyjnego wariantu urokinazy, sposób wytwarzania plazmidów i trombolityk

Info

Publication number: PL176971B1
Application number: PL94304290A
Authority: PL
Inventors: Gerd J. Steffens; Stephan Wnendt; Johannes Schneider; Regina Heinzel-Wieland; Derek J. Saunders
Original assignee: Gruenenthal Gmbh
Priority date: 1993-07-15
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 1999-08-31
Also published as: CZ288536B6; FI943354L; ZA944202B; DE4323754C1; FI943354A7; CN1057124C; UA27132C2; US5747291A; PT669394E; CN1102438A; SK84594A3; RU2143490C1; FI943354A0; AU679512B2; RU94026095A; AU6452594A; HUT70579A; HU217101B; EP0669394A1; KR960014346A

Abstract

1. Dwufunkcyjne warianty urokinazy o ogólnym wzorze 1: M4-X1 -Y1, w którym: M4 oznacza sekwencje aminokwasowa od 4 7 ser do 4 1 1Leu nieglikozylowanej prourokinazy wedlug figury 1, X1 oznacza bezposrednie wiazanie miedzy M4 i Y1 lub peptyd o sekwencji: Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro- Gly-Gly-PhelubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-PhelubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro- Gly-Gly-Phe-Gly lub sekwencje peptydowa o ogólnym wzorze 2: Ser-X2-X3-X4-X5-X6-X7, P L 176971 01 przy czym X2 oznacza Pro lub Leu; X3: Val lub Pro; X4 : Lys, Val, Arg, Gly lub Glu, X5: Ala, Val, Gly, Leu lub Ile, X6 : Phe, Trp, Tyr lub Val; a X7 : Gly lub bezposrednie wiazanie miedzy X6 i Y 1 a Y 1 oznacza peptyd o sekwencji: Y2-Arg-Pro-Y3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-De-Pro-Glu-Glu-Ty r-Leu-Y4 lub Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phy-Trp-Glu-A sp-Glu-Glu-Lys- Asn-Glu lub Y2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-Ile-Asp-Glu-Glu-Glu-Lys z symbolami oznaczajacymi: Y2 Pro lub Val, Y3 Leu lub bezposrednie wiazanie miedzy Pro i Gly oraz Y4 Gin lub grupe-wodorotlenowa. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są dwufunkcyjne warianty urokinazy, plazmidy stosowane do otrzymywania dwufunkcyjnego wariantu urokinazy, sposób wytwarzania tych plazmidów oraz trombolityk.

Ważną właściwością krwi jest jej zdolność zamykania zranień układu krwionośnego poprzez tworzenie skrzeplin. Krzepnięcie krwi jest powodowane przez szereg zawartych w krwi enzymów, które na drodze tak zwanej kaskady zakrzepowej powodują, że na zakończenie enzym trombina przekształca proteolitycznie proteinę poprzedzającą, czyli fibrynogen, w fibrynę. Fibryna polimeryzuje w miejscu uszkodzenia włączając równocześnie w swoją masę trombocyty, erytrocyty oraz inne składniki krwi i tworzy w ten sposób skrzeplinę.

Krew zawiera jednak także szereg enzymów, które przeciwdziałają krzepnięciu i po zregenerowaniu ścianki naczynia zapewniają przepływ krwi. Dla trombolizy najwyżniejszym enzymem jest plazmina, która atakuje proteolitycznie przędziwo fibrynowe i tą drogą powoduje rozpuszczanie skrzepliny. Plazmina powstaje w wyniku proteolitycznego rozszczepienia nieczynnej proteiny poprzedzającej, czyli plazminogenu. Aktywację powodują aktywatory plazminogenu przez proteolityczne rozszczepianie plazminogenu. Znane są dwa wewnątrzpochodne ludzkie aktywatory plazminogenu: urokinaza występująca w moczu i tkankowy aktywator plazminogenu.

Zawał serca i zawał mózgu są ściśle związane z patologicznym tworzeniem się skrzeplin. W obydwóch postaciach zawału powstają w pewnych warunkach skrzepliny na ściankach naczyń, najczęściej w wyniku zmian sklerotycznych w tętnicach. Te skrzepliny zakłócają przepływ krwi w tętnicach, tak że tkanki nie mogą już być w wystarczającym stopniu zaopatrywane w tlen. W przypadku zawału serca prowadzi to do częściowego lub całkowitego obumarcia mięśnia sercowego. Natomiast blokada tętnic mózgowych powoduje ciężkie uszkodzenie tkanki mózgu.

Do leczenia pacjentów z zawałami stosuje się jako trombolityki aktywatory plazminogenu, które uruchamiają rozkładanie skrzeplin przez plazminę. Obecnie stoją do dyspozycji jako leki: streptokinaza, APSAC (Anisolated Plasminogen Streptokinase Activator Complex), dwułańcuchowa urokinaza (UK), rekombinantowa jednołańcuchowa urokinaza (rekombinantowa prourokinaza) i tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) (Collen i Lijnen, Blood 78, 3114 3124 (1991)). Streptokinazajest proteiną wytwarzaną przez hemolityczne streptokoki. Aktywuje ona plazminogen tworząc z nim kompleks i w ten sposób przekształca plazminogen w aktywną konformację. Właśnie ten kompleks przekształca wolny plazminogen w plazminę, która następnie odszczepia plazminogen związany ze streptokinazą. Dalsze rozwinięcie streptokinazy

176 971 stanowi APSAC, który jest wytworzonym in vitro związkiem streptokinazy z ludzkim plazminogenem. APSAC posiada biologiczny półokres reakcji przedłużony w porównaniu ze streptokinazą ze względu na modyfikację chemiczną aktywnego centrum plazminogenu.

Urokinaza jest proteolitycznie aktywną ludzką proteiną, którą można otrzymać z moczu w dwóch postaciach: wysokocząsteczkowej urokinazy (HUK) i niskocząsteczkowej urokinazy (LUK)(Stumpetal., J.Biol, Chem. 261.1267 -1273 (1986)). HuKi LUK majądwułańcuchowe cząsteczki. Urokinaza jako związek jednołańcuchowy (prourokinaza) tworzy się w różnych tkankach i jako proenzym można ją stwierdzić w małych ilościach w ludzkiej krwi (Wun et al., J. Biol. Chem. 257. 3276 - 3283 (1982)). Aktywowana postać prourokinazy ma jako HUK ciężar cząsteczkowy 54 kilodaltony i składa się z 3 domen: aminoterminalnej domeny growth-factor (czynnika wzrostowego), obwarzanka i domeny proteazy serynowej (Giinzler et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363. 1155 - 1165 (1982); Steffens et al., Hoppe Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363. 1043 - 1058 (1982)). Chociaż prourokinaza i plazminogen są proenzymami, to prourokinaza ze względu na jej własną aktywność jest w stanie przekształcać plazminogen w aktywną plazminę. Ten aktywator plazminogenu uzyskuje jednak swoją pełną aktywność dopiero wtedy, gdy powstała plazmina ze swojej strony rozszczepi prourokinazę miedzy ¹⁵⁸lizyną a ¹⁵⁹izoleucyną (Lijen et al., J. Biol. Chem. 261. 1253 - 1258 (1986)). Otrzymywanie urokinazy w Escherichia coli metodami techniki genowej zostało opisane po raz pierwszy przez Heynekera (Procedings of the IVth Internationa Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms 1982). Nieglikozylowana prourokinaza (saruplaza) jest wytwarzana przy użyciu syntetycznego genu (Brigelius-Flohe’et al., Appl. Microbiol. Biotechn. 36, 640 - 649 (1992)).

Tkankowy aktywator plazminogenu jest proteiną o ciężarze cząsteczkowym 72 kilodaltonów, występującym we krwi i w tkankach. Ten aktywator składa się z 5 domen: amino-terminalnej domeny palcowej, domeny growth-factor, obwarzanka 1, obwarzanka 2 i domeny proteazy serynowej. W przeciwieństwie do prourokinazy tPA jest w stanie rozszczepiać plazminogen dopiero po połączeniu się z fibryną. Tak jak prourokinaza tPA jest przekształcany w aktywną postać przez katalizowane plazminą rozszczepienie między obwarzankiem 2 i domeną proteazy serynowej. Tkankowy aktywator plazminogenu wiąże się przy tym z fibryną, a nie z fibrynogenem, co powoduje specyficznie skrzeplinową aktywność plazminogenu. W przeciwieństwie do dwułańcuchowej urokinazy w dużym stopniu unika się generalnej aktywacji plazminogenu (Collen i Lujnen, Blood 78, 3114 - 3124 (1991)).

Aktywne leczenie zawału mięśnia sercowego trombolitykami okazało się skuteczne i efektywne od początku lat 80. W szeregu prac badawczych wykazano, że leczenie streptokinazą, APSAC’em, UK, rekombinantową prourokinazą lub tPA pacjentów z zawałem serca powoduje wyraźne zmniejszenie ich śmiertelności w porównaniu z pacjentami nieleczonymi. W celu polepszenia skuteczności działania leczniczego tych substancji, wytworzono przy użyciu metod techniki genowej szereg pochodnych tkankowego aktywatora plazminogenu i prourokinazy. Oprócz zwiększania aktywności fibrynolitycznej i zmniejszania działań ubocznych, głównym przedmiotem zainteresowania jest rozwijanie form leku nadających się do stosowania w postaci szybkich wlewów dożylnych (bolus). Przegląd zaleceń dotyczących ulepszania aktywatorów plazminogenu jest podany w Thrombosis and Haemostasis 66, 88 - 110 (1991) oraz w Trends in Biotech. 2, 86-90199991).

W celu polepszenia skuteczności działania aktywatorów plazminogenu w terapii lizowej, a zwłaszcza zwiększenia półokresu ich reakcji biologicznej, zostały wytworzone warianty delecyjne i substytucyjne tkankowego aktywatora plazminogenu, polegające np. na usunięciu domeny palcowej i domeny growth-factor oraz wymianie domeny proteazy serynowej na domenę proteazy serynowej z urokinazy (Collen et al., Thromb. Haemostasis 65, 174 - 180 (1991); Fromage et al., Fibrinolysis 5, 187 - 190 (1991); Lu et al., Blood 78, 125 - 131 (1991)). Okazało się, że rzeczywiście delecja domeny palcowej i domeny growth-factor zwiększyła półokres reakcji biologicznej wariantów tPA (Lijnen i Collen, Thromb. Haemostasis 66, 94 - 95 (1991)). Wariant delecyjny i substytucyjny, który składa się z obydwóch domen obwarzankowych z tPAs i domeny proteazy serynowej z UK, ze względu na wyraźnie dłuższy półokres wyraźnie przewyższa pod względem trombolizy pierwotny, to znaczy nie zmieniony aktywator

176 971 plazminogenu. te warianty aktywatora plazminogenu posiadały jednak tylko niewielką specyficzność fibrynową (Lu et al., Blood 78 125 - 131 (1991)).

Podejmowano różne próby wytwarzania aktywatorów plazminogenu o zwiększonej specyficzności fibrynowej. W celu zmniejszenia niebezpieczeństwa występowania krwawień, takie substancje czynne powinny aktywować plazminogen w miarę możliwości wyłącznie w pobliżu skrzepliny, ale nie wywoływać jego aktywacji w układzie. Znany jest np. wariant tPAs, który zawiera obwarzanek 1 zamieniony przez obwarzanek 2 z cząsteczki pierwotnej. Ten wariant ma wprawdzie zwiększone powinowactwo do N-terminalnych rodników lizynowych, ale nie do fibryny. W modelu zwierzęcym ten wariant nie był skuteczniejszy pod względem trombolizy od pierwotnego tkankowego aktywatora plazminogenu (Collen et al., Thromb. Haemostasis 65, 174 - 180(1991)).

Inne znane warianty, które składają się z połączeń między przeciwciałami o specyficzności skrzeplinowej i aktywatorami plazminogenu, są w modelu zwierzęcym skuteczniejsze od pierwotnych aktywatorów plazminogenu (Lijnen i Collen, Thromb. Haemostasis 66, 88 - 110 (1991)). Bardzo dużą specyficzność fibrynową ma aktywator plazminogenu wyodrębniony z Fledermaus Desmodus retundus (Gardell et al., J. Biol. Chem. 264. 17947 do 17952 (1989)). Ten aktywator plazminogenu wykazuje w badaniach na zwierzętach trombolizę polepszoną w stosunku do tPA przy zwięszonym półokresie reakcji i zmniejszonej aktywacji plazminogenu w układzie (Gardell et al., Circulation 84, 244 do 253 (1991)); Mellot et al., Arterioscl. Thromb. 12, 212 do 221 (1992)).

Sukces leczenia pacjentów z zawałem za pomocą aktywatorów plazminogenu zależy jednak nie tylko od trombolizy, lecz także od tego, w jakim stopniu można zapobiegać ponownemu zamykaniu otwartych naczyń krwionośnych. Wyniki różnych badań wskazują na to, że trombina związana w skrzeplinach ponownie wydziela się podczas trombolizy jako wolny enzym i może powodować ponowne zamykanie naczyń (Szczeklil et al., Arterioscl. Thromb. 12, 548 - 553 (1992); Eisenberg, Circulation 84, 2601 - 2603 (1991)). Działanie trombolityku faktycznie ulega polepszeniu w przypadku wcześniejszego lub równoczesnego podania heparyny będącej inhibitorem trombiny. Występowanie ponownych zamknięć w terapii lizowej można także zmniejszyć przez podawanie argatrobanu, hirugenu lub proteiny C (Schneider, Thromb. Res. 64, 677 - 689 (1990); Yao et al., Am. Physiol. 262 (Heart Circ. Physiol. 31, H374 - H379 (1992); Gruber et al., Circulation 84, 2454 - 2462 (1991)). Ponadto wiadomo, że śmiertelność pacjentów z zawałami, którym podano najpierw heparynę, a następnie prourokinazę, była znacznie mniejsza w porównaniu z grupą kontrolną (podawanie prourokinazy bez uprzedniego stosowania heparyny) Tebbe et al., Z. Kardiol. 8Q, Suppl. 3, 32 (1991).

Jednym z najsilniejszych inhibitorów trombininy jest wyodrębniona z pijawki Hirudo medicinales hirudyna, która swoją karboksy - terminalną połową wiąże się specyficznie z miejscem wiązania anionów w trombinie. Pewne aminokwasy amino-terminalnej połowy cząsteczki hirudyny zakrywają dostęp do kieszeni wiązania substratu w trombinie (Rydel et al., Science 249.277 - 280 (1990)). Ponadto wiadomo także, że trombina może być hamowana przez mniejsze pochodne hirudyny, przy czym zwłaszcza należy tu wymienić opisane przez Maranganore et al. w Biochemistry 22, 7095 - 7101 (1990) cząsteczki hirulogu (Krstenansky et al., J. Med. Chem. 3Q, 1688 - 1691 (1987); Yue et al., Protein Engineering 1, 77 - 85 (1992)).

Stosowanie hirudyny w połączeniu z aktywatorem plazminogenu do leczenia uwarunkowanych skrzeplinowo chorób naczyń jest opisane w europejskich zgłoszeniach patentowych EP 328 957 i EP 365 468. Stosowanie lecznicze pochodnych hirudyny w kombinacji z trombolitykiem jest znane z międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 91/01142.

Trombina może być hamowana także przez peptyd, który wywodzi się z amino-terminalnej sekwencji ludzkiego receptora trombiny (Vu et al., Naturę 253. 674 - 677 (1991)). Receptor trombiny zawiera w amino-terminalnym regionie sekwencję wiążącą trombinę z sąsiadującym miejscem rozszczepiania dla trombiny. Wiążący trombinę region receptora ma strukturę bardzo podobną do karboksy-terminalnego obszaru hirydyny. Receptor jest aktywowany przez trombinę, gdy sekwencja receptora zostanie rozszczepiona. Z uwagi na powinowactwo między recep176 971 torem a trombiną fragment receptora z regionem wiążącym i zmodyfikowanym miejscem rozszczepiania działa jako inhibitor trombiny.

Trombina może być hamowana również przez peptyd, który pochodzi od aminokwasów 41 do 57 hemadyny (Strube et al., J. Biol. Chem. 268. 8590 - 8595 (1993).

Zadaniem wynalazku jest zaproponowanie substancji czynnych do leczenia wywołanych skrzeplinami zamknięć naczyń, które w przeciągu bardzo krótkiego czasu powodują całkowitą trombolizę i równocześnie przeciwdziałają ponownemu zamykaniu naczyń po uprzedniej skutecznej trombolizie. Ponadto podczas używania tych substancji czynnych nie powinna następować aktywacja plazminogenu w układzie.

Obecnie stwierdzono, że wysokie wymagania stawiane takim substancjom czynnym są spełniane poprzez pewne dwufunkcyjne warianty urokinazy.

Przedmiotem wynalazku są odpowiadające tym wymaganiom dwufunkcyjne warianty urokinazy o ogólnym wzorze 1:

Μ4-Χ1-Υ1, w którym:

M 4 oznacza sekwencję aminokwasową od ⁴⁷Ser do ^{41 ]}Leu nieglikozylowanej prourokinazy według firmy 1,

Xi oznacza bezpośrednie wiązanie między M4 i Y1 lub peptyd o sekwencji: Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe-Gly lub sekwencję peptydową o ogólnym wzorze 2:

Ser-X 2-X 3-Χ4-Χ 5-X 6-X 7, przy czym X2 oznacza Pro lub Leu; X3: Val lub Pro; X4: Lys, Val, Arg, Gly lub Glu, X5: Ala, Val, Gly, Leu lub De, X6 : Phe, Trp, Tyr lub Val; a Χη : Gly lub bezpośrednie wiązanie między Xei Yi a Yi oznacza peptyd o sekwencji:

Y2-Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ee-Pro-Glu-Glu-Ty r-Leu-Y 4 lub Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Glu-AspGlu-Glu-lys-Asn-Glu lub Y2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-De-Asp-Glu-Glu-Glu-Lysz symbolami oznaczającymi: Y2 Pro lub Val, Y3 Leu lub bezpośrednie wiązanie między Pro i Gly oraz Y 4 Gin lub grupę wodorotlenową.

Korzystnie Y i oznacza peptyd o sekwencji:

Y 2-Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-PrO-GliLi-Glu-Tyr-Leu-Y 4

Również korzystnie Y1 oznacza peptyd o sekwencji:

Ya-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Ly s-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Glu-As p Glu-Glu-Lys-Asn-Glu.

Przy czym korzystnie Xi przedstawia sekwencję peptydu o ogólnym wzorze 2, w którym symbole oznaczają: X2: Pro lub Leu; X3: Val; X4: Lys, Val lub Arg; X5: Ala, Val lub Gly; Xf,: Phe, Trp, Tyr lub Val; a Χ7 : Gly lub bezpośrednie wiązanie między X6 i Y1.

Szczególnie korzystnie symbole oznaczają: Χ4 : Lys lub Val; Χ5: Ala lub Val; X6: Phe, Trp lub Tyr; a Χ7 : Gly lub bezpośrednie wiązanie między Xe i Yi, korzystnie Χ7 oznacza bezpośrednie wiązanie między Xć i Yi.

W równie korzystne są warianty urokinazy, w których Xi przedstawia sekwencję peptydu o ogólnym wzorze 2, w którym symbole oznaczają: Χ2 : Pro lub Leu; Χ3: Val; Χ4 : Lys lub Val; Χ5: Ala lub Val; X(, : Phe lub Trp; a Χ7 : bezpośrednie wiązanie między Xó i Yj.

W porównaniu ze znanymi aktywatorami plazminogenu i znanymi mieszaninami składającymi się z aktywatora plazminogenu i inhibitora trombiny, dwufunkcyjne warianty urokinazy według wynalazku odznaczają się silniejszym działaniem fibrynolitycznym wynikającym z

176 971 nieprzewidywalnie dobrych właściwości hamowania trombiny. Ponadto fibrynogen osocza jest zużywany przez polipeptydy według wynalazku niespodziewanie w wyraźnie mniejszych ilościach. Wynikająca z tego znacząco większa specyficzność fibrynową, zwłaszcza w porównaniu ze znanymi mieszaninami aktywatora plazminogenu i inhibitora trombiny powoduje, że jest wywierany tylko mały wpływ na krzepliwość krwi i niebezpieczeństwo występowania niekontrolowanych krwawień jako możliwej komplikacji rozkładu fibrynogenu w układzie jest zminimalizowane. Duża specyficzność fibrynową wariantów urokinazy według wynalazku umożliwia więc stosowanie ich w postaci szybkich wlewów dożylnych z wyraźnie zmniejszonym ryzykiem występowania krwawień w porównaniu ze stosowaniem szybkich wlewów dożylnych znanych trombolityków.

Dwufunkcyjne warianty urokinazy o ogólnym wzorze 1 nie nasuwają wątpliwości pod względem toksykologicznym, tak, że mogą one być podawane w postaci odpowiednich preparatów farmaceutycznych pacjentom ze skrzeplinowymi zamknięciami naczyń.

Wytwarzanie dwufunkcyjnych wariantów urokinazy odbywa się za pomocą metod techniki genowej. W związku z tym przedmiotem wynalazku są także plazmidy stosowane do otrzymywania dwufunkcyjnego wariantu urokinazy, charakteryzujące się tym, że operon zawiera regulowany promotor, sekwencję· Shine-Dalgamo działającą jako miejsce wiązania rybosomów, kodon startowy, syntetyczny gen strukturalny dla dwufunkcyjnego wariantu urokinazy o ogólnym wzorze 1:

Μ4-Χ1-Υ1, w którym:

M 4 oznacza sekwencję aminokwasową od 4^?Ser do 41 'Leu nieglikozylowanej prourokinazy według figury 1,

Xi oznacza bezpośrednie wiązanie między M4 i Yi lub peptyd o sekwencji: Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe-Gly lub sekwencję peptydową o ogólnym wzorze 2:

Ser-X2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7, przy czym X2 oznacza Pro lub Leu; X3: Val lub Pro; X4: Lys, Val, Arg, Gly lub Glu, X5: Ala, Val, Gly, Leu lub Ile, Xó : Phe, Trp, Tyr lub Val; a X7 : Gly lub bezpośrednie wiązanie Xg i Yi a Y1 oznacza peptyd o sekwencji:

Y2-Arg-Pro-Y3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-he-Pro-Glu-Glu-Ty r-Leu-Y4 lub Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-GluAsp-Glu-Glu-Lys-Asn-Glu lub Y2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-Ile-Asp-Glu-Glu-Glu-Lys z symbolami oznaczającymi: Y2 Pro lub Val, Y 3 Leu lub bezpośrednie wiązanie między

Pro i Gly oraz Y 4 Gin lub grupę wodorotlenową;

oraz za genem strukturalnym 1 lub 2 terminatory, przy czym plazmidy te są odpowiednie do przeprowadzania ekspresji dwufunkcyjnego wariantu urokinazy w szczepach Escherichia coli.

Korzystnie odległość między sekwencją Shine-Dalgamo a kodonem startowym wynosi 6 do 12, a zwłaszcza 8-10 nukleotydów.

W korzystnej realizacji wynalazku są to plazmidy według wynalazku wybrane z grupy obejmującej: pSJ 69, pSJ 76, pSJ 77, pSJ 78, pSJ 79, pSJ 81, pSJ 83, pSJ 90, pSJ 91, pSJ 92, pSJ 93, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103, pSJ 104, pSJ 105, pSJ 106, pSJ 109, pSJ 111, pSJ 114 i pSJ 113, korzystniej wybrane z grupy obejmującej: pSJ 76, pSJ 81, pSJ 83, pSJ 90, pSJ 91, pSJ 92, pSJ 93, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103, pSJ 105, pSJ 106, pSJ 109, pSJ 111 i pSJ 114, szczególnie korzystnie wybrane z grupy obejmującej: pSJ 76, pSJ 81, pSJ 83, pSJ 91, pSJ 92, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103, pSJ 106, pSJ 109, pSJ 111

176 971 i pSJ 114, najkorzystniej wybrane z grupy obejmującej: pSJ 76, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103, pSJ 106, pSJ 109, pSJ 111 i pSJ 114.

Jako regulowalny promotor nadaje się zwłaszcza promotor trp lub promotor tac. Jako terminator stosuje się przede wszystkim terminator trp A i lub terminator tet A/orf L z TN 10.

Ekspresję plazmidów według wynalazku wykonuje się w szczepach Escherichia coli, zwłaszcza w szczepach grupy K 12, np. E. coli K 12 JX 101 (ATTC 33876), E. coli K 12 JX 103 1ATTC 39403), E. coli K 12 JM 105 (DSM 4162) i E. coli K 12 DH 1 (ATTC 33849). Dwufunkcyjne warianty urokinazy według wynalazku o ogólnym wzorze 1 gromadzą się z dużą wydajnością w komórce bakteryjnej w ciałach wtrąconych, w których białko występujące w postaci zdenaturowanej. po wyodrębnieniu ciał wtrąconych przywraca się zdenaturowanej proteinie żądaną strukturę trzeciorzędową poprzez działanie układem redoks.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania plazmidów stosowanych do otrzymywania dwufunkcyjnego wariantu urokinazy, charakteryzujący się tym, że otrzymuje się je z plazmidów pBlueskript KS II+, pUC 8 i pGR 201 w znany sposób. Sposób ten został przedstawiony na figurach 2 i 2 a do 2p.

Przedmiotem wynalazku jest także trombolityk zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako substancję czynną zawiera dwufunkcyjny wariant urokinazy o ogólnym wzorze 1:

Μ4-Χ1-Υ1, w którym:

Χ4 oznacza sekwencję aminokwasową od 47Ser do 4’¹ Leu nieglikozylowanej prourokinazy według figury 1,

Y1 oznacza bezpośrednie wiązanie między Χ4 i Y1 lub peptyd o sekwencji: Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-Pr()-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe-Gly lub sekwencję peptydową o ogólnym wzorze 2:

Ser-Y 2-Y 3-Y 4-Y 5-Y 6-Y7, przy czym Χ2 oznacza Pro lub Leu; Χ3: Val lub Pro; Χ4: Lys, Val, Arg, Gly lub Glu, Χ5: Ala, Val, Gly, Leu lub Ile, X(, : Phe, Trp, Tyr lub Val; a Χ7: Gly lub bezpośrednie wiązanie między X6 i Yi a Y1 oznacza peptyd o sekwencji;

Y2-Arg-Pro-Y3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-He-]Pro-31u-^lu-Tyr-Leu-Y4 lub Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Glu-AspGlu-Glu-Lys-Asn-Glu lub Y 2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-ne-Asp-Glu-Glu-Glu-Lys z symbolami oznaczającymi: Y 2 Pro lub Val, Y 3 Leu lub bezpośrednie wiązanie między

Pro i Gly oraz Y 4 Gin lub grupę wodorotlenową.

Do leczenia skrzeplinowych zamknięć naczyń, np. takich jak zawał serca, zawał mózgu, obwodowa, ostra niedrożność tętnicy, zator płuc i głęboka zakrzeplica żyły nogi i żyły miednicy, potrzeba 0,1 mg/kg do 1 mg/kg polipeptydu według wynalazku. Dwufunkcyjne warianty urokinazy można podawać dożylnie, zwłaszcza w postaci szybkiego wlewu dożylnego. Trombolityki zawierają obok co najmniej jednego dwufunkcyjnego wariantu urokinazy substancje pomocnicze, np. substancje nośnikowe, rozpuszczalniki, rozcieńczalniki, barwniki i środki wiążące. Rodzaje i ilości używanych substancji pomocniczych zależą od tego, jak środek leczniczy ma być stosowany i nie stanowią dla specjalisty żadnego problemu.

Przykłady

I) Wytwarzanie, wyodrębnianie i oczyszczanie dwufunkcyjny ch wariantów nrokinazy według wynalazku.

ó) Klonowanie

176 971

Plazmidy ekspresyjne do otrzymywania metodami techniki genowej w Escherichia coli polipeptydów według wynalazku zostały wytworzone w znany sposób. Kolejność poszczególnych etapów wytwarzania jest przedstawiona na fig. 2 i 2a do 2p. Surowcami wyjściowymi do wytwarzania plazmidów były plazmidy pBlueskript KS II + (firma Stratagene, Heidelberg), pUC8 (firma Pharmacia, Freiburg) i pGR201. pGR201 jest identyczny z plazmidem pBF 160 opisanym w dokumencie patentowym EP 408 945 i w Appl. Microbiol. Biotechn. 26, 640 - 649 (1992). Endonukleazy restrykcyjne Banll, BamHI, Ciał, HindUl, NcoI, Ndel, Nhel i Notl jak również enzymy modyfikujące DNA, takie jak fosfataza alkaliczna, ligaza T4, kinaza T4 i polimeraza T7, zostały sprowadzone z firm: Pharmacia, Strategene, Boehringer (Mannheim) i Gibco (Eggenstein). Zmiany plazmidów podczas ich wytwarzania były badane za pomocą analizy restrykcyjnej i przez sekwencjonowanie DNA. Sekwencjonowanie DNA było wykonywane według przepisów producenta za pomocą zestawu odczynników firmy Pharmacia. Do wytwarzania plazmidów były stosowane różne oligodezoksyrybonukleotydy (w skrócie: oligo), których sekwencje wraz z przynależnymi oznaczeniami są podane w poniższej tabeli.

Tabela 1

Oznaczenie oligo	Sekwencja oligo /5' napisane po 3
1	2
0105	TATGAGCAAAACTTGCTACGAAGGTAACGGTC ACTTCTA
	CCGTGGTAAGGCTTCTACCGACAC
0106	C ATGGTSTCGGTKGAAGCCTTACCACGGTAGGAAGTGACC
	GTTACCTTCGTAGCAAGTTTTGCTCA
0220	CGGTTAAGGCTTTCCCGAGGCCTGGTGGTGGTGGTAACG
	GTGACTTC GAAGAAATCC CGGAAG AGTACC TGTGATAGG
	ATCAA
0221	CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTT
	CGAAGTCACCGTTACCACCACCACCAGGCCTCGGGAAAG
	CCTTAACCGGGCT
0222	CGCCGAGCCCGCCGAGCCCGCCGGGTGGTTTCCCGAGGC
	CTGGTGGTGGTGGTAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGG
	AAGAGTACCTGTGATAGGATCAA

176 971 cd. tabeli 1

0223

CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTT

CGAAGTCACCGTTACCACCACCACCAGGCCTCGGGAAAC

CACCCGGCGGGCTCGGCGGGCTCGGCGGGCT

0224

0225

0226

0227

CGCCGGGTGGTTTCCCGAGGCCTGGTGGTGGTGGTAACG

GTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAGTACCTGTGATAGG

ATCAA

CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTT CGAAGTGACCGTTACCACCACCACCAGGCCTCGGGAAAC CACCCGGCGGGCT

CGCCGAGCCCGCCGAGCCCGCCGGGTGGTTTTCGGTCCGA

GGCCTGGTGGTGGTGGTAACGGTGACTTCGAAGAAATCC

CGGAAGAGTACCTGTGATAGGATC AA

CTAGTTGATCCTATCACAGGTACTCTTCCGGGATTTCTT

CGAAGTCACCGTTACCACCACCACCAGGCCTCGGACCGA

AACCACCCGGCGGGCTCGGCGGGCTCGGCGGGCT

CACCCGGCGGAGACGGCGGGCTCAGAGCCAGACCGTTTT

CTTCTTTGGTGTGAGAACG

CGTCCGGGTGGTGGTGGTAACGGTGACTTCGAAGAAATC

C CGGAAGAATACCTGTAAG

GATCCGTTCTCACACCAAAGAAGAAAACGGTCTGGCTCT

GAGCCCGCCGTCTCCGCCGGGTGGTTTCCCG

CTAGCTTACAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCA

CCGTTACCACCACCACCCGGACGCGGGAAAC

AAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAATAAG

176 971 cd. tabeli 1

1 2 \|
0330	CGGTTAAGGCTTGGGGACCGCGGCCGCTGGGTGGTGGTG j GTAACGGTGACTTCG
0331	ACCACCACCCAGCGGCCGCGGTCCCCAAGCCTTAACCGG GCT
0332	CTAGCTTATTGC AGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAG TCACCGTTACC
0333	CGGTTAAGGCTTTCGGACCGC
0334	GGCCGCGGTCCGAAAGCCTTAACCGGGCT
0335	CGGTTCGGGCTTTCGGTCCGC
0336	GGCCGCGGACCGAAAGCCCGAACCGGGCT
0337	CGGTTAAGGCTTACGGACCGC
0338	GGCCGCGGTCCGTAAGCCTTAACCGGGCT
0339	CGGTTGTTGCTTTCGGTCCGC
0340	GGCCG(^(G^AC(^(^AAAGCAACAACCGGGCT
0341	CGGTTCGGGCTTTCCCGC
0342	GGCCGCGGGAAAGCCCGAACCGGGCT
\| 0343	CGGTTAAGGCTTACCCGC
0344	GGCCGCC-GGTAAGCCTTAACCGGGCT
I 0347	CGGTTGTTGCTTTCCCGC
0348	GGCCGCGGGAkAGCAACAACCGGGCT
0381	CGGTTAAGGCTTGGCCGC

176 971 cd. tabeli 1

1	2
0383	GGCCGCGGCCAAGCCTTAACCGGGCT
0384	CGGTTAAGGCTTTCCCGC
0385	GGCC^CGi^t^^^C^TTAACCGGGCT
0386	CGGTTCTAGTTTTCCCGC
0387	CCCTTCAAGTTTTCCCGC
0388	GGCCCGCACTACAACTAC AACCGGGCT
0389	CCCTTCTACTTGTACTCC
0390	GGCCG^^j^.A^C^iPTCAACC^GCT
0391	G^CCC^(^(^(^.AICCAC^eTACAACCC(CcCT
0392	CTACCTTATTCGTTTTTTTCTW?CGTCTTCCCAG/ACGCT TCCTATTTGTCGTTCGCCTTCCGCACCACCAAC
0393	CGCCCTTCCTGCTGCGGAACCCGAACGACAAATACGAAC CCTTCTCCGAACAC GAAGAAAAAAAC GAAT AAG
0453	TCCTTAAAGCTTTCCCCC
0454	CCCCGCCGGAAAGCTTTAACCAGCCT
0455	TCCTTCTTGCTTTCCCCC
0456	GCCCCCCGCAAACC AAC AACC AGGCT
0465	^CGC^AAC AGAC^GAC^^^^^^^ TCACAACC
0466	GATCCGTTCTC AC ACCAAACAACAAAACGCTCTCCCTCT GTTCCCGC
0467	CCCTTAACGCTTTCCCCCCCCCCTTCCTGCTCCGCAAC

176 971

Oligodezoksyrybonuąleotydu były wytwarzane w detritylowanej postaci w skali 0,1 (imola za pomocą syntezatora (model 391) firmy Applied Biosystems (Weiterstadt) według danych producenta przy użyciu zablokowanych β-cneanoejylemdwuizopropyloaminofosfoaminianów. W każdym przypadku 100 pmoli oligoSezoąsyrubonukleotudu w 50 mM trój/hydroksumetylo/aminometanu/HCl /tris/HCl/, 10 mM chlorku magnezu i 5 mM Ssutiotrcitolu o wartości pH 7,5 były fosforylowane za pomocą jednostki enzymatycznej kinazy T4 w obecności 10 mM adezynotrójfosforanu, a następnie przekształcane w tym samym buforze w dwuniciową cząsteczkę DNA. Otrzymane syntetyczne, dwuniciowe cząsteczki DNA były oczyszczane za pomocą elektroforezy żelowej w żelu poliakruloamidowum (5% poliakruloaminiS8ic) i następnie stosowane do ligacji z odpowiednio przygotowanymi plazmidami. Przygotowywanie plazmidów przez trawienie ich enzymami restrykcyjnymi, wyodrębnianie odpowiednich fragmentów restrykcyjnych i defosforulowanie końców 5', następująca po tym ligacja i transformacja w E. coli Ki2 JM103 jak również wszystkie dalsze operacje stosowanej techniki genowej były wykonywane znanymi sposobami podanymi w pracy: Sambrook et al. % Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2 wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, USA, 1989.

b) Wytwarzanie trwałych kultur i fermentacja

Rekombinantowe plazmidy ekspresyjne pSJ69, pSJ76, pSJ77, pSJ78, pSJ79, pSJ81, pSJ83, pSJ90, pSJ91, pSJ92, pSJ93, pSJ94, pSJ95, pSJIOl, pSJ 102, pSJ103, pSJ104, pSJ105, pSJ106, pSJ109, pS^lll, pSJ 114 i pSJ 113 były umieszczone w E. coli K12 JM103 (ATCC39403) i nanoszone na agar wzoru I (150 mg/l ampicyliny) (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manuał). Pojedyncza kolonia każdej transformacji była hodowana w pożywce wzoru I (pH7,0; 150 mg/l ampicyliny) w temperaturze 20°C do gęstości optycznej 1 przy 578 nm, zamrażana w ciekłym azocie w 5 porcjach po 2 ml jako trwała kultura z dodatkiem sulfotlenku dwumetylowego (DMSO) (przy stężeniu końcowym 7,5%) i przechowywana w temperaturze -70°C. W celu otrzymania dwufunkcyjnych wariantów urokinazy przeprowadzano każdorazowo 1 ml każdej trwalej kultury a stan zawiesiny w 20 ml pożywki wzoru I (pH 7,0; 150 mg/l ampicyliny) i hodowano w temperaturze 37°C do gęstości optycznej 1 przy 578 nm.

Następnie cała ilość otrzymanej kultury była przeprowadzana w stan zawiesiny w 1 i pożywki wzoru I (pH 7,0; 150 mg/l ampicyliny) i poddawana fermentacji w temperaturze 37°C w kolbie potrząsalnej. Indukcja następowała przez dodanie 2 ml roztworu kwasu inSoloakrulowego (60 mg w 2 ml etanolu) przy gęstości optycznej 0,5 do i przy 578 nm.

c) Testowanie ekspresji

W celu przetestowania szybkości ekspresji (jednostek Plouga na jednostkę gęstości optycznej na ml) odwirowywano bezpośrednio przed indukcją i co godzinę po indukcji (razem w

176 971 ciągu 6 godzin) komórki w ilości odpowiadającej 1 ml zawiesiny komórek o gęstości optycznej 1 przy 578 nm. Odwirowane komórki rozpuszczano za pomocą lizozymu (1 mg lizozymu na ml w 50 mM buforze tris/HCl, pH 8,0; 50 mM kwas etyleondwuamioorzterooctnwb (EDTA) i 15% objętościowych sacharozy). Zlizowane komórki rozpuszczano w 4 - 5 M roztworze chlorowodorku guanidyniowogo i po rozcieńczeniu do 1,2 M chlorowodorku guaoidboiowegn oraz dodaniu środka redukującego 1glutetinou lub cysteiny) poddano w ciągu 2-5 godzin reakcji składania (Winkler et al., Biochemist^ 25, 4041 - 4045 (1986)). otrzymane jedonłańcuchowe dwufunkcyjne warianty uro^nazy przekształcono przez dodanie plazminy w odpowiednie dwułóńccchowe warianty urokinazy, których aktywność oznaczano za pomocą chromowego substratu piro-Glu-Gly-Arg-p-nitroóoilidu, rozszczepianego tylko przez dwułańcuchowo aktywne urokina/y.

Aktywowanie dwufunkcyjnych wariantów urnkioezb według wynalazku za pomocą plazminy wykonywano w 50 mM buforze tris/HCl z dodatkiem 12 mM chlorku sodu, 0,02% Tween 80, przy wartości pH 7,4 i w temperaturze 37°C. Stosunek dwufunkcyjnego wariantu urnkioezy do plazminy wynosił około 100 - 1500 do 1, licząc w odniesieniu do molow^ci, lub około 8000 - 36000 do 1, licząc w odniesieniu do jednostek enzymatycznych. Inkubację testową wykonywano w 50 mM buforze tris/HCl i 38 mM chlorku sodu przy wartości pH 8,8 w obecności 0,36 μm óprntyniny (do hamowania plazminy) i 0,27 mM substratu piro-Glu-Glb-Arg-p-nitroenilidu w temperaturze 37°C. W zależności od stężenia dwufunkcyjoegn wariantu urokinazy zatrzymywano reakcję po trwającej 5 - 60 minut inkubacji przez dodanie 50% kwasu octowego i mierzono ekstynkcję przy 405 nm. Według danych producenta substratu (Kabi Vitrum, Szwecja) przy tym sposobie postępowania zmiana ekstynkcji o 0,05 na minutę przy 405 nm odpowiada aktywności urokinazy wynoszącej 25 jednostek Plouga na ml roztworu testowego. Dwufuokryjoe warianty umk^azy według wynalazku miały aktywności właściwe między 120.000 a 155.000 jednostek Plouga na mg oczyszczonej proteiny. Zawartość proteiny w roztworach oznaczano za pomocą BCA-Assay firmy Pierce.

d) Wyodrębnianie i oczyszczanie

Fermentacja przeprowadzona w warunkach opisanych w punkcie Ib była, zakończona po upływie 5 do 6 godzin od chwili indukcji (gęstość optyczna 5-6 przy 578 nm). Komórki zostały odwirowane. Osad komórek przeprowadzono ponownie w stan zawiesiny w 200 ml wody i rozpuszczono w hnmngonizótnrze wysokociśnieniowym. Po ponownym odwirowaniu otrzymany osad, który zawierał całkowitą ilość jedno^^^owego dwufcnkryjoogo wariantu urokinazy, rozpuszczono w 500 ml 5M chlorowodorku guanidyniowego, 40 mM cysteiny, 1 mM EDTA o wartości pH 8,0 i rozcieńczono przez dodanie 2000 ml 25 mM tris/HCl o wartości pH 9,0. Reakcja składania była zakończona po upływie około 12 godzin.

Otrzymane dwufuokryjne warianty urokinózb po dodaniu 8 g żelu krzemionkowego i 2-gndzioobm mieszaniu zostały całkowicie związane z tym żelem. Obładowany żel krzemionkowy oddzielono i przemyto buforem octanowym (pH 4,0). Warianty urokinózb wyelunwano roztworem 0,5 M chlorku rzteromotyloómooiowegn (TmAC) w 0,1 M buforu octanowego (pH 4). Po dwukrotnym oddzielaniu chromatograficznym (kolumna z chelatem miedziowym i wymieniacz kationowy) otrzymano warianty urokinezb w czystej postaci. Na drodze N-terminalnej analizy sekwencyjnej stwierdzono jedonłańcurhnwnść jak również istnienie żądanej sekwencji amino-tormioóloej. Charakterystykę chemiczno-proteinową zmienionego regionu ^boksy-termmalnego poszczególnych wariantów uzyskano po modyfikowanym rozszczepieniu CNBr proteiny (rozpuszrznooj w 1 ml 90% kwasu mrówkowego i 1 ml kwasu siedminfluoromasłowego) przez rozszczepienie łańcucha poptbdowegn za rodnikami tryptofanu. Peptyd karboksbtermioólob oddzielono i oczyszczono za pomocą HPLC (High Pressure Liquid Chromótngróphy = chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej).

Wszystkie wyodrębnione i wymienione w tabeli 2 dwufunkcyjne warianty urokioazb wykazały w bezpośrednim teście aktywności z chromogenowym substratem dla urokinezy zerową albo bardzo małą aktywność (poniżej 1200 jednostek Plouga na mg oczyszczonej proteiny). Dopiero po rozszczepieniu plazminą (warunki są podane w punkcie Ic)) otrzymano aktywność enzymu w granicach od 120.000 do 155.000 jednostek Plouga oó mg oczyszczonej

176 971 proteiny. Wszystkie warianty urokinazy zostały wiec poddane ekspresji w E. coli K12 JM103 jako jednołańcuchowe proteiny.

Tabela 2.

Dwufunkcyjne warianty urokinazy według wynalazku (bU) o ogólnym wzorze 1

bU	*1	^Y1
1	2	3
M11	Ser-Pro-Pro-Ser-Pro- Pro-Gly-Gly-Phe	1 / A z =Pro, Y3=bezpośred- nie wiązanie między Pro i Gly, Y₄=0H
M12	Ser-Pro-Val-Lys-’Ala- Phe	A ^1y^ z Y2=Pro₉ Y^sbezpośrednie wiązanie między Pro i Gly, Y₄=OH
M13	Ser-Pro=Pro~Ser-Pro- Pro-Ser-Pro-Pro-Gly- Gly-Phe	1 / ' A ' _z Y₂=Pro, Y3=bezpoSrednie wiązanie między Pro i Gly, Y₄=CH
MU	Ser-Pro-Pro-Gly-Gly- Phe	1 / A ' z Y =Pfo_s Y0=bezpoś- 2 > rednie wiązanie mędzy Pro i Gly, Y4=OH
M15	Ser-Pro-Pro-Ser-Pro- Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-	A ¹ / z Yp=Pro, Y^be zpośrednie Wiązanie mędzy Pro i Gly, Y4=OH
M16	Ser-Pro-Val“Lys-Ala- Trp-Gly	a1/ z Y2=Pro, Y3=Leu, Y4=GLn
M17	Ser-Pro-Val-Lys-Ala-	A^ z Y2 =Pro, Y^=Leu₉
	Phe—Gly	Y4 =Gln

176 971 cd. tabeli 2

M18

M19

Ser-Pro-Val-Arg-AlaPhe-Gly

Ser-Pro-Val-Lya-AlaTyr-Gly

M20

M22

Ser-Pro-V81-Val-AlaPhe-Gly

Ser-Pro-Val-Arg-AlaPhe

Ser-Pro-Val-Lys-AlaTyr

1/

A¹' z Y2=Pro_s Y'=Leu₉Y₄=G.a

A^ z Y2=PrOs, Y-^LeUs ^Y4=Gln a1' z Y2=Pro, Y^Letis, Y₄=GLn a1' z Y2=Pro, Y^Lects Y₄=Gla a1' z Y2=Pro, Y'=Leu._s

Y =Gln 4

M23

Ser-Pro~Val-Val-AlaPhe

A^V z Y2=Pro, Y^=Leu, Y₄=Gla

M24 I Ser-Pro-Val-Lys-AlaTrp a1' z Y2=Pro, Y^Leu, Y₄=Gln

M25

Ser-Pro-Val-LyS“AlaPhe z Y2=Pro₉ Y^Leu Y^eGln

M26 | Ser-Pro-Val-Yal-7alPhe

A¹' z Y2=Pro_s Y₃=Leu, Y,=Gla

M27

Ser-Pro-Val-Glu-ValPhe

A¹' Y2=Pro₉ Y^Leu, Y4=G1a

176 971 cd. tabeli 2

1 1	2 I 3
128	Ser-Pro-Val-Val“Val-	A^V z Y₂=Val_s Y3=Leu₉
	Val	Y₄=Gln
M29	Ser-Pro-Val-Val“Ala”	B^2/ z Y₂=Pro
	Phe
M30	Ser-Lea-Val~Val-Ala-	A¹/ z Y2=Pro* Y^Leu
	Phe	Y₄=Gln
M31	Ser-Leu-Yal-Lys-Ala-	a1/ z Y2=Pro₉ Y./=Leu₉
	Phe	Y₄=GLn
M32 .	Ser-Pro-Val-Lys-Ala-	b2/ z Y2=Pro
M33	bezpośrednie wiązanie	A^ z Y2=Pro„ Y/=Leu_s
	m.ędzy M4 i Y-j	Y₄=Gla

A = Y2-Arg-Pro-Y3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Y4 B = Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Glu-Asp-Glu-Glu-LysAsn-Glu

II) Badania farmakologiczne

Oznaczanie działania hamującego trombinę

Aktywność działania hamującego wywieranego przez dwufunkcyjne warianty urokinazy według wynalazku oznaczano przez mierzenie czasu trombinowego po zmieszaniu 200 μl rozcieńczonego w stosunku 1:10 ludzkiego osocza cytrynianowego w buforze weronalowym z 50 μ! roztworu trombiny (0,2 jednostki) i 50 μl roztworu wodnego zawierającego 0,5 - 50 (Ig dwufunkcyjnego wariantu urokinazy. Następnie mierzono czas, po upływie którego wytworzyło się przędziwo fibrynowe. W tabeli 3 zestawiono zmierzone współczynniki hamowania, które podają przedłużenie czasu trombinowego spowodowane każdorazowo obecnością 10 μg dwufunkcyjnego wariantu urokinazy według wynalazku. Przedłużenie czasu trombinowego w zależności od stężenia zostało także oznaczone i jest pokazane graficznie na fig. 3 dla dwufunkcyjnych wariantów urokinazy M12, M23, M29, M32, M33 i w celu porównania także dla M4.

W przeciwieństwie do dwufunkcyjnych wariantów urokinazy według wynalazku czas wystąpienia krzepnięcia nie był przedłużony ani przez M4, to znaczy przez sekwencję aminokwasów 47Ser do ⁴4Leu nieglikozylowanej prourokinazy, według fig. 1, ani przez nieglikozylowaną prourokinazę (saruplazę), ani przez LUK, nawet gdy użyto je w dawce 1 mg.

176 971

Tabela 3

Przedłużenie czasu trombinowego przez dwufunkcyjne warianty urokinazy według wynalazku o wzorze 1

Dwufunkcyjny wariant urokinazy	Współczynnik hamowania1)	Dwufunkcyjny wariant urokinazy	Współczynnik hamowania¹)
1	2	1	2
M11	1,8	M23	5,3
M12	4,6	M24	6,2
M13	1,7	M25	2,9
M14	1,8	M26	3,2
M15	2,5	M27	2,0
M16	3,2	M28	2,1
M17	3,1	M29	2,6
M18	2,9	M30	3,4
M19	2,0	M31	2,0
M20	2,2	M32	3,0
M21	2,3	M33	2,0
M22	3,7

liczone w stosunku do działania 10 gg proteiny

Współczynnik hamowania = ilorazowi czasu trombinowego w obecności środka hamującego i czasu trombinowego w nieobecności środka hamującego.

Właściwości farmakologiczne dwufunkcyjnych wariantów urokinazy M12 i M23 w doświadczeniach na zwierzętach. W farmakologicznym modelu in vivo zbadano działanie dwufunkcyjnych wariantów urokinazy M12 i M23 na trombolizę zamknięć naczyń tętniczych w porównaniu z działaniem saruplazy (nieglikozylowanej prourokinazy). W tym celu wstrzyknięto narkotyzowanym królikom miejscowo w boczne odgałęzienie czasowo wyodrębnionego odcinka tętnicy udowej o długości 1 cm trombinę i znaczony przez 125j fibrynogen ludzki. Spowodowało to wytworzenie się skrzepliny, która całkowicie zamknęła naczynie. Wielkość powstałej skrzepliny była oznaczana przez mierzenie wprowadzonej radioaktywności fibryny ludzkiej za pomocą detektora promieniowania gamma umieszczonego na zewnątrz ciała królika. Elektromagnetyczne pomiary przepływu krwi i oznaczanie radioaktywności skrzepliny były wykonywane w sposób ciągły podczas całego okresu trwania doświadczenia. Działanie fibrynolityczne było określane ilościowo przez wyznaczanie reperfuzji naczynia zamkniętego przez skrzeplinę oraz rozkładu znaczonej radioaktywnie fibryny wbudowanej w skrzeplinę.

Przed zastosowaniem dwufunkcyjnych wariantów urokinazy według wynalazku oraz po upływie 30, 60 i 90 minut po ich zastosowaniu pobrano próbki krwi, w których oznaczono stężenie fibrynogenu w osoczu. M12, M23 i saruplazę w dawkach po 6 mg/kg zastosowano w postaci szybkich wlewów dożylnych. Ponieważ M12 i M23 w przeciwieństwie do saruplazy mają dodatkowo działanie przeciwzakrzepowe, więc w 4 grupie doświadczalnej zastosowano saruplazę w kombinacji ze środkiem przeciwzakrzepowym heparyną (150 jednostek/kg w postaci szybkiego wlewu dożylnego). Wielkość każdej grupy wynosiła 6 zwierząt.

W ciągu trwającego 90 minut doświadczenia tromboliza znaczonej fibryny skrzeplinowej wyniosła 46 ±11% dla M 12,43 ± 12% dlaM23,22 ±5% dla saruplazy i 39 ± 15% dla kombinacji saruplazy z heparyną. Szybkie wlewy dożylne M12 i M23 spowodowały u wszystkich 6 zwierząt otworzenie naczynia zamkniętego przez skrzeplinę; reperfuzja naczynia w wyniku zastosowania saruplazy nastąpiła u 5 spośród 6 zwierząt a w wyniku zastosowania saruplazy i heparyny u 4

176 971 spośród 6 zwierząt. Maksymalna wielkość przepływu roperfuzyjnogn (w % wartości wyjściowej) wyniosła 95 ± 10% dla M12 i 82 ± 9% dla M23 oraz różniła się znacznie od maksymalnej wielkości przepływu reporfuzbjoegn dla saruplazy, który wynosił 43 ± 12%. Maksymalna wielkość przepływu roperfuzyjoegn, wynosząca 58 ± 8% w przypadku działania saruplazą i heparyną, leżała między wynikami dla M12 i M23 z jednej strony i dla sar-uplazy z drugiej strony i nie różniła się znacznie po obydwóch stronach. Całkowite działanie fieryoolityczoe zostało nznóczono jako powierzchnia przepływu roperyuzyjoogn (podana w % przepływu wyjściowego) w ciągu trwającego 90 minut doświadczenia. Ten efekt całkowity wynosił 4502 ± 1127% min dla M12 i 4270 ± 885% min dla M23 i dla obydwóch wariantów urokioózy według wynalazku był znacznie większy od wartości 1519 ± 643% min dla saruplazy. W wyniku kombinowanego działania saruplazy i heparyny efekt całkowity wynosił 2217 ±761% min i nie był znacznie lepszy niż w przypadku działania samą saruplazą ó znacznie gorszy od wyników dla M12 i M23. Wyniki są zestawione w tabeli 4.

Tabela 4.

Działanie trnmezlitbrzoo po zastosowaniu szybkiego wlewu dożylnego; zekrzopoira tętnicy udowej, narkotyzowane króliki

Polipeptyd	Dawka	% 125 J fierbnnlizb	Maksymalny przepływ roperfuzbjob (% wartości wstępnej)	Całkowity przepływ reper^^ny (% min.)
M12	6 mg/kg	46 ±11	95 ± 10*	4502 ±1127
M23	6 mg/kg	43 ±12	82 ±9*	4270 ± 885*
sórcpleza	6 mg/kg	22 ± 5	43 ± 12	1519 ±643
sórupleze + hoperboe	6 mg/kg 150 jedn/kg	39 ±15	58 ±8	2217 ±761

* p < 0,05 vs sa^lazy

Niespodziewanie stwierdzono, że zarówno po zastosowaniu szybkiego wlewu dożylnego M12 i jak i szybkiego wlewu dożylnego M23 stężenie fieryongeou w osoczu spadło znacznie mniej niż po szybkim wlewie dożylnym sa^lazy. Wyniki są zestawione w tabeli 5.

Tabela 5.

Działanie szybkiego wlewu dożylnego M12 i M23 w porównaniu z sa^lazą, użytą bez dodatku lub z dodatkiem heparyny, na spadek stężenia yierbongeoc w osoczu; narkotyzowane króliki

Polipeptyd	Dawka	Spadek zawórtzśri fierbnngoou w osoczu (zmiana % w stosunku do wartości wyjściowej)
czas po zastosowaniu
30 min	60 min	90 min
M12	6 mg/kg	-19 ± 9	-20 ±9*	-19±9*
M23	6 mg/kg	-20 ±11*	-21 ±11*	-20 ±11*
serupleze	6 mg/kg	-64 ±7	-66 ±6	-67 ±6
sa^laza + heparyna	6 mg/kg +150 jedn/kg	n.b. 11	-46 ±8	-45 ±9

* p < 0,05 vs sar-uplazy

1) n.b. = nie badano

Wyniki pokazały, że dwufuokryjno warianty uro^nazy według wynalazku M12 i M23 rozpuszczają skrzepliny tętnicze, które powodują całkowite zamkniecie naczyń, i przywracają u^wienie tych naczyń. To działanie było osiągnięte przez jednokrotne zastosowanie szybkiego wlewu dożylnego M12 oraz M23 u zwierząt nie poddanych działaniu heparyny. To silniejsze w

176 971 porównaniu do saruplazy fibrynolityczne działanie M12 i M23 niespodziewanie było związane z mniejszym zużyciem fibrynogenu osocza. Oznacza to, że M12 i M23 mają znacznie większą specyficzność fibrynową w porównaniu do saruplazy. Lepsza ochrona fibrynogenu osocza przez M12 i M23 w porównaniu do saruplazy oznacza, że zdolność krzepnięcia krwi zostaje lepiej zachowana i dzięki temu maleje niebezpieczeństwo występowania niekontrolowanych krwawień będących możliwą komplikacją rozkładu fibrynogenu w układzie. Pod względem ryzyka występowania hemostatycznych działań ubocznych należy więc zaszeregować M12 i M23 jako bezpieczniejsze od saruplazy.

Wzór 1

Wzór 2

176 971

Fig . 1

971

	VO
—ł	O
er\	-ł	O\
	b	ΓΜ
co 22	co	<2
o* —	Cl

Π

Cł

<30

ΐ-

<o

tn

__

m

f*1

n

<Ί

O1

<Ί

nj

ej

tł

-i

o

Ch

<30

**>

22

3

«e.

3

5

3

“1

Γ4

-t

-4

CM

*-*

—

·—

5

3

22

3

22

3

«a

—-

*>>—»

—·

<«μΓ

Μ»

Ή

<n

tn

'tf

n

N

*H

o

O

o

O

n

m

Cl

o

in

^*4

*4

-4

*4

co

o\

σ\

<n

σ\

<n

o

*O

b

»□

Ti

►a

hj

>1

Lj

in

b

*□

Hj

*□

*T3

CO

co

ca

co

ca

co

ca

CO

Ca

&

a

a a

a

Cl

a

Ca

1

ł

1

k

A

CJ CO

Fig .2

176 971

Trawienie za pomocą Ndel i Ncol, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego defosforylowanie końców 5', ligaćja z syntetycznym DNA z oligo 0105 i 0106, transformacja w E.coli

Fig.2a

176 971

Trawienie za pomocą BamHI i Ciał, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pBluescriptKSII+ i małego fragmentu restrykcyjnego pGR201„ defosforylowanie końców 5' fragmentu pBluescriptKSII+, ligaćja, transformacja w E.coli

Fig„ 2b

176 971

Trawienie za pomocą BamHI i HindUl wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pUC8 i małego fragmentu restrykcyjnego pGR201, defosforylowanie końców 5' fragmentu pUC8, ligacja, transformacja w E.coli

Fig.2c

176 971

Niiel

BamHI

Trawienie za pomocą Nhel i BamHI, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego defosforylowanie końców 5', ligaćja z syntetycznym DNA z oligo 0265, 0281, 0282, 0283, transformacja w E.coli

Fig.2d

176 971

Trawienie za pomocą BamHI i Hind III, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pSJ41 i małego fragmentu pSJ68, defosforylowanie końców 5' fragmentu pSJ41, ligacja, transformacja w E.coli

Fig.2e

176 971

Trawienie za pomocą BamHI i Ciał, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pSJ70 i małego fragmentu pSJ68, defosforylowanie końców 5* fragmentu pSJ70, ligacja, transformacja w E.coli

Fig. 2f

176 971

Trawienie za pomocą Banll i Nhel, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego, defosforylowanie końców 5', ligaćja z syntetycznym DNA, transformacja w E.coli

plazmid	ol i go
pSJ7 2	0220,	0221
pSJ73	0222,	0223
pSJ7 4	0224,	0225
pSJ75	0226,	0227

Fig . 2g

176 971

Trawienie za pomocą BamHI i HindUl wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pSJ41 i każdorazowo małego fragmnetu pSJ72 do pSJ75, defosforylowanie końców 5' fragmentu pSJ41, ligacja, transformacja w E.coli

Fig. 2h

Trawienie za pomocą Banll i Nhel, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego, defosforylowanie końców 5', ligaćja z syntetycznym DNA z oligo 0329, 0330, 0331, 0332, transformacja w E.coli

F.ig. 2i

176 971

wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pSJ41 i małego fragmentu pSJ80, defosforylowanie końców 5' fragmentu pSJ41, ligacja, transformacja w E.coli

V

Fig . 2j

176 971

Trawienie za pomocą Banll i Notl, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego, defosforylowanie końców 5' ligaćja z syntetycznym DNA, transformacja w E.coli

V

BamHI Banll Nhel Notl Ciał

Hindlll

plazmid	oligo
pSJ82	0333,	0334
pSJ84	0335,	0336
pSJ85	0337,	0338
pS«J86	0339,	0340
pSJ87	0341,	0342
pSJ83	0343,	0344
pSJ39	0347,	0348
pSJ95	0381,	0383
pSJ97	0384,	0385
pSJ98	0386,	0391
pSJ99	0390,	0387
pSJIOO	0388,	0389
pSJ107	0455,	0456
pSJ108	0453,	0454

Fig. 2k

176 971

Trawienie za pomocą BamHI i Hindlll, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pSJ41 i każdorazowo małego fragmentu pSJ82 do pSJlO8, defosforylowanie końców 5' fragmentu pSJ41, ligaćja, transformacja w E.coli

BamHI Banll Nhel-Nctl Ciał

Hindlll

Fig. 21

176 971

Trawienie za pomocą Banll i Nhel, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego, defosforylowanie końców 5', ligacja z syntetycznym DNA z oligo 0467, 0468, 0469 i 0470, transformacja w E.coli ·'

Hindlll

Fig. 2m

176 971

wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego pSJ41 i małego fragmentu pSJ112, defosforylowanie końców 5' fragmentu pSJ41, ligacja, transformacja w E.coli

Fig. 2n

176 971

Trawienie za pomocą Nhel i NotI wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego, defosforylowanie końców 5', ligaćja z syntetycznym DNA z oligo 0392 i 0393, transformacja w E.coli

Fig - 2o

176 971

Trawienie za pomocą BamHI i Notl, wyodrębnianie dużego fragmentu restrykcyjnego defosforylowanie końców 5', ligaćja z syntetycznym DNA z oligo 0465 i 0466, transformacja w E.coli

Fig. 2p

176 971

Czas tsek]

Proteina [pg]

Fig. 3 :Przedłużenie czasu trombinowego zależne od stężenie

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Dwufunkcyjne warianty urokinazy o ogólnym wzorze 1:

M4-X1-Y1, w którym:

M 4 oznacza sekwencję aminokwasową od 47ser do 411leu nieglikozylowanej prourokinazy według figury 1,

X1 oznacza bezpośrednie wiązanie między M4 i YUub peptyd o sekwencji: Ser-Pro-ProSer-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lub Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lub Ser-ProPro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe-Gly lub sekwencję peptydową o ogólnym wzorze 2:

Ser-X₂-X3-X4-X5-Xfr^X?, przy czym Χ2 oznacza Pro lub Leu; Χ3: Val lub Pro; Χ4: Lys, Val, Arg, Gly lub Glu, Χ5: Ala, Val, Gly, Leu lub Ile, X6: Phe, Trp, Tyr lub Val; a Χ7 : Gly lub bezpośrednie wiązanie między X6 i Yi a Y1 oznacza peptyd o sekwencji:

Y 2-Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-De-Pro-Glu-Glu-Ty r-Leu-Y4 lub Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phy-Trp-Glu-AspGlu-Glu-Lys-Asn-Glu lub Y 2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-He-Asp-Glu-Glu-Glu-Lys z symbolami oznaczającymi: Y 2 Pro lub Val, Y 3 Leu lub bezpośrednie wiązanie między

Pro i Gly oraz Y 4 Gin lub grupę wodorotlenową..
2. Warianty urokinazy według zastrz. 1, znamienne tym, że Yi oznacza peptyd o sekwencji:

Y2-Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-He-Pro-Glu-Glu-Ty r-Leu-Y4
3. Warianty urokinazy według zastrz. 1, znamienny tym, że Yi oznacza peptyd o sekwencji:

Y 2-Arg-Pro-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Glu -Asp -Glu-Glu-Lys-Asn-Glu
4. Warianty urokinazy według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że Xi przedstawia sekwencję peptydu o ogólnym wzorze 2, w którym symbole oznaczają: X₂: Pro lub Leu; Χ3: Val; Χ4: Lys, Val lub Arg; Χ5; Ala, Val, lub Gly; Xó: Phe, Trp, Tyr lub Val; a Χ7: Gly lub bezpośrednie wiązanie między Xó i Yi.
5. Warianty urokinazy według zastrz. 4, znamienne tym, że symbole oznaczają: Χ4: Lys lub Val; Χ5: Ala lub Val; X(,: Phe, Trp lub Tyr; A Χ7: Gly lub bezpośrednie wiązanie między Xe, i Yi.
6. Warianty urokinazy według zastrz. 4, znamienne tym, że X7 oznacza bezpośrednie wiązanie między Xć i Yi.
7. Warianty urokinazy według zastrz. 1 albo 3, znamienne tym, że Xi przedstawia sekwencję peptydu o ogólnym wzorze 2, w którym symbole oznaczają: X2: Pro lub Leu; X 3: Val,; Χ4: Lys lub Val; Χ5: Ala lub Val; Xć: Phe lub Trp; a Χ7: bezpośrednie wiązanie między X(, i Y1.
8. Plazmidy stosowane do otrzymywania dwufunkcyjnego wariantu urokinazy, znamienne tym, że operon zawiera regulowany promotor, sekwencję Schine-Dalgamo działającą jako miejsce wiązania rybosomów, kodon startowy syntetyczny gen strukturalny dla dwufunkcyjnego wariantu urokinazy o ogólnym wzorze 1:

Μ4-Χ1-Υ1 w którym:

'M4 oznacza sekwencję aminokwasową od47ser do 411lcu nieglikozylowanej prourokinazy według fig. 1,

Xi oznacza bezpośrednie wiązanie między M4 i Yi lub peptyd o sekwencji: Ser-Pro-ProSer-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-PiO-PiO-Ser-Pro-Pro-Ser-PiO-Pro-Gly-Gly-Phc lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-PiO-Pro-Gly-Gly-Phe-Gly lub sekwencję peptydową o ogólnym wzorze 2:

Ser-X2-X₃-X4-X5-X6-X?, przy czym X2 oznacza Pro lub Leu; X₃: Val lub Pro; X4: Lys, Val, Arg, Gly lub Glu, X>: Ala, Val, Gly, Leu lub Ile, Xe: Phe, Trp, Tyr lub Val; aXy: Gly lub bezpośrednie wiązanie między X6 i Yi a Y1 oznacza peptyd o sekwencji:

Y2-Arg-Pro-Y 3-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Cilu-Glu-He-Pro-Glu-Glu-Ty r-Leu-Y 4 lub Y2-Arg-Pro-Phe-Lcu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Trp-Clu-AspGlu-Glu-Lys-Asn-Glu lub Y 2-Arg-Pro-Scr-Scr-Clu-Phe-Clu-Glu-Phc-Glu-Ile-Asp-Clu-Clu-Clu-Lys z symbolami oznaczającymi: Y 2 Pro lub Val, Y3 Leu lub bezpośrednie wiązanie między

Pro i Gly oraz Y 4 Gin lub grupę wodorotlenową;

oraz za genem strukturalnym ilub 2 terminatory, przy czym plazmidy te są odpowiednie do przeprowadzania ekspresji dwufunkcyjnego wariantu urokinazy w szczepach Escherichia coli.
9. Plazmidy według zasłrz. 8, znamienne tym, ee odległość między sekwencją ShineDalgarno a kodonem startowym wynosi 6 do 12, a zwłaszcza 8-10 nukleotydów.
10. Plazmidy według zastrz. 8 albo 9, wybrane z grupy obcjmująnej: pSJ 69, pSJ 76, pSJ 77, pSJ 78, pSJ 79, pSJ 81, pSJ 83, pSJ 90, pSJ 91, pSJ 92, pSJ 93, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103, pSJ 104, pSJ 105, pSJ 106, pSJ 109,pSJ 111, pSJ 114 i pSJ 113.
11. Plazmidy według zastrz. l0, wybrane z grupy obejmującej: pSJ 76, pSJ 81, pSJ 83, pSJ 90, pSJ 91, pSJ 92, pSJ 93, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103, pSJ 105, pSJ 106, pSJ 109, pSJ iii ipSJ 114.
12. Plazmidy według zastrz. 10, wybrane z grupy obejmującej: pSJ 76, pSJ 81, pSJ 83, pSJ 91,pSJ 92, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103,pSJ 106,pSJ 109, pSJ iii i pSJ 114.
13. Plazmidy według zastrz. 10, wybrane z grupy obejmującej: pSJ 76, pSJ 94, pSJ 95, pSJ 101, pSJ 102, pSJ 103, pSJ 106, pSJ 109, pSJ 111 ipSJ 114.
14. Sposób wytwarzania plazmidów stosowanych do otrzymywania dwufunkcyjnego wariantu urokinazy, znamienny tym, ge otrzymuje się je z plazmidów pBlueskript KS II+, pUC 8 i pGR 201 w znany sposób.
15. Trombolityk zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, żejako substancję czynną zawiera Ssufunknyjny wariant urokinazy o ogólnym wzorze 1:

Μ4-Χ1-Υ1, w którym:

M 4 oznacza sekwencję aminokwasową od 47ser do 411 Leu nieglikozylowanej prourokinazy według figury 1,

Xi oznacza bezpośrednie wiązanie między M4 i Y1 lub peptyd o sekwencji: Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Clu-Cly-dhe

176 971 lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Gly-Gly-Phe lubSer-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-PiO-Pro-Gly-Gly-Phe-Gly lub sekwencję peptydową o ogólnym wzorze 2:

Ser-X2-X₃-X4-X5-X6-X7, przy czym X2 oznacza Pro lub Leu; X₃: Val lub Pro; X4 : Lys, Val, Arg, Gly lub Glu, Xs: Ala, Val, Gly, Leu lub Ile, Xe : Phe, Trp, Tyr lub Val; a X7 : Gly lub bezpośrednie wiązanie między X6 i Y1 a Y1 oznacza peptyd o sekwencji:

Y2-Arg-PiO-Y3=Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-A.sp-Phe-Glu-Glu-ne-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Y4

1 u b Y2-Arg-Pro-Phe-Leu-LeuArg-Asn-Prr-Asn-Asp-Ly s-TyrrGlu-IPo-Phe-Trp-GluAsp-Glu-Glu-Lys-Asn-Glu lub Y2-Arg-Pro-Ser-Ser-Glu-Phe-Glu-Glu-Phe-Glu-He-Asp-Glu-Glu-Glu-Ly ^s z symbolami oznaczającymi: Y 2 Pro lub Val, Y 3 Leu lub bezpośrednie wiązanie między Pro i Gly oraz Y4 Gin lub grupę wodorotlenową.