JPH02262598A - ヒト抗トロンビン３の変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、野生型ＡＴｍ　（アンチトロンビン■）と比
較して改良された性質を有する、ＡＴＨの変異体（ｍｕ
ｔａｎｔｓ）に間する。一つまたはそれ以上の可能なグ
ルコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部位（例え
ばＡｓｎ１３５およびＡｓｎ１５５）における修飾は、
ＡＴＩＩ［のプロテアーゼ特異性を保ちながらヘパリン
結合／ヘパリン活性化の性質を向上させる。位置Ａ　ｒ
　ｇ　３９３における変化は、プロテアーゼに対する特
異性の変化をもたらす、一般に、変異（ｍｕｔａｔｉｏ
ｎ）、の組合せは改良を促進する。

ヒト抗トロンビンｍ（ＡＴｍ）をコードするｃＤＮＡお
よび大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）におけるその発現は、欧
州特許出願ＥＰ第００９０５０５　Ａ２号明細書に記載
されている。ＡＴ［ＩＩの発現は、さらに、組換え酵母
（ＥＰＰＯ２２５６３０２Ａ２号明１ｓｌｊ　）　オよ
び哺乳動物細胞（ＤＥ第３６２４４５３　ＡＩ号明細ｉ
１）において示されている。これらの実験から、哺乳動
物細胞によりて培養培地に分泌されるＡ　Ｔ　ＩＩＩの
みがインビトロでの完全な生物学的活性を示し、血漿タ
ンパク質と非常に似た複雑な炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅ）構造を有しているということが明らかにな
った（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌら：　ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ。

１９８７．５、？２Ｏ−７２５）。

哺乳動物細胞からの組換え八Ｔｉ１ｌの約５８ｋｄの分
子黴は、血漿から精製されたタンパク質のものに相当す
る。成熟ヒ）ＡＴｍのアミノ酸配列は表１に示される通
りである。

ＡＴＩＩＩは、タンパク質のセルビン（５ｅｒ１月ｎ）
ｉｆｆのひとつであり、したがって、α−１抗トリプシ
ン、α−２抗プラスミン、ヘパリン補因子■、α−１抗
キモトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子（ａｃｔ
ｉｖａｔｏｒ）インヒビターなどのプロテアーゼインヒ
ビターと大きな類似を有している。セリンプロテアーゼ
トロンビンはＡ　Ｔ　ｕＩと反応すると、それはＡｒｇ
３９３−９ｅｒ３９４結合を切断して、共有結合のＡＴ
ＩＩＩ−）ロンビン複合体を形成する。

トロンビンは複合体形成（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）
においてそのブａテアーゼ活性を失う。ヘパリンの非存
在下では、Ａ　Ｔ　Ｉｍはトロンビンの比較的弱いイン
ヒビターである。ヘパリンの最適濃度は、少なくとも２
０００倍（ｆａｃｔｏｒ）のレベルでＡ　Ｔ　ＩＩＩ　
−）ロンビン結合反応の速度定数（ｒａｔｅ　ｃｏｎｓ
ｔａｎｔ）を増加させる（　ｔｌｏｙｌａｅｒｔｓら：
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　（：ｈｅｎ＋、、１９８４．２５
９．５Ｇ７０−５６７７）。ヒトの血漿中には二つの型
のＡＴＩＩＩ　（アルファおよびベータ）が存在してお
り、これらはヘパリンに対して異なる親和性（ａｆｆｉ
ｎｉｔｙ）を有している（　Ｐｅｔｅｒｓｏｎおよび８
１ａｃｋｂｕｒｎ：　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅ
ｗ、、　１９８５、２６０、６１〇−ｆｌ１５、Ｂｒｅ
ｎｎａｎら：　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴ、、１９８７．２１
９．４３１−４３６）。ｌ′Ｉｌ［Ｌ漿中９０〜９５％
の範囲で存在するＡＴＩＩＩアルファはＡｓｎ残基９６
．１３５．１３５および１９２に炭水化物側鎖を有する
のに対して、ＡＴｍベータにおいては位置９６．１５５
および１９２のみが占められている。二つのＡＴＩＩＩ
の型の生理学的役割は知られていない。

管理された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発の技術に
よってＡＴＩ［［ｃＤＮＡへの特異的変化の導入が可能
である。これはＡＴＬ［Ｉのアミノ酸組成の修飾をもた
らす。１本鎖ＤＮＡまたはへテロ二本鎖（ｈｅｔｅｒｏ
ｄｕｐｌｅｘ）　Ｄ　Ｎ　Ａを用いる管理された突然変
異誘発の方法は開示されている（Ｍｏ口ｎａｇａら：８
ｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏ８ｙ、　１９８４．７．６３６−
６３９、にＩ’ａｆｆｌｅｌ・ら：Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ
１ｄ　　Ｒｅｓ、、１９８．１２．９４４１−９４５６
）。表２は、ヒ）ＡＴＨの管理された突然変異誘発に用
いられるオリゴヌクレオチドのいくつかを例示したもの
である。

一つまたはそれ以上のグリコジル化部位Ａ　ｓ　ｎ９６
、Ａ　Ｓ　１１１３５、Ａｓｎ１５５およびＡ　ｓ　ｎ
１９２において、異なるアミノ酸、好ましくはＧｌｎ、
を有する変異体が合間製され、これはプロテアーゼ特異
性を保ちながらヘパリン結合／ヘパリン活性化の性質を
増進する。さらに、１１７置Ａｒ　ｇ３９３で修飾され
た変異体く好ましくはＭｅｔまたはＶａｌへの変異（ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ））を調製した。これは酵素特異性の修
飾（改良）をもたらす。

ヘパリン結合／ヘパリン活性化の性質を向上させた変異
体は、適宜、より低いヘパリン量を治療に用いることが
可能であることから、ＡＴｍ／ヘパリン併用治療におい
て有利である。

一方、特異性変異体は、可能なヘパリン活性化のＡＴＨ
の性質を新たなプロテアーゼ（例えばエラスターゼ、プ
ラスミンなど）に対する親和性を有する突然変異した分
子へ移すことができる新たな分子を結果としてもたらす
。したがって、この型の分子は、投与量を変えることに
よって有利な方法で治療の政策を変えることを可能にす
る。

突然変異したＡＴｍタンパク質を、哺乳動物細胞におい
て発現して、標準法によって精製して、それらのプロテ
アーゼ特異性またはそれらのヘパリン活性化の性質、生
物化学的／生物物理学的性質および／またはそれらの臨
床的パラメーターについて調べることが可能である。Ａ
Ｔ［［の修飾型の合成は、高発現率を迅速にもたらすベ
クター／宿主細胞系（ｓｙｓｔｅｍ）によって達成され
る（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌら：　Ｂｅｈｒｉｎｇ　１
ｎｓｔ、　Ｍｉｔｔ、、１９８８．８２．２６−３４）
。

したがって、本発明は次のようなＡ　１’　ＩＩＩ変異
体に間する。

（１〉グリコジル化部位Ａｓｎ９６、Ａ　ｓ　ｎ１３５
、Ａｓ　ｎ　１５５およびＡｓｎ１９２の一つまたはそ
れ以上において異なるアミノ酸、好ましくはＧｌｎ、を
有しており、 （２）位置Ａ　ｒ　ｇ　３９３において修飾されており
（好ましくはＭｅｔまたはＶａｌへの変異）、（３）一
般に改良を促進する、変異（１）および（２）の組合せ
を有する。

本発明は諸例および特許請求の範囲にさらに記載される
通りである。

例１：ＡＴＩ１１変異体の合成（一般法）ヒトＡＴＩＩ
ＩｃＤＮＡの全コード領域を含む１．４ｋｂのフラグメ
ントを、Ｅｃ　ｏＲＩ／Ｈｉ　ｎｄｍによる消化によっ
てプラスミドｐβＡＴ６　（ＥＰＰＯ２２５８３０２Ａ
２号明細書）から単離した。このフラグメントを突然変
＊！誘発ベクターｐＭＡ５−８　（第１図）のポリリン
カー（ＥｃｏＲＩ／Ｈｔｎｄｍで切断した）にクローニ
ングした。その結果得られるプラスミドをｐＭＡＡＴ［
［［と称した（第２図）。

突然変異誘発を行った後に（「突然変異誘発」の項を！
Ｊ照されたい）、突然変異させたｃＤＮＡを５ａｃｆｆ
／ＸｂａＩによる切断によって単離して、同様に５ａｃ
ｎ／Ｘｂａｌで消化しておいた発現ベクターｐＡＢ３−
１にクローニングした（ＡＴｍ野生型）、その結果、プ
ラスミドｐＡＢｍｕｔが得られた（第３図）。

ｐＡＢｍｕ　ｔプラスミドは、特有の突然変異したｃＤ
ＮＡに加えてＳＶ４０初期エンハンサ−／プロモーター
ユニット、初期転写のためのＳＶ４０ポリアデニル化（
ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）部位およびＣＭＶ迅
速初期エンハンサ−（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ　ら：前
出）を有している。

ｐＡＢｍｕｔプラスミドをＣｓＣＩ勾配でｍａして、Ｚ
ｅｔｔｌｅｓｅｉｓｓｌら（前出）による記載のように
してプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒおよびｐＲＭＨ１４０
でＢ　ＨＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）中で共トランス
フェクシヨン（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた
。

ＤＭＥ培地＋ｌＯ％ＦＣＳ＋４００μｇ／■１に４１８
および１７ｚＭメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘ
ａｔｅ、標準増殖培地）中での二重選択後に得られる耐
性クローン（約４０〜１００）をクローン混合物として
Ｔ２５培ｌＩ器に集めた。混合されたクローンをＴ８０
およびＴ１８０培ＩＷを介して標準増殖培地中でプラス
チックローラーボトル（１７５０ｃｍ２）に拡げて、そ
こにコンフルエントになるまで付着培養させた。コンフ
ルエントになった細胞を２００１の１ｓｃｏｖｅの培地
（Ｂｅｈｒｉｎｇｖｅｒｋｅ　ＡＧ％Ｍａｒｂｕｒｇ）
で２回（それぞれ３７℃で２時間）洗浄して、次いで５
００１の同じ培地を回収培地（ｈａｒｖｅｓｔ　ｍｅｄ
ｉｔ」＊）として４８時間回転させた。回収培地を細胞
成分から遠心分離によって分離した。調整した回収培地
の各一部をとり、ヒトＡＴｍに特異性のあるＥＬ、Ｉ　
ＳＡによってそれらのＡＴＩＩＩ抗原含有量を調べた（
Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌら：　ＢｉｏＴｃｈｑｏｌｏｇ
ｙ、！９８７．５．７２０−７２５）。このようにして
測定した野生型ＡＴｍ（ＡＴＩＩＩ−ＷＴ）および種々
の突然変異体（＠ｕｔａｎｔ）の発現レベルは、表３に
例示する通りである。

ＡＴｎＩ−ＷＴおよびそれから派生した突然変異したタ
ンパク質を標準法（ヘパリン−セファ０−スを用いるア
フィニティークロマトグラフィーとそれに続く分画硫酸
アンモニウム沈Ｒ）　（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌら：　
１９８７）によって回収培地から精製して、次いで特徴
付けを行った。

変異体ＡＴＩ［分子は、また種々の永久哺乳動物細胞系
において技術状態に応じて他の発現ベクターを用いても
発現させることができる。

隈２±突然変異誘発／一般法（に「ａ■ｅｒら：　Ｎｕ
ｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９８４．１２．９４４１−９
４５６）大腸菌Ｗ　Ｋ　６株で形質転換させておいた突
然変異誘発ベクターｐＭＡＡＴｍ　（第２図）の−末鎖
ＤＮＡを桿準法によって単離した。

ｐ　ＭＣ５−８のプラスミドＤＮＡ　（第１図の説明を
１ＴＭされたい）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄｌＩＩで切断
して、ベクターフラグメント（３，８ｋｂ）をアガロー
スゲルからペーパー溶出（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

１９８２、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）によって精製した。

ギ＋’７ブト二本鎖（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）　
Ｄ　Ｎ　Ａを得るために、０．１ｐｍｏｌの二本鎖フラ
グメント（ｐ　Ｍ　Ｃから）および０．５ｐ＋ｗｏｌの
一本鎖ＤＮＡ（ｆ）ＭＡＡＴｍ）を１２．５ｍＭ）リス
−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）＋　１９Ｏｎ＋ＭＫＣｌ　　（
最終容量４０μｍ）中で１００℃で４分間加熱して、次
いで６５℃で１０分間インキュベートした。突然変異誘
発オリゴ又クレオチド（表２を参照されたい）上でのハ
イブリダイゼーションのために、８μｍの該ハイブリダ
イゼーション溶液を４〜８ｐ■ｏ１（２μｍ）の酵素的
に燐酸化したオリゴヌクレオチドと６５℃で５分間加熱
して、次いで徐々に室温に冷却した。２４μｍのＨ２Ｏ
，４μｍのＩＯＸ埋填ｍ衝液（ｆｉｌｌ−ｉｎ　ｂｕｆ
ｆｅｒ）　（６２５ｍＭＫ　ＣＩ、２７５ｍＭ）リス−
ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）、１５０＋ＭＭｇＣ１２，２
０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰおよび各０．２５ｓ＋
Ｍの四つのｄＮＴＰ）、１μｍのＴ４ＤＮＡリガーゼ（
５Ｕ／１１１）および１μｍのＤＮＡポリメラーゼ■の
フレノウフラグメント（１０７８ｍ）を加えて、室温で
４６分間インキュベートシた。５１１１の埋填ギャップ
ト二本鎖ＤＮＡでＷ　Ｋ　６　ｍｕｔｓ　（ｎ＋ｕｔｓ
２１５：ＴｎｌＯ）を形質転換さ、せた。

全形質変換混合物をＬＢ培地＋２５μ８／１クロラムフ
ェニコール（１０ａ＋ｌ）中での賑盪培養で３７℃で一
晩増殖させる。プラスミドＤＮＡを全混合物から標準法
（Ｍａｎｉａｔｉｓら：　１９８２）によってＩＩＳ！
した。約２００８の精製プラスミドでＷＫ６を形質転換
させた。形質転換体を２５μ８／１のクロラムフェニコ
ールを含むしＢプレート玉で選択した。

これらの形質転換体の５個について適当な配列反応＜Ｃ
−５Ｔ−Ａ−またはＧ−特異性）によって所望の突然変
異を分析した。陽性のクローンを突然変異誘発部位の領
域の詳細な配列分析によって確認した（　Ｓａｎｇｅｒ
ら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　１９８８．７４．５４６３−５４６７）。

ｆＬａ±ＡＴｍ−Ｍｅ　ｔ３９３：　ＡＴＩＩＩ−Ｖａ
　１３９３およびＡＴＩ［［−Ｌ　ｅ　ｕ　３９３αｌ
抗トリプシン（エラスターゼインヒビター）と同様の特
異性を有する分子を形成する目的で、ＡＴＩＩＩのＡｒ
ｇ３９３　（Ｐ１位置）をＭｅＬ、ＶａｌまたはＬｅｕ
に変換した。表２からのオリゴヌクレオチドＮｏ、１．
２および３を突然変異誘発に用いた。

突然変異体は、Ｂ　ｔ（Ｋ細胞によって合成されて、Ａ
ＴＩＩＩ野生型（ＷＴ）に匹敵する量で培養培地に放出
され（表４）、これはウサギからの抗ＡＴｍ血清に対し
てＡＴｍ−血漿およびＡＴ［ＩＩ−ＷＴと同一の反応を
示して、ＡＴｍ−ＷＴと類似して上記の標準法によって
９５％以上の純度で精製することができる。これら突然
変異体のヘパリン−セファ０−ス上での結合および溶出
の性質は、ＡＴｍ−ＷＴと違わない。このことは、突然
変異体のヘパリン結合およびヘパリン活性化の性質がそ
のままで保持されていることを示す。

突然変異体はもはやトロンビンに対する累進的な阻害活
性（Ｈｅｎ５ｅｎら：　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔｌ。

１１ａｅｍｏｒｒｈ、、１９６３．９．１８−２９）ま
たはヘパリン補因子活性（Ｓｃｈｒａｄｅｒら：　Ａｅ
ｒｚｔｌ、、　Ｌａｂ、、１９８６．３２．１１１−１
１４）を有していない（表３）。

ＡＴｍ−ＷＴと対照的に、三つの突然変異体は白血球エ
ラスターゼを阻害する。エラスターゼは、ヒト白血球か
らＥｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔらの記載による方法（Ｈｏｐ
ｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚｔｓｃｈｒ、　Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍｉｅ。

１９８２．３６３．３０５−３１５）で＠離された。用
いられた基質は、Ｎａｋａｊｉｍａら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ、、１９７９．２５４．４０２７−４０３
２）による記載のＭｅＯ−５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａ　ｌ−ｐＮＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）であ
った。基質からのバラニトロアニリンの遊離を１５分以
内の４０５ｎ票における吸光度の増加として分光光度計
によって測定した。

この吸光度をＰＭＮエラスターゼ酵素の１００％活性と
定義した。インヒビターを最高１１００１ｚ／ｌにまで
あげた濃度で酵素とともに１時閉ブレインキュベーショ
ンした。次いでｒＩｔ素反応を基質とともに始めた。分
析を０．１ｍｏｆ／リットルＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５
）＋０．１ｍｏｌ／リットル塩化ナトリウム中で行った
。基質濃度は０．１３ｍｍｏ　Ｉ　／リットルであった
。（Ｃ５０を、酵素活性の５０％を阻害する阻害１度（
７１ｇ／ｍｌ）として定義した。最高濃度の１００７１
３／ａ＋ｌにおいて阻害作用を示さない物質を不活性と
称した。用いた参照インヒビターは、αｌプロテアーゼ
インヒビター（ａｌＰＩ、α１抗−トリプシン）であっ
て、これは阻害値３．７を有した。八１’　ＩＩＩ　−
Ｗ　Ｔは、ＰＭＮエラスターゼ活性の阻害を示さなかっ
た。ＡＴＩＩＩＶａｌは（！ＩＰＩに匹敵する４、０７
％ｇ／ｍｌの活性を示したが、ＡＴＩｌＩＭｅｔおよび
Ａ　Ｔ　ＩＩＩ　Ｌ　ｅ　ｕは明かに活性がより低く、
それぞれ２８および６５ｍｇ／ｎ＋１であった（続く表
を参照されたい）。

記述のＰＭＮエラスターゼ分析を、ａｌＰＩとの比較に
よってＡＴｍ−Ｖａ１３９３のＫ　Ｉの決定に用いた。

用いた基質ＭｅＯ−５ｕ　ｃ−Ａｌ　ａ−Ａｌ　ａ−Ｐ
　ｒ　ｏ−Ｖａ　１−ｐＮＡの濃度は、０．００１１、
０．００２２、０．００４４．０．００８７、０．０１
７５、０．０３５．０．７＋ｎａ＋ｏｌ／リツトルであ
った。インヒビターの濃度は３−５　Ｘ　ｌ　Ｏ−’ｓ
＋ｏｌ／リットルであった。

両方の場合で、９ＭＮエラスターゼの阻害は非競合的阻
害で、あった（続く表を参照されたい）。

ａｌＰＩおよびＡＴｍ−Ｖａ　１３９３ｃ７）Ｋ　Ｉｈ
ｉは、実質的に同一である。

１ＬＡ　Ｔ　ＩＩＩ−Ｇ　ｌ　ｎ　１３５およびＡ　Ｔ
　ｌｌｌ−に　ｌ　１１発明として本出願において請求
される実験の一つの目的は、　ＡＴｒＩ［分子中のグリ
コジル化の、ＡＴＨの生物学的および生物化学的性質に
及ぼす影響を調べることにある。位置１３５および１５
５におけるＡ　ｓ　ｎ−＋Ｇ　ｌ　ｎｆ！＊を、それぞ
れ炭水化物側鎖を欠いている二つのＡＴｎｌ突然変異体
（ＡＴ［Ｉ−Ｇ　ｌ　ｎ　１３５およびＡＴＩＩ［−Ｇ
ｉｎ１５５）の産生に用いた。用いた突然変異誘発オリ
ゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド８および９（表２
）であった、ＢＨＫｍ胞（ＡＴＩ［Ｉは培養培地中）に
おける両突然変異体の発現率は、表４に示されるように
、ＡＴＩ［１−ＷＴと同じオーダーの大きさである。両
突然変異体は特頁的累進的阻害活性およびヘパリン補因
子活性に関して、ウサギからの抗−ＡＴｍ血清に対して
ＡＴＬＩＩ−血づ１およびＡＴｍ−ＷＴと同一の反応を
示す（表４）。これらをＬ記の標準法に・よって９５％
以五の純度で精製することができる。

二つの突然変異体を、分析中のヘパリン濃度を関数とし
てそれらのトロンビン不活性化能（比較値）を調べて、
ＡＴｕｒ−血づ１、ＡＴＩｎ−ＷＴおよび突然変異体Ａ
ＴＩｒ［−Ｌｙｓ４９と比較した（表５）。

分析は次の条件下で行った。０．０２Ｕ（抗原）／ｍｌ
Ａ　Ｔ　ＩＩＩ　（Ａ　Ｔ　［ＩＩ−血づ４、ＡＴｎｌ
−ＷＴまたはＡＴＩＩＩＭｕｔ）を、０．３１１１／ｍ
ｌの（Ｘ−トロンビン（ヒト）、２にＩＵ／ｍｌのアプ
ロチニン（Ｈｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）および０〜２５
１ＬＪ／ｍｌの濃度の１１の容量のヘパリン（Ｉｌｏｆ
ｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）とともに３７℃で５分間
ブレインキュベーションした。

１００　Ｉｔ　Ｉの基質試薬（２＋＋＋Ｍ　ＨＤ−ＣＨ
Ａ−Ｂｕ　ｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を加えた後、４０５ｎ
ｍ（３７℃）における吸光度（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）
の変化を動力学的に（ｋｉｎｅｔｉｃａｌ　ｌｙ）追跡
した。ヘパリン飽ＩＵにおけるα−トロンビンの最大阻
害を１００％と設定した。

突然変異体ＡＴｒｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ　１３５およびＡＴｍ
−Ｇｌｎ１３５による低ヘパリン濃度におけるトロンビ
ンの阻害はＡＴＩＩＩ−血漿およびＡＴＩ［Ｉ−ＷＴよ
りも良好であった（表５）。

表５には、ＡＴＩ［［−血漿、ＡＴｍ−ＷＴおよび種々
のＡＴ［１１突然変異体についての１７２最大（ｈａｌ
ｆ−＋＊ａｘｉ＊ｕｓ）　）ロンビン阻害（ｃｌ／２）
におけるヘパリン濃度が示されている。

例ｊ≦−Ａ　Ｔ　０Ｉ−Ｇ　ｌ　ｎ　１３５／１５５ｆ
’Ｍ４に記載の突然変異を、オリゴヌクレオチド８およ
び９（表２）を用いる連続的突然変異誘発によって一つ
のＡＴ［［１分子において組合わせた。

突然変異したタンパク質は記載の標準精製法において１
１Ｉｉ換え野生型ＡＴＩ’［［分子のように挙動する。

ＡＴｌ［ｌ−Ｇｌｎ１３５およびＡ　Ｔ　ＩＩＩ−Ｇ　
ｌ　ｎ１５５について見出された低ヘパリン濃度におけ
るα−トロンビンの増進された阻害は、ＡＴＩＩＩ−Ｇ
ｌｎ１３５／１５５の場合にはよりいっそう顕著である
（表５）。

表」− １１１ＧＳＰＶＤＩＣＴＡ　ＫＰＲＤＩＰＭＮＰＭ　Ｃ
ＺＹＲ５ＰＥＫＸＡ丁ΣＤＥＧＳ）：ＱＫ工ＰＥＡ諏Ｒ
ＲＶＷＥ５１　　ＬＳＸＡＮＳＲＦＡＴ　　ＴｎＱＨＩ
ＪＤ５）ＣＮＤＮ■１０１　ＱＬＭＥＶＦ）ＣＦＤＴ　
Ｚ５Ｅ）Ｃ’！’５ＤＱＩＨＰｉ”Ｆ。

１５１５ＬＴＦＮＥ買ＱＤ　ＺＳＥＬＶ’ＸＣＪＪ山Ｑ
ｐＬ＋２０１　ＶＩＰＳＥＡＩＮＥＬＴＹＬＶＬＶＮＴ
ＸＹ　ＦＩＣＧ１４０１　Ｔ！’ＫＡＮＲＰＦＬＩＶ　
ＦＩＲＥＶＰＬＮＴエ　エＦＭＧＲＶＡＮＰＣ■スＬ１ ヒト多形核顆粒球からのエラスターゼ（ＰＭＮエラスタ
ーゼ）の阻害 法ＬＩ ＡＴＩＩＩ突然変異体の発現および精製物質 Ｉ　Ｃ５ａ（７Ｚ　８／ｍ１） Ｋ　１（ｍｏｌ／ｌ） 、Ｐ■ ７ｍ−ＷＴ Ｔ　ｍ　−Ｍｅｔ３９３ Ｔ　ＩＩＩ　−Ｖａ１３９３ ｔ　　ＩＩＩ　−Ｌｅｕ３９３ ３．７ ２８．０ ４．０ ６５．０ １．７　　ｘ　　１０”８ ｎ、ｄ。

ｎ、ｄ。

１　　　　ｘｌＯ−８ ｎ　、　ｄ。

＝阻害無しく　Ｉ　ｃｓａ＞　１００　／ｊ　ｇ／ｍ１
）ｎ、ｄ、＝非測定 ＡＴＩＩ［−血漿 ＡＴＩＩＩ−讐Ｔ ＡＴＩＩＩ　−Ｍｅｔ３９３ ＡＴｍ　−Ｖａ１３９３ ＾Ｔｍ−Ｌｅｕ３９３ ＡＴｍ　−Ｔｈｒ３９４ ＡＴｍ−Ｌｙｓ４９ ＡＴ［ＩＩ　−ＧＩｎ１３５ ＡＴｍ−Ｇｌｎ１５５ ４．２ ５．５ ４．８ ９．８ ９．７ ３．３ ３．６ Ｔｍ　− ｑｌｎ１３５／１５５ １．２ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋÷ ＋＋＋ ＋＋＋ ４−３．５本 ６．２ ｎ、ｄ ４．６ ３．１） ４．２ ＋＋＋ ｎ　、　ｄ ４−６．５ネ ３．５ ４．３ ４．５ ５．５ ３．８ ネ ＝バッチ依存性変動範囲 表」− トロンビン不活化のヘパリン濃度依存性（ｍ　Ｉ　Ｕ／
ｍ　ｌ　） ＡＴ［ＩＩ−血某 Ａ　Ｔ　ｍ　−ＷＴ Ａ　Ｔ　ｍ−Ｇｌｎｌ３５ Ａ　Ｔ　ｍ−Ｇｌｎ１５５ Ａ　Ｔ　ｌｌｌ−Ｇｌｎ１３５／１５５Ａ　Ｔ　ｍ−Ｌ
ｙｓ４９ 以１ １）１／２最大比トロンビン阻害におけるヘパリン濃度

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｒ）　ＭＡＣ５−８（＝　ｐ　Ｍ
Ａ５−８およびｐ　Ｍ　Ｃ５〜８）の地図を示す、説明
図である。図中、Ｆｌ−ＯＲＩ：フ７−ジ「ｌの復製開
始点、ＯＲＩ：Ｃｏ１Ｅｌ型の複製開始点、ＣＡＴ：ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのコー
ド領域、ＡＭＰ：β−ラクタマーゼのコード領域。ｐ　
Ｍ　Ａ　５−８はＣＡＴ中（１〜２置３４０９のＡ）に
アンバー（ａｍｂｅｒ）突然変異を有し、９ＭＣ５−８
はＡＭＰ中（位置２２３８のＣ）にアンバー突然変異を
有する。 第２図は、突然変異誘発ベクター１）　Ｍ　Ａ　Ａ　Ｔ
　ｍを示す、説明図である。 第３図は、プラスミドｐＡＢｍｕｔを示す、説明図であ
る。 第４図は、ＡＴｍ−血漿＜０＞、ＡＴＩＩＩ−ＷＴ（ロ
）、ＡＴＩＩＩ−Ｇ　ｌ　ｎ　１３５　（・）、Ａ　Ｔ
　ＩＩＩ　−Ｇｌｎ１５５（■）およびＡＴｍ−Ｌｙｓ
　（マ）によるヒトα−トロンビンの比阻害（ｒｅｌａ
ｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）の依存性を示す、説明
図である。実験条件は例４に記載されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、位置Ｔｒｐ４９、Ｇｌｎ９６、Ｇｌｎ １３５、Ｇｌｎ１５５、Ｇｌｎ１９２、Ａｒｇ３９３、
   Ｔｈｒ３９４において単独でまたは組み合わせで変異を
   含む、抗トロンビンIII変異体。 ２、表２に示される変異を単独でまたは組み合わせで含
   む、請求項１に記載の抗トロンビンIII変異体。 ３、表２に示される変異Ｎｏ．１、２または３と表２に
   示される変異Ｎｏ．７〜１０の一つまたはそれ以上をと
   もに含む、請求項２に記載の抗トロンビンIII変異体。 ４、表２に示される変異Ｎｏ．７〜１０の一つまたはそ
   れ以上を含む、請求項２に記載の抗トロンビンIII変異
   体。 ５、表２に示される変異Ｎｏ．１を含む、請求項２に記
   載の抗トロンビンIII変異体。 ６、表２に示される変異Ｎｏ．２を含む、請求項２に記
   載の抗トロンビンIII変異体。 ７、表２に示される変異Ｎｏ．３を含む、請求項２に記
   載の抗トロンビンIII変異体。 ８、表２に示される変異Ｎｏ．４を含む、請求項２に記
   載の抗トロンビンIII変異体。 ９、表２に示される変異Ｎｏ．５を含む、請求項２に記
   載の抗トロンビンIII変異体。 １０、表２に示される変異Ｎｏ．６を含む、請求項２に
   記載の抗トロンビンIII変異体。 １１、表２に示される変異Ｎｏ．７を含む、請求項２に
   記載の抗トロンビンIII変異体。 １２、表２に示される変異Ｎｏ．８を含む、請求項２に
   記載の抗トロンビンIII変異体。 １３、表２に示される変異Ｎｏ．９を含む、請求項２に
   記載の抗トロンビンIII変異体。 １４、表２に示される変異Ｎｏ．１０を含む、請求項２
   に記載の抗トロンビンIII変異体。 １５、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の変異体を
   コードするｃＤＮＡの、適当な原核または真核生物発現
   系中での発現を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に
   記載の変異体の製造法。 １６、請求項１〜１４に記載の変異体の一つまたはそれ
   以上を含んでなる、薬剤。