KR0171197B1 - 사람 항트롬빈3의 돌연변이체 및 이의 제조방법 - Google Patents
사람 항트롬빈3의 돌연변이체 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용없음.
Description
제1도는 플라스미드 pMAC-8(=pMA5-8 및 pMC5-8)의 구조도이다.
제2도는 플라스미드 PMAATIII의 작제도이다.
제3도는 플라스미드 PABmut의 작제도이다.
제4도는 AT III 혈장(○), AT III-WT(□), AT III-Gln 135(·), AT III Gln 155(■) 및 AT III-Lys 49(▼)의 사람 α-트롬빈의 상대 억제율(%)을 보여주는 그래프이다.
본 발명은 야생형 항트롬빈 III(AT III)와 비교하여 개선된 특성을 갖는 AT III 돌연변이체에 관한 것이다. 하나 이상의 잠재적 글리코실화 부위(예를 들어 Asn 135, Asn 155)의 변형은 AT III의 프로테아제 특이성을 유지하면서 헤파린-결합/헤파린-활성화 특성을 증가시킨다. 위치 Arg 393에서의 변이는 프로테아제에 대한 특이성의 변화를 유도한다. 대개, 돌연변이의 조합은 여러 특성의 개선을 촉진시킨다.
사람 항트롬빈 III(AT III)을 암호화하는 cDNA 및 이 콜라이중에서 이의 발현은 유럽 특허원 제 EP 0 090 505 A2호에 기술되어 있다. AT III의 발현은 또한 재조합 효모(EP 0 256 302 A2) 및 포유동물 세포(DE 3624 453 A1)에서도 나타난다. 포유동물 세포에 의해 배양배지로 분지된 AT III만이 시험관내에서 완전한 생물학적 활성을 나타내고 혈장 단백질과 매우 유사한 복합 탄수화물 구조를 갖는다는 것이 이들 실험으로부터 밝혀졌다[Zettlmeissl et al., BioTechnology, 1987, 5, 720-725].
포유동물 세포로부터 수득한 재조합 AT III의 약 58kd의 분자량은 혈장으로부터 정제된 단백질의 분자량에 상응한다. 성숙한 사람 AT III의 아미노산 서열은 표 1에 기재되어 있다.
AT III는 세르핀 계열의 단백질 구성원이므로, α-항트립신, α-2-항플라스민, 헤파린 조인자 II, α-1 항키로트립신, 플라스미노겐 활성체 억제제등과 같은 프로테아제 억제제와 상당한 상동성을 갖는다. 세린 프로테아제 트롬빈이 AT III와 상호반응하는 경우 이는 Arg 393-Ser 394 결합을 절단하여 AT III-트롬빈의 공유결합 복합체를 형성한다. 트롬빈은 복합체 형성시 이의 프로테아제 활성을 상실한다. 헤파린의 부재하에, AT III은 비교적 좋지 않은 트롬빈 억제제이다. 최적 농도의 헤파린은 AT III-트롬빈 결합 반응 속도 상수를 적어도 2000배까지 증가시킨다[문헌: Hoylaerts et al., J. Biol. Chem., 1984, 259, 5670-5677], 2가지 형태의 AT III(α 및 β)가 사람 혈장중에 존재하고 헤파린에 대해 다른 친화성을 갖는다[Peterson and Blackburn. J. Biol. Chem., 1985, 260, 610-615; Brennan et al., FEBS LETT., 1987, 219, 431-436]. 혈장중에 90 내지 95%로 존재하는 AT III α는 Asn 잔기 96, 136, 155 및 192상에서 탄수화물 측쇄를 갖는 반면, AT III β에서는 위치 96, 155 및 192상에서 탄수화물 측쇄로 점유된다. 2가지의 AT III 형태의 생리학적 역할은 알려져 있지 않다.
지시된 돌연변이 기술은, AT III의 아미노산 조성의 변화를 유도하는 AT III cDNA내로의 특이적 변이의 도입을 가능케한다. 일본쇄 DNA 또는 이종이본쇄 DNA를 사용하는 지시된 돌연변이 방법은 문헌[Morinaga et al., BioTechnology, 1984, 7, 636-639-, Kramer et al., Nucl, Acid Res., 198, 12, 9441-9456]에 기술되어 있다. 표 2는 사람 AT III의 지시된 돌연변이에 사용된 몇몇의 올리고뉴클레오티드의 실례를 들고 있다.
글리코실회 부위 Asn 96, Asn 135, Asn 155 및 Asn 192 중 하나 이상에서 다른 아미노산, 바람직하게는 Gln을 갖는 돌연변이체가 제조되어, 프로테아제 특이성을 보유하면서 헤파린-결합/헤파린-활성화 특성이 개선되었고; 또한, 위치 Arg 393에서 변형(바람직하게는 Met 또는 Val으로의 돌연변이)된 돌연변이체가 제조되어 효소특이성의 변형을 초래하였다.
개선된 헤파린-결합/헤파린-활성화 특성을 갖는 돌연변이체는 필요한 경우, 치료시 더욱 저용량의 헤파린을 사용할 수 있기 때문에 AT III/헤파린 조합 치료에서 이점을 갖는다.
다른 한편으로, 특이성 돌연변이체는, 가능한 헤파린 활성화의 AT III 특성이 새로운 프로테아제(예를 들어 엘라스타제, 플라스민 등)에 대해 친화성을 갖는 돌연변이된 분자로 전이될 수 있는 신규한 분자를 생성시킴으로써, 이러한 형태의 분자에 의해 변화된 투여량에 따른 유리한 방식으로 치료방법이 변형될 수 있다.
돌연변이된 AT III 단백질을 포유동물 세포에서 발현시키고 표준방법으로 정제하고 이의 프로테아제 특이성 또는 헤파린-활성화 특성 특성, 이의 생화학적/생물리학적 특성 및/또는 이의 임상적 파라미터를 조사할 수 있다. 변형된 형태의 AT III의 합성은 고발현율을 급속하게 유도하는 벡터/숙주세포 시스템에 의해 수행된다[문헌 : Zettlmeissl et al. (1988) Behring Inst. Mitt. 82, 26-34].
따라서 본 발명은, (1) 글리코실화 부위 Asn 96, Asn 135, Asn 155 및 Asn 192중 하나 이상에서 상이한 아미노산, 바람직하게는 Gln을 갖고, (2) 위치 Arg 393에서 변형(바람직하게는 Met 또는 Val으로의 돌연변이)되며, (3) 일반적으로 개선점을 강화해주는 돌연변이 (1) 및 (2)가 조합된 AT III 돌연변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 실시예 및 특허청구범위에 기술되어 있다.
[실시예 1]
AT III 돌연변이체의 합성방법(일반적인 방법)
플라스미드 pbetaAT6(EP 0 256 302 A2)을 EcoRI/Hind III로 분해하여 사람 AT III cDNA의 전 암호화 영역을 함유하는 1.4kb 단편을 분리한다. 이 단편을 돌연변이 유발 벡터 pMA 5-8(제1도)의 폴리링커(EcoRI/Hind III로 절단함)내에 클로닝시킨다. 생성된 플라스미드를 pMAAT III(제2도)라 한다.
돌연변이를 유발시킨 후(돌연변이 유발에 대한 기술 참조), 돌연변이된 cDNA를 Sacll/Xbal 으로 절단하여 분리하고, 마찬가지로 Sacll/Xbal 로 분해된 발현벡터 pAB 3-1(AT III 야생형) 내로 클로닝시켜, 플라스미드 pABmut(제3도)를 형성한다. pABmut 플라스미드는 특정의 돌연변이된 cDNA외에 SV 40 초기 인헨서/프로모터 단위, 초기 전사체에 대한 SV 40 폴리아데닐화 부위 및 CMV 즉각 초기 인헨서(Zettmeissl et al. loc. cit.)를 함유한다.
pABmut 플라스미드를 CaCl 구배상에서 정제하고 문헌[참고문헌: Zettlmeissl et al. loc. cit.]에 기술된 바와 같이 BHK 세포(ATCC CCL10)중의 플라스미드 pSV2dhfr 및 pRMH 140으로 공동 형질감염시킨다. DME 배지 + 10% FCS + 400㎍/㎖ G418 및 1μM 메토트렉세이트(표준 성장배지)중에서 이중 선별후에 나타난 내성 클론(약 40 내지 100개)을 T25 배양 용기중에서 클론 혼합물로서 합한다. 혼합된 클론을 표준 성장배지 중에서 T80 및 T180 배양용기를 통해 플라스틱 로울러 병(1750㎠)내로 증식시키고 그 안에 점착시킨 상태로 융합시까지(confluence) 배양시킨다. 융합 세포를 200㎖의 이스코브(Iscove) 배지(Behringwerke AB, Marburg)로 2회 세척(각 경우 37℃에서 2시간 동안)하고 이어서 회수 배지로서 동일한 배지 500㎖로 48시간 동안 롤링시킨다. 회수배지를 세포 구성물로부터 원심분리로 분리한다. 컨디셔닝된 회수배지의 분취량을 사람 AT III에 대해 특이적인 ELISA로 AT III 항원 함량에 대해 조사한다[참고문헌: Zettlmeissl et al. 1987, BioTechnology 5. 720-725]. 이러한 방법으로 측정된 양생형 AT III(AT III-WT) 및 여러 가지 돌연변이에 대한 발현수준은 표 3에서 실시예를 통해 기재하고 있다.
AT III-WT 및 이로부터 유도된 돌연변이 단백질을 표준방법 헤파린-세파로우즈를 사용하는 친화성 크로마토그라피를 수행한 후 분별 황산 암모늄으로 침전시킴)[Zettlmeissl et al., 1987]으로 회수배지로부터 정제하고 이어서 특성화한다.
돌연변이 AT III 분자는 또한 당해 기술 분야에 따라 여러 가지 영구적인 포유동물 세포주 중에서 기타 발현 벡터를 사용하여 발현시킬 수 있다.
[실시예 2]
돌연변이 유발/일반적인 방법[참고문헌: Kramer et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12, 9441-9456]
이 콜라이 균주 WK6 중에서 형질전환된 돌연변이 유발 벡터 pMAAT III(제2도)의 일본쇄 DNA를 표준방법으로 분리한다.
pMC 5-8의 플라스미드 DNA(제1도 참조)를 EcoRI/Hind III로 절단하고, 벡터 단편(3.8kb)을 종이 용출에 의해 아가로즈 겔로부터 정제한다[참조: Maniatis et al. 1982, Molecular Clonning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York].
이본쇄 단편(pMC로부터) 0.1pmol 및 일본쇄 DNA(pMAAT III) 0.5pmol을 12.5mM 트리스-HCl pH 7.5+190mM KCl(최종 용적 40㎕)중 100℃에서 4분 동안 가열시키고 이어서 65℃에서 10분 동안 배양하여 갭핑된(gapped) 이본체 DNA를 제조한다. 상기 하이브리드화 용액 8㎕를 효소적으로 인산화된 올리고뉴클레오티드 4 내지 8pmol(2㎕)와 함께 65℃에서 5분 동안 가열시킨 후 서서히 실온으로 냉각시켜 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드상에 하이브리드화시킨다(참조 표 2). H2O 24㎕, 10X 충전 완충액(625mM KCl, 275mM 트리스-HCl pH 7.5, 150mM MgCl2, 20mM DTT, 0.5mM ATP 및 4개의 dNTPs 각 0.25mM), T4DNA 리가제 1㎕(50U/㎕) 및 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편 1㎕(1U/1㎕)을 가하고 실온에서 45분 동안 배양시킨다. 충전되고 갭핑된 이본체 DNA 5㎕를 WK 6 muts(mutS215:Tn10)으로 형질전환시킨다. 모든 형질전환된 혼합물을 LB배지+25㎍/㎖ 클로람페니콜(10㎖) 중 37℃에서 밤새 진탕 배양시켜 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 표준방법(Maniatis et al., 1982)으로 전체 혼합물로부터 정제한다. 정제된 플라스미드 약 20ng을 WK6내로 형질전환시킨다. 형질전환제를 25㎍/㎖ 클로람페니콜이 함유된 LB 평판상에서 선별한다.
이들 형질전환체 5개를 적합한 서열반응(C-, T-, A- 또는 G-특이적)으로 목적한 돌연변이에 대해 분석한다. 양성 클론을 돌연변이 유발 부위 영역에서의 상세한 서열분석으로 입증한다[참조: Sanger et al. (1983), Proc. Natl. Acad, Sci. USA 74, 5463-5467].
[실시예 3]
AT III-Met 393; AT III-Val 393 및 AT III-Leu 393
α1 항트립신(엘라스타제 억제제)과 유사한 특이성을 갖는 분자를 제조하기 위해, AT III 의 Arg 393(PI 위치)을 Met. Val 또는 Leu로 전환시킨다. 표 2의 올리고뉴클레오티드 제1번, 2번 및 3번을 돌연변이 유발을 위해 사용한다.
돌연변이체는 AT III 야생형(WT)과 비견되는 양으로 BHK 세포에 의해 합성되어 배양배지내로 방출된다(표4). 이들 돌연변이체는 AT III 혈장 및 AT III-WT와 동일한 토끼의 항-AT III 혈청에 대한 양태를 보이며, AT III-WT와 마찬가지로 상술한 표준방법에 의해 95% 이상의 순도로 정제될 수 있다. 이들 돌연변이체는 헤파린-세파로즈상에서의 결합 및 용출양태에 있어서 AT III-WT와 다르지 않다. 이는 돌연변이체의 헤파린 결합특성 및 헤파린 활성화 특성이 손상되지 않았음을 나타내다.
돌연변이체는 트롬빈에 대해 진행성 억제성[참조: Hensen et al., 1963. Thromb. Diatl. Haemorrh. 9, 18-29] 또는 헤파린 조인자 활성[참조 : Schrader et al., 1986. Arztl. Lab. 32, 111-114]을 더이상 갖지 않는다(표 3).
AT III-WT와는 대조적으로, 세개의 돌연변이체는 백혈구 엘라스타제를 억제한다. 엘라스타제는 문헌[참조 : Engelbrecht et al, Hoppe-Seyler′s Ztschr. Physiol. Chemie 363, 305-315, 1982]에 기술된 방법으로 백혈구로부터 분리된다. 사용된 기질은 문헌[참조: Nakajima et al., J. Biol. Chem. 254. 4027-4032,1979]에 기술된 MeO-Suc-Ala-Pro-Val-pNA(Calbiochem)이다. 기질로부터 파라니트로아닐린의 방출은 분광광도계로 405nm에서 15분 이내에 흡광도의 증가로서 광도계로 측정한다. 이러한 흡광도는 PMN 엘라스타제 효소의 100% 활성으로서의 정의된다. 억제제를 최대 100㎍/㎖까지 농도를 증가시키면서 효소와 함께 1시간 동안 예비배양시킨다. 그후 기질을 사용하여 효소반응을 개시한다. 검정은 0.1몰/1HEPES, pH 7.5+0.1몰/l 염화나트륨중에서 수행한다. 기질 농도는 0.13mmol/l이다. IC50은 효소활성을 50% 억제하는 억제제 농도(㎍/㎖)로 정의한다. 100㎍/㎖의 최대농도에서 억제작용을 나타내지 않는 기질은 불활성으로 나타낸다. 사용된 대조 억제제는 3.7의 억제치를 갖는 α1프로테아제 억제제(α1 PI, α1 항트립신)이다. AT III-WT는 PMN 엘라스타제 활성을 억제하지 않는다. AT III Val은 α1 PI와 비교하여 4.0㎍/㎖의 활성을 나타내는 반면, AT III Met 및 AT III Leu는 각각 28 및 65㎎/㎖의 활성으로 명백히 덜 활성적이다(하기 표 참조).
기술된 PMN 엘라스타제 검정은 α1PI와 비교함으로써 AT III-Val 393에 대한 Kl를 측정하는데 사용된다. 사용된 기질 MeO-Suc-Ala-Pro-Val-pNA의 농도는 0.0011, 0.0022, 0.0044, 0.0087, 0.0175, 0.035, 0.7mmol/l이다. 억제제의 농도는 .5×10-8mol/l 이다.
두가지 경우에 있어서 PMN 엘라스타제의 억제는 비경쟁적인 억제(하기 표 참조)이다. α1PI 및 AT III-Val 393에 대한 KI치는 실질적으로 동일하다.
[실시예 4]
AT III-Gln 135 및 AT III-Gln 155
본 발명에서 청구된 실험의 하나의 목적은 AT III의 생물학적 및 생화학적 특성에 AT III 분자의 클리코실화가 미치는 영향을 조사하는 것이다. 위치 135 및 155에서 Asn→Gln으로 변화시켜 각각 탄수화물 측쇄가 결여된 2개의 AT III돌연변이체(AT III-Gln 135 및 AT III-Gln 155)를 생성시킨다. 사용된 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 8 및 9(표 2)이다. BHK 세포에서 2개의 돌연변이체(배양배지 중의 AT III)에 대한 발현속도는 표 4에 기재되어 있는 바와 같이 AT III-WT에서와 동일한 순서의 크기이다. 2개의 돌연변이체는 특이적 진행성 억제 및 헤파린 조인자 활성의 측면에서 AT III 혈장 및 AT III-WT와 동일한 토끼의 항-AT III 혈청에 대해 반응을 보이며(표 4) 상술된 표준방법으로 95% 이상의 순도까지 정제될 수 있다.
2개의 돌연변이체를 검정에서 헤파린 농도의 함수로서 트롬빈을 불활성화시키는 이의 상대적인 능력에 대해 조사하고 AT III혈장, AT III-WT 및 돌연변이체 AT III-Lys 49와 비교한다(표 5).
검정은 하기 조건하에 수행한다.
0.02U(항원)/㎖ AT III(AT III 혈장, AT III-WT 또는 AT III--Mut)을 0.31U/㎖ α-트롬빈(사람), 2KIU/㎖ 아프로티닌(Behringwerke) 및 0 내지 25IU/㎖ 농도의 헤파린(Hoffmann-LaRoche)과 1㎖의 용적으로 37℃에서 5분 동안 예비 배양시킨다. 기질시약(2mM HD-CHA-But-Arg-pNA) 100㎕을 가한 후, 405nm(37℃)에서 흡광의 변화를 역학적으로 측정한다. 헤파린 포화시 α-트롬빈의 최대 억제율을 100%로 설정한다.
낮은 헤파린 농도에서 돌연변이체 AT III-Gln 135 및 AT III-Gln 155에 의한 트롬빈의 억제는 AT III 혈장 및 AT III-WT에 의한 트롬빈 억제보다 더 우수하다(표 5).
표 5는 AT III 혈장, AT III-WT 및 여러 가지 AT III 돌연변이체에 대한 반-최대 트롬빈 억제시의 헤파린 농도(C 1/2)를 나타낸다.
[실시예 5]
AT III-Gln 135/155
실시예 4에서 기술된 돌연변이를 올리고뉴클레오티드 8 및 9(표 2)로 연속 돌연변이 유발시켜 하나의 AT III 분자중에서 조합한다. 돌연변이 단백질은 기술된 표준 정제 방법에서 재조합 야생형 AT III분자와 같이 작용한다.
낮은 헤파린 농도에서 AT III-Gln 135 및 AT III-Gln 155로 나타나는 α-트롬빈의 개선된 억제율은 AT III-Gln 135/155에서 보다 훨씬 현저하다(표 5).
제1도에 대한 주:
플라스미드 pMAC5-8 지도(=pMA5-8 및 pMC5-8)
F1-ORI : 파이지 f1의 복제기원;
ORI : ColE1 타입의 복제기원;
CAT : 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제에 대한 암호화 영역;
AMP : β-락타마제에 대한 암호화 영역;
pMA5-8은 CAT내에서 앰버(amber) 돌연변이 (위치 3409에서 A)를 갖고 pMC5-8은 AMP내에서 앰버 돌연변이(위치 2238에서 C)를 갖는다.
제4도에 대한 주:
AT III 혈장(○), AT III-WT(□), AT III-Gln 135(●), AT III Gln 155(■) 및 AT III-Lys 49(▼)의 사람 α-트롬빈의 상대적인 억제 의존성 실험 조건은 실시예 4에 기술되어 있다.
Claims (17)
- Trp49, Gln96, Gln135, Gln155, Gln192, Arg393 또는 Thr394의 위치에서 단독으로 또는 조합으로 돌연변이가 유발된 항트롬빈 III(AT III) 돌연변이체.
- 제1항에 있어서, 표 2에 기재된 돌연변이가 단독으로 또는 조합으로 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제1번, 제2번, 또는 제3번 돌연변이가 표 2에 기재된 제7번 내지 제10번중 하나 이상의 돌연변이와 함께 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제7번 내지 제10번중 하나 이상의 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제1번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제2번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제3번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제4번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제5번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제6번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제7번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제8번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제9번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 제10번 돌연변이가 유발된 AT III 돌연변이체.
- 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 돌연변이체중 하나를 암호화하는 cDNA를 적합한 원핵 또는 진핵 발현 시스템중에서 발현시킴을 포함하여, 언급된 돌연변이체를 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 하나 이상을 함유하는, AT III의 헤파린-결합/헤파린-활성화 특성을 개선시키는데 유용한 약제.
- 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 하나 이상을 함유하는, 백혈구 엘라세타제를 억제시키는데 유용한 약제.
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