PT92928B - Processo para a preparacao de mutantes da antitrombina iii humana e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Processo para a preparacao de mutantes da antitrombina iii humana e de composicoes farmaceuticas que os contem Download PDF

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Description

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial com sede em D-3550 Marburg, Alemanha Ocidental, (inventores: Dr.Gerd Zettlmeissl, Dr.Hermqnn Erich Karges e Achim Becker, residentes na Alemanha Ocidental), para MUTANTES DA ANTI-TROMBINA III HUMANA, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM
DESCRIÇÃO
A invenção refere-se a mutantes da AT III que possuem propriedades melhoradas em relação à AT III do tipo nativo. A modificação em uma ou mais potenciais posições de glicosiiação (por exemplo Asn 135, Asn 155) aumenta as propriedades de ligação ou de activação da heparina, mantendo a especificidade de protease da AT III. Modificações na posição Arg 393 conduzem a alterações da especificidade em relação a proteases. A combinação das mutações provoca em geral uma potenciação dos melhoramentos.
cDNA codificante para a antitrombina III humana (ATUI) e as respectivas expressões em E-coli encontam-se descritas no registo de patente europeia EP 0 90 505 A 2. Além disso descreve-se a expressão da AT III em leveduras recombinantes (EP 0 256 302 A2) e em células de mamíferos (DE 3 624 453 Al). Através destas experiências demonstrou-se que
apenas a AT III, que é segregada por células de mamíferos no meio de cultura, apresenta uma actividade biológica total in vitro epossui uma estrutura de hidrato de carbono complexa muito semelhante à proteína do plasma (ZettlmeiBl et al., BioTechtechnology, 1987, 5, 720-725).
peso molecular da AT III recombinante de células de mamíferos corresponde com cerca de 58 kd ao da proteínapurifiçada a partir do plasma. A sequência de aminoácidos da AT III humana madura encontra-se representada na Tab. 1.
f Ak !·.·
A AT III é um membro da família de proteínas das serpinas e apresenta por isso uma elevada homologia com inibidores de protease como a alfa-1- antitripsina, a alfa -2-antiplasmina, heparinocofactor II, alfa-1- antiquimotripsin inibidor do activador do plasminogénio, etc. Quando a serinoprotease trombina interactiva com a AT III, cinde-se a ligação Arg 393-Ser 394 e forma-se um complexo covalente de AT III trombina. Com a formação do complexo a trombina perde a sua actividade de protease. Na ausência de heparina a AT III é um inibidor da trombina relativamente fraco. Com concentração opt mizadas de heparina aumenta-se a constante de velocidade da reacção de associação AT III-trombina, pelo menos de um factor de 2000 (Hoylaerts et al., J. Biol. Chem., 1984, 259, 5670-5677). No plasma humano existem duas formas de AT III (alfa e beta) com diferentes afinidades para a heparina (Peterson e Blackburn, J. Biol. Chem., 1985, 260, 610-615; Brennan et al., FEBS LETT., 1987, 219, 431-436). Enquanto que AT III alfa, que ocorre no plasma com um teor de 90-95%, tem nas unidades Asn 96, 135, 155 e 192 cadeias laterais de hidratos de carbono, na AT III beta apenas as posiçoes 96, 155 e 192 se encontram acupadas. O papel fisiológico das duas formas de AT III nao é con eido.
ΘΑ técnica da mutagénese pretendida permite introduzir modificações específicas no cDNA da AT III, que con duzem a alterações na composição em aminoácidos da AT III.
Sao conhecidos os métodos de efectuar esta mutagénese, que tra balham com DNA de cadeia simples ou DNA heteroduplex (morinaga et al., BioTechnology, 1984, 7, 636-639; Kramer et al., Nucl. Acid Res., 198, 12, 9441-9456). A Tab. 2 mostra, a título de exemplo, alguns oligonucleótidos, tal como se empregaram para a mutagénese pretendida da AT III humana.
Prepararam-se então mutantes que, em uma ou mais das posições de glicosilação Asn 96, Asn 135, Asn 155 ou Asn 192, possuem um outro aminoácido, de preferência Gin, o que melhora as propriedades de ligação e de activação da heparina, mantendo a especificidade de protease; além disso, pre pararam-se mutantes modificados na posição Arg 393 (de preferência mutação para Met ou Vai), o que provoca uma modificação da especificidade do enzima.
Os mutantes com melhores propriedades de ligaçãoe de activação da heparina possuem vantagens na coterapia com AT III/heparina, pois nesse caso se pode ter um efeito terapêutico com doses de heparina mais baixas.
Os mutantes de especificidade, pelo contra rio, conduzem a novas moléculas nas quais a propriedade de activação da heparina da AT III pode ser transmitida a moléculas mutacionadas com afinidade para novas proteases (por exemplo elastase, plasmina, etc.), tendo essas moléculas a vantagem de permitir novos conceitos terapêuticos baseados em dosagens diferentes.
As proteínas AT III mutacionadas podem exprimir-se em células de mamiferos, purificar-se por meio de métodos usuais e testar-se em relação à sua especificidade para proteases ou às suas propriedades de activaçao da heparina e às suaspropriedades bioquímicas/biofísicas e/ou em relaçao aos seus parâmetros clínicos. A síntese de formas modificadas de AT III efectua-se por meio de um sistema celular vector/hos pedeiro, o que conduz rapidamente a rendimentos de expressão elevados (ZettlmeiB et al. (1988), Behring Inst. Mítt. 82, 26-34) .
A invenção ffifere-se sucessivamente a mutantes de AT III, que (1) em uma ou mais das posiçoes de glicosilaçao Asn 96, Asn 135, Asn 155, Asn 198 possuem um outro aminoácido, de preferência Gin, (2) estão modificadas na posição Arg 393 (de preferência mutação para Met ou Vai), (3) possuem uma combinação das mutações referidas em (1) e (2), que em regra provocam uma potenciação dos melhoramentos .
A invenção encontra-se ainda descrita nos exemplos enas reivindicações da patente.
Exemplo 1: Síntese do mutantes de AT III (processo geral).
A partir do plasmídeo pbeta AT6 (EP 0 256
302 A 2), isolou-se por meio de digestão com EcoRI/Hind III um fragmento de 1,4 kb, que contém a região codificante completa do cDNA da AT III humana. Este fragmento clonou-se no polilincante (cortado com EcoRI/Hind III) do vector de mutogénese pMA 5-8 (Fig. 1). 0 plasmídeo resultante designou-se por pMAAT IIl(Fig. 2).
Após execução da mutagénese (ver abaixo: descrição da mutagénese) isolou-se o cDNA mutacionado por meio de cisão com Sac II/XbaI e clonou-se no vector de expressão pAB 3-1 (ATUI nativo), que se digerir a também com Sacll/ /Xbal, o que conduziu ao plasmídeo pABmut /Fig.3). 0 plasmídeo pAB mut contém, para além do cDNA mutacionado, a unidade activador/promotor early SV40, a posição de poliademilação SV40 para as transcrições iniciais e o activador immediate early CMV /ZettlmeiBl et al., vide acima).
Os plasmídeos pABmut purificaram-se através de gradiantes de CsCl, e, como descrito por Zettlmei^l et al., vide acima, cotransfeccionaram-se com os plasmídeos pSV2-dhfr e pRMHl40 em células BHK (ATCCCCL10). Após selecçao dupla em meio DME + 10% FKS + 400 ^ig/ml G418 e 1 ^iM metotrexato (meio de crescimento padrão), reuniram-se os clonos resistentes formados (cerca de 40-100) como mistura de clonos em balões de cultura T25. Os clonos mistos expandiram-se por meio de balões de cultura T80 e T180, em meio decrecimento padrão, sobre frascos de plástico cilíndricos (1750 cm^) e desenvolveram-se por aderência até à confluência. As células confluentes lavaram-se duas vezes com 200 ml de meio de Iscove (Behringverke AG, Marburg) (2 horas de cada vez, a 37sc) e por fim rolaram-se com 500 ml do mesmo meio como meio de cultura, durante 48 horas. Libertou-se o meio de cultura dos componentes celulares por meio de centrifugação. Testaram-se alíquotas dos meios de colheita condicionados, num ensaio ELISA específico para a ATUI humana (Zettlmeipi et al., 1987, BioTechnology 5, 720-725), em relaçao ao seu teor antigênico AT III. Os valores de expressão assim determinados para a AT III nativa (AT III-WT) e para vários mutantes indicam-se na Tab.3 a título de exemplo.
A AT III-WT e as proteínas mutacionadas dela derivados purificaram-se a partir dos meios de colheita, de acordocom um processo usual (cromatografia de afinidade como heparina-Sepharose, seguida por precipitação fraccionada com sulfato de amónio) (Zettlmeipi et al., 1987) e caracterizaram-se por fim.
As moléculas de AT III mutantes podem também exprimir-se com outros vectores de expressão em várias linhas celulares de mamíferos, permanentes, de acordo com o estado da técnica.
Exemplo 2 : Mutogénese/Processo geral (Kramer et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12, 9441-9456)
Isolou-se DNA de cadeia simples do vector de mutagénese pMAAT III (Fig.2), que fora transformado em E. coli, estirpe WK6, de acordo com métodos usuais.
Cortou-se o DNA plasmídeo de pMC 5-8 (vide legenda da Fig. 1) com EcoRI/MindIII e purificou-se o fragmento de vector (3,8 Kb) num gel de agarose com eluição em papel (Maniatis et al., 1982, Moléculas Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York).
Para a preparação de um DNA gapped-duplex aqueceram-se 0,1 pmol de fragmento de cadeia dupla (de pMC) e 0,5 pmol de DNA de cadeia simples (pMAAT III) em 12,5 mM Tris-HC1, pM 7,5 + 190 mM KC1 (volume final 40 jil), durante 4 minutos a 1009C e incubou-se em seguida durante 10 minutos a 652C Para a hibridação do mucleótico de mutagénese (vide Tab. 2) aqueceram-se 8 pl da solução de hibridaçao referida com 4-78 pmol (2 μΐ) do oligonucleótido fosforilado enzimático, durante 5 minutos a 659C e deixou-se depois arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. Após adição de 24 ^ul de H2O, 4 μΐ de tampão fill-in 10 vezes (525 mM KC1, 275 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM MgCl2» 20 mM DTT, 0,5 mM ATP e 0,25 mM de cada um dos quatro dNTP' s), 1 jul de T4-DNA-ligose (5 U/jul) e 1 jil de fragmento de klenow de DNA polimerase I (1 U/jul) , seguiu-se uma incubaçao de 45 minutos à temperatura ambiente. Transformaramse 5 pl de DNA gapped duplex preenchido, em wk5 muts (mut 5215: TnlO). Desenvolveu-se a mistura de transformaçao total numa culturacom agitação em meio LB + 25 yug/ml de cloranfenicol (10 ml), durante a noite a 372C. A partir da mistura total purificou-se oDNA plasmídeo, de acordo com métodos usuais (Maniatis et al., 1982). Transformaram-se cerca de 20 ng de plasmídeo transformado em WK6. Seleccionaram-se os transformantes em placas LB com 25 JJg/ml de cloranfenicol.
Avalisaram-se cinco destes transformantes por meio de uma seccao sequencial apropriada (C-, T-, A - ou G-específica) em relaçao 'mutaçao desejada. Identificaram-se
os clonos positivos por meio de uma anális sequencial detalhada na zona das posições de mutagénese (Sanger et al., (1977), Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 74, 5463-5467).
Exemplo 3: AT III-Met 393; AT III-val 393 e AT III- Leu 393
Com o objectivo de preparar uma molécula com especificidade análoga à da alfa 1 - antitripsina (inibidor de elastase), transformou-se a unidade Arg 393 da AT III (posição Pl) numa unidade Met, Vai ou Leu. Para a mutagénese utilizaram-se os oligonucleótidos N2s 1,2 e 3 da Tab. 2.
Os mutantes sintetizam-se em quantidades comparáveis às da AT III nativa (WT) a partir de células BHK e desenvolvem-se no meio de cultura (Tab.4), mostram um comportamento idêntico ao da AT III de plasma e da AT III-WT em relação a anti-rosas anti AT III de coelho e podem purificar-se de modo análogo ao da AT III-WT, de acordo com os métodos usuais acimadescritos, obtendo-se purezas superiores a 95%. 0 comportamento de ligação e de eluição destes mutantes em sepharose de heparina não mostra qualquer diferença em relaçao à AT III-WT. Isto comprova as propriedades intactas de ligação à heparina e de activação da heparina destes mutantes.
Os mutantes nao apresentam qualquer actividade de inibidor progressivo (Hensen et al., 1963, Thromb. Diatl. Haemorrh. 9, 18-29) e de cofactor de heparina (Schrader et al., 1986, Arztl. Lab. 32, 111-114) em relação à Trombina (Tab. 3).
Os três mutantes, ao contrário da AT III-WT, inibem a elastase dos leucócitos. Isolou-se a elastose a partir de leucócitos humanos, de acordo com o método descrito por Engelbrecht et al., (Hoppe-Seyler's Ztschr. Physiol. Chemie 363, 305-315, 1982). Como substrato utilizou-se MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (Calbiochem). descrito por Nakajima et • al. (J. Biol. Chem. 254, 4027-4032, 1979). Mediu-se a Liberta- 7 insau» ção da paranitroanilina a partir do substrato pelo aumento da absorção a 405 nm num espectrofotómetro, durante 15 minutos. Este valor de absorçao definiu-se como 100% de actividade enzimática da PMN elastase. Pré-incubaram-se os inibidores em concentrações crescentes até ao máximo de 100 ^qg/ml, durante uma hora, com o enzima. Iniciou-se então a reacção enzimática com o substrato. Efectuou-se o teste em 0,1 mol/1 de HEPES, pH 7,5 +0,1 mol/1 de cloreto de sódio. A concentração do substrato era de 0,13 mmol/1. Como valor IC50, em pg/ml, definiu-se a concentração de inibidor capaz de inibir 50% da actividade enzimática. As substâncias que nao mostraram qualquer efeito inibidor a uma concentração máxima de 100 jug/ml, definiram-se como inactivas. Como inibidor de referência utilizou-se o inibidor de protease alfa 1 (alfal-PI, alfal-antitripsina) que tinha um valor de inibição de 3,7. A ATIII-WT não mostrou qualquer inibição da actividade de elastase PMN. A ATIII-val mostrou uma actividade de 4,0 jag/ml, comparável à da alfal-PI, enquanto que a AT III-Met e a AT III-Leu, como 28 ^ig/ml e 65 ug/ /ml, respectivamente, eram claramente menos activas (vide Tabelas seguintes).
Por meio do teste da elastase PMN descrito determinou-se o Kl para a AT III-val 393 em comparação com a alfal-PI. As concentrações empregues do substrato MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA foram de 0,0011; 0,0022; 0,0044; 0,0087; 0,0175; 0,035 e 0,7 mmol/1. A concentração do inibidor foi de 3,5χ10“θ mol/1.
Em ambos os casos a inibição da elastase PMN, trata-se de uma inibição nao competitiva (vide Tabelas seguintes). Os valores do Kl para a alfal PI e para a AT III-Val 393 sao aproximadadmente idênticos.
Exemplo 4: AT III-Gln 135 e AT III-Gln 155
Um dos objectivos das experiências reivindicadas como invenção neste pedido, é o de estudar a influência da glicosilação na molécula de AT III sobre as propriedades biológicas e bioquímicas da AT III. Por meio da substituição Asn-* Gin nas posições 135 ou 155 prepararam-se dois mutantes de AT III (AT III - Gin 135 e AT III-Gln 155), aos quais falta uma cadeia Lateral de hidrato de carbono. Como oligonucleótidos de mutagénese utilizam-se os oligonucleótidos 8 e 9 (Tab. 2). Os rendimentos de expressão para ambos os mutantes em células BHK (AT III em meio de cultura) sao, como se mostra na Tab. 4, da mesma ordem de grandeza dos da AT III-WT. Ambos os mutantes apresentam, em comparação com a AT III-plasma e a AT III-WT, comportamentos idênticos em relaçao a soros anti-ATIII de coelho, no que respeita à actividade de inibidor progressivo e de cofactor de heparina (Tab. 4) e podem purificar-se, de acordo com os métodos usuais acima descritos, obtendo-se purezas superiores a 95%.
Ambos os mutantes se testaram no que respei ta às suas capacidades relativas de inactivação da trombina em função da concentração de heparina e compararam-se com a AT III-plasma, a AT III-WT ou o mutante AT III-Lys 49 (Tab.5).
teste realizou-se nas seguintes condições:
Pré-incubaram-se 0,02 U (antigene)/ml de AT III (AT III-plasma, AT III-WT ou AT III-Mut) com 0,3 IU/ml de alfa-trombina (humana), 2KIU/ml de aprotinina (Behringwerke) e heparina (Hoffmann-LaRoche) em concentrações de 0-25 IU/ml, num volume de 1 ml, durante 5 minutos a 379C. Após adição de 100/il de substrato (2mM HD-CHA-But-Arg-pNA) seguiu-se a variação de extinção a 405 nm (379C) cineticamente. Considerou-se como 100% a inibição máxima da alfa-trombina à saturação da heparina .
Os mutantes AT III-Gln 135 e AT III-Gln 155 mostram, em comparação com a AT III-plasma e a AT III-WT, uma melhor inibição da trombina a baixas concentrações de heparina (Tab. 5).
A Tab. 5 mostra a concentração de heparina correspondente à inibição semi-máxima da trombina(C 1/2) para a AT III-plasma, AT III-WT e vários mutantes de AT III.
Exemplo 5; AT III- Gin 135/155
Reuniram-se numa única molécula de AT III as mutações descritas no exemplo 4, por meio de mutogénese sequencial com os oligonucleótidos 8 e 9 (Tab.2). A proteína mutacionada, comporta-se em processos de purificação usuais descritos, comouma molécula recombinante de AT III nativa.
A melhor inibição da alfa-trombina em AT III-Gln 135 e AT III-Gln 155, a baixas concentrações de heparina, é ainda mais reforçada no caso da AT III-Gln 135/155 (Tab.5).
TABELA 1
HGSPVDICTA KPRDIPMNPM CIYRSPEKKA TEDEGSEQKI PEATNRRVWE 51 LSKANSRFAT TFYQHLADSK NDNDNIFLSP LSISTAFAMT KLGACNDTLQ
101 QLMEVFKFDT ISEKTSDQIH FFFAKLNCRL YRKANKSSKL VSANRLFGDK 151 SLTFNETYQD ISELVYGAKL QPLDFKENAE QSRAAINKWV SNKTEGRITD 201 VIPSEAINEL TVLVLVNTIY FKGLWKSKFS PENTRKELFY KADGESCSAS 251 MMYQEGKFRY RRVAEGTQVL ELPFKGDDIT MVLILPKPEK SLAKVEKELT 301 PEVLQEWLDE LEEMMLVVHM PRFRIEDGFS LKEQLQDMGL VDLFSPEKSK 351 LPGIVAEGRD DLYVSDAFHK AFLEVNEEGS EAAASTAVVI AGRSLNPNRV 401 TFKANRPFLV FIREVPLNTI IFMGRVANPC VK
Exemplos para oligonucleótidos de mutagénese
Ns. Sequência Mutaçao
1 5 GGG GTT TAG CGA CAT GCC AGC AAT CAC 3' Arg393-Met
2 5 GGG GTT TAG CGA AAC GCC AGC AAT CAC 3' Arg393-Val
3 5 GGG GTT TAG CGA AAG GCC AGC AAT CAC 3' Arg393-Leu
4 5 GGG GTT TAG CGT ACG GCC AGC 3' Ser394-Thr
5 5 GGG GTT TAG CAT ACG GCC AGC 3 ' Ser394-Met
6 5 GGA CAG TTC CTT GAC ACG CCG G 3 1 Trp49 -Lys
7 5 G GAG GGT GTC CTG ACA GGC ACC CAG C 3' Asn96 -Gin
8 5 GGA GGA TTT CTG GGC TTT TCG Asnl35-Gln
9 5 G GTA GGT CTC CTG GAA GGT AAG G 3 ' Asnl55-Gln
10 5 CG GCC TTC GGT CTT CTG GGA CAC CC 3 Asnl92-Gln
. . Ϊ* y·:
TABELA 3
Inibição da elastase de granulócitos humanos de núcleo
polimórfico (Elastase PMN)
Substância IC50 (yg/ml) KT (mo1/1)
alfai PI 3.7 1,7 χ 108
AT III - WT - n. d.
AT III - Met 393 28.0 n. d.
AT III - Vai 393 4.0 1 χ 10-θ
AT III - Leu 393 65.0 n. d.
= (Nao há inibição (IC5Q > 100 yg/ml)
n.d.= nao determinado
TABELA 4
Expressão e purificação de mutantes de AT III
Concentração na camada sobrenadante1 (mg/l) Purificação de acordo com processos usuais PI2) (U/mg) HC3) (U/mg)
ATIII-Plasma — +++ 4-6,5* 4-6,5*
ATIII-WT 4,2 +++ 6,2 5
ATIII-Met393 5,5 +++ 0 0
ATIII-Val393 4,8 +++ 0 0
ATIII-Leu393 9,8 +++ 0 0
ATIII-Thr394 9,7 +++ n.d. 3,5
ATIII-Lys49 3,3 ++ 4,6 4,3
ATUI—Glnl35 8 +++ 3,9 4,5
ATIII-Glnl55 3,6 +++ 4,2 5,5
ATIII-
Glnl35/155 1,2 +++ n.d 3,8
1) Sobrenadantes isentos de soro, 48 h (ELISA), de células
BHK
2) Actividade inibitória progressiva (Hens en et al. , 1963)
3) Actividade de cofactor de heparina (Schrader et al.1986
n.d. = não determinado
= Zona de variação dependente da carga
.3
TABELA 5
Dependência da inactivação da trombina em relação à concentração de heparina
Cl/2 HeParinal) (mlD/ml)
ATIII-Plasma 65
ATIII-WT 65
ATIII-Glnl35 22
ATIII-Glnl55 22
ATIII-Glnl35/155 5
ATIII-Lys49 maior que 360
Concentração de heparina à xima relativa inibição da trombina semi-má- 14 -
Legenda da Fig. 1
Carta dos plasmideos pMAC 5-8 (=pMA 5-8 e pMC5-8) F1-0RI: origem de replicação do fogo fl;
ORI: origem de replicação do tipo ColEl;
CAT: região codificante para a cloranfenicol-acetil-transferase; AMP: região codificante para a p-Lactanase.
OpMA 5-8 tem uma mutação em CAT (A na posição 3409) e o pMC 5-8 uma mutação em AMP (C na posição 2238).
Legenda da Fig. 4:
Dependência da inibição relativa da alfa -trombinu humana pela AT III-plasma (0), AT III-WT ( D ), AT III - Gin 135 ( · ), AT III-Gln 155 ( B ) e AT III-Lys (v).
As condições experimentais são as descritas no exemplo 4.

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Mutantes de antitrombina III (AT III), caracterizados por, nas posições Asn96, Asnl35, Asnl55, Asnl92, Arg393, possuírem o aminoácido naturalmente ocorrente substituido por um ou outro aminoácido, isoladamente ou em combinação, não podendo contudo Arg393 estar substituido por His ou Cys.
  2. 2. Mutantes de AT III, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por conterem as mutações Arg393=>Met, Arg393 =>Val, Arg393=>Leu, Asn96=>Gln, Asnl35=>Gln, Asnl55=>Gln, Asnl92=>Gln, isoladamente ou em combinação.
  3. 3. Mutantes de AT III, de acordo com a reivindicação 2, caracterizados por conterem uma mutação Arg393=>Met, Arg393 =>Val, Arg393=>Leu, con j untamenete com uma ou mais das mutações Asn96=>Gln, Asnl35=>Gln, Asnl55=>Gln, Asnl92=>Gln.
  4. 4. Mutantes de AT III, de acordo com a reivindicação 2, caracterizados por conterem uma ou mais das mutações Asn96 =>Gln, Asnl35=>Gln, Asnl55=>Gln, Asnl92=>Gln.
  5. 5. Mutante de AT III, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por conter a mutação Arg393=>Met.
  6. 6. Mutante de AT III, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por conter a mutação Arg393=>Val.
  7. 7. Mutante de AT III, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por conter a mutação Arg393=>Leu
  8. 8. Mutante de AT III, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por conter a mutação Asn96=>Gln.
    Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se prepararem mutantes de ATUI, que contêm uma mutação de acordo com os n9s 1, 2 ou 3 da Tabela 2 juntamen te com uma ou mais mutações de acordo com os nss, 7 a 10 da Tabela 2.
    - 43 Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se prepararem mutantes de ATUI, que contêm uma ou mais mutações de acordo com os N9s 7 a 10 da Tabela 2.
    - 53 Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutação de acordo com ο Ν9 1 da Tabela 2.
    - 63 _
    Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutação de acordo com o N9 2 da Tabela 2.
    Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutaçao de acordo com o N9 3 da Tabela 2.
    - 83 Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutação de acordo com o N9 4 da Tabela 2.
    is _ ga _
    Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de AT III, que contém a mutação de acordo com o N® 5 da Tabela 2.
    - 10ã Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutaçao de acordo com o N® 6 da Tabela 2.
    - llã Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutação de acordo com o N® 7 da Tabela 2.
    - 123 Processo de acordo com a reivindicação ,2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutaçao de acordo com o N® 8 da Tabela 2.
    - 133 _
    Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutaçao de acordo com o N® 9 da Tabela 2.
    - 143 _
    Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um mutante de ATUI, que contém a mutaçao de acordo com o N® 10 da Tabela 2.
    15ã
    Processo para a preparaçao de composições farmacêuticas, caracterizado por se incorporarem como ingredien tes activos um ou mais mutantes de ATUI, quando preparados de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, juntamente com veículos farmacêuticos adequados usuais no mercado.
    A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 24 de Janeiro de 1989, sob ο N2.
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