JP3226215B2 - ヒト抗トロンビン３の変異体 - Google Patents

ヒト抗トロンビン３の変異体

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、野生型AT III（アンチトロンビンIII）と
比較して改良された性質を有する、AT IIIの変異体（mu
tants）に関する。一つまたはそれ以上の可能なグルコ
シル化（glycosylation）部位（例えばAsn135およびAsn
155）における修飾は、AT IIIのプロテアーゼ特異性を
保ちながらヘパリン結合／ヘパリン活性化の性質を向上
させる。位置Arg393における変化は、プロテアーゼに対
する特異性の変化をもたらす。一般に、変異（mutatio
n）の組合せは改良を促進する。
ヒト抗トロンビンIII（AT III）をコードするcDNAお
よび大腸菌（E.coli）におけるその発現は、欧州特許出
願EP第0 090 505 A2号明細書に記載されている。AT III
の発現は、さらに、組換え酵母（EP第0 Z56 302 A2号明
細書）および哺乳動物細胞（DE第3 624 453 A1明細書）
において示されている。これらの実験から、哺乳動物細
胞によって培養培地に分泌されるAT IIIのみがインビト
ロでの完全な生物学的活性を示し、血漿タンパク質と非
常に似た複雑な炭水化物（carbohydrate）構造を有して
いるということが明らかになった（Zettlmeisslら:BioT
echnology、1987、５、720−725）。
哺乳動物細胞からの組換えAT IIIの約58kdの分子量
は、血漿から精製されたタンパク質のものに相当する。
成熟ヒトAT IIIのアミノ酸配列は表１に示される通りで
ある。
AT IIIは、タンパク質のセルピン（serpin）類のひと
つであり、したがって、α−１抗トリプシン、α−２抗
プラスミン、ヘパリン補因子II、α−１抗キモトリプシ
ン、プラスミノーゲン活性化因子（activator）インヒ
ビターなどのプロテアーゼインヒビターと大きな類似を
有している。セリンプロテアーゼトロンビンはAT IIIと
反応すると、それはArg393−Ser394結合を切断して、共
有結合のAT III−トロンビン複合体を形成する。トロン
ビンは複合体形成（complexation）においてそのプロテ
アーゼ活性を失う。ヘパリンの非存在下では、AT IIIは
トロンビンの比較的弱いインヒビターである。ヘパリン
の最適濃度は、少なくとも2000倍（factor）のレベルで
AT III−トロンビン結合反応の速度定数（rate constan
t）を増加させる（Hoylaertsら:J.Biol.Chem.、1984、2
59、5670−5677）。ヒトの血漿中には二つの型のAT III
（アルファおよびベータ）が存在しており、これらはヘ
パリンに対して異なる親和性（affinity）を有している
（Petersonおよびblackburn:J.Biol.Chem.、1985、26
0、610−615、Brennanら:FEBS LETT.、1987、219、431
−436）。血漿中90〜95％の範囲で存在するAT IIIアル
ファはAsn残基96、135、155および192に炭水化物側鎖を
有するのに対して、AT IIIベータにおいては位置96、15
5および192のみが占められている。二つのAT IIIの型の
生理学的役割は知られていない。
管理された（directed）突然変異誘発の技術によって
AT IIIcDNAへの特異的変化の導入が可能である。これは
AT IIIのアミノ酸組成の修飾をもたらす。一本鎖DNAま
たはヘテロ二本鎖（heteroduplex）DNAを用いる管理さ
れた突然変異誘発の方法は開示されている（Morinaga
ら:BioTechnology、1984、７、636−639、Kramerら:Nuc
l.Acid Res.、198、12、9441−9456）。表２は、ヒトAT
IIIの管理された突然変異誘発に用いられるオリゴヌク
レオチドのいくつかを例示したものである。
一つまたはそれ以上のグリコシル化部位Asn96、Asn13
5、Asn155およびAsn192において、異なるアミノ酸、好
ましくはGln、を有する変異体が今調製され、これはプ
ロテアーゼ特異性を保ちながらヘパリン結合／ヘパリン
活性化の性質を増進する。さらに、位置Arg393で修飾さ
れた変異体（好ましくはMetまたはValへの変異（mutati
on））を調製した。これは酵素特異性の修飾（改良）を
もたらす。
ヘパリン結合／ヘパリン活性化の性質を向上させた変
異体は、適宜、より低いヘパリン量を治療に用いること
が可能であることから、AT III/ヘパリン併用治療にお
いて有利である。
一方、特異性変異体は、可能なヘパリン活性化のAT I
IIの性質を新たなプロテアーゼ（例えばエラスターゼ、
プラスミンなど）に対する親和性を有する突然変異した
分子へ移すことができる新たな分子を結果としてもたら
す。したがって、この型の分子は、投与量を変えること
によって有利な方法で治療の政策を変えることを可能に
する。
突然変異したAT IIIタンパク質を、哺乳動物細胞にお
いて発現して、標準法によって精製して、それらのプロ
テアーゼ特異性またはそれらのヘパリン活性化の性質、
生物化学的／生物物理学的性質および／またはそれらの
臨床的パラメーターについて調べることが可能である。
AT IIIの修飾型の合成は、高発現率を迅速にもたらすベ
クター／宿主細胞系（system）によって達成される（Ze
ttlmeisslら:Behring Inst.Mitt.、1988、82、26−3
4）。
したがって、本発明は次のようなAT III変異体に関す
る。
（１）グリコシル化部位Asn96、Asn135、Asn155およびA
sn192の一つまたはそれ以上において異なるアミノ酸、
好ましくはGln、を有しており、 （２）位置Arg393において修飾されており（好ましくは
MetまたはValへの変異）、 （３）一般に改良を促進する、変異（１）および（２）
の組合せを有する。
本発明は諸例および特許請求の範囲にさらに記載され
る通りである。
例1:AT III変異体の合成（一般法） ヒトAT IIIcDNAの全コード領域を含む1.4kbのフラグ
メントを、EcoR I/Hind IIIによる消化によってプラス
ミドｐβAT6（EP第0 256 302 A2号明細書）から単離し
た。このフラグメントを突然変異誘発ベクターpMA5−８
（第１図）のポリリンカー（EcoR I/Hind IIIで切断し
た）にクローニングした。その結果得られるプラスミド
をpMAAT IIIと称した（第２図）。
突然変異誘発を行った後に（「突然変異誘発」の項を
参照されたい）、突然変異させたcDNAをSac II/Xba Iに
よる切断によって単離して、同様にSac II/Xba Iで消化
しておいた発現ベクターpAB3−１にクローニングした
（AT III野生型）。その結果、プラスミドpABmutが得ら
れた（第３図）。pABmutプラスミドは、特有の突然変異
したcDNAに加えてSV40初期エンハンサー／プロモーター
ユニット、初期転写のためのSV40ポリアデニル化（poly
adenylation）部位およびCMV迅速初期エンハンサー（Ze
ttlmeisslら：前出）を有している。
pABmutプラスミドをCsCl勾配で精製して、Zettlemeis
slら（前出）による記載のようにしてプラスミドpSV2dh
frおよびpRMH140でBHK細胞（ATCC CCL10）中で共トラン
スフェクション（cotransfection）させた。DME培地＋1
0％FCS＋400μg/mlG418および１μＭメトトレキセート
（methotraxate、標準増殖培地）中での二重選択後に得
られる耐性クローン（約40〜100）をクローン混合物と
してT25培養器に集めた。混合されたクローンをT80およ
びT180培養器を介して標準増殖培地中でプラスチックロ
ーラーボトル（1750cm2）に拡げて、そこにコンフルエ
ントになるまで付着培養させた。コンフルエントになっ
た細胞を200mlのIscoveの培地（Behringwerke AG、Marb
urg）で２回（それぞれ37℃で２時間）洗浄して、次い
で500mlの同じ培地を回収培地（harvest medium）とし
て48時間回転させた。回収培地を細胞成分から遠心分離
によって分離した。調整した回収培地の各一部をとり、
ヒトAT IIIに特異性のあるELISAによってそれらのAT II
I抗原含有量を調べた（Zettlmeisslら:BioTchnology、1
987、５、720−725）。このようにして測定した野生型A
T III（AT III−WT）および種々の突然変異体（mutan
t）の発現レベルは、表３に例示する通りである。
AT III−WTおよびそれから派生した突然変異したタン
パク質を標準法（ヘパリン−セファロースを用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーとそれに続く分画硫酸ア
ンモニウム沈澱）（Zettlmeisslら:1987）によって回収
培地から精製して、次いで特徴付けを行った。
変異体AT III分子は、また種々の永久哺乳動物細胞系
において技術状態に応じて他の発現ベクターを用いても
発現させることができる。
例2:突然変異誘発／一般法（Kramerら:Nucl.Acids Re
s.、1984、12、9441−9456） 大腸菌WK6株で形質転換させておいた突然変異誘発ベ
クターpMAAT III（第２図）の一本鎖DNAを標準法によっ
て単離した。
pMC5−８のプラスミドDNA（第１図の説明を参照され
たい）をEcoR I/Hind IIIで切断して、ベクターフラグ
メント（3.8kb）をアガロースゲルからペーパー溶出（M
aniatisら:Molecular Cloning−A Laboratory Manual、
1982、Cold Spring Harbor、New York）によって精製し
た。
ギャップト二本鎖（gapped duplex）DNAを得るため
に、0.1pmolの二本鎖フラグメント（pMCから）および0.
5pmolの一本鎖DNA（pMAAT III）を12.5mMトリス−HCl
（pH7.5）＋190mM KCl（最終容量40μｌ）中で100℃で
４分間加熱して、次いで65℃で10分間インキュベートし
た。突然変異誘発オリゴヌクレオチド（表２を参照され
たい）上でのハイブリダイゼーションのために、８μｌ
の該ハイブリダイゼーション溶液を４〜8pmol（２μ
ｌ）の酵素的に燐酸化したオリゴヌクレオチドと65℃で
５分間加熱して、次いで徐々に室温に冷却した。24μｌ
のH2O、４μｌの10×埋填緩衝液（fill−in buffer）
（625mM KCl、275mMトリス−HCl（pH7.5）、150mM MgCl
2、20mM DTT、0.5mM ATPおよび各0.25mMの四つのdNT
P）、１μｌのT4DNAリガーゼ（5U/μｌ）および１μｌ
のDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（1U/μ
ｌ）を加えて、室温で45分間インキュベートした。５μ
ｌの埋填ギャップト二本鎖DNAでWK6muts（mutS215:Tn1
0）を形質転換させた。全形質変換混合物をLB培地＋25
μg/mlクロラムフェニコール（10ml）中での振盪培養で
37℃で一晩増殖させる。プラスミドDNAを全混合物から
標準法（Maniatisら:1982）によって精製した。約20ng
の精製プラスミドでWK6を形質転換させた。形質転換体
を25μg/mlのクロラムフェニコールを含むLBプレート上
で選択した。
これらの形質転換体の５個について適当な配列反応
（Ｃ−、Ｔ−、Ａ−またはＧ−特異性）によって所望の
突然変異を分析した。陽性のクローンを突然変異誘発部
位の領域の詳細な配列分析によって確認した（Sanger
ら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1988、74、5463−546
7）。
例3:AT III−Met393:AT III−Val393およびAT III−Leu
393 α１抗トリプシン（エラスターゼインヒビター）と同
様の特異性を有する分子を形成する目的で、AT IIIのAr
g393（P1位置）をMet、ValまたはLeuに変換した。表２
からのオリゴヌクレオチドNo.1、２および３を突然変異
誘発に用いた。
突然変異体は、BHK細胞によって合成されて、AT III
野生型（WT）に匹敵する量で培養培地に放出され（表
４）、これはウサギからの抗AT III血清に対してAT III
−血漿およびAT III−WTと同一の反応を示して、AT III
−WTと類似して上記の標準法によって95％以上の純度で
精製することができる。これら突然変異体のヘパリン−
セファロース上での結合および溶出の性質は、AT III−
WTと違わない。このことは、突然変異体のヘパリン結合
およびヘパリン活性化の性質がそのままで保持されてい
ることを示す。
突然変異体はもはやトロンビンに対する累進的な阻害
活性（Hensenら:Thromb.Diatl.Haemorrh.、1963、９、1
8−29）またはヘパリン補因子活性（Schraderら:Aerzt
l.Lab.、1986、32、111−114）を有していない（表
３）。
AT III−WTと対照的に、三つの突然変異体は白血球エ
ラスターゼを阻害する。エラスターゼは、ヒト白血球か
らEngelbrechtらの記載による方法（Hoppe−Seyler's Z
tschr.Physiol.Chemie、1982、363、305−315）で単離
された。用いられた基質は、Nakajimaら（J.Biol.Che
m.、1979、254、4027−4032）による記載のMeO−Suc−A
la−Ala−Pro−Val−pNA（Calbiochem）であった。基質
からのパラニトロアニリンの遊離を15分以内の405nmに
おける吸光度の増加として分光光度計によって測定し
た。この吸光度をPMNエラスターゼ酵素の100％活性と定
義した。インヒビターを最高100μg/mlにまであげた濃
度で酵素とともに１時間プレインキュベーションした。
次いで酵素反応を基質とともに始めた。分析を0.1mol/
リットルHEPES（pH7.5）＋0.1mol/リットル塩化ナトリ
ウム中で行った。基質濃度は0.13mmol/リットルであっ
た。IC50を、酵素活性の50％を阻害する阻害濃度（μg/
ml）として定義した。最高濃度の100μg/mlにおいて阻
害作用を示さない物質を不活性と称した。用いた参照イ
ンヒビターは、α１プロテアーゼインヒビター（α1P
I、α１抗−トリプシン）であって、これは阻害値3.7を
有した。AT III−WTは、PMNエラスターゼ活性の阻害を
示さなかった。AT III Valはα1PIに匹敵する4.0μg/ml
の活性を示したが、AT III MetおよびAT III Leuは明か
に活性がより低く、それぞれ28および65mg/mlであった
（続く表を参照されたい）。
記述のPMNエラスターゼ分析を、α1PIとの比較によっ
てAT III−Val393のKIの決定に用いた。用いた基質MeO
−Suc−Ala−Ala−Pro−Val−pNAの濃度は、0.0011、0.
0022、0.0044、0.0087、0.0175、0.035、0.7mmol/リッ
トルであった。インヒビターの濃度は3.5×10-8mol/リ
ットルであった。
両方の場合で、pMNエラスターゼの阻害は非競合的阻
害であった（続く表を参照されたい）。α1PIおよびAT
III−Val393のKI値は、実質的に同一である。
例4:AT III−Gln135およびAT III−Gln155 発明として本出願において請求される実験の一つの目
的は、AT III分子中のグリコシル化の、AT IIIの生物学
的および生物化学的性質に及ぼす影響を調べることにあ
る。位置135および155におけるAsn→Gln変換を、それぞ
れ炭水化物側鎖を欠いている二つのAT III突然変異体
（AT III−Gln135およびAT III−Gln155）の産生に用い
た。用いた突然変異誘発オリゴヌクレオチドはオリゴヌ
クレオチド８および９（表２）であった。BHK細胞（AT
IIIは培養培地中）における両突然変異体の発現率は、
表４に示されるように、AT III−WTと同じオーダーの大
きさである。両突然変異体は特異的累進的阻害活性およ
びヘパリン補因子活性に関して、ウサギからの抗−AT I
II血清に対してAT III−血漿およびAT III−WTと同一の
反応を示す（表４）。これらを上記の標準法によって95
％以上の純度で精製することができる。
二つの突然変異体を、分析中のヘパリン濃度を関数と
してそれらのトロンビン不活性化能（比較値）を調べ
て、AT III−血漿、AT III−WTおよび突然変異体AT III
−Lys49と比較した（表５）。
分析は次の条件下で行った。0.02U（抗原）/ml AT II
I（AT III−血漿、AT III−WTまたはAT III−Mut）を、
0.3IU/mlのα−トロンビン（ヒト）、2KIU/mlのアプロ
チニン（Behringwerke）および０〜25IU/mlの濃度の1ml
の容量のヘパリン（Hoffmann−LaRoche）とともに37℃
で５分間プレインキュベーションした。100μｌの基質
試薬（2mM HD−CHA−But−Arg−pNA）を加えた後、405n
m（37℃）における吸光度（extinction）の変化を動力
学的に（kinetically）追跡した。ヘパリン飽和におけ
るα−トロンビンの最大阻害を100％と設定した。
突然変異体AT III−Gln135およびAT III−Gln155によ
る低ヘパリン濃度におけるトロンビンの阻害はAT III−
血漿およびAT III−WTよりも良好であった（表５）。
表５には、AT III−血漿、AT III−WTおよび種々のAT
III突然変異体についての1/2最大（half−maximum）ト
ロンビン阻害（c1/2）におけるヘパリン濃度が示されて
いる。
例5:AT III−Gln135/155 例４に記載の突然変異を、オリゴヌクレオチド８およ
び９（表２）を用いる連続的突然変異誘発によって一つ
のAT III分子において組合わせた。突然変異したタンパ
ク質は記載の標準精製法において組換え野生型AT III分
子のように挙動する。
AT III−Gln135およびAT III−Gln155について見出さ
れた低ヘパリン濃度におけるα−トロンビンの増進され
た阻害は、AT III−Gln135/155の場合にはよりいっそう
顕著である（表５）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドpMAC5−８（＝pMA5−８およびpMC
5−８）の地図を示す、説明図である。図中、F1−ORI:
ファージf1の複製開始点,ORI:ColE1型の複製開始点、CA
T:クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの
コード領域、AMP:β−ラクタマーゼのコード領域。pMA5
−８はCAT中（位置3409のＡ）にアンバー（amber）突然
変異を有し、pMC5−８はAMP中（位置2238のＣ）にアン
バー突然変異を有する。 第２図は、突然変異誘発ベクターpMAAT IIIを示す、説
明図である。 第３図は、プラスミドpABmutを示す、説明図である。 第４図は、AT III−血漿（○）、AT III−WT（□）、AT
III−Gln135（●）、AT III−Gln155（■）およびAT I
II−Lys（▼）によるヒトα−トロンビンの比阻害（rel
ative inhibition）の依存性を示す、説明図である。実
験条件は例４に記載されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 37/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 アヒム、ベッカー ドイツ連邦共和国ダウトフェタル、オー バーラントシュトラーセ、４ (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 263，Ｎｏ．31，Ｐ．15849−15852 （1988) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．72，Ｎｏ．５, Ｐ．1817−1821（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/81 A61K 38/00 A61K 38/55 A61P 7/02 C12N 9/99 C12P 21/02 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】改良された抗トロンビンIII変異体であっ
    て、位置135、155、192または393においてアミノ酸置換
    を含み、上記置換が単独でまたは一つまたはそれ以上の
    他の置換との組合せで存在することができ、ただし、位
    置393で置換されるアミノ酸はHisまたはCysではない、
    抗トロンビンIII変異体。
  2. 【請求項２】ヘパリン結合およびヘパリン活性化の性質
    が改良された抗トロンビンIII変異体であって、位置Asn
    135、Asn155、Asn192において天然に生じるアミノ酸が
    一つまたはそれ以上の位置で他のアミノ酸と交換された
    抗トロンビンIII変異体からなる群からなる選択され
    る、抗トロンビンIII変異体。
  3. 【請求項３】Arg393のMetとの交換、Arg393のValとの交
    換、Arg393のLeuとの交換、Asn135のGlnとの交換、Asn1
    55のGlnとの交換およびAsn192のGlnとの交換からなる群
    から選択される変異を単独または組合せで含む、請求項
    １に記載の抗トロンビンIII変異体。
  4. 【請求項４】Arg393のMetとの交換、Arg393のValとの交
    換またはArg393のLeuとの交換による変異と、Asn96のGl
    nとの交換、Asn135のGlnとの交換、Asn155のGlnとの交
    換およびAsn192のGlnとの交換による変異の一つまたは
    それ以上を共に含む、請求項３に記載の抗トロンビンII
    I変異体。
  5. 【請求項５】Asn135のGlnとの交換、Asn155のGlnとの交
    換およびAsn192のGlnとの交換からなる群から選択され
    る変異の一つまたはそれ以上を含む、請求項２または３
    に記載の抗トロンビンIII変異体。
  6. 【請求項６】Arg393のMetとの交換による変異を含む、
    請求項３に記載の抗トロンビンIII変異体。
  7. 【請求項７】Arg393のValとの交換による変異を含む、
    請求項３に記載の抗トロンビンIII変異体。
  8. 【請求項８】Arg393のLeuとの交換による変異を含む、
    請求項３に記載の抗トロンビンIII変異体。
  9. 【請求項９】Asn135のGlnとの交換による変異を含む、
    請求項２または３に記載の抗トロンビンIII変異体。
  10. 【請求項１０】Asn155のGlnとの交換による変異を含
    む、請求項２または３に記載の抗トロンビンIII変異
    体。
  11. 【請求項１１】Asn192のGlnとの交換による変異を含
    む、請求項２または３に記載の抗トロンビンIII変異
    体。
  12. 【請求項１２】請求項１〜11のいずれか１項に記載の変
    異体をコードするcDNAの、適当な原核または真核生物発
    現系中での発現を含む、請求項１〜11のいずれか１項に
    記載の変異体の製造法。
  13. 【請求項１３】請求項１〜12のいずれか１項に記載の変
    異体の一つまたはそれ以上を含んでなる、野性型抗トロ
    ンビンIIIと比較して性質を改良するための薬剤。
  14. 【請求項１４】改良された抗トロンビンIII変異体であ
    って、位置393でのアミノ酸置換と、位置96、135、15
    5、192での少なくとも一つのアミノ酸置換とを組合せで
    含み、位置393での上記置換がHisまたはCysではない、
    抗トロンビンIII変異体。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3479539B2 (ja) * 1992-04-10 2003-12-15 エーザイ株式会社 ヒトアンチトロンビンｉｉｉ変異体
CA2328397A1 (en) * 1998-05-12 1999-11-18 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Human antithrombin iiis and methods related thereto
DE19839337A1 (de) * 1998-08-28 2000-03-02 Centeon Pharma Gmbh Antithrombin III-beta enthaltende Arzneimittelzubereitung
WO2000020026A2 (en) 1998-10-08 2000-04-13 Children's Hospital Compositions and methods for inhibiting angiogenesis
AUPP971299A0 (en) * 1999-04-12 1999-05-06 South Eastern Sydney Area Health Service Procoagulant assay
CA2368608A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Genzyme Transgenics Corp. Transgenically produced antithrombin iii and mutants thereof
JP4339962B2 (ja) 1999-06-23 2009-10-07 武比古 小出 ヒトアンチトロンビン変異体
DE19932782A1 (de) * 1999-07-14 2001-01-18 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung von Plasma oder Serum, so erhaltene Präparate und deren Verwendung
CA2487901A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 University Of Utah Research Foundation Variants of antithrombin iii
WO2005070148A2 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 University Of Utah Research Foundation Methods of using high affinity atiii variants
WO2009013251A1 (en) * 2007-07-20 2009-01-29 Universite Paris-Sud Xi Use of mutated antithrombins for treating or preventing coagulation disorders
WO2010081878A1 (en) * 2009-01-16 2010-07-22 Universite Paris-Sud Xi Mutated antithrombins, a process for preparing the same and their use as drugs
EP2496246B1 (en) 2009-11-03 2018-06-27 Grifols Therapeutics LLC Composition, method, and kit for alpha-1 proteinase inhibitor
JP5810091B2 (ja) 2009-11-24 2015-11-11 グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツドＧｒｉｆｏｌｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 凍結乾燥方法、組成物、及びキット

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2116183B (en) * 1982-03-03 1985-06-05 Genentech Inc Human antithrombin iii dna sequences therefore expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby a process for expressing human antithrombin iii and pharmaceutical compositions comprising it
US4746306A (en) * 1982-03-26 1988-05-24 General Motors Corporation Electrical connector lock with gauge pin
US4632981A (en) * 1982-07-30 1986-12-30 Genentech, Inc. Human antithrombin III
US4711848A (en) * 1984-03-14 1987-12-08 Zymogenetics, Inc. Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin
DE3624453A1 (de) * 1986-07-19 1988-01-28 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung von humanem antithrombin iii (atiii), dafuer geeignete vektoren und wirtszellen, so erhaltenes, biologisch aktives atiii und dieses enthaltende arzneimittel
GB8621118D0 (en) * 1986-09-01 1986-10-08 Whitbread & Co Plc Stabilised polypeptides
IE902276A1 (en) * 1989-06-26 1991-01-16 Akzo Nv Serpin variants

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．５，Ｐ．１８１７−１８２１（１９８８）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６３，Ｎｏ．３１，Ｐ．１５８４９−１５８５２（１９８８）

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